कैल्शियम आयनोफोर का उपयोग करके लाल रक्त कोशिकाओं में एरिप्टोसिस का शामिल होना

Biochemistry

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Summary

एरिप्तोसिस को शामिल करने के लिए एक प्रोटोकॉल, एरिथ्रोसाइट्स में प्रोग्राम सेल डेथ, कैल्शियम आयनोफोर, आयनोमाइसिन का उपयोग करके प्रदान किया जाता है। झिल्ली बाहरी पत्रक में स्थानीयकरण फॉस्फेटिटिलसेरीन की निगरानी करके सफल एरिप्तोसिस का मूल्यांकन किया जाता है। प्रोटोकॉल की सफलता को प्रभावित करने वाले कारकों की जांच की गई है और इष्टतम शर्तें प्रदान की गई हैं ।

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Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).

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Abstract

एरिपेटोसिस, एरिथ्रोसाइट प्रोग्राम की गई सेल डेथ, कई हेमेटोलॉजिकल बीमारियों में और एरिथ्रोसाइट्स को चोट लगने के दौरान होती है। एरिप्टोटिक कोशिकाओं की एक बानगी कोशिका झिल्ली की रचनात्मक विषमता का नुकसान है, जिससे झिल्ली बाहरी पत्रक में फॉस्फेटिल्डसेरीन का स्थानांतरण होता है। यह प्रक्रिया सीए2 +की बढ़ी हुई इंट्रासेल्युलर एकाग्रता से शुरू होती है, जो हाथापाई को सक्रिय करती है, एक एंजाइम जो झिल्ली पत्रक के बीच फॉस्फोलिपिड के द्विदिशात्मक आंदोलन की सुविधा प्रदान करता है। विभिन्न रोगग्रस्त परिस्थितियों में एरिप्तोसिस के महत्व को देखते हुए, विट्रो मेंएरिप्टोसिस को प्रेरित करने के प्रयास किए गए हैं। इस तरह के प्रयासों ने आम तौर पर कैल्शियम आयनोफोर, आयनोमाइसिन पर भरोसा किया है, ताकि इंट्रासेलर सीए2 + एकाग्रता को बढ़ाया जा सके और एरिप्तोसिस को प्रेरित किया जा सके। हालांकि, आयनमाइसिन का उपयोग करके एरिपेटोसिस को प्रेरित करने की प्रक्रिया के संबंध में साहित्य में कई विसंगतियों की सूचना मिली है। इसके साथ, हम मानव एरिथ्रोसाइट्स में आयनोमाइसिन-प्रेरित एरिपेटोसिस के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। हम आयनोफोर एकाग्रता, ऊष्मायन समय और ग्लूकोज की कमी सहित प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरणों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, और प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगशाला में एरिप्तोसिस को पुन: उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

एरिथ्रोसाइट्स में प्रोग्राम की गई सेल डेथ, जिसे एरिप्टोसिस भी कहा जाता है, कई नैदानिक स्थितियों और हेमेटोलॉजिकल विकारों में आम है। एरिप्टोसिस कोशिका सिकुड़न और कोशिका प्लाज्मा झिल्ली1,2में फॉस्फोलिपिड विषमता के नुकसान से जुड़ा हुआ है। विषमता की हानि के परिणामस्वरूप फॉस्फेटिटिलसेरीन (पीएस) का स्थानांतरण होता है, एक लिपिड सामान्य रूप से आंतरिक पत्रक3,4में सेल बाहरी पत्रक में स्थानीयकृत होता है, जो मैक्रोफेज को फेगोसाइटोज करने और दोषपूर्ण एरिथ्रोसाइट्स5,6,7,8को हटाने का संकेत देता है। एरिथ्रोसाइट्स के सामान्य जीवन काल के अंत में, मैक्रोफेज द्वारा एरिप्टोटिक कोशिकाओं को हटाना परिसंचरण में एरिथ्रोसाइट्स का संतुलन सुनिश्चित करता है। हालांकि, सिकल सेल रोग और थैलीसीमिया9,10,11जैसी रोगग्रस्त स्थितियों में, बढ़ी हुई एरिप्टोसिस के परिणामस्वरूप गंभीर एनीमिया2हो सकता है। हेमेटोलॉजिकल रोगों में इसके महत्व के कारण, इस प्रक्रिया में अंतर्निहित एरिप्तोसिस और आणविक तंत्र को उत्प्रेरण या बाधित करने वाले कारकों की जांच करने में महत्वपूर्ण रुचि है।

