Uso de Imunoensaios de Eletroforese Capilar para Procurar Potenciais Biomarcadores de Esclerose Lateral Amiotrófica em Plaquetas Humanas

Neuroscience
 

Summary

Biomarcadores à base de sangue para doenças neurodegenerativas são essenciais para a implementação de estudos clínicos em larga escala. Um exame de sangue confiável e validado deve exigir um pequeno volume amostral, bem como ser um método de amostragem menos invasivo, acessível e reprodutível. Este artigo demonstra que a eletroforese capilar de alto ato de ponta faz a que satisfaz critérios para o desenvolvimento potencial de biomarcadores.

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Sage, J. M., Hall, L., McVey, A., Barohn, R. J., Statland, J. M., Jawdat, O., Dimachkie, M. M., Agbas, A. Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets. J. Vis. Exp. (156), e60638, doi:10.3791/60638 (2020).

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Abstract

O imunoensaio de eletroforese capilar (CEI), também conhecido como tecnologia ocidental capilar, está se tornando um método de escolha para o rastreamento de proteínas e medicamentos relevantes para doenças em ensaios clínicos. Reprodutibilidade, sensibilidade, requisito de volume de amostras pequenas, anticorpos multiplexantes para rotulagem múltipla de proteínas na mesma amostra, capacidade automatizada de alto throughput para analisar até 24 amostras individuais e exigência de curto tempo fazer CEI vantajoso sobre o imunoensaio de mancha ocidental clássico. Existem algumas limitações desse método, como a incapacidade de utilizar um gel de gradiente (4%-20%) matriz, alta formação com amostras biológicas não refinadas e indisponibilidade comercial de reagentes individuais. Este artigo descreve um método eficiente para executar CEI em uma configuração de ensaio múltiplo, otimizando a concentração de proteínas e a titulação primária de anticorpos em uma placa de ensaio e fornecendo modelos fáceis de usar para preparação de amostras. Também são descritos métodos para medir a panela TDP-43 e o derivado TDP-43 fosforlado em citosol de lisato como parte da iniciativa no desenvolvimento biomarcador à base de sangue para doenças neurodegenerativas.

Introduction

O objetivo geral do CEI como descrito aqui é fornecer um protocolo atualizado para analisar proteínas-alvo em plaquetas humanas. Atribuição de uma molécula de assinatura baseada no sangue é uma das tarefas mais importantes no campo do desenvolvimento biomarcadores em doenças neurodegenerativas humanas, como a doença de Alzheimer (DD), esclerose lateral amiotrófica (ELA), lobar frontotemporal degeneração (FTLD), Doença de Parkinson (DP), miosite corporal de inclusão (IBM) e outras condições patológicas relevantes para agregação de proteínas. A detecção de quantidades minúsculas de tais proteínas de assinatura em grandes volumes de sangue com muitos agentes interferindo é um desafio. Portanto, a especificidade, sensibilidade, capacidade de lidar com um grande número de amostras e a reprodutibilidade do método selecionado são cruciais.

Plaquetas humanas podem servir como um meio para identificar e atribuir potenciais proteínas biomarcadores para doenças neurodegenerativas. Plaquetas oferecem a oportunidade de servir como um modelo de célula primária substituta, que reflete algumas características das células neuronais1,2,3. Existem certas características que fazem das plaquetas um dos meios preferidos para analisar proteínas de candidatos biomarcadores e seus derivados químicos. Em primeiro lugar, as plaquetas podem ser facilmente adquiridas usando uma abordagem menos invasiva coletando sangue de doadores (ou seja, vefuratura) ou em grandes volumes de bancos de sangue comunitários. Em segundo lugar, as plaquetas podem ser facilmente isoladas de todo o sangue com trabalho preparatório mínimo em laboratórios minimamente equipados4,5. Terceiro, plaquetas não têm núcleos; portanto, são uma boa célula modelo para estudar alterações no metabolismo sem regulamentação transcricional. Em quarto lugar, o teor biomolécula de plaquetas é encapsulado; portanto, o microambiente plaquetário protege seu conteúdo de substâncias que interferem no soro (ou seja, proteases). Em quinto lugar, o plasma enriquecido com plaquetas pode ser armazenado em temperatura ambiente por 7-8 dias sem perder a atividade metabólica. Portanto, as plaquetas fornecem um modelo de trabalho no qual fatores externos são minimizados e controlados.

Técnicas tradicionais de imunoensaio, como imunocoagulação (por exemplo, manchas ocidentais) e ensaio imunosorbent ligado à enzima (ELISA) são mais amplamente utilizadas em análises específicas de proteínas. No entanto, esses dois métodos têm várias desvantagens, incluindo múltiplas etapas de ensaio, exigência de produtos químicos perigosos e reagentes, grande tamanho amostral, problemas com reprodutibilidade de ensaios e variabilidade sem dados inter-executados. Isso motivou o desenvolvimento de um método mais simples, com menos passos e alcançável em um período relativamente curto. Embora a técnica clássica de manchas ocidentais continue sendo um método de laboratório popular, seu procedimento multi-passos, suprimentos, resíduos tóxicos (ou seja, acrilamida, metanol, etc.) e o tempo de ensaio estão se tornando menos desejáveis ao realizar quantitativo de alto grau análise proteica.

Uma abordagem automatizada do CEI está gradualmente se tornando um método de escolha para laboratórios que realizam ensaios de proteína de alto porte6. O CEI elimina a necessidade de gel, aparelhos de eletroforese de gel, membranas, eletroforese e dispositivos de eletrotransferência, e mais envolvimentos de manuseio físico. Se bem projetado, um ensaio CEI deve ser concluído dentro de aproximadamente 3,5 h, incluindo análise quantitativa de dados, eletropherograma de qualidade de publicação e gráficos com análise estatística. Outra superioridade do sistema CEI é a exigência de concentração de proteínas 10x-20x menos, tornando-o ideal para uso em amostras humanas utilizadas em ensaios clínicos7,8.

A parte mais crítica do CEI é otimizar as condições de ensaio para cada anticorpo comprado de diferentes fornecedores, tipo de anticorpo (monoclonal vs. policlonal), concentrações de proteínas ideais, preparação amostral, temperatura de desnaturação amostral e tensão de eletroforrese aplicada nos capilares. Desenvolvemos um método de otimização de formato de ensaio único para o CEI que deve ser implementado antes de quaisquer novos ensaios, o que economizará tempo e recursos. Esta etapa de otimização é seguida por uma avaliação quantitativa automatizada de derivativo total e fosforilado da proteína de ligação de dna/RNA de resposta transativa (TARDP). Devido ao seu tamanho (43 kDa), a sigla TDP-43 será usada ao longo deste papel. Aqui, a proteína TDP-43 em lisato de plaqueta humana obtida de pacientes com ELA são avaliadas para ajudar a desenvolver o valor preditivo de fosforilação (PPV) como um potencial biomarcador prognóstico.

TDP-43 é um novo potencial candidato a biomarcador de doenças para A ELA. TDP-43 é uma proteína onipresente em todas as células nucleadas; portanto, foraminvestigadasas funções do TDP-43 durante diversos eventos celulares normais e em doençaneurodegenerativa9,10,11,12,13,14. Embora o TDP-43 seja uma proteína nuclear15, tem a capacidade de entrar e sair entre o núcleo e o citoplasma devido à presença de sequências de localização nuclear e exportação nuclear16,17,18,19. O TDP-43 citoplasmático está envolvido em diversos eventos celulares, como estabilidade e transporte mRNA, resposta ao estresse, função mitocondrial, autofofômio20. No entanto, pouco se sabe sobre o papel dos derivados fosforilados do TDP-43 além de seu envolvimento na patogênese da doença neurodegenerativa21.

Este protocolo ilustra como otimizar as condições de ensaio para analisar o conteúdo do TDP-43 e seu derivado fosforilado em plaquetas usando a abordagem CEI. Como o TDP-43 fosforilado não está disponível comercialmente, propõe-se usar um valor preditivo de fosforryilação (PPV) para avaliar perfis TDP-43 em pacientes com ELA. Este sistema CEI utiliza um pequeno volume de mistura de amostra (2,5-3,0 μL por capilar). A configuração total do volume de ensaios é de 8,0 μL por capilar com base no protocolo do fabricante; portanto, os pesquisadores podem utilizar uma preparação de mistura de amostras para duas corridas separadas. O fabricante projetou o protocolo de ensaio para que quaisquer erros de tubulação sejam minimizados, se não totalmente eliminados. As 24 misturas individuais de amostras de plaquetas humanas são divididas em meio volume (ou seja, 2,5-3,0 μL por amostra) e analisadas consecutivamente por dois anticorpos diferentes dentro de ~7 h. O sistema CEI descrito aqui fornece uma desejável modalidade de ensaio de alto desempenho. Os usuários precisam testar anticorpos de diferentes fornecedores e modalidades de preparação de amostras para a proteína-alvo antes de realizar triagem em larga escala.

Protocol

Todos os protocolos relativos ao processamento de plaquetas humanas seguem as diretrizes tanto do Centro Médico da Universidade do Kansas quanto dos comitês irb da Universidade de Medicina e Biociências de Kansas City.

1. Preparação de buffers e reagentes

NOTA: Prepare todas as amostras de acordo com as diretrizes do fabricante. Use equipamentos de proteção individual (jalecos, luvas e óculos) durante este procedimento.

  1. Prepare o tampão de lavagem de citrato combinando 0,941 g de sacarose (concentração final de 11 mM), 6,4 mL de 5 M NaCl (final de 128 mM), 5,4 mL de 0,2 M NaH2PO4 (4,3 m Final de MM), 9,4 mL de 0,2 M Na2PHO4 (final de 7,5 mM), 0,352 g de citrato de sódio (final de 4,8 mM) e 0,115 g de ácido cítrico (final de 2,4 mM). Ajuste o volume total para 250 mL com ddH2O. Filtrar através de um disco de filtro de 0,45 μm e ajuste o pH para 6,5. Guarde até 1 ano a 4°C. Traga a temperatura ambiente de solução (RT) antes do uso22.
  2. Prepare o tampão de ruptura combinando sacarose de 250 mM, 1 mM EDTA e 10 mM Tris-Cl (pH 7.4) em um volume final de 100 mL. Guarde até 1 ano a 4°C. Adicione 2 μL de coquetel inibidores de fosfatase (1:1000 final) e 1 μL de coquetel inibidores protease (1:2000 final) em 2 mL de tampão de ruptura. Mantenha no gelo até usar. Descarte o tampão de ruptura não utilizado.

2. Isolamento plaqueta

  1. Coletar 8-10 mL de sangue humano em tubo de coleta de sangue de tampa amarela contendo solução ácido-citrato-dextrose (ACD) (75 mM trissódico citrato, 124 mM dextrose, e 38 mM ácido cítrico, pH = 7,4; ACD:sangue = 1:9). Misture suavemente o conteúdo do tubo 5x-6x invertendo à mão.
  2. Centrífuga os tubos a 200 x g em um rotor de balde balançando por 20 min na RT.
  3. Colete plasma rico em plaquetas (PRP) (~3-4 mL) em um tubo inferior cônico de 15 mL e deixe aproximadamente 0,5 mL do PRP do casaco polido (fração de aparência nebulosa) para evitar contaminação. Se ocorrer alguma contaminação de glóbulos vermelhos, repita esta etapa.
  4. Centrífuga as amostras de PRP a 1.200 x g por 15 min na RT.
  5. Lave as pelotas de plaquetas (P1) por resuspensão suave em 1 mL de tampão de lavagem de citrato e pelota por centrífuga a 1.200 x g por 15 min na RT.
  6. Guarde a pelota de plaqueta pura. Descarte o supernatante.
  7. Resuspender as pelotas de plaquetas em 600 μL do tampão de ruptura contendo coquetéis inibidores.
  8. Sone a suspensão da plaqueta usando um sônico. Coloque a amostra em um mini balde de gelo. Ajuste o sônico na configuração 3 para 20 s no modo contínuo.
    NOTA: Certifique-se de limpar a sonda com 10% de alvejante seguido de água destilada.
  9. Centrífuga as amostras sônicas a 20.000 x g por 30 min a 4 °C para remover frações membrantórias. Supernatants aliquot em 60 μL e armazenar a -80 °C. Evite ciclos de descongelamento/congelamento repetidos para as frações citosólicas plaquetas.

3. Preparação para CEI

NOTA: 100 μL de lisato de plaqueta humana foi combinado de pacientes com ELA (n = 8-10), e indivíduos saudáveis (n = 8-10) foram agrupados separadamente e utilizados para a otimização de ensaios.

  1. Preencha os modelos gerados internamente para o layout cei (Tabela 1) e preparação de amostras (Tabela 2). A tabela de preparação da mistura de amostras é dinâmica e calculará automaticamente quanto volume precisa ser removido da fonte.
    NOTA: Quando o volume de fonte necessário inserido na tabela dinâmica-2, o volume de buffer de amostra 0,1 X será calculado automaticamente.
  2. Tubos PCR pré-rótulo 25 0,2 mL com capilares #1-#25 e colocá-los em um rack PCR. Coloque no gelo.
  3. Tubos de microcentrífuga de 0,6 mL pré-rótulo: um para cada anticorpo primário e diluição (se necessário) a ser usado, um para o tampão de amostra de 0,1x, um para o luminol-S/peróxido e um para cada amostra ser diluído (se necessário). Coloque-os no gelo no rack de tubo.
  4. Tire o buffer de amostra, tampão de lavagem, uma placa e um cartucho fornecidos no módulo de separação CEI 12-230 kDa módulo de separação do kit mestre.
  5. A partir da geladeira 4 °C, retire o tampão de diluição anticorpo, anticorpos primários, anticorpos secundários, luminol, peróxido de hidrogênio e pacote padrão. Coloque todos os reagentes no gelo, exceto o pacote padrão, que permanece na RT.
    NOTA: Os reagentes das embalagens padrão são liofilizados e selados com uma tampa de papel alumínio. Estes devem ser girados para baixo brevemente usando uma mini centrífuga antes de abrir para reduzir a perda do produto. Para abrir, os tubos de reagente podem ser perfurados por uma ponta de pipette ou puxados para trás do canto.
  6. Para preparar o DTT de 400 mM, adicione 40 μL de água deionizada ao tubo claro contendo o DTT.
  7. Para preparar 40 μL de mistura master fluorescente de 5x, adicione 20 μL do buffer de amostra de 10x e 20 μL da solução DTT preparada de 400 mM para o tubo rosa fornecido no kit.
  8. Para preparar a escada biotinylated, adicione 16 μL de água desionizada, 2 μL de tampão de amostra de 10x e 2 μL da solução DTT preparada de 400 mM para o tubo branco fornecido no kit. Misture suavemente e transfira em um tubo PCR de 0,2 mL para desfazer.
  9. Prepare o buffer amostral de 0,1x adicionando 1,5 μL de tampão de amostra de 10x e 148,5 μL de água desionizada a um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL. Vórtice para misturar e colocar no gelo.
  10. Prepare as diluições desejadas de anticorpos. Adicione diluente anticorpo em volumes designados a cada tubo de microcentrífuga pré-rotulado. Se os volumes forem idênticos, use a técnica de tubulação reversa23; se não, pré-enxaguar a ponta de pipeta antes de dispensar.
    NOTA: Neste ensaio, foram utilizados anticorpos TDP-43 e a-p (S409/410-2) anticorpo TDP-43. O anticorpo anti-ERK foi usado para um controle interno para garantir que os componentes de ensaio estejam funcionando.
  11. Realize a tubulação inversa para diluição de anticorpos conforme descrito abaixo. Alternativamente, podem ser encontradas informações adicionais na literatura24.
    NOTA: A técnica de pipetting reversa é preferida ao dispensar pequenos volumes sequenciais de soluções23. Esta técnica oferece algumas vantagens: (i) fornecer um volume preciso, (ii) eliminando o reagente espumando na ponta orifício, e (iii) ideal para pequenos reagentes de volume (<5 μL), soluções viscosas, soluções surfactantes e soluções com alta pressão de vapor.
    1. Coloque uma dica adequada em uma pipeta e pressione o êmbolo até a segunda parada (Passo-2). Mergulhe a ponta de tubulação alguns milímetros na solução. Solte lentamente o êmbolo para encher a ponta de tubulação com a solução enquanto a ponta ainda está imersa na solução. Retire a ponta da solução e toque delicadamente contra a borda do reservatório de reagente para que o excesso de líquido remanescente na parte externa da ponta seja removido.
    2. Dispense a solução pressionando o êmbolo até a primeira parada (Passo 1). Não dispense a solução restante na ponta.
    3. Esvazie a solução restante na ponta para o reservatório de reagente pressionando o êmbolo para a segunda parada (Passo-2). Solte o êmbolo para a posição pronta para a próxima etapa de pipetting.
    4. Adicione o anticorpo necessário em volumes designados a cada tubo de microcentrífuga pré-rotulado(Tabela 1) Não enxaguar a ponta do tubo: adicione-o diretamente ao diluente e lave a ponta várias vezes para remover o anticorpo. Coloque os tubos no gelo.
  12. Para preparar o mix de amostras CEI, execute as etapas listadas abaixo para tubos PCR rotulados cap#2 através do cap #25: Esta está na mesma ordem que aparece na Tabela 1.
    1. Abra todos os tubos, adicione alíquotas de 1,6 μL de tampão de amostra fluorescente de 5x a cada tubo usando uma técnica de tubulação reversa e, em seguida, feche cada tubo PCR sobre a adição do buffer de 5x para minimizar a perda de amostra.
    2. Abra todos os tubos, adicione tampão de amostra de 0,1x em volumes designados na Tabela 2 para cada tubo e, em seguida, feche imediatamente depois. Se os volumes forem idênticos, use uma técnica de tubulação reversa. Se não, a ponta de tubo pré-enxaguar antes de dispensar o buffer de amostra de 0,1x.
    3. Abra todos os tubos, adicione amostra de proteína em volumes designados na Tabela 2 a cada tubo e feche imediatamente depois. Se os volumes forem idênticos, use técnica de tubulação reversa. Se não, a ponta de tubo pré-enxaguar antes de dispensar o buffer de amostra de 0,1x.
    4. Brevemente centrífuga todos os tubos PCR em uma centrífuga bancada (13.000 x g para 30 s), tubos PCR de flick/vórtice para misturar, em seguida, repita a centrífuga.
    5. Transfira todos os tubos PCR para o termociclor com uma tampa aquecida. Amostras de denatureza em temperatura e duração definidas (ou seja, 95 °C por 5 min; 70 °C para 10 min).
      NOTA: A temperatura e a duração da denaturação precisam ser otimizadas para a proteína-alvo.
    6. Repita o passo 3.12.4.
    7. Devolva todos os tubos PCR ao rack de tubo e coloque no gelo.
    8. Durante a etapa de desmembração, prepare a solução de desenvolvimento (solução 1:1 luminol-S:peróxido), em seguida, adicione 200 μL de luminol-S e 200 μL de peróxido. Coloque no gelo.
    9. Para carregar uma placa pré-preenchida cei com a amostra preparada acima, dispense reagentes e amostras na placa de ensaio mostrada no layout de ensaio(Figura 1). Evite introduzir bolhas de ar.
      NOTA: Se os volumes e a solução forem idênticos, use uma técnica de pipetagem reversa. Se não, pré-enxaguar a ponta de pipet antes de dispensar e não expela o restante para o poço da placa usando a segunda parada de guia na pipeta. Um módulo de separação de 12-230 kDa pode conter um guia de carregamento de placas codificado por cores. Coloque este guia a placa enquanto adiciona reagentes e amostras ao poço, o que ajuda visualmente ao carregar amostras. O guia de carregamento de placas também pode ser baixado no site da empresa.
      1. Na linha E, adicione 15 μL de mistura de luminol:peróxido para cada poço.
        NOTA: Idealmente, prepare este reagente pouco antes de usar e adicione a cada poço. Se isso não for conveniente, esta mistura pode ser preparada não mais de 30 min antes do carregamento da placa.
      2. Na linha D, para bem D1, adicione 10 μL de streptavidin-HRP.
      3. Na linha D, para poços D2-D25, adicione 10 μL de anticorpo secundário designado.
      4. Na linha B, para cada poço, adicione 10 μL de diluente anticorpo.
      5. Na linha C, para bem C1, adicione 10 μL de diluente anticorpo.
      6. Na linha C, para poços C2-C25, adicione 10 μL de anticorpo primário designado.
      7. Na linha A, para bem A1, adicione 5 μL de escada biotinylated do tubo PCR #1.
      8. Na linha A, para poços A2-A25, adicione 3 μL da amostra, tubos PCR #2-#25 em poços correspondentes #2-#25.
      9. Adicione 500 μL de tampão de lavagem a cada poço de tampão de lavagem designado.
      10. Centrífuga a placa por 5 min a 1.000 x g na RT.

Figure 1
Figura 1: Layout de ensaio. Tanto a otimização de anticorpos primários quanto a amostra de proteína alvo podem ser realizadas em um ensaio. Capilares 2-7, 8-13, 14-19 e 20-24 representam várias concentraçãos proteicas e alcance primário de anticorpos. Capilar 25 representa controle positivo. Anti-ERK anti-ERK foi usado; no entanto, qualquer controle positivo apropriado pode ser incluído. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

4. Realizar o CEI na placa 1

  1. Primeiro, ligue o analisador cei (Tabela de Materiais) e, em seguida, ligue o computador. Abra o software (Tabela de Materiais)
  2. Conecte o analisador ao sistema online (Tabela de Materiais). Este é um passo necessário para coletar os dados de execução para fins de filmagem de problemas e recuperação de dados.
  3. Clique no Instrumento do menu superior esquerdo e clique em Conectar. Selecione o número de série do instrumento que aparece como um menu pop-up. Clique em Conectar-se.
  4. Selecione a guia "Ensaio" e selecione Novo Ensaio ou selecione um modelo salvo.
  5. Parâmetros de ensaio de entrada(Tabela 1) ou modificar o modelo atualmente. Salve o nome do arquivo e a localização.
  6. Certifique-se de que o indicador de cor azul piscando no analisador permanece azul sólido.
  7. Toque no botão de metal prateado em cima da porta laranja para abrir.
  8. Remova cuidadosamente o cartucho capilar de sua embalagem. Insira o cartucho capilar conforme descrito pelo protocolo do fabricante. Se corretamente instalada, a luz interna vira -se para "azul".
  9. Remova o selo protetor da placa de ensaio. Observe visualmente os poços pré-preenchidos para bolhas de ar. Se observado, coloque-os com uma pequena ponta de tubulação (ponta de tubulação P10 de eixo longo funciona bem).
  10. Carregue o suporte da placa colocando a placa de ensaio e feche a porta. No computador, clique no botão Iniciar.
    1. Coloque a bandeja de gelo contendo reagentes sensíveis à temperatura e amostras no escuro a 4 °C até que esteja pronta para preparar a segunda placa pré-preenchida.
    2. Deixe reagentes/suprimentos à temperatura ambiente para a segunda placa.

5. Realizar o CEI na placa 2

NOTA: Esta placa é definida para analisar os níveis de TDP-43 fosforilado.

  1. Remova a bandeja de gelo armazenada a 4 °C e coloque-a no banco, 1h antes do tempo estimado de conclusão da primeira placa. Recupere uma segunda placa e um cartucho.
  2. Prepare as diluições de anticorpos necessárias para a segunda corrida e guarde-as no gelo. Prepare a solução de 1:1 luminol-S:peróxido (passo 3.12,8 acima).
  3. Remixe e recentríe brevemente o mix de amostras e os reagentes necessários para carregar a placa pré-preenchida. Carregue a segunda placa de acordo com a Figura 1. Carregue a-p (S409-410-2) solução de anticorpos TDP-43 em poços da linha C.
  4. Quando a primeira corrida estiver completa, descarte a primeira placa e o cartucho. Remova o cartucho e coloque em um recipiente afiado para descarte. Mantenha os adesivos da placa e do cartucho para fins de referência.
  5. Feche o arquivo de software e reselecione o mesmo modelo. O software lembrará das configurações da execução anterior. Faça qualquer alteração na anotação conforme necessário (ou seja, alterando o anticorpo primário).
  6. Repita as etapas 4.8-4.10. Guarde todos os reagentes e suprimentos do módulo de separação do módulo de separação do kit master de 12-230 kDa
  7. Descarte sobrando sobre mistura de amostras CEI, diluições de anticorpos, buffer de amostra de 0,1x e misturas de luminol-S:peróxido de acordo com as regulamentações da universidade.

6. Análise de dados

  1. Uma vez concluída a corrida, certifique-se de que as seguintes verificações de qualidade sejam realizadas.
    1. No software, selecione o ícone Mostrar Padrões e a guia Gráfico View. Verifique todos os 25 capilares para os alinhamentos de pico com tamanhos internos de marcadores fluorescentes. Corrija os desalinhamentos selecionando o Force Standard ou clicando com o botão direito no pico incorreto e selecionando Não um Padrão. Faça esta verificação para cada novo capilar.
    2. Clique em Amostras e no ícone Single View. Selecione #1 capilares (escada biotinylated) na aba do experimento. Reveja os alinhamentos de pico aos marcadores de peso molecular. Clique no pico da Visualização do Gráfico e selecione Remover o Pico,se uma seleção incorreta do pico for feita pelo software.
      NOTA: Como exemplo, a escada biotinylated de 12 a 230 KDa mostrará picos de dimensionamento em 12 kDa, 40 kDa, 66 kDa, 116 kDa, 180 kDa e 230 kDa. O dimensionamento dos picos amostrais será incorreto se essa etapa não for realizada e gerará resultados imprecisos.
    3. Veja o filme eletrofótico e note se alguma migração anormal ocorreu durante a execução.
    4. Derivam dados (por exemplo, tabela de picos, incluindo peso molecular, área de pico, altura máxima e sinal-to-noise [S/N]), conforme necessário para novos cálculos. Existem ferramentas de anotação gráfica localizadas no canto superior direito da janela Graph para fornecer mais informações sobre o gráfico.

Representative Results

Otimização da concentração de proteína citosolica plaquetária e titulação primária de anticorpos
É importante estabelecer uma faixa dinâmica linear de proteínas citosolicas plaquetárias no ensaio, uma vez que as mudanças no sinal são diretamente proporcionais às mudanças na proteína no citosol plaquetário. O uso de mistura de lisato de plaqueta inteira no ensaio pode reduzir a intensidade do sinal das proteínas-alvo (TDP-43 e P(S409-412) TDP-43) e contribuir para um sinal de fundo elevado. Portanto, neste ensaio, o supernatante claro foi usado (fração citosólica) após romper plaquetas(Figura 2).

Figure 2
Figura 2: A clareza do sinal depende da qualidade da amostra. (A)Toda a lisada de plaquetas interfere na ligação anti-TDP-43; portanto, observou-se um eletropherograma barulhento. (B) A fração citosolica da plaqueta foi obtida a partir da sujeitatoa total ao lysato à centrífuga (16.000 x g por 30 min). A maioria das proteínas membrantórias foram removidas; portanto, anti-TDP-43 a ligação com proteína TDP-43 foi aprimorada (traço de linha azul). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Uma faixa dinâmica linear para concentração de proteína citosol de plaquetas foi estabelecida em 0,2-0,8 mg/mL. Um modelo de ensaio foi adotado para que tanto a concentração de proteínas quanto a titulação primária do anticorpo pudessem ser realizadas em um ensaio (Figura 3).

Figure 3
Figura 3: Faixa dinâmica linear para concentração de proteína citosol plaquetária. (A)Tanto as concentrações proteicas quanto as titulações de anticorpos foram otimizadas em uma placa durante a mesma corrida. (B) Foi estabelecida a faixa de trabalho linear (0,2-0,8 mg/mL) para proteína. Uma carga proteica de 0,5 mg/mL foi rotulada por anticorpo a-ERK como o controle positivo (capilar 25). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Deve-se notar que o teor de glicerol no tubo de preparação da amostra deve ser inferior a 20% (final), caso contrário, a alta concentração de glicerol afetará negativamente a ligação primária de anticorpos.

Determinando o tempo ideal de exposição
Na versão mais antiga do software, o tempo de exposição ideal teve que ser determinado por traçar área de pico contra a concentração de proteínas (mg/mL). A nova versão fornece uma nova ferramenta chamada perfil de detecção de alto alcance dinâmico(HDR) (Figura 4). O uso do painel de imagem proporcionou a opção de visualizar todos os tempos de exposição (ou seja, 5 s, 15 s, 30 s, 60 s, 120 s, 240 s, 480 s) juntos. O software do computador analisou todos os tempos de exposição e identificou automaticamente o melhor tempo de exposição (HDR). O perfil de detecção de HDR proporcionou um alcance dinâmico significativamente mais amplo devido à maior sensibilidade do CEI, o que significa melhor detecção e quantitação sobre uma faixa de concentração amostral maior. No entanto, os usuários ainda têm a opção de escolher qualquer tempo de exposição que satisfaça o objetivo experimental. Usando este recurso, o tempo ideal de exposição foi encontrado para a proteína TDP-43. O pico representa o tempo ideal de exposição (Figura 4A). Um único tempo de exposição (4 s) foi definido para este anticorpo depois de revisar todos os nove tempos de exposição que variam entre 1-512 s (Figura 4B).

Figure 4
Figura 4: Perfil de detecção de alto alcance dinâmico (HDR) para uma proteína-alvo. (A)O pico da proteína TDP-43 representa o tempo ideal de exposição para a proteína-alvo. a-TDP-43 Ab titulação foi de 1:300, e a concentração de proteína citosol de plaquetas foi de 0,5 mg/mL. A linha azul definida pelo software indica o tempo ideal de exposição. (B ) Este número representa um tempo de exposição única definido pelo usuário (4 s) depois de revisar todos os nove tempos de exposição que variam entre 1-512 s. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Níveis TDP-43 em citosol de plaquetas humanas de pacientes com ELA
Foi realizado um desenvolvimento biomarcador de base sanguínea. Utilizando condições otimizadas de ensaio, foram analisadas frações citosólicas de lisolica de plaquetas obtidas de pacientes com ELA por meio de dois conjuntos de anticorpos (ou seja, anti-TDP-43 [Pan], um anticorpo que reconhece derivados fosforilatados da proteína TDP-43; aqui, a-P [S409/410-2] TDP-43 foi usado). Nesta demonstração, são apresentados TDP-43 específicos para doenças e seu derivado fosforilado (Figura 5).

Figure 5
Figura 5: Uma representação do valor preditivo de fosforryilação (PPV) do TDP-43. A quantidade absoluta de TDP-43 fosforilado e o Pan TDP-43 sozinho sem mostrar muita diferença entre a ELA e os grupos de controle. No entanto, o PPV indicou um ligeiro aumento na coorte da ALS, embora não houvesse diferença estatística entre os dois grupos devido ao número insuficiente de sujeitos (ALS = 25, controle = 27). Um baixo valor d de Cohen entre os meios da ELA e do grupo controle mostrou um baixo tamanho de efeito entre os dois grupos devido ao pequeno tamanho amostral (controle = 25, ALS = 27). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

O TDP-43 total foi quantificado usando a curva de calibração (Figura 6)

Figure 6
Figura 6: Curva de calibração padrão. Concentrações de proteína TDP-43 compradas comercialmente foram usadas para construir uma curva padrão. Cada dado representa a média dos triplicados. As intensidades da banda proteica eram dependentes de concentração (Inset). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

A quantificação da proteína TDP-43 fosforilada não foi possível devido à indisponibilidade comercial dessa proteína. Em vez disso, foi estabelecido um valor de fosforiculação (PPV) previsto que define a porcentagem das espécies fosforilizadas do TDP-43. O PPV foi determinado a partir de dois ensaios sequenciais do CEI para a mesma amostra usando a equação a seguir.

Equation 1

Variabilidade de ensaios intra e inter-executado foram testadas em frações citosólicas de plaquetas als humanas(Figura 7)

Figure 7
Figura 7: Variações de ensaio. (A) Dois capilares carregados com a mesma amostra foram analisados pelo CEI, e a variação de ensaio intra-run foi calculada como CV% = 14,9. (B)A mesma amostra foi analisada em três dias diferentes de ensaio e em três corridas diferentes de ensaio. A variação de ensaio inter-executado foi calculada como CV% = 18,7. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Embora os valores de variação de coeficientes intra-run (variação capilar-capilar) tenham caído na faixa aceitável (CV% = 14,9), o valor de ensaio inter-executado foi relativamente alto (CV% = 18,7). É interpretado que essa variação pode ser devido ao uso de cartuchos capilares e placas de amostra de diferentes lotes. Recomenda-se que os estudos de reprodutibilidade sejam realizados em componentes cei que tenham o mesmo número de lote.

Tabela 1: Modelo de carregamento da placa de ensaio CEI. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Modelo interativo de preparação da mistura de amostras. Após entrar na concentração de proteína de estoque a partir de amostras desconhecidas, as células interativas calcularão automaticamente quanto volume precisa ser usado para preparar o mix de amostras. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussion

O imunoensaio de base eletrofóstica capilar é agora o método de escolha para análise de amostra de alto apito e exames de medicamentos25. Pequenos volumes de amostra, componentes de ensaio bem otimizados, plataforma de ensaio e instrumentação amigável ao usuário, despesas de reagente e baixa porcentagem de CV são vantagens primárias26,27. Embora existam vários métodos para separar proteínas em diferentes modalidades de ensaio, o CEI baseado em anticorpos descrito aqui pode ser adaptado por pequenos laboratórios que estão envolvidos no desenvolvimento de biomarcadores à base de sangue. A tecnologia de ensaio CEI utilizada aqui fornece medições confiáveis, reprodutíveis e sensíveis para TDP-4328 e seu derivado fosforilado5.

O sistema CEI também fornece uma escolha multiplexante de analisar o TDP-43 e seus derivados fosforilados simultaneamente e fornecer a quantificação direta da proteína-alvo, se a proteína-alvo purificada ou recombinante estiver disponível. A proteína TDP-43 recombinante de comprimento completo está disponível comercialmente; no entanto, o derivado TDP-43 recombinante não é. Como o TDP-43 fosforilado não está disponível comercialmente, foi implementado um valor preditivo de fosforryilação (PPV) para avaliar o perfil TDP-43 em pacientes com ELA. Os valores Pan TDP-43 e Fosfórico TDP-43 foram permanentemente rotulados com fluoroforre; portanto, o perfil TDP-43 permanece o mesmo com ou sem unidade quantitativa (ou seja, ng/mL, pg/mL, etc.). Embora determinar a quantidade absoluta de TDP-43 e seus derivados fosforilados (ou seja, P [S409-410-12] TDP-43) fornece uma medição mais quantitativa, calcular o PPV elimina a necessidade do TDP-43 fosforilado recombinante para padronização, uma vez que não está disponível comercialmente.

O CEI fornece vários pontos de verificação na plataforma de ensaios para identificar com precisão o problema no caso de um ensaio falhar. Isso elimina obstáculos e fornece melhor design experimental. O procedimento de ensaio é totalmente automatizado, exceto para o preenchimento da placa de amostra. Esta é uma característica significativa em comparação com a análise padrão de manchas ocidentais. Este recurso fornece consistência do run-to-run. Embora cada laboratório tenha procedimentos operacionais padrão únicos, é importante aderir a práticas que minimizem o erro humano. Por exemplo, é fundamental preparar a mistura luminol-S/peróxido pouco antes do carregamento da placa, uma vez que adicionar peróxido em luminol inicia a reação enzimática e consome o substrato luminol. Carregar amostras e anticorpos primários/secundários em poços de placas sem bolhas de ar também são passos criticamente importantes.

Além disso, uma vez que os poços da placa são pequenos em volume e não há espaço entre poços, os usuários devem ter cuidado durante a tubulação, que é o passo mais importante, já que todo o resto é automatizado. A ordem de carregamento das amostras, anticorpos e outros reagentes é importante para a consistência do ensaio (Figura 1). O processo de preparação da placa leva cerca de 40-45 min. Portanto, recomenda-se primeiro carregar a placa com os componentes de ensaio necessários e preparar a mistura luminol-S/peróxido pouco antes de encanar. Dessa forma, há uma sequência consistente de reagente adicionando, e a força consistente do sinal de luminescência será alcançada. Não é recomendável usar um reagente luminol-S/peróxido expirado, pois afeta principalmente a força do peróxido. Os progressos recentes na introdução do sistema de buffer dividido e incluindo a linha de compatibilidade química e detergente melhoraram a qualidade do ensaio e produziram resultados mais reprodutíveis e previsíveis. Agora, um novo combo-analisador do mesmo fabricante possui uma característica para analisar as amostras rotuladas com quimioriedade e fluorescência anticorpos conjugados na mesma corrida. Este novo recurso elimina a necessidade de executar consecutivamente duas placas individuais e elimina a variação run-to-run.

As placas de ensaio devem ser armazenadas na temperatura ambiente. Se for escolhido manter as placas de ensaio em uma geladeira de 4 °C, as placas devem ser retiradas na noite anterior ao ensaio e levadas à temperatura ambiente. Os poços de amostra carregados incorretamente precisam ser extensivamente (4-5 vezes) lavados com buffer fornecido no kit antes de adicionar a amostra correta. Cada anticorpo primário e amostras biológicas são únicos; portanto, a otimização anticorpo/proteína deve ser realizada antes de analisar as amostras para proteínas-alvo em fluidos biológicos.

Aqui, o tempo primário de incubação de anticorpos foi definido para 30 min por padrão. Se o sinal for fraco, os usuários devem considerar aumentar o tempo de incubação primária do anticorpo até atingir a força de sinal desejada sem o burnout do sinal de fluorescência. Para plaquetas humanas, amostras agrupadas de pacientes foram preparadas e usadas para um ensaio de otimização. A coleta de amostras representa melhor a variação entre as biomoléculas-alvo. Recomenda-se usar supernatantes claros em vez de total lisato ou total homogeneado para o CEI.

A alta concentração de proteína sate integral pode diminuir a relação sinal-ruído(Figura 2). Devem ser evitados ciclos repetidos de congelamento das amostras, pois isso afeta negativamente a ligação primária de anticorpos. Os ingredientes do tampão de lysato são importantes, pois alguns reagentes não são compatíveis com o CEI29. É aconselhável cruzar a lista de reagentes compatíveis fornecidos no site do fabricante antes da preparação da amostra. Esta é uma limitação do sistema que não tolera altas condições de stringência para a preparação da amostra. Recomenda-se otimizar os parâmetros de execução de ensaio (ou seja, diluição primária de anticorpos, concentração de proteínas, tempo de incubação primária de anticorpos, etc.) usando amostras agrupadas para analisar posteriormente as amostras individuais.

Disclosures

Os autores não declaram interesse financeiro concorrente, exceto a ProteinSimple, Inc. cobriu o custo de publicação deste manuscrito.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi patrocinada por uma subvenção intramural concedida para A.A. Este trabalho foi apoiado por uma subvenção da CTSA da NCATS concedida ao Centro Médico de Fronteiras da Universidade do Kansas: O Heartland Institute for Clinical and Translational Research (#UL1TR606381). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não necessariamente representa as opiniões oficiais do NIH ou ncats. Somos gratos pela clínica ALS do Centro Médico da Universidade do Kansas por obter aprovação do IRB para coleta de amostras de sangue de pacientes voluntários saudáveis e da ELA. Os autores agradecem a Emre Agbas pela revisão do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-230 kDa Separation kit ProteinSimple SM-W004 Contains pre-filled assay plate and 25-channel capillary cartridge
3000G Thermocycler Techne FTC3G/02 We used this thermocylcer for heating the sample mix
Anti-Mouse detection kit ProteinSimple 042-205 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-P(S409-410) TDP-43 antibody ProteinTech 22309-1-AP Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-P(S409-412) TDP-43 antibody CosmoBio-USA TIP-PTD-P02 Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-Rabbit detection kit ProteinSimple DM-001 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-TDP-43 (pan) antibody ProteinTech 10782-2-AP Primary antibody that recognizes whole TDP-43 protein
Compass for SimpleWestern (SW) ProteinSimple Ver.4.0.0. Compass for SW is the control and data analysis application for SimpleWestern instruments
Sonic Dismembrator; Model100 Fisher Scientific Sonicator. Used to rupture the cell membrane. This model is discontinued (Model XL2000-350)
Table top centrifuge Eppendorf 22625004 Model# 5810 with swinging plate bucket
Wes analyzer ProteinSimple 55892-WS-2203 Performs the capillary gel electrophoresis

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