Visualisere den utviklende hjernen i levende sebrafisk ved hjelp av Brainbow og Time-lapse Confocal Imaging

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

In vivo imaging er et kraftig verktøy som kan brukes til å undersøke cellulære mekanismer underliggende nervesystemet utvikling. Her beskriver vi en teknikk for bruk av tidsforløp konfokal mikroskopi for å visualisere et stort antall flerfarget Brainbow-merkede celler i sanntid i det utviklende sebrafisknervesystemet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60593, doi:10.3791/60593 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Utvikling av virveldyrnervesystemet krever en presis koordinering av kompleks cellulær atferd og interaksjoner. Bruken av høyoppløselige in vivo bildeteknikker kan gi et klart vindu inn i disse prosessene i den levende organismen. For eksempel kan deling av celler og deres avkom følges i sanntid som nervesystemet dannes. I de senere årene har tekniske fremskritt i flerfarget teknikker utvidet hvilke typer spørsmål som kan undersøkes. Den flerfargede Brainbow-tilnærmingen kan brukes til ikke bare å skille mellom like celler, men også til fargekode flere forskjellige kloner av relaterte celler som hver kommer fra en stamcelle. Dette gir mulighet for en multipleks avstamning analyse av mange forskjellige kloner og deres atferd samtidig under utviklingen. Her beskriver vi en teknikk for bruk av tidsforløp konfokal mikroskopi for å visualisere et stort antall flerfarget Brainbow-merkede celler over sanntid i det utviklende sebrafisknervesystemet. Dette er spesielt nyttig for å følge cellulære interaksjoner mellom som celler, som er vanskelig å merke differensialt ved hjelp av tradisjonelle promotordrevne farger. Vår tilnærming kan brukes til å spore avstamningrelasjoner mellom flere forskjellige kloner samtidig. De store datasettene som genereres ved hjelp av denne teknikken, gir rik informasjon som kan sammenlignes kvantitativt på tvers av genetiske eller farmakologiske manipulasjoner. Til syvende og sist kan resultatene som genereres bidra til å svare på systematiske spørsmål om hvordan nervesystemet utvikler seg.

Introduction

I de tidlige fasene av utviklingen deler bassenger av spesialiserte stamceller gjentatte ganger i proliferative soner, og produserer ulike arrayer av datterceller. Cellene som er født i denne utviklingsperioden vil da differensiere og reise for å danne de gryende organene. I nervesystemet gir stamfarer som radial glia opphav til umodne nevroner i ventrikulære soner. Som nevroner migrere bort fra ventrikler og modne, danner det ekspanderende vevet til slutt de svært komplekse strukturene i hjernen1,2,3,4,5,6. Koordineringen mellom deling av stamfarer og differensiering og migrasjon av nevroner vil bestemme den endelige størrelsen, formen og dermed funksjonen til hjernen, direkte påvirker atferd7,,8,9,10. Selv om tett kontroll over disse prosessene er klart avgjørende for normal hjerneutvikling, er de globale mekanismene som regulerer disse dynamikkene ikke godt forstått. Her beskriver vi et verktøy for å studere utvikling av nervesystemet ved en cellulær oppløsning, slik at forskere kan visualisere stamceller og nevroner in vivo i den utviklende sebrafiskhjernen med Brainbow og spore deres oppførsel over tid via tid-bortfall konfokal mikroskopi11. Tilnærmingen kan også tilpasses for å visualisere andre deler av det utviklende embryoet.

For å observere og skille mellom celler i den utviklende sebrafiskhjernen, har vi tilpasset Brainbow cellemerkingsteknikk11. Brainbow benytter det tilfeldig bestemte, kombinatoriske uttrykket av tre forskjellige fluorescerende proteiner (FPs) for å merke en populasjon av celler. Mens standarduttrykket for Brainbow-uttrykk er det røde FP dTomato, resulterer rekombinasjon av enzymet Cre rekombinase i uttrykk for mCerulean (cyan fluorescerende protein, CFP) eller gult fluorescerende protein (YFP)12,13. Den kombinerte mengden av hver FP uttrykt i en celle gir den en unik nyanse, slik at klart visuelt skille fra nærliggende celler. I tillegg, når en stamcelle deler seg, vil hver dattercelle arve fargen fra sin morcelle, produsere fargekodede kloner og tillate forskere å spore celleavstamning11,14. Mens den opprinnelig ble brukt til å analysere nevronale kretser i mus12,har Brainbow siden blitt uttrykt i et bredt spekter av modellorganismer, inkludert sebrafisk15.

Vår teknikk bygger på tidligere flerfarget merking og bildemetoder for å direkte bilde flere fargekodede kloner over tid i levende sebrafisk. På grunn av deres optiske gjennomsiktighet som embryoer, er sebrafisk godt egnet til bildeeksperimenter16, og tidligere studier har benyttet Brainbow i sebrafisk for å studere en rekke vev, inkludert nervesystemet11,,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Evnen til å direkte bilde inn i den levende organismen, sammen med deres raske ex utero utvikling, gjør sebrafisk til en verdifull modell for virveldyrutvikling. I motsetning til den pattedyrhjernen er hele proliferativ sone av sebrafisk hindbrain lett tilgjengelig for avbildning uten avbrudd i sitt endogene miljø6. Dette gjør det mulig å gjennomføre eksperimenter i den levende organismen, i stedet for in vitro eller faste vevspreparater. I motsetning til faste bildeeksperimenter tillater in vivo-studier en langsgående design, som produserer timer med data som kan analyseres for mønstre, og dermed øke sannsynligheten for å observere relativt sjeldne hendelser. Avhengig av hastigheten og lengden på hendelsene av interesse, forskere kan velge å utføre korte (1-2 t) eller lange (opp til ~ 16 h) time-lapse bildeforsøk. Ved å bruke sebrafisk varme sjokk promotoren 70 (hsp70, hsp), Brainbow uttrykk kan være tempolysk kontrollert28,29. I tillegg er mosaikkuttrykket indusert av denne arrangøren godt egnet for merking og sporing av mange kloner11.

Evnen til visuelt å identifisere flere kloner i den levende hjernen er en fordel med denne metoden. Viktige tidligere studier som undersøkte klonenes rolle i utviklingen av nervesystemet, benyttet retrovirale vektorer til å merke en enkelt stamcelle og dens avkom ved hjelp av en enkelt FP eller annet lett visualisert protein. Slik merking gjør det mulig for forskere å observere en enkelt klone over tid, enten in vitro eller in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. I motsetning til metoder for å spore oppførselen til celler i en klone, de distinkte fargene i Brainbow tillate forskere å observere dynamikk blant kloner. I tillegg, ved å bruke Brainbow til å merke mange kloner i hjernen, samles ytterligere data om klonal atferd i forhold til teknikker som merker en enkelt klone11. Viktigere, tilnærmingene beskrevet her kan utvides til å generere utviklingssammenligninger mellom fisk som har gjennomgått forskjellige genetiske eller farmakologiske manipulasjoner18. Samlet sett gjør disse fordelene time-lapse in vivo confocal imaging av Brainbow-uttrykkende sebrafisk ideell for forskere som utforsker utviklingen av virveldyrnervesystemet, spesielt de som er interessert i kloners rolle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrer som involverer dyreforsøk er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Lewis & Clark College.

1. Mikroinjeksjon av sebrafiskembryoer

  1. Sett opp vill type, voksen sebrafisk i sex-segregerte parring tanker ettermiddagen før du utfører mikroinjeksjoner39,40.
  2. Forbered DNA-løsningen om morgenen av mikroinjeksjonene. Fortynn hsp:Zebrabow11 plasmid DNA til en konsentrasjon på ~ 10 ng / μL i 0,1 mM KCl, sammen med 2,5% fenol rød og 3,75U Cre rekombinase enzym.
  3. Utfør mikroinjeksjoner av DNA-oppløsning i encellede sebrafiskembryoer innen 45 minutter etter befruktning39,41. Injiser ca. 4,2 nL av denne oppløsningen i hvert embryo, tilsvarende ~42 pg av plasmid DNA.
    MERK: Mikroinjeksjonstrinnet kan utelates hvis en transgen, Brainbow-uttrykkende sebrafisklinje pares i stedet, for eksempel Tg(ubi:Zebrabow)15 og Tg(neurod:Zebrabow)18. Utføre mikroinjeksjoner kan være en fordel fordi det gjør det mulig for forskere å titrere kopinummeret og merke tetthet. Videre kan en annen DNA-konstruksjon som koder eller manipulerer et bestemt genprodukt injiseres sammen med Brainbow hvis ønskelig (f.eks. et langt rødt fluorescerende protein som utfyller Brainbow18).
  4. Vedlikehold injiserte embryoer i Petri-retter på E3 medium39 i en 28 °C inkubator i 24 timer.

2. Varme sjokk for å indusere Brainbow Uttrykk

MERK: Hvis plasmid DNA injisert eller transgene uttrykt ikke bruker hsp70 arrangøren til å kjøre uttrykket, kan varmesjokktrinnet hoppes over, og friske embryoer skal umiddelbart overføres til fenylthiourea (PTU) ved 24 h post befruktning (hpf).

  1. Ved 24 hkf, cull døde og deformerte embryoer fra gruppen av injisertembryoer. Deretter overfører du de friske embryoene til et 50 ml rør, med opptil 20 embryoer/rør.
  2. Fyll rørene med 10 ml E3. Plasser en hette på toppen av hvert rør, men ikke lukk tett.
  3. Plasser rørstativet som inneholder 50 ml rørene oppreist i et 37 °C vannbad. Sørg for at vannivået i badekaret er høyere enn nivået på E3 i rørene og la dem stå i 80 til 90 min.
  4. Fjern rørstativet med embryoene fra vannbadet og gå tilbake til 28 °C inkubatoren oppreist. La opptil 1 h for E3 avkjøles og embryoene gradvis re-akklimatisere seg til temperaturen. Deretter overfører embryoene til Petri retter på 0,2 mM PTU i E3 oppvarmet i inkubatoren for å forhindre pigmentering av embryoer.
    FORSIKTIG: PTU er et giftig kjemikalie som skal håndteres med forsiktighet og avhendes på riktig måte. Bruk av hansker er foreslått.

3. Screening Embryoer for Brainbow Uttrykk

  1. Ved 2 til 4 timer etter varmesjokket, undersøke embryoene under en standard fluorescens disseksjon mikroskop for uttrykk for CFP eller YFP, som indikerer vellykket Brainbow rekombinasjon (fra standard uttrykk for dTomato).
    MERK: Hvis flere fluorescensfilteralternativer er tilgjengelige, er screening for CFP den mest effektive måten å identifisere godt recombined fisk. Hvis CFP- og YFP-filtre ikke er tilgjengelige, kan YFP også visualiseres under grønne fluorescerende proteinfiltre (GFP) på grunn av overlappingen i spektrale profiler.
  2. Velg embryoer med robust FP-uttrykk gjennom og overfør til en egen tallerken med PTU. Bildeembryoer ved 1 dag etter befruktning (dpf; 28 hkf eller nyere) eller opprettholde embryoer i PTU og bilde ved 2 eller 3 dpf.

4. Montering embryoer for In Vivo Imaging

  1. Før eksperimentets dag, forberede bildekammeret og embryomanipulasjonsverktøyet.
    1. Forbered bildekammeret ved å nøye superlime en plastring til midten av en 60 mm Petriskål.
    2. Eventuelt forberede en skreddersydd embryomanipulator for å flytte embryoer i parabolen og orientere embryoer mens montering. Konstruer manipulatoren ved å superlime en liten lengde av nylon fiskesnøre (~ 1 / 2 i, ~ 6 lb) til enden av en tre bomull vattpinne som har blitt kuttet til en ~ 4 i lengde.
  2. Om nødvendig (dvs. bildebehandling ved 2 dpf eller tidligere), før du monterer embryoenes dechorionat e i bruk av sprøyter under et disseksjonsmikroskop.
  3. Bedøve sebrafisk embryoer.
    1. Fyll en 60 mm petriskål halvveis med E3 og tilsett 5–6 dråper 4 mg/ml MS-222 Tricaine-S til en endelig konsentrasjon på ~0,2 mM. Virvle for å blande.
      FORSIKTIG: Tricaine skal håndteres med forsiktighet og avhendes på riktig måte.
    2. Overfør embryoer fra PTU til tricaine-løsningen, og pass på at så lite PTU overføres som mulig. Mens fiskereflekser skal opphøre etter 1–2 min, la embryoene stå i tricaine i opptil 10 minutter for å sikre grundig anestesifor tidsforløpsforsøk.
    3. Bekreft at embryoene er riktig bedøvet. Vurder startlerefleksen ved å berøre embryohalene forsiktig med embryomanipulatoren. Hvis en refleksbevegelse observeres, legg til en ekstra dråpe tricaine til parabolen så langt fra embryoene som mulig og virvler for å blande. Vær oppmerksom på embryopulsen under et disseksjonsområde. Hvis det er unormalt sakte, tilsett flere dråper E3 til parabolen for å redusere tricainkonsentrasjonen.
  4. Mount bedøvet embryoer i agarose.
    1. Overfør fisken til midten av plastringen i bildekammeret og fjern så mye overflødig E3 som mulig ved hjelp av en fintippet overføringspipette.
    2. Bruk en ren overføringspipette til å dekke fisken med 1,0 % lavsmelteagarose (LMA) i E3 lagret ved 42 °C og fyll hele plastringen med et tynt lag med agarose. Bruk en overføringspipette til å trekke embryoene forsiktig opp i pipettespissen og tilbake i agarose uten å introdusere luftbobler.
    3. Før agarose herder, raskt bruke et embryo manipulator for å orientere fisken riktig. Hvis du avbildning med et oppreist mikroskop, plasser embryoene så nær den øvre overflaten av agarose som mulig. Plasser embryoene parallelt med bunnen av bildekammeret med halen rett.
      MERK: For hindbrain imaging kan embryoene plasseres i en dorsal eller sagittal visning. Det bør utvises forsiktighet for å sikre at embryoenes hoder ikke synker mens agarose fortsatt er flytende. Andre orienteringer kan være hensiktsmessig å målrette andre utviklende vev for bildebehandling. For inverterte mikroskoper ville montering gjøres annerledes, vanligvis posisjonering av fisken nær bunnen av en glassbunnet petriskål.
  5. Vent til agarose å herde, og fyll deretter bildekammeret med E3. Legg til så mye E3 som mulig for å ta hensyn til fordampningen i løpet av bildebehandling.

5. Time-lapse Confocal Imaging av utvikle Sebrafisk Hindbrain

  1. Plasser bildekammeret på konfokalmikroskopet som forberedelse til avbildningen.
    1. Plasser bildekammeret med fisken og E3 på konfokalmikroskopet.
    2. Velg et mål med høy numerisk blenderåpning og en lang arbeidsavstand, for eksempel et mål for 20 x vannnedsenking (1,0 NA).
    3. Finn et område med passende tett og lys merking av celletypen(e) av interesse.
      MERK: Et temperaturkontrollert stadium/apparat på mikroskopet kan også brukes til å regulere temperatur og fuktighet under lange bildebehandlingsøkter. Dette kan redusere fordampning.
  2. Definer anskaffelsesparameterne for Brainbow-avbildning.
    1. Bilde hver FP-kanal sekvensielt. Hvis du bruker en kommersiell programvare (f.eks. Zen-programvare), gjøres dette ved å forberede tre "spor". Bruk en Argon laser for å opphisse CFP på 458 nm og YFP på 514 nm. Bruk en DPSS 561 nm laser for å opphisse dTomato. Samle opp utslipp mellom 463–509 nm for CFP, 519–555 nm for YFP og 566–691 nm for dTomato.
    2. For skjermvisning, kode CFP som blå, YFP som gul, og dTomato som rød.
      MERK: Disse innstillingene vil variere avhengig av hvilke laserlinjer og andre funksjoner som er tilgjengelige på konfokalmikroskopet. For å øke hastigheten på bildebehandling, kan CFP og dTomato-kanaler avbildes samtidig uten merkbar utfiltring. Hvis en separat FP også blir avbildet, for eksempel en fjernrød FP, kan dette avbildes sekvensielt eller samtidig med YFP.
    3. Sett opp de generelle bildeparametrene for å ta 16-biters bilder med en oppløsning på minst 1024 x 1024 og snitt to ganger. Juster zoomen avhengig av region- og celletypen av interesse (dvs. for hindbrain-avbildning med en 20x-mål, vil zoomen variere fra 1,0–2,5). Maksimer synsfeltet for å tillate vekst av fisken over tid.
    4. Vise ett spor om gangen (og slå av andre lasere for å forhindre fotobleking), optimalisere anskaffelsesinnstillingene for hver FP individuelt (f.eks. lasereffekt, pinhole størrelse, photomultiplier tube gevinst, etc.).
    5. Velg Z-stack område til bilde.
      MERK: For lange bildebehandlingsøkter (> 2 h), ta hensyn til at fisken vil fortsette å vokse i løpet av bildebehandling, og dermed bør både XY-feltet og Z-stack-serien stå for dette med ekstra plass. Hvis du forestiller hindbrain, inkluderer plass i feltet for vevet å flytte rostrally under bildeperioden. Plass må også inkluderes for vekst i Z-dimensjonen. Ta med i bildet ca. 10–20 μm over interesseområdet, om fisken er plassert for sagittal eller dorsal visning.
  3. Definere parametere for bildebehandling for tidsforløp.
    1. Velg et tidsintervall. Intervalllengde varierer mellom 10–30 min for å spore mitotiske og apoptotiske hendelser i den utviklende hindbrainen. Intervalllengden vil variere avhengig av hastigheten på hendelsene av interesse og den totale tiden det tar å fange en enkelt Z-stack.
    2. Velg lengden på bildebehandlingsøkten. Time-lapse bildebehandlingsøkter oppstår vanligvis over natten og kan vare minst 16 timer.
  4. Kjør eksperimentet.
    MERK:
    Fisken kan eutaniseres umiddelbart etter avbildning eller nøye dissekert fra agarose ved hjelp av sprøyter og returneres til E3 for å komme seg. Gjenvunnet fisk kan deretter avbildes igjen på et senere tidspunkt, selv om celleposisjon og dybde vil skifte i denne perioden på grunn av generell vekst.

6. Filbehandling for tidsforløp

  1. Importer bildefilen til analyseprogramvaren.
    1. Hvis du bruker Zen-programvaren, lagrer du filen i CZI-format når bildeoppkjøpet er fullført. Sørg for å lagre rådata i et format som er kompatibelt med Fiji42 og/eller annen programvare.
    2. Importer til Fiji-programvare ved hjelp av BioFormats Importer.
      MERK: Tidsforløpsfiler vil være store og kan kreve betydelige mengder tid og minne for å åpne for analyse. Dermed er det nyttig å være strategisk i hvordan de blir frelst og åpnet. Det kan være nyttig å lagre en lavere kvalitet versjon som kan åpnes lettere for å søke etter hendelser av interesse for øye.
  2. Hvis du bruker Fiji, kan du opprette mindre, mer håndterlige delsett av tidsforløpsfiler. Generer delsett enten etter tid (f.eks. visning av full Z-stack ved første gangs punkt) eller dybde (f.eks. visning av de første 50 Z-delene på hvert tidspunkt) ved å klikke Bilde| Stabler| Verktøy| Lag Substack.

7. Kvantitativ klonal fargeanalyse av Brainbow Bilder

  1. Mål de gjennomsnittlige røde, grønne og blå (RGB) intensitetsverdiene for cellene av interesse i Fiji.
    MERK:
    Disse instruksjonene er spesifikke for bildeanalyse i Fiji. Forskere foretrekker imidlertid kanskje å oppnå gjennomsnittlige RGB intensitetsverdier i et alternativt program.
    1. Kontroller at filen er riktig beskåret slik at det ikke er svart plass rundt kantene på bildet. Svart plass vil kunstig senke de minimale intensitetsmålingene som trengs for analysen. Hvis filen må beskjæres, velger du rektangelvalgknappen og tegner et område av interesse (ROI) rundt synsfeltet, unntatt all svart plass. Klikk på Bilde| Beskjær.
    2. Angi at måleverktøyet skal ta gjennomsnittlige, minimums- og maksimumsmålinger for grå verdi. Klikk på Analyser| Angi målinger. Kontroller at avmerkingsboksene for Min & Max Gray Value og Gjennomsnittlig grå verdi er valgt.
    3. Vise rådatafiler eller subsetted Z-stabler i Fiji, finne celler av interesse for klonal fargeanalyse. I hindbrain kan antatte kloner visuelt identifiseres av deres delte nyanse, så vel som deres radiale orientering. Ikke velg celler som er i nær kontakt med, og dermed vanskelig å løse fra, nærliggende celler av en annen farge. Det kan være vanskelig å kvantifisere deres nyanse.
    4. Finn det midterste Z-planet av cellen av interesse ved hjelp av Z-rullefeltet. Høyreklikk knappen Ovalvalg, og velg Elliptisk valgknapp. Andre utvalgsverktøy vil være egnet for ulike celletyper. Tegn en elliptisk avkastning rundt den sentrale ~ 2/3 av cellekroppen.
    5. Velg den røde (dTomato)-kanalen ved hjelp av C-rullefeltet. Ta gjennomsnittlig intensitetsmåling for denne kanalen ved å velge Analyser| Mål. Gjenta med samme avkastning og brennvidde for de grønne (YFP) og blå (CFP)-kanalene og lagre alle gjennomsnittlige intensitetsverdier.
    6. Klikk hvor som helst på bildet for å fjerne elliptisk avkastning i cellen av interesse.
    7. Hvis du vil måle bakgrunnsnivåer for normalisering, bruker du C-rullefeltet og velger den røde (dTomato)-kanalen. Ta minimumsmåling for intensitet for hele feltet i denne kanalen ved å velge Analyser| Mål. Gjenta med samme brennvidde for de grønne (YFP) og blå (CFP)-kanalene og lagre alle minimumsintensitetsverdier.
  2. Beregn relative RGB-kanalvekter for cellene av interesse.
    Merk:
    Beregning av relative RGB-kanalvekter fra disse intensitetsverdiene kan utføres i en rekke programmer, for eksempel Microsoft Excel eller R43.
    1. Normaliser gjennomsnittlig intensitetsmåling av celleavkastningen for hver kanal ved å trekke den minimale intensiteten fra hele feltet i den kanalen og fokusplanet.
    2. Sum de normaliserte gjennomsnittlige RGB intensitetsverdiene fra hver kanal for å finne den totale normaliserte RGB-intensiteten for cellen.
    3. Beregn den relative kanalvekten for hver kanal ved å dele den normaliserte gjennomsnittlige intensitetsverdien for den kanalen med den totale normaliserte RGB-intensiteten.
  3. Vis relative RGB-kanalvekter som ternary-plott ved hjelp av Ternary-pakken for R43,44. Ternary tomter er nyttige for å visualisere klynger av lignende farger i 3D RGB plass.
  4. Beregn fargespredningskoeffisienten for å kvantifisere forskjellen mellom cellefarger.
    1. Beregn den euklideanavstanden mellom de to fargene i 3D RGB-plass ved hjelp av følgende ligning:
      Equation 1
      hvor R, G og B er de relative RGB-kanalvektene beregnet i 7,2.
    2. For enkel forståelse normaliserer du fargeavstanden ved å dele med √2, maksimal mulig avstand mellom farger, for å oppnå en fargespredningskoeffisient mellom 0 og 1, hvor 0 indikerer nøyaktig samme farge og 1 indikerer helt forskjellige farger (f.eks. rød og ren blå).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne delen illustrerer eksempler på resultater som kan oppnås ved hjelp av in vivo multicolor time-lapse imaging tilnærming beskrevet her. Vi viser at Brainbow fargekodede kloner av celler i den proliferative ventrikulære sonen av den utviklende sebrafisk hindbrain14 (Figur 1).

Vanligvis, når Brainbow-merkede celler ble arrangert langs en bestemt radial fiber, delte de samme farge (Figur 1D), som kan kvantifiseres som de relative RGB-kanalvektene (Figur 1E). Dette tyder på at disse radiale gruppene var kloner av deleceller og at deres lignende farge kan brukes til å identifisere dem som klonalt relatert, som observert i tidligere studier i sebrafisk, mus og kylling14,15. Når Brainbow merking tetthet er relativt sparsom, denne fargekoding kan brukes til å tydelig visualisere og spore mange forskjellige radiale kloner innenfor proliferative områder av den levende virveldyr hjernen.

En kvantitativ fargeanalyse viste at datterceller uttrykte samme farge som sin mor (stamfar) celle (Figur 1F), men at nærliggende radiale klynger av celler kan skilles fra hverandre11 (Figur 1E). Dette betyr at mange kloner av relaterte celler kan følges samtidig over timer in vivo (Figur 2), noe som åpner for en multipleks avstamning analyse og sammenligning. Kvantifisering av fargeuttrykk i kloner ved 2 dpf og deretter igjen ved 3 dpf (Figur 2A-B) viste at Brainbow uttrykk også forble relativt konstant fra 2-3 dager i vivo11. Individuelle celler kan dermed identifiseres og spores i sanntid i relativt lange perioder under utviklingen.

Time-lapse imaging avslørte mange celler som gjennomgår interkinetisk kjernefysisk migrasjon og celledeling i perioden fra 1-2 dpf (Figur 2C-F)11, tillater studie av cellesyklusen. Ved hjelp av et intervall for tidsforløp på 30 minutter fanget vi ikke alltid mitotisk figur under celledeling. Dette introduserte en potensiell feil på opptil 30 minutter til den tildelte tiden for celledeling. I tillegg observerte vi at noen kloner som så ut til å inneholde to stamceller (f.eks. figur 2F). Innenfor disse begrensningene kan lengden på cellesyklusen måles. Ved å spore individuelle Brainbow-merkede stamfarer over tid beregnet vi en gjennomsnittlig cellesyklus på 8,4 ± 1,5 timer, sammenlignbarmed tidligere målinger i sebrafisk1,,45,46. Videre, ved hjelp av Brainbow time-lapse imaging teknikk, var vi også i stand til å observere individuelle celler som gjennomgår de stereotypiske morfologiske endringene forbundet med apoptose (Figur 3)11, for eksempel membran blebbing og cellefragmentering47,48.

Figure 1
Figur 1: Brainbow merket klonalt relaterte klynger av å dele celler i den utviklende sebrafisk hindbrain. (A) Skjematisk hsp: Zebrabow (Brainbow) DNA transiently uttrykt til fargekode kloner. (B) In vivo overførte lysbilder av utvikling av sebrafisk ved 1 og 2 dpf; pilene indikerer den generelle hindbrain-regionen som er rettet mot bildebehandling. Translucency av embryoene er demonstrert av et mikrometer plassert under hver fisk. Eksperimentell tidslinje som viser injeksjoner på encellede stadium, varmesjokk (HS) ved 24 hkf og bildebehandling fra 1–3 dpf. (C) Dorsal visning av 29 hpf sebrafisk hindbrain merket med Brainbow. Den overførte lyskanalen viste morfologien til hindbrain og ventrikkel overlaid med maksimal intensitetprojeksjon av Brainbow-merkede kloner som representerer 165 μm. Rostral er oppe. (D) In vivo Brainbow uttrykk i hindbrain, vist i maksimal intensitet projeksjoner representerer 41 μm i tynt merket 51 hpf sebrafisk (D1), og 81 μm i 63,5 hpf sebrafisk (D2). I begge panelene er dorsal opp og rosenkrans en til venstre. (E) Fargen på cellene i D1 og D2 ble kvantifisert som relative kanalvekter i tilsvarende ternary tomter (n = 54 celler E1; 461 celler E2). (F) Cellefarge forble relativt konstant i datterceller etter celledeling. Serie av tidspunkter som viser in vivo mitotic hendelser i hindbrain av 29 hpf Brainbow-merket sebrafisk over 1 t (F1, maksimal intensitet projeksjoner, 30 μm dybde). Fargen på mor og datter celler, angitt av de svarte boksene i F1, er representert som relative kanal vekter i ternary tomten i F2. Innsettet viser en zoom av samme plott for å vise tett grupperte cellefarger (M er mor; D1 og D2 er døtre på 30 min / firkanter, og 60 min / trekanter). Skalastenger = 30 μm (C), 20 μm (D1),16 μm (D2)og 5 μm (F1). I C, D og F er dTomato kodet som rød, YFP er kodet som grønn, og CFP er kodet som blå. Bilder gjengitt med tillatelse fra Brockway et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Time-lapse in vivo imaging kombinert med Brainbow fargekoding skilte flere nærliggende kloner av celler som gjennomgår interkinetisk kjernefysisk migrasjon og deling. (A) Fargekodede radiale klynger merket i bakhjernen til en fisk som uttrykker Brainbow ved 2 dpf (55 hkf; A1) og 3 dpf (71 hkf; A2); maksimal intensitetprojeksjoner som representerer henholdsvis 62 μm og 47 μm. Tre fargekodede radiale klynger identifiseres med pilspisser på hvert tidspunkt. (B) Fargen på alle Brainbow-merkede celler i A1 og A2 ble kvantifisert som relative kanalvekter i tilsvarende ternary tomter i B1 og B2 (n = 106 celler, 119 celler). (C) Zebrafish hindbrain ved 35 hkf merket med Brainbow (maksimal intensitetprojeksjon som viser 24 μm); innfelt angitt med stiplet hvit boks er første gangpunkt vises i D. (D) Serie med tidspunkter tatt med 30 minutter intervaller i hindbrain fra C. Det vises en periode på >9,5 timer. De merkede cellene gjennomgikk interkinetisk kjernefysisk migrasjon; hvite pilspisser indikerer en celle på den apikale overflaten. Avrunding av cellesoma på apical overflaten og en tilsvarende økning i klone nummer (f.eks, rød celle på 5,5 t og deretter 8 h) ble ansett som en mitotisk hendelse. (E) Dorsolateral visning av sebrafisk hindbrain på 30,5 hpf merket med Brainbow, hvor den hvite stiplet og stiplede linjen viser den omtrentlige grensen av hodet, og den hvite stiplede boksen indikerer innfelt vist i første gang punkt av F. (F) Serie av tidspunkter tatt på 30 min intervaller i bakhjernen fra E. Over en periode på 1,5 timer kunne to blå celler indikert av de hvite pilhodene observeres flytte til den apikale overflaten og gjennomgår mitose, noe som tyder på en klone som inneholder to stamceller. Skalabar = 20 μm (A), 25 μm (C) og 20 μm (F). I A–D er dorsal oppe og rosenkransen er til venstre. I E og F er rostral til venstre. I alle bilder er dTomato kodet som rød, YFP er kodet som grønn, og CFP er kodet som blå. Bilder gjengitt med tillatelse fra Brockway et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Tidsforløp Brainbow imaging viser celler i ventrikulær sone gjennomgå celledød in vivo. (A) Zebrafish hindbrain ved 31 hkf merket med Brainbow (maksimal intensitetprojeksjon som representerer 36 μm). Hvit stiplet boks indikerer innfelt vist i første gang punkt i B. (B) Serie av tidspunkter som viser hindbrain i A med 30 minutter intervaller. Hvitt pilhode i det første panelet viser en lavendelcelle som gjennomgikk apoptose som vist i etterfølgende paneler, indikert ved cellefragmentering etterfulgt av gradvis clearance av apoptotiske kropper. Nærliggende merkede celler virket friske gjennom hele. Dorsal er oppe og rosentral er til venstre. Skalabar = 20 μm (B). I alle bilder er dTomato kodet som rød, YFP er kodet som grønn, og CFP er kodet som blå. Bilder gjengitt med tillatelse fra Brockway et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en metode for å visualisere kloner av stamceller og nevroner i den utviklende sebrafisk hindbrain og følge dem in vivo ved hjelp av Brainbow og time-lapse confocal mikroskopi11. Den store fordelen med denne protokollen i forhold til in vitro eller ex vivo studier er evnen til å direkte observere den proliferative sonen av virveldyr hjernen i sitt naturlige miljø over tid. Denne teknikken bygger på tidligere studier som merket en enkelt klone ved hjelp av retrovirale vektorer. I motsetning, bruk av hsp:Zebrabowkonstruere fargekoder mange kloner samtidig, slik at multipleks avstamning sporing og fokus på dynamikk blant kloner11. Denne protokollen kan endres for å fokusere på utvikling i andre systemer eller celletyper. For eksempel kan forskjellige Brainbow konstruksjoner uttrykkes i sebrafisk embryoer. Bruk av sebrafisk hsp70 promotor i hsp:Zebrabow vil resultere i mosaikk merking av en rekke celletyper etter varmesjokk, inkludert nevrale stamfarer og nevroner11, og gir forskere temporal kontroll over genuttrykk29. Det bør bemerkes at bruk av varmesjokkarrangøren konsekvent merker fargekodede kloner, mens andre arrangører kanskje ikke klart avgrense celleavstamning på denne måten. Når klonal identitet ikke er en interessefaktor, kan konstruksjoner som bruker andre arrangører, brukes til å merke bestemte celletyper. For eksempel kan neuroD-arrangøren brukes til å merke umodne nevroner18,49. I tillegg, i stedet for å utføre mikroinjeksjoner, kan forskere velge å bruke transgen Brainbow sebrafisk, inkludert linjer som Tg (ubi:Zebrabow)15 og Tg (nevrod:Zebrabow)18. I dette tilfellet, krysser til linjer som uttrykker Cre rekombinase, for eksempel Tg (hsp: Crea134)15, produsere uinjisertembryoer som samles inn og vedlikeholdes på en lignende måte. Mens denne protokollen er utformet for å bilde fisk mellom 1-3 dpf, for å falle sammen med den store perioden med utviklingsnevrogenese50, kan sebrafisk opprettholdes lenger avhengig av utviklingsstadiet av interesse. Varmesjokk for å indusere Brainbow-uttrykk før 24 hkf kan imidlertid være mer skadelig for embryoer51. Avhengig av alder og vev av interesse, ulike monteringsstrategier vil være hensiktsmessig å ha målrettet vev orientert riktig.

Det finnes en rekke trinn som kan kreve feilsøking, spesielt hvis det gjøres endringer i protokollen. Konsentrasjonen av DNA, bolus størrelse injisert, og total mengde DNA levert per embryo kan alle justeres hvis Brainbow uttrykket er dim eller sparsom eller hvis embryoer ikke vises sunt. I tillegg kan lengden og tidspunktet for varmesjokktrinnet endres hvis ønsket uttrykk ikke oppnås. Anskaffelsesparametrene som brukes i bildebehandling vil variere avhengig av laserlinjer og filtre tilgjengelig, samt lysstyrken på uttrykk, montering og type analyse ønsket. I tillegg må tidsforløpsparametrene justeres avhengig av hastigheten på hendelsene av interesse og tiden må skaffe en enkelt Z-stack. Et av de mest kritiske trinnene i protokollen er riktig montering av fisken i agarose: hvis fiskerens vinkel er upassende eller hvis fisken er dekket av for mye agarose, vil optimal bildebehandling ikke være mulig. Optimalisering av denne teknikken kan ta litt øvelse. I tillegg er det ofte nyttig å montere flere fisk før bildebehandling, da det kan være vanskelig å fastslå om montering er hensiktsmessig før du ser FP-uttrykk på selve konfokalmikroskopet. Et annet kritisk skritt er screening og valg av den spesifikke fisken som skal avbildes. Hvis du utfører mikroinjeksjoner, kan lysstyrke, merkingstetthet og Brainbow-kopieringsnummer variere betydelig blant fisk. Bilder tatt i fisk med dim merking, altfor tett merking, eller et lavt kopinummer som resulterer i få farger kan være vanskeligere å analysere.

Med denne protokollen har vi vært i stand til å kontinuerlig bilde levende sebrafisk opp til 16 t11. Denne tiden kan begrenses av E3-fordampning fra bildekammeret, veksten av fisken ut av planet av bildebehandling, død eller bevegelse av fisken, eller brukerbegrensninger på konfokalmikroskoptid. Fordampning kan reduseres ved bruk av et temperaturkontrollert tilbehør på mikroskopstadiet. Det bør bemerkes at 5D-datasettene som genereres ved hjelp av denne tilnærmingen, har en tendens til å være store filer som krever betydelig harddiskplass (f.eks. opp til ~ 100 GB for en overnattingstidsforløp) og tilstrekkelig datakraft til å analysere.

Denne protokollen veileder forskere til å visualisere fargekodede kloner i en populasjon av nevrale forfedre og datternevroner i den utviklende sebrafiskhjernen og spore dynamikken over tid. En mulig utvidelse er kombinasjonen av Brainbow time-lapse imaging med langt rød FP-merking for å vurdere rollene til spesifikke gener i utvikling18. På denne måten kan kloner som uttrykker manipulerte gener visualiseres i en distinkt farge, spores over tid, og sammenlignet med Brainbow-merkede, ikke-manipulerte nabokloner. In vivo flerfarget avbildning kan brukes til å ta opp viktige mekanistiske spørsmål om hvordan nervesystemet former og fungerer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Y. A. Pan, J. Livet og Z. Tobias for tekniske og intellektuelle bidrag. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (Award 1553764) og M.J. Murdock Charitable Trust.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL transfer pipette (fine tip) Globe Scientific, Inc. 134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Alfa Aesar L06690 Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50 mL conical tubes Corning 352070 For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing line SecureLine NMT250 For making embryo manipulators
7.5 mL transfer pipet Globe Scientific, Inc. 135010
CaCl2 Sigma C3881 For E3
Cotton swabs Puritan 867-WC NO GLUE For making embryo manipulators
Cre recombinase New England Biolabs M0298M
Digital dry bath Genemate 490016-616 Used to store LMA at 42 °C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubes World Precision Instruments TW100F-4
Incubator Forma Scientific 3158 To maintain embryos at 28 °C
Injection plate molds Adaptive Science Tools TU-1
Isotemp water bath Fisher Scientific 2320 For heat shocking embryos
KCl AMRESCO 0395 For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscope Zeiss LSM710
LE agarose Genemate E3120 To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA) AMRESCO J234
Mating tanks Aquaneering, Inc. ZHCT100
Methylene blue Sigma M9140 For E3
MgSO4 Sigma 9397 For E3
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
MS-222 Tricaine-S Western Chemical, Inc. Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaCl J.T. Baker 4058-01 For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm) Genesee Scientific 32-107G To house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol red Sigma P0290
Soft stitch ring markers Clover Needlecraft, Inc. 354 For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control) Loctite 1363589 For making embryo manipulators
Syringe needles Beckton Dickinson BD329412 For dechorionating embryos

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
  2. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, (6821), 714-720 (2001).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  5. Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
  6. Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
  7. Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297, (5580), 365-369 (2002).
  8. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146, (1), 18-36 (2011).
  9. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
  10. Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16, (11), 647-659 (2015).
  11. Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453, (2), 130-140 (2019).
  12. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, (7166), 56-62 (2007).
  13. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199, (2), 293-306 (2015).
  14. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81, (3), 505-520 (2014).
  15. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  16. Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
  17. Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
  18. Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30, (4), 491-505 (2019).
  19. Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
  20. Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, (3), 1164-1169 (2011).
  21. Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
  22. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33, (11), 5027-5039 (2013).
  23. Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
  24. Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36, (6), 1823-1840 (2016).
  25. Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. Springer. Cham, Switzerland. 41-49 (2017).
  26. Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
  27. Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4, (1), (2017).
  28. Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
  29. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
  30. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1, (8), 635-647 (1988).
  31. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
  32. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255, (5043), 434-441 (1992).
  33. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362, (6421), 632-635 (1993).
  34. Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17, (6), 2088-2100 (1997).
  35. Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
  36. Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
  37. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21, (17), 6772-6781 (2001).
  38. Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458, (7237), 501-504 (2009).
  39. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  40. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53, (2), 161-168 (2012).
  41. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
  42. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  43. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. (2017).
  44. Smith, M. R. Ternary: an R package to generate ternary plots. (2017).
  45. Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27, (38), 10143-10152 (2007).
  46. Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
  47. Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
  48. Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
  49. Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18, (4), 333-344 (1999).
  50. Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4, (5), 669-679 (1990).
  51. Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics