Evaluación de la cicatrización aguda de heridas utilizando los modelos de esponja de alcohol de polivinilo subcutáneo dorsal y modelos de herida sin piel de cola excisional.

Immunology and Infection

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Summary

Aquí, se describen dos modelos de cicatrización de heridas murinas, uno diseñado para evaluar las respuestas de cicatrización de heridas celulares y citoquinas y el otro para cuantificar la tasa de cierre de heridas. Estos métodos se pueden utilizar con modelos de enfermedades complejas como la diabetes para determinar los mecanismos de varios aspectos de la cicatrización deficiente de heridas.

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Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, H. L., Albina, J. E., Jamieson, A. M. Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.. J. Vis. Exp. (157), e60653, doi:10.3791/60653 (2020).

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Abstract

La cicatrización de heridas es un proceso complejo que requiere la progresión ordenada de la inflamación, la formación de tejido de granulación, la fibrosis y la resolución. Los modelos murinos proporcionan una valiosa visión mecanicista de estos procesos; sin embargo, ningún modelo solo aborda completamente todos los aspectos de la respuesta de cicatrización de heridas. En su lugar, es ideal utilizar varios modelos para abordar los diferentes aspectos de la cicatrización de heridas. Aquí, se describen dos métodos diferentes que abordan diversos aspectos de la respuesta de cicatrización de heridas. En el primer modelo, las esponjas de alcohol polivinílico se implantan por vía subcutánea a lo largo del dorso del ratón. Después de la recuperación de la esponja, las células pueden ser aisladas por interrupción mecánica, y los fluidos se pueden extraer por centrifugación, lo que permite una caracterización detallada de las respuestas celulares y de citoquinas en el ambiente agudo de la herida. Una limitación de este modelo es la incapacidad de evaluar la tasa de cierre de la herida. Para ello, se utiliza un modelo de escisión de la piel de la cola. En este modelo, una pieza rectangular de 10 mm x 3 mm de piel de cola se extirpada a lo largo de la superficie dorsal, cerca de la base de la cola. Este modelo se puede fotografiar fácilmente para el análisis planimétrico para determinar las tasas de curación y se puede extirpar para el análisis histológico. Ambos métodos descritos se pueden utilizar en cepas de ratón genéticamente alteradas, o en combinación con modelos de condiciones comorbilidades, como diabetes, envejecimiento o infección secundaria, con el fin de dilucidar los mecanismos de cicatrización de heridas.

Introduction

Hay muchos sistemas de modelos murinos disponibles para examinar los procesos de cicatrización de heridas, cada uno posee ventajas y limitaciones específicas1,,2. Los siguientes métodos presentan dos modelos de heridas murinas, cada uno de los cuales aborda un aspecto particular de la respuesta de cicatrización de heridas, y que se pueden utilizar para identificar la causa y el efecto de las perturbaciones en la respuesta a la lesión. El proceso de cicatrización de heridas ocurre en fases distintas. La primera fase es inflamatoria, caracterizada por la rápida afluencia de plaquetas, neutrófilos y monocitos/macrófagos, así como la producción de citoquinas proinflamatorias y quimioquinas. Tras la resolución de la inflamación, el medio ambiente pasa a un estado más reparador con la inducción de citoquinas y factores de crecimiento profisóxicos y proangiogénicos. El tejido de granulación se deposita y los neovasculares se forman con la migración de miofibroblastos, fibroblastos, células epiteliales y células endoteliales. En las etapas finales, se remodela la matriz extracelular provisional, y la formación de cicatrices y el cierre de la herida procede2,3,4,5,6,7,8.

Ningún modelo murino proporciona un sistema para estudiar todas las etapas de la cicatrización de heridas2. Aquí, se describen dos modelos quirúrgicos de heridas: uno aclara las respuestas agudas de cicatrización celular y citoquina, y el otro permite la evaluación del cierre de la herida, así como análisis histológicos. Estos dos métodos pueden emplearse de manera complementaria para evaluar los efectos de una perturbación o comorbilidad en diferentes aspectos de la respuesta de cicatrización de heridas. La implantación dorsal subcutánea de esponjas de alcohol polivinílico (PVA) es un sistema que se ha utilizado en modelos de roedores durante décadas para esclarecer numerosos aspectos de las respuestas celulares y granulados de tejidos9,,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Este enfoque permite la recuperación de líquidos de heridas ricos en citoquinas e infiltrados celulares. En este modelo, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm trozos de esponja PVA se colocan en bolsillos subcutáneos a través de una incisión de 2 cm realizada en la línea media dorsal posterior. La incisión se cierra con clips quirúrgicos, y las esponjas se pueden recuperar en puntos de tiempo posteriores para el aislamiento celular y fluido. El ambiente celular y citoquina de las esponjas aisladas refleja las etapas normales de la cicatrización aguda de heridas hasta unos 14 días después de la implantación. En los puntos de tiempo posteriores el modelo es más ventajoso para el estudio de la formación de tejido de granulación y la respuesta del cuerpo extraño1. Con este sistema, es posible aislar >106 células, lo que ofrece una clara ventaja para ensayos fenotípicos y funcionales y aislamiento de ARN, sobre células de aislamiento de otros métodos basados en biopsias1,22,23,25,26.

La tasa de cierre de la herida se determina utilizando el modelo de escisión de la piel de la cola. En este modelo, como se describe inicialmente por Falanga et al. e informado por otros27,28,29,30, una sección de espesor completo de 1 cm x 0,3 cm de la piel de la cola se elimina cerca de la base de la cola. El área de la herida se visualiza fácilmente y se puede medir con el tiempo. Alternativamente, el tejido de la cola se puede aislar para el análisis histológico. Este enfoque se puede utilizar como una alternativa o en conjunto con el método de biopsia de punzonado dorsal bien establecido. Las principales distinciones entre estos dos modelos son la tasa de cierre de2la herida, la presencia o ausencia de piel, y la estructura de la piel2,31,,32. Las heridas de la piel de la cola ofrecen un plazo más largo para evaluar el cierre de la herida, ya que se necesitan aproximadamente 21 días para que se produzca un cierre completo. Esto se opone a las biopsias de punzón dorsal sin esplinar, que sanan mucho más rápido (7-10 días), principalmente por contracción debido a la acción del panniculus carnosus. Las biopsias de punzón dorsal astillado sanan más lentamente y disminuyen los efectos de la curación contráctela, pero dependen de la presencia de un cuerpo extraño para restringir los mecanismos basados en contrámenes1,,2,27,30,31,33.

Los modelos de heridas descritos son informativos para entender los procesos normales de cicatrización de heridas en ausencia de perturbación. Mientras que la curación de la piel de los roedores difiere de maneras muy significativas de la piel humana, incluyendo la estructura suelta, la dependencia de la curación contráctea, y otras diferencias anatómicas, el sistema murino ofrece ciertas ventajas para los estudios mecanicistas y de cribado. El principal de ellos es la disponibilidad de cepas endogámicas y mutantes genéticos, la tractabilidad genética y un menor costo. La visión mecanicista obtenida de los estudios murinos se puede traducir a modelos animales complejos que imitan más de cerca la cicatrización de la piel humana, como el sistema porcino2,,31.

Además de examinar las respuestas de cicatrización de heridas en el estado estacionario, estos modelos se pueden combinar con condiciones comorbilidades para entender la base de los defectos de cicatrización de heridas a nivel celular, citoquina y tejido bruto. Es en este entorno particular que los dos modelos se pueden utilizar en concierto para evaluar los efectos de una condición comorbilidad particular, como la neumonía postoperatoria, tanto en la respuesta de cicatrización de heridas celulares agudas como en la tasa de cierre de la herida30.

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Protocol

Todos los estudios en animales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Brown y llevados a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de los Institutos Nacionales de Salud.  NOTA: en el vídeo, la cortina quirúrgica se ha omitido con fines de demostración.

1. Implantación subcutánea de esponjas de PVA

  1. Utilice tijeras para cortar láminas de esponja PVA en piezas de 8 mm x 8 mm x 4 mm. Rehidrata los trozos de esponja de PVA sumergiéndolas en 1pbS estéril en un vaso de precipitados.
  2. Autoclave las esponjas en 1x PBS para esterilizar, y enfriar completamente. Almacene las esponjas autoclavedas en 1pbS estéril a 4 oC.
  3. Antes de realizar la implantación quirúrgica, alícuota el número necesario de esponjas en un plato de cultivo estéril en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Almacene las esponjas adicionales en 1pbS estéril a 4 oC para su uso futuro. Asegúrese de que las esponjas se hinchan hasta 1 cm x 1 cm x 0,5 cm después de la rehidratación. En la Figura 1Ase muestra una imagen de las esponjas de PVA deshidratadas.
    NOTA: Para mantener la esterilidad del sitio quirúrgico, el procedimiento de implantación de la esponja PVA requiere que una persona manipule el ratón y prepare el sitio quirúrgico, y una segunda persona para realizar la implantación.
  4. Anestetizar un ratón C57BL/6J masculino de 8–12 semanas de edad por inyección intraperitoneal de 80 mg/kg de ketamina. Administrar 40 mg/kg de xilazina intraperitonealmente para analgesia.  Confirmar la profundidad de la anestesia por la pérdida de un reflejo del pedal. Preparar el sitio quirúrgico quitando el cabello a lo largo del dorso con cortadores. Usando gasa estéril, aplique la solución de povidona-yodo en el área de afeitado 2x, seguido de 70% de etanol.
  5. Coloque el ratón sobre cortinas quirúrgicas estériles. Coloque una almohadilla calentada debajo de las cortinas quirúrgicas para mantener la temperatura del núcleo del ratón.
  6. Use guantes quirúrgicos estériles para realizar la cirugía. Tire de la piel dorsal lejos del tejido subyacente con fórceps, y usando tijeras quirúrgicas estériles, haga una incisión de 2 cm a lo largo de la línea media dorsal aproximadamente 2 cm antes de la base de la cola. Mientras mantiene la incisión abierta con fórceps estériles, utilice tijeras quirúrgicas curvas estériles con puntas romas para formar un bolsillo subcutáneo a lo largo del dorso en una de las posiciones indicadas en la Figura 1B.
  7. Continúe usando fórceps para levantar la piel del tejido subyacente. Usando tijeras quirúrgicas estériles, apriete suavemente una esponja de PVA en el plato de cultivo para eliminar el exceso de PBS. Recoger la esponja PVA por una esquina usando tijeras quirúrgicas estériles y, llevando con la esquina sostenida por las tijeras, colocar la esponja en el bolsillo subcutáneo formado en el paso 1.4.
  8. Repita este proceso 5x, colocando un total de seis esponjas en bolsillos subcutáneos como se muestra en la Figura 1B.
  9. Pellizque la piel dorsal incisa junto con fórceps estériles y cierre la incisión con dos clips de herida de acero inoxidable.
  10. Utilice un nuevo conjunto de instrumentos quirúrgicos estériles para cada ratón. Alternativamente, utilice un esterilizador de cuentas para esterilizar instrumentos entre ratones.

2. Aislamiento de líquidos de esponjas DE PVA

  1. Para evaluar el ambiente agudo de citoquinas de la herida, aísle las esponjas entre 1-14 días después de la implantación.
  2. Preparar un tubo de recogida de fluidos anidando el barril de una jeringa de 5 ml en un tubo de cultivo de 16 ml.
  3. Euthanizar un ratón con esponjas de PVA implantadas por asfixia porCO2 seguida de luxación cervical.
  4. Retire las grapas quirúrgicas y abra la incisión con fórceps dentados. Utilice tijeras para extender la incisión a lo largo de la línea media dorsal.
  5. Usando fórceps, extraiga una esponja de su bolsillo subcutáneo y transfiérala al barril de jeringa preparado, teniendo cuidado de minimizar la presión a la esponja. Desasocie cualquier tejido conectivo que quede adherido a la superficie de la esponja. Use tijeras para diseccionar la esponja del tejido circundante si es necesario. Repita el proceso de eliminación de esponjas con las esponjas restantes. Coloque el tubo que contiene las esponjas sobre hielo.
  6. Para aislar el líquido de la herida, centrifugar el tubo de cultivo que contiene la jeringa de 5 ml con las esponjas a 700 x g durante 10 min.
  7. Después de la centrifugación, deseche la jeringa y las esponjas. El líquido de la herida se habrá acumulado en el tubo de cultivo de 16 ml. En la Figura 1Dse muestra una imagen representativa del líquido recogido de una herida del día 7. Transfiera el líquido de la herida a un tubo limpio para un almacenamiento a largo plazo a -80 oC.

3. Aislamiento de células de esponjas PVA

  1. Para evaluar el ambiente celular de cicatrización aguda de heridas, recoja las esponjas entre 1-14 días después de la implantación de la esponja. Las esponjas obtenidas de una herida 7 días después de la implantación se muestran en la Figura 1E.
  2. Prepare un medio de recolección que contenga 1 x HBSS (+calcio/+magnesio/rojo fenol) complementado con 1% de FBS, 1% de HEPES y 1% de penicilina-estreptomicina.
  3. Aliquot 5 mL de medio de recogida HBSS en un tubo cónico de 15 ml.
  4. Extraiga las esponjas de PVA de ratones eutanizados como se describe en 2.2–2.4. Coloque las esponjas en el tubo cónico que contiene 5 ml de medio de recogida de HBSS.
  5. Transfiera las esponjas y el medio de recogida HBSS a una bolsa de licuadora de 80 ml vertiendo. Cuelgue la bolsa de la licuadora de la escotilla de la licuadora de paletas, colocada de modo que las paletas golpeen las esponjas y los medios. Ajuste los ajustes de la licuadora de paletas para que funcionen en alto durante 60 s. Pulse inicio.
  6. Transfiera el medio de la bolsa de la licuadora de nuevo al tubo cónico de 15 ml con una pipeta, dejando las esponjas en la bolsa. Apriete las esponjas para liberar completamente los medios. Ajuste los ajustes de la licuadora de paletas para que funcionen durante 30 s en alto. Añadir 5 ml de medios a la bolsa de la licuadora y repetir el proceso de estómago 2x para un total de tres lavados de esponja.
  7. Centrifugar el tubo cónico a 250 x g durante 5 min. Un gránulo rojo de células y glóbulos rojos será visible en la parte inferior del tubo cónico después de la centrifugación.
  8. Deseche el sobrenadante y realice una lisis de glóbulos rojos: agregue 900 éL de dH2O al pellet celular y a la pipeta para mezclar. Neutralizar con 100 s de 10x PBS. Añadir 4 ml de 1x PBS al tubo para neutralizar completamente la lisis, luego centrifugar a 250 x g durante 5 min.
    NOTA: El paso de lisis debe ser breve; dejar el agua en contacto con las células durante más de 3-5 s podría resultar en lisis de glóbulos no rojos.
  9. Después de la centrifugación, un pellet de células blancas que contiene células de la herida desprovistas de glóbulos rojos estará presente en la parte inferior del tubo cónico. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en el medio deseado para los análisis posteriores.

4. Análisis opcional de citometría de flujo de leucocitos innatos aislados de heridas de esponja de PVA

  1. Resuspenda 0,5–1 x 106 células de la herida en 25 ml de una solución de bloqueo de 2 x que contenga 10 ég/ml anti-CD16/CD32 Anticuerpo FcR-II/III diluido en 1x PBS + 1% De BSA.
    NOTA: Todos los anticuerpos deben ser valorados para determinar las concentraciones óptimas para el análisis de citometría de flujo.
  2. Incubar las células con anticuerpos de bloqueo durante 10 minutos sobre hielo.
  3. Hacer una mezcla maestra 2 de anticuerpos que contengan 2,5 mg/ml de PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 mg/ml de FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F y 10 mg/ml de eFluor660-F4-80 diluido en 1x PBS + 1% BSA. Añadir directamente 25 l del cóctel de anticuerpos a las células que se incuban en el bloqueo de anticuerpos.
  4. Incubar las células durante 20 minutos sobre hielo, protegidas de la luz.
  5. Lavar las células 2veces con 1x PBS.
  6. Hacer una mezcla maestra de amina-reactiva reactiva de viabilidad fijable tinte-eFluor506 diluido 1:1,000 en 1x PBS. Resuspenda el gránulo celular en 50 ml de la solución de colorante de viabilidad.
    NOTA: El suero debe excluirse del paso de viabilidad fijable, ya que evitará la unión del tinte a las proteínas endógenas. Incubar las células durante 20 minutos sobre hielo, protegidas de la luz.
  7. Lavar las células 2veces con 1x PBS. Resuspenda el gránulo celular en 50 s de 1% de paraformaldehído.
  8. Incubar las células con 1% de paraformaldehído durante 15 minutos sobre hielo, protegidos de la luz.
  9. Lavar las células 1x con 1x PBS y resuspender el pellet en 1x PBS para el análisis citométrico de flujo.

5. Escisión de la piel de la cola

  1. Anestetizar un ratón C57BL/6J masculino de 8–12 semanas de edad por inyección intraperitoneal de 80 mg/kg de ketamina. Administrar 40 mg/kg de xilazina intraperitonealmente para analgesia. Confirmar la profundidad de la anestesia por la pérdida de un reflejo del pedal.
  2. Preparar el sitio quirúrgico en la cola del ratón anestesiado mediante el uso de gasa estéril para aplicar la solución de povidona-yodo 2x, seguido de una aplicación de 70% de etanol.
  3. Defina una sección de 10 mm x 3 mm en la superficie dorsal de la cola, a 10 mm de la base de la cola(Figura 1C)utilizando un marcador permanente para trazar desde una plantilla prefabricada.
  4. Coloque el ratón anestesiado en cortinas quirúrgicas estériles.
  5. Use guantes quirúrgicos estériles para realizar los procedimientos quirúrgicos. Con una cuchilla de bisturí estéril, haga una incisión de espesor completo a lo largo de los bordes derecho, inferior e izquierdo del área de la herida.
  6. Usando fórceps estériles, despega la piel extirpada lejos de la cola, y usa tijeras quirúrgicas estériles para cortar el borde superior del área de la herida.
  7. Aplique presión con gasa estéril para detener el sangrado.
  8. Aplique una película de barrera de pulverización en el lecho de la herida.
  9. Fotografíe las heridas a una distancia fija a intervalos de tiempo regulares. Analice las fotografías mediante análisis planimétrico para determinar las mediciones del área de la herida. Alternativamente, utilice pinzas para obtener medidas de longitud y anchura de la herida.

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Representative Results

Respuesta inflamatoria sistémica tras la implantación de la esponja de PVA
La cirugía de implantación de esponja PVA generó una respuesta inflamatoria sistémica, como lo demuestra la inducción de IL-6 en el plasma 1 día después de la herida(Figura 2A). Otras citoquinas proinflamatorias, incluyendo TNF-o e IL-1, así como una serie de quimioquinas incluyendo CCL2 y CXCL1 fueron inducidas sistémicamente en los primeros 7 días después de la implantación de la esponja DE PVA, y se han descrito en otros lugares26,30.

Aislamiento de células y líquidos de las heridas de esponja de PVA
La principal ventaja del modelo de herida de esponja PVA es la capacidad de recuperar suficientes células para análisis fenotípicos y funcionales de la respuesta de cicatrización de heridas celulares agudas. El número de células que se pueden recuperar de las heridas de la esponja PVA aumenta con el tiempo, de aproximadamente 2 x 106 células por seis esponjas en el día de la herida 1 x 106 a 8 x 106 células en el día de la herida 7(Figura 2B). El número de celdas sigue aumentando más allá del día 7. No se recomienda continuar este modelo más allá de los 14 días porque las esponjas se encapsulan completamente por colágeno y el sistema pasa de modelar una respuesta aguda de cicatrización de heridas al modelado de un granuloma de cuerpo extraño1,22,23,25,26. Los neutrófilos, monocitos y macrófagos fueron el principal infiltrado celular en las heridas de esponja de PVA. Los neutrófilos predominaron el ambiente celular de la herida un día después de la herida, según lo evaluado por el análisis citométrico de flujo(Figura 2C). Los monocitos y los macrófagos derivados de monocitos se acumularon dentro de los 3 días posteriores a la implantación de la esponja, y las poblaciones de tres células aumentaron en número con el tiempo(Figura 2C). En la Figura 2Dse muestra una estrategia representativa de citometría de flujo para identificar las poblaciones de neutrófilos, monocitos y macróforos. Después de excluir los dobletes celulares utilizando parámetros FSC-H y SSC-H(Figura 2D, i y ii),las células no viables fueron excluidas utilizando un tinte de viabilidad reactiva blea-reactiva (que se muestra aquí) o un tinte ácido nucleico (por ejemplo, yoduro de sistema o propidium)(Figura 2D, iii). Los desechos celulares residuales no eliminados por los pasos anteriores fueron excluidos usando los parámetros FSC-A y SSC-A(Figura 2D, iv). Las células hematopoyéticas comprendieron la mayoría de las células de la herida de la esponja PVA y fueron identificadas por la expresión CD45(Figura 2D, v). Los neutrófilos fueron identificados como Ly6G+Siglec-F(Figura 2D, vi). Siglec-F+ células eran principalmente eosinófilos(Figura 2D, vii). Gating en Ly6GSiglec-F células, monocitos/macrofagos fueron identificados como F4/80+ células(Figura 2D, viii). F4/80+ células podrían ser fraccionadas aún más por la expresión Ly6C para distinguir los monocitos inflamatorioshi inflamatorios de Ly6C(Figura 2D, ix)y los macrófagos derivados de monocitosbajos de Ly6C(Figura 2D, x)26.

La capacidad de medir las citoquinas y otros factores solubles en heridas es otra ventaja para el modelo de herida de esponja PVA. Es posible extraer hasta 100 ml de líquido por esponja. Los fluidos extraídos son adecuados para una variedad de ensayos aguas abajo. La detección de citoquinas y quimioquinas en fluidos de heridas tempranas y tardías por ELISA o inmunoensayos múltiples x a base de cuentas se ha notificado en otros lugares26,30. Es posible obtener células y líquidos de la misma herida. Para ello, se recomienda aislar tres esponjas de un lado de la línea media dorsal para el aislamiento celular y 3 esponjas del lado opuesto de la línea media dorsal para la extracción de fluidos.

Evaluación del cierre de la herida utilizando el modelo de escisión de la piel de la cola
El modelo de piel de cola escisión al tisumos proporciona una alternativa al método de biopsia de punzonado de la piel dorsal para estudiar el cierre lento de la herida en la piel firme que carece de piel densa. En la Figura 3Ase muestran imágenes de ejemplo de heridas en la piel de la cola a los días 1, 7 y 15 días posteriores a la escisión. El cierre de la herida podría cuantificarse midiendo el área del lecho de la herida con el tiempo. El día 7 y el día 15 áreas del lecho de las heridas fueron aproximadamente 70% y 35%, respectivamente, de la zona de la herida del día 1(Figura 3B). El cierre completo de la herida requirió aproximadamente 28 días. La herida de la piel de la cola también se pudo observar en sección transversal mediante análisis histológicos. La Figura 3C y la Figura 3D muestran imágenes representativas de las secciones transversales de la cola teñida tricroma de H&E y Masson, respectivamente. Los márgenes laterales de la piel extirpada están indicados por puntas de flecha en la superficie dorsal de la cola.

Figure 1
Figura 1: Esquema de modelos de cicatrización de heridas murinas. (A) Vista lateral (izquierda) y superior (derecha) de esponjas PVA deshidratadas que miden 8 mm x 8 mm x 0,4 mm.(B) Ilustración de un ratón que demuestra la colocación de la incisión dorsal de la línea media (línea roja central) y seis esponjas DE 1 cm x 1 cm x 0,5 cm PVA en bolsillos subcutáneos. (C) Esquema que demuestra el tamaño y la colocación de una herida de piel escisión (10 mm x 3 mm rectángulo rojo) en la superficie dorsal de la cola. (D) Líquido de heridas aislado de tres esponjas que fueron recuperadas del espacio subcutáneo 7 días después de la implantación. (E) La aparición de esponjas recuperadas de la herida 7 días después de la implantación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La respuesta sistémica y celular a la implantación de esponja salvoltitos PVA. (A) Un curso de tiempo de los niveles de IL-6 en el plasma demuestra que la implantación de esponja de PVA indujo una respuesta inflamatoria sistémica. La concentración de IL-6 se midió utilizando un inmunoensayo a base de perlas múltiplesx. (B) El número de células aisladas de las esponjas de PVA herida aumentó con el tiempo. (C) Un curso de tiempo demuestra la acumulación de neutrófilos, monocitos y macrófagos derivados de monocitos en heridas de esponja DE PVA con el tiempo. (D) Una estrategia representativa de gating de células aisladas de heridas de esponja DE PVA demuestra cómo identificar subconjuntos de leucocitos mediante análisis citométricos de flujo. Las puertas se definen de la siguiente manera: (i y ii) exclusión de doblete, (iii) exclusión de células muertas utilizando un tinte de viabilidad reactiva reactiva amina, (iv) exclusión de escombros por FSC-A y SSC-A, (v) CD45+ células hematopoyéticas, (vi) Ly6G+ neutrófilos, (vii) Siglec-F+ eosinófilos, (viii) Ly6GSiglec-F F4/80+ monocitos/macrofages, (ix) F4/80+ Ly6Chi monocitos, y (x) F4/80+Ly6Cbaja macrófagos. Las puertas se colocaron de acuerdo con los controles de fluorescencia menos uno (FMO). Los datos que se muestran en AC son la media de los ratones SEM, n a 6-10 por grupo en (a), n a 8–9 ratones en (B), y n a 6-8 ratones en (C). Todos los datos se combinan entre 2 y 3 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Evaluación de la cicatrización de la herida de la piel de la cola escisión. (A) Fotografías representativas de las heridas de la piel de la cola escisión tomadas 1, 7 y 15 días después de la herida. (B) La tasa de cierre de las heridas de la piel de la cola escisión. Las heridas eran fotografiadas cada dos días. El software de procesamiento de imágenes se utilizó para rastrear los márgenes del lecho de la herida y calcular el área de la herida en los puntos de tiempo indicados. El área de la herida se presenta como una fracción del área de la herida medida el día 1. Imágenes representativas de secciones transversales de cola incrustadas en parafina, seccionadas y teñidas con (C) H&E o (D) Tricromo de Masson. La herida se encontraba en la superficie dorsal de la sección transversal de la cola; los márgenes laterales de la herida están indicados por puntas de flecha. Los datos que se muestran en (B) son la media de SEM, n a 8 ratones por grupo. Los datos se combinan a partir de dos experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este artículo describe dos modelos de heridas murinas tractables que permiten la evaluación de la respuesta aguda de cicatrización de heridas. El primer método consiste en la implantación quirúrgica de esponjas de PVA en el espacio subcutáneo dorsal. Este enfoque ofrece una clara ventaja sobre los modelos de heridas basadas en biopsias para estudiar la respuesta de cicatrización de heridas celulares debido al gran número de células y la cantidad de líquidos de la herida obtenidos de las esponjas aisladas. Para la ejecución exitosa de este procedimiento, mantener un campo quirúrgico estéril mediante la limpieza a fondo de la piel alrededor de la incisión es imperativo, ya que la translocación de bacterias en la herida alterará significativamente el curso de la curación. Usando el método de aislamiento celular descrito aquí, es posible aislar al menos 1–10 x 106 células de las esponjas DE PVA, dependiendo del tiempo de extracción de la esponja. La mayoría de las células aisladas de las heridas de esponja DE PVA son viables(Figura 2D). Sin embargo, debido a que es posible que las células muertas constituyan hasta un 20 % de células de heridas aisladas después de una interrupción mecánica, se recomienda encarecidamente utilizar una mancha de viabilidad al proceder con análisis basados en citometría de flujo. Las células aisladas de las heridas de esponja de PVA son principalmente de origen hematopoyético según lo determinado por la positividad CD45 (Figura 2D). La rápida acumulación de neutrófilos seguidos de monocitos y macrófagos es consistente con las etapas agudas de reparación de heridas3,4,34,35,36,37,38. Las células aisladas son adecuadas para análisis posteriores, incluyendo inmunofenotipado, clasificación celular, cultivo, extracción de ARN y una variedad de ensayos funcionales.

El modelo de herida de esponja PVA también permite el aislamiento de líquidos, lo que es ideal para evaluar las respuestas de citoquinas y factores de crecimiento en el entorno agudo de la herida. Los fluidos de esponja DE PVA son adecuados para pruebas por ELISA, inmunoensayo multiplex a base de perlas y cuantificación de proteínas, entre otros. Estudios anteriores han demostrado a través de la citoquina y la medición del factor de crecimiento que el ambiente de la herida temprana es inflamatorio en la naturaleza, con la inducción rápida de IL-6, TNF-o, y IL-1 ( de los días 1-3. A continuación, el entorno de la herida pasa a un estado reparador con la posterior inducción de factores de crecimiento pro-angiogénicos y profibroscos, incluyendo VEGF y TGF-22,22,23,25,26,30.

Mientras que el modelo de implantación de esponja PVA es ventajoso para el estudio de las respuestas celulares y de citoquinas agudas de la herida, una de sus limitaciones es la incapacidad para medir la tasa o grado de curación. La medición de este aspecto de la cicatrización de heridas puede ser necesaria al evaluar los efectos de una condición comorbilidad en varios aspectos de la respuesta de cicatrización de heridas30. Para esta métrica, se prefieren métodos basados en biopsias. Aquí, se presenta el modelo de escisión de la piel de la cola. En este modelo, una sección de espesor completo de la piel de la cola se extirpada de la superficie dorsal de la cola. Una vez más, mantener un campo quirúrgico estéril es importante para evitar inocular el lecho de la herida. También se recomienda el uso de una película de barrera de pulverización u otra cubierta de heridas para evitar infecciones posteriores de la herida. Los ratones machos más viejos o las cepas agresivas requieren alojamiento en solitario para evitar la interrupción de la herida. Una ventaja particular de la cola como sitio para estudiar la cicatrización de heridas es que se basa más en la reepitelización para el cierre, como lo describen otros27,,32,33. Además de medir el área del lecho de la herida y realizar análisis histológicos, otros han informado de su uso en la evaluación de la eficacia de las intervenciones tópicas en la modulación de los procesos de curación33.

Cada uno de los modelos de heridas descritos en estos métodos ofrecen ventajas distintas para la comprensión de los procesos de reparación de heridas en estado estacionario y en presencia de comorbilidades. Debido a la amplia disponibilidad de cepas genéticamente alteradas de ratones endogámicos, también es posible manipular las respuestas de cicatrización de heridas para responder preguntas mecanicistas sobre el proceso. Además, estos sistemas se pueden implementar en modelos murinos de condiciones asociadas con la cicatrización de heridas deficientes incluyendo diabetes, envejecimiento, infección secundaria, y otros30,36,39,40. Los conocimientos mecanicistas obtenidos de los estudios murinos pueden proporcionar la base para estudiar la cicatrización de heridas en modelos animales de orden superior. Juntos, la implantación de esponjas PVA y los modelos de heridas de piel de cola excisional proporcionan sistemas tractables y versátiles para dilucidar los procesos de cicatrización de heridas en condiciones patológicas y de estado estacionario.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores quieren agradecer a Kevin Carlson, de la Citometría de Flujo de la Universidad Brown y del Centro de Clasificación, la consulta y la asistencia con los experimentos de citometría de flujo. Las imágenes de las figuras 1B y C se crearon con BioRender. Kayla Lee y Gregory Serpa son agradecidos por su asistencia fotográfica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los siguientes: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean's Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, Instituto Nacional de Ciencias Ambientales (NIES) T32-ES7272 (Formación en Patología Ambiental), y el Premio Semilla de Investigación de la Universidad Brown.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus Genesee 28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) ThermoFisher Scientific 14025076
5ml Syringe BD 309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 BioLegend 109852 Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660 ThermoFisher Scientific 50-4801-82 Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC BD Biosciences 553104 Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 ThermoFisher Scientific 46-9668-82 Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 BD Biosciences 565183 Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier Braintree Scientific NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm Braintree Scientific NC9334081
Blender Bag, 80mL Fisher Scientific 14258201
Culture Tube, 16mL, 17x100 Genesee Scientific 21-130
Fetal Bovine Serum - Standard ThermoFisher Scientific 10437028
Fixable Viability Dye eFluor506 ThermoFisher Scientific 65-0866-14
Hepes Solution, 1M Genesee Scientific 25-534
ImageJ Software NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070-063
Polyvinyl alcohol sponge - large pore size Ivalon/PVA Unlimited www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10% Fisher Scientific 3955-16
Spray barrier film, Cavilon 3M 3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V Seward 0080/000/AJ

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