स्वस्थ एरिथ्रोसाइट्स की प्लाज्मा झिल्ली असममित है, जिसमें बाहरी और आंतरिक पत्रकों पर अलग-अलग फॉस्फोलिपिड स्थानीयता है। झिल्ली विषमता मुख्य रूप से झिल्ली एंजाइमों की कार्रवाई से विनियमित होती है। अमीनोफोस्फोलिपिड ट्रांसलोकेस इन लिपिड को सेल इनर पेपरट में निर्देशित करके अमीनोफोस्फोलिपिड, पीएस और फॉस्फेटिफाइडलथेनोथेलामामाइन (पीई) के परिवहन की सुविधा प्रदान करता है। दूसरी ओर, फ्लॉपाज़ फॉस्फोलिपिड्स, फॉस्फेटिडिलकोलिन (पीसी) और स्फिंगोमायलिन (एसएम) वाले कोलीन को कोशिका झिल्ली12के बाहरी पत्रक तक ले जाता है। हालांकि, स्वस्थ कोशिकाओं के विपरीत, एरिप्टोटिक एरिथ्रोसाइट्स की झिल्ली तले हुए होती है। यह एक तीसरे एंजाइम, हाथापाई की कार्रवाई के कारण है, जो अमीनोफोस्फोलिपिड13,14,15,16के द्विदिशात्मक परिवहन को सुविधाजनक बनाकर फॉस्फोलिपिड विषमता को बाधित करता है। स्क्रैम्बलएसई सीए2 +के ऊंचा इंट्रासेलुलर स्तर ों द्वारा सक्रिय होता है। इसलिए, कैल्शियम आयनोफोरस, जो कोशिका झिल्ली12में सीए2 + के परिवहन की सुविधा प्रदान करते हैं, एरिप्टोसिस के कुशल प्रेरक हैं।

आयोनोमाइसिन, कैल्शियम आयनोफोर, व्यापक रूप से एरिथ्रोसाइट्स12,17,18,19,20 ,21,22,23,24,25,26में एरिप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए उपयोग किया गया है। आयनोमाइसिन में हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक दोनों समूह हैं, जो सीए2 + आयन को बांधने और कैप्चर करने के लिए आवश्यक हैं, और इसे साइटोसोलिक स्पेस27,28,29तक ले जाते हैं। इससे तले हुए लोगों की सक्रियता और पीएस के बाहरी पत्रक में स्थानांतरण हो ता है, जिसे पीएस12के उच्च आत्मीयता वाले सेलुलर प्रोटीन एनेक्सिन-वी का उपयोग करके आसानी से पता लगाया जा सकता है। यद्यपि आयनोमाइसिन द्वारा एरिप्टोसिस को ट्रिगर करना आमतौर पर सूचित किया जाता है, साहित्य में काफी विधि विसंगति है(तालिका 1)। एरिपेटोसिस से गुजर रहे एरिथ्रोसाइट्स की आबादी आयनोफोर एकाग्रता, आयनोफोर के साथ उपचार का समय, और एक्स्टोसेलुलर वातावरण की चीनी सामग्री (ग्लूकोज की कमी से सन्तर चैनलसक्रिय हो जाती है और साइटोसोलिक स्पेस में सीए2 + के प्रवेश की सुविधा होती है)30,31। हालांकि, साहित्य में इन कारकों में थोड़ी निरंतरता है, जिससे विट्रो मेंएरिप्टोसिस को पुन: उत्पन्न करना मुश्किल हो जाता है।

इस प्रोटोकॉल में, हम मानव एरिथ्रोसाइट्स में एरिप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। सीए2 + एकाग्रता, आयनोफोर एकाग्रता, उपचार समय, और ग्लूकोज-समाप्त बफर में पूर्व-ऊष्मायन सहित सफल एरिप्तोसिस को प्रभावित करने वाले कारकों की जांच की जाती है और इष्टतम मूल्यों की सूचना दी जाती है। यह प्रक्रिया दर्शाती है कि ग्लूकोज-मुक्त बफर में एरिथ्रोसाइट्स का पूर्व-ऊष्मायन ग्लूकोज युक्त बफर की तुलना में एरिप्टोसिस का प्रतिशत काफी बढ़ जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगशाला में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए एरिप्टोटिक एरिथ्रोसाइट्स का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

नीचे वर्णित प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किए गए सभी मानव रक्त नमूनों को डी-चिन्हित नमूने के रूप में खरीदा गया था । इस अध्ययन के लिए कोई भी मानव विषय सीधे तौर पर शामिल या भर्ती नहीं किया गया था । हेलसिंकी की घोषणा के दिशा निर्देशों का उपयोग तब किया जाना चाहिए जब अनुसंधान में मानव विषय शामिल हों ।

1. पूरे रक्त से एरिथ्रोसाइट अलगाव

  1. एक माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में एसिड सिट्रेट डेक्सट्रोस (एसीडी) (4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) में पूरे रक्त का 500 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: पूरा खून एसीडी में खरीदा गया था । कंपनी के अनुसार, एसीडी के 1.5 mL पूरे रक्त के 7 mL (8.5 mL कुल मात्रा) में जोड़ा जाता है।
  2. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिन के लिए 700 x ग्राम पर पूरे रक्त को अपकेंद्रित करें और लाल एरिथ्रोसाइट परत छोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करके स्पष्ट प्लाज्मा और पतले बफी कोट को हटा दें।
  3. 125 एमएम नैल, 5 एमएम केसीएल, 1 एमएम एमजीएसओ4,32 एमएम एचईपी, 5 एमएम ग्लूकोज और 1 एमएम सीएसीएल2वाले रिंगर समाधान के 1 एल तैयार करें। पीएच को 1.0 एम नाओएच की 2 माइक्रोन ड्रॉप जोड़कर 7.4 पर समायोजित करें। ग्लूकोज मुक्त रिंगर समाधान तैयार करने के लिए, एक ही प्रोटोकॉल का पालन करें, लेकिन समाधान में ग्लूकोज शामिल नहीं है।
  4. रिंगर समाधान के 1.5 मीटर में सेल पैलेट को निलंबित करके रिंगर समाधान में एरिथ्रोसाइट्स 2x को धोएं, आरटी में 5 मिन के लिए 700 x ग्राम पर अपकेंद्री, और सुपरनेटेंट को हटा दें।
  5. 10 मीटर की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए ग्लूकोज मुक्त रिंगर समाधान के 9,960 माइक्रोन में एरिथ्रोसाइट पैलेट के 40 माइक्रोन को फिर से निलंबित करके 0.4% हेमेटोक्रिट बनाएं।
    नोट: हेमेटोक्रिट एक शब्द है जिसका उपयोग निलंबन में एरिथ्रोसाइट्स के वॉल्यूम अंश को संदर्भित करने के लिए किया जाता है। 0.4% हेमेटोक्रिट एक निलंबन है जिसमें 0.4% एरिथ्रोसाइट्स होते हैं।
  6. सेल निलंबन को 7 दिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

2. आयनोमाइसिन और हीमोलिसिस की माप के साथ एरिथ्रोसाइट्स का उपचार

  1. 2 mM की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए डिमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) के 630 माइक्रोन में 1 मिलीग्राम आयनोमाइसिन कैल्शियम नमक भंग करें। अलीकोट और स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. चरण 1.5 से 0.4% हेमेटोक्रिट का 1 एल लें और 1 माइक्रोएम की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 2 एम एम आयनोमाइसिन के 0.5 माइक्रोन जोड़ें। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    1. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कोई आयनमाइसिन उपचार के साथ हेमेटोक्रिट के 1 mL का उपयोग करें।
  3. आर टी में 5 मिन के लिए 700 x ग्राम पर आयनोमाइसिन-इलाज और अनुपचारित हेमेटोक्रेट्स को अपकेंद्रित्र करें, और ट्यूबों के नीचे सेल छर्रों को छोड़ने के लिए अपने सुपरनेटेंट को हटा दें।
  4. रिंगर समाधान के 1.5 मीटर में सेल छर्रों को निलंबित करके रिंगर समाधान के साथ कोशिकाओं 3x को धोएं, आरटी में 5 मिन के लिए 700 x ग्राम पर अपकेंद्री और सुपरनेटेंट को त्यागदें।
  5. हीमोलिसिस को मापने के लिए, अनुपचारित 0.4% हेमेटोक्रिट के 1 मिलीएल को चरण 1.5 से माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में जोड़ें और हेमोलिसिस (0%) के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. अनुपचारित 0.4% हेमेटोक्रिट के 1 मिलीएल को चरण 1.5 से माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में जोड़ें और आरटी पर 5 मिन के लिए 700 x ग्राम पर अपकेंद्री रखें। सुपरनेट ेंट को हटाएं और सेल पैलेट में आसुत पानी का 1 मिलील जोड़ें और हेमोलिसिस (100%)
  7. 2.2 चरण से माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में आयनोमाइसिन-उपचारित 0.4% हेमेटोक्रिट का 1 मिलील जोड़ें।
  8. अनुपचारित कोशिकाओं, इलाज कोशिकाओं, और आसुत पानी में कोशिकाओं को आरटी में 5 मिन के लिए 700 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  9. सुपरनेटेंट के 200 माइक्रोन लें और 96-वेल प्लेट में जोड़ें।
  10. माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 541 एनएम पर अवशोषक को मापें।
  11. समीकरण 132का उपयोग कर हीमोलिसिस की गणना करें:

    % हीमोलिसिस = (एकटी - एक0)/ (एक100 - एक0)* 100

    जहां एक0 रिंगर समाधान में एरिथ्रोसाइट्स का अवशोषण है,एक 100 पानी में एरिथ्रोसाइट्स का अवशोषण है, और एटी आयनोमाइसिन द्वारा उपचारित एरिथ्रोसाइट्स का अवशोषण है।

3. एनेक्सिन-वी बाध्यकारी परख

  1. 1x बाध्यकारी बफर प्राप्त करने के लिए फॉस्फेट-बफर्ड लवइन (पीबीएस) के 8 मिलील में 5x एनेक्सिन वी बाध्यकारी बफर के 2 मिलीएल को पतला करें।
  2. 1x बाध्यकारी बफर के 1 मिलील में चरण 2.4 से आयनोमाइसिन-इलाज और अनुपचारित सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें।
  3. बाध्यकारी बफर में सेल निलंबन के 235 माइक्रोन लें और एनेक्सिन वी-एलेक्सा आटा 488 कॉन्जुगेट के 15 माइक्रोन जोड़ें।
  4. एक अंधेरे जगह में 20 मिन के लिए आरटी पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। आरटी में 5 मिन के लिए 700 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और सुपरनेटेंट को हटा दें।
  5. बाइंडिंग बफर के 1.5 mL में सेल पैलेट को निलंबित करके, टी आरटी में 5 मिन के लिए 700 x ग्राम पर अपकेंद्री और सुपरनेटेंट को हटाकर कोशिकाओं 2x को 1x बाध्यकारी बफर से धोएं।
  6. प्रवाह साइटोमेट्री माप के लिए 1x बाध्यकारी बफर के 250 माइक्रोन में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें।

4. फ्लो साइटोमेट्री

  1. एनेक्सिन-वी दाग एरिथ्रोसाइट्स के 200 μL को 1 मिलीएल राउंड बॉटम पॉलीस्टीरिन ट्यूबों में स्थानांतरित करें जो प्रवाह साइटोमेट्री के साथ संगत होती है।
  2. फ्लो साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर पर लॉगइन करें और नए एक्सपेरिमेंट बटन पर क्लिक करें। नए ट्यूब बटन पर क्लिक करें। वैश्विक शीट का चयन करें और 488 एनएम की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 530 एनएम के उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने के लिए आवेदन विश्लेषण चुनें।
  3. फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (FACS) विश्लेषण के लिए एकत्र किए जाने वाले 20,000 तक कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें।
  4. मनचाही ट्यूब का चयन करें और लोड बटन पर क्लिक करें। आगे स्कैटर और साइड स्कैटर मापन के लिए रिकॉर्ड बटन पर क्लिक करें। सभी नमूनों के लिए दोहराएं।
  5. नमूना बटन पर सही क्लिक करें और परिणाम फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए आवेदन बैच विश्लेषण पर क्लिक करें।
  6. नमूना बटन पर सही क्लिक करें और एफएससी फ़ाइलों को उत्पन्नकरने पर क्लिक करें।
  7. फ्लो साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर के कार्यस्थल में फ्लो साइटोमेट्री डेटा (एफएससी फाइल्स) जोड़ें।
  8. ब्याज की सेल आबादी का चयन करके और एरिप्टोसिस मूल्य के लिए आंकड़े जोड़कर नियंत्रण डेटा का विश्लेषण करें।
    1. नियंत्रण पर डबल क्लिक करें और फ्लोरेसेंस तीव्रता बनाम हिस्टोग्राम का चयन करें।
    2. हिस्टोग्राम पर एक गेट खींचने के लिए गेट बटन पर क्लिक करें जो एरिप्तोसिस के प्रतिशत को इंगित करता है।
  9. एरिप्तोसिस मान प्राप्त करने के लिए अन्य सभी प्रयोगात्मक ट्यूबों के लिए एक ही आंकड़े लागू करें। नियंत्रण पर सही क्लिक करें और समूह के लिएकॉपी विश्लेषण का चयन करें ।
  10. सभी नमूनों को ठीक से गेटिंग करने के बाद, विश्लेषण किए गए डेटा को खींचकर और उन्हें लेआउट संपादक में छोड़कर स्थानांतरित करें।
    1. लेआउट संपादक में नियंत्रण के साथ विश्लेषण किए गए डेटा को ओवरले करें।
    2. मढ़ा रेखांकन के एक्स और वाई धुरी को बदलकर वांछित हिस्टोग्राम और तीव्रता निर्धारित करें।
    3. निर्यात बटन पर क्लिक करके और वांछित स्थान में रेखांकन को सहेजकर छवि फ़ाइलों का निर्यात करें।

5. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एनेक्सिन-वी-दाग कोशिकाओं के 5 माइक्रोन को स्थानांतरित करें और इसे कवर स्लिप से कवर करें। फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए अंधेरे जगह पर रखें।
  2. वांछित आवर्धन के साथ 488 एनएम पर उत्साहित कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के आर्गन लेजर का उपयोग करें।
    नोट: एक confocal माइक्रोस्कोप की जरूरत नहीं है और फ्लोरेसेंस क्षमताओं के साथ किसी भी माइक्रोस्कोप का उपयोग अनुवाक-वी बाध्यकारी प्रदर्शित करने वाली फ्लोरेसेंस छवियों को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।
  3. नियंत्रण (गैर-इलाज कोशिकाओं) और इलाज कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस छवियां प्राप्त करें।
    नोट: गैर-इलाज कोशिकाओं को बहुत कमजोर फ्लोरेसेंस संकेत दिखाने की उम्मीद है, जबकि इलाज कोशिकाओं को उनकी झिल्ली पर उज्ज्वल हरे रंग की फ्लोरेसेंस दिखाने की उम्मीद है।

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Representative Results

आयनोमाइसिन एकाग्रता का अनुकूलन

जबकि आयनोमाइसिन को एरिपेटोसिस को प्रेरित करने की आवश्यकता होती है, आयनोमाइसिन सांद्रता में वृद्धि से हीमोलिसिस (यानी एरिथ्रोसाइट्स का लाइसिस और हीमोग्लोबिन जारी करना) हो सकता है, जिससे बचने की आवश्यकता होती है। 2 घंटे के लिए रिंगर समाधान में 1 μM ionomycin के साथ एरिथ्रोसाइट्स का उपचार एरिप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है, जैसा कि एनेक्स विश्लेषण(चित्रा 1ए)द्वारा एनेक्सिन-वी एलेक्सा आटा 488 संकीर्तन और मात्राकरण के साथ सफल लेबलिंग का सबूत है। आयनमाइसिन (5 और 10 माइक्रोन) की उच्च सांद्रता के परिणामस्वरूप एरिप्तोसिस(चित्रा 1ए-डी)में थोड़ी वृद्धि होती है। हालांकि, इस तरह की सांद्रता हीमोलिसिस(चित्रा 1ई)को भी बढ़ाती है, जो वांछित नहीं है। 5% हीमोलिसिस से नीचे रहने के लिए, 1 माइक्रोन आयोनोमाइसिन का उपयोग किया जाना चाहिए।

आयनमाइसिन के साथ उपचार का समय

रिंगर समाधान में आयनोमाइसिन के साथ एरिथ्रोसाइट्स का ऊष्मायन 30 मिन के रूप में कम के लिए एरिप्टोसिस(चित्रा 2ए)को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है। ऊष्मायन समय में वृद्धि एरिप्तोसिस के स्तर को बढ़ाती है, जैसा कि एनेक्सिन वी-बाध्यकारी परख द्वारा मापा जाता है, 2 घंटे तक(चित्रा 2बी, सी)के लिए। हालांकि, आगे ऊष्मायन समय के परिणामस्वरूप एरिप्तोसिस(चित्रा 2डी) के स्तर में थोड़ी कमी आतीहै। अधिकतम एरिप्तोसिस 1 माइक्रोन आयोनोमाइसिन के साथ उपचार के 2 घंटे के बाद प्राप्त किया गया था, और अन्य सभी उपचार समय के लिए, कम एरिपेटोसिस प्राप्त किया गया था(चित्रा 2ई)। रिप्रेजेंटेटिव फ्लो साइटोमेट्री हिस्टोग्राम को फिगर 2ए-डीमें पेश किया जाता है । इसके अलावा, 1 माइक्रोन आयनोमाइसिन के साथ विभिन्न उपचार समय के लिए औसत प्रतिशत एरिपेटोसिस और हीमोलिसिस, क्रमशः चित्रा 2 और चित्रा 2एफमें प्रस्तुत किए जाते हैं। 180 मिन के बाद हीमोलिसिस का उच्च मूल्य ऊष्मायन की समान मात्रा के बाद एरिप्टोसिस में कमी बताता है(चित्रा 2ई)क्योंकि कम व्यवहार्य कोशिकाएं आयनोमाइसिन के साथ उपचार के 180 min पर मौजूद हैं।

इसके अलावा, कोशिकाओं को 0, 0.25, 0.5 सहित आयनोमाइसिन की कम सांद्रता और 6 और 12 घंटे सहित लंबे उपचार के समय के लिए 1 माइक्रोन के साथ इलाज किया गया था, और एरिप्टोसिस मापा गया था(चित्रा 3)। कोशिकाओं को कम की आयनोमाइसिन सांद्रता के साथ इलाज किया जाता है कि 6 और 12 घंटे के लिए 1 माइक्रोन 1 माइक्रोन 1 माइक्रोन आयनमाइसिन(चित्रा 3)के साथ इलाज कोशिकाओं की तुलना में कम एरिप्तोसिस दिखाते हैं। चूंकि एकाग्रता कम होने और एक्सपोजर समय बढ़ाने के बाद से एरिप्टोसिस में वृद्धि नहीं हुई, इसलिए एरिप्टोसिस को ट्रिगर करने के लिए 1 माइक्रोन का उपयोग किया गया था।

एरिप्तोसिस ऊष्मायन समय और बाह्य ग्लूकोज एकाग्रता पर निर्भर है

एक्स्ट्रासेलुलर ग्लूकोज एकाग्रता प्रक्रिया के परिणाम को प्रभावित करती है। उच्च एरिपेटोसिस मान तब देखे जाते हैं जब 2 घंटे के लिए 1 माइक्रोन आयनोमाइसिन के साथ ऊष्मायन से पहले ग्लूकोज युक्त रिंगर समाधान की तुलना में ग्लूकोज-मुक्त रिंगर समाधान में एरिथ्रोसाइट्स को प्री-इनक्यूबेटेड किया जाता है। दोनों समाधानों में पूर्व-ऊष्मायन के 7 दिनों के बाद उच्चतम एरिप्टोसिस मान प्राप्त किए जाते हैं। हालांकि, सामान्य रिंगर समाधान की तुलना में ग्लूकोज-मुक्त रिंगर समाधान में प्री-इनक्यूबेशन के बाद एरिप्टोसिस अधिक है, जिसमें 5 mM ग्लूकोज होता है (वैश्विक साधनों की तुलना के लिए प्रतिनिधि भूखंडों के लिए चित्रा 4 और चित्रा 4बी देखें)। इसके अलावा, आगे तितर बितर हिस्टोग्राम एरिथ्रोसाइट सिकुड़न पर ग्लूकोज की कमी के प्रभाव का संकेत देता है(चित्रा 5ए-डी)। आगे का बिखराव प्रकाश अपवर्तन के आधार पर कोशिका आकार के लिए एक उपाय है, और बिखरे हुए प्रकाश का स्तर सीधेकोशिकाओं केआकार के आनुपातिक 33 है। ग्लूकोज मुक्त रिंगर समाधान में इनक्यूबेटेड कोशिकाएं ग्लूकोज युक्त बफर(चित्रा 5ई)में इनक्यूबेटेड कोशिकाओं की तुलना में कम आगे बिखराव दिखाती हैं, जो ग्लूकोज मुक्त वातावरण में कोशिका सिकुड़न का संकेत देती हैं।

फ्लो साइटोमेट्री मापन के अलावा, एरिप्टोसिस की पुष्टि करने के लिए एक कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं को मनाया गया। कोई उपचार के साथ एरिथ्रोसाइट्स(चित्रा 6ए)और आयनोमाइसिन उपचार के साथ(चित्रा 6बी)को एनेक्सिन-वी एलेक्सा आटा 488 कॉन्जुगेट के साथ लेबल किया गया था और माइक्रोस्कोप के तहत मनाया गया था। इलाज कोशिकाओं को बाहरी पत्रक में एनेक्सिन-वी से पीएस के बंधन के कारण एक उज्ज्वल फ्लोरेसेंस संकेत(चित्रा 6बी)दिखाया । इसके विपरीत, कोई उपचार के साथ कोशिकाओं को एक बहुत कमजोर फ्लोरेसेंस संकेत(चित्रा 6ए)बहुत कम eryptosis का संकेत दिखाया । इसके अलावा उच्च फ्लोरेसेंस सिग्नल के साथ एनेक्सिन-वी के साथ लेबल किए गए एरिपेटोटिक एरिथ्रोसाइट्स की छवियां चित्र 6सीमें दिखाई जाती हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एरिपेटोसिस और हीमोलिसिस पर विभिन्न आयनोमाइसिन सांद्रता के प्रभाव के प्रतिनिधि रेखांकन। 2 घंटे काली रेखा के लिए रिंगर समाधान में 0.4%हेमेटोक्रिट पर37 डिग्री सेल्सियस पर(एरिथ्रोसाइट्सके प्रवाह साइटोमेट्री हिस्टोसाइट्स) के साथ इलाज किया गया। प्रत्येक आंकड़े में एरिप्तोसिस का प्रतिशत दर्शाया गया है। फॉस्फेटिल्डसेरिन एक्सपोजर को एनेक्सिन-वी बाइंडिंग का उपयोग करके मापा गया था। (घ)अंकगणित का अर्थ है ± एसडी (एन = 3) कोशिकाओं के प्रतिशत एरिप्तोसिस का 2 घंटे उपचार के बाद आयनोमाइसिन की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया जाता है, और(ई)अंकगणित का अर्थ है ± एसडी (एन = 3) एक ही शर्तों के तहत आयनोमाइसिन की विभिन्न सांद्रता द्वारा एरिथ्रोसाइट्स के हीमोलिसिस का। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एरिपेटोसिस पर विभिन्न आयनमाइसिन उपचार समय के प्रभाव पर प्रतिनिधि आंकड़े। 37 डिग्री सेल्सियस(ए)30 मिन,(बी)60 मिन,(सी)120 मिन, और(डी)180 मिन रिंगर समाधान में 0.4% हेमेटोक्रिट पर 1 माइक्रोम आयनोमाइसिन (ग्रे) के साथ इलाज किया गया। ब्लैक लाइन गैर-इलाज कोशिकाओं को इंगित करती है। प्रत्येक आंकड़े में एरिप्तोसिस का प्रतिशत दर्शाया गया है। फॉस्फेटिल्डसेरिन एक्सपोजर को एनेक्सिन-वी बाइंडिंग के जरिए मापा गया था । (ई)अंकगणित का अर्थ है विभिन्न समयों के लिए 1 माइक्रोन आयनोमाइसिन के साथ इलाज कोशिकाओं के प्रतिशत एरिप्तोसिस का ± एसडी (एन = 3) । सबसे ज्यादा एरिप्तोसिस 120 मिन ट्रीटमेंट के बाद हासिल किया गया। (एफ)अंकगणित का अर्थ है विभिन्न समयों के लिए 1 माइक्रोन आयनोमाइसिन के साथ इलाज कोशिकाओं के प्रतिशत हीमोलिसिस का ± एसडी (एन = 3) । सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, क्रुस्कल-वालिस परीक्षण के साथ एक तरफा गैर-पैरामेट्रिक एनोवा किया गया था, और 120 मिन उपचार के बाद एरिप्तोसिस नियंत्रण से काफी अधिक था जैसा कि पैनल ई में इंगित किया गया है * पी एंड एलटी के लिए है; 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एरिपेटोसिस पर विभिन्न आयनमाइसिन सांद्रता और उपचार के समय का प्रभाव। अंकगणित का अर्थ है विभिन्न उपचार समय के बाद आयनमाइसिन की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज की कोशिकाओं के प्रतिशत एरिप्तोसिस का ± एसडी (एन = 3) । कोशिकाओं को 0, 0.25, 0.5, और 1 माइक्रोन सहित आयनोमाइसिन की कम सांद्रता के साथ इलाज किया गया था (6 एच और 12 घंटे)। उच्च सांद्रता और लंबे उपचार के परिणामस्वरूप उच्च एरिप्टोसिस मूल्य होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एरिप्तोसिस पर ऊर्जा की कमी का प्रभाव। (क)1 से 7 दिनों तक ग्लूकोज मुक्त रिंगर समाधान (शीर्ष आंकड़े) और रिंगर समाधान (नीचे के आंकड़े) में पूर्व-ऊष्मायन के बाद, 0.4% हेमेटोक्रिट पर 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 माइक्रोम आयनोमाइसिन (ग्रे) के साथ इलाज किए गए एरिथ्रोसाइट्स के लिए फ्लो साइटोमेट्री हिस्टोग्राम से पता चलता है कि ऊर्जा की कमी एरिप्टोसिस की सुविधा देती है। ब्लैक लाइन गैर-इलाज कोशिकाओं को इंगित करती है। प्रत्येक दिन के लिए रेखांकन में एरिप्टोसिस का प्रतिशत दर्शाया जाता है। (ख)अंकगणित का अर्थ है 1 से 7 दिनों तक रिंगर समाधान (काले सलाखों) और ग्लूकोज मुक्त रिंगर समाधान (सफेद सलाखों) में पूर्व-ऊष्मायन के बाद, 0.4% हेमेटोक्रिट पर 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 माइक्रोएम आयनोमाइसिन के साथ इलाज किए गए एरिथ्रोसाइट्स के प्रतिशत एरिप्टोसिस का ± एसडी (एन = 3) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: कोशिका के आकार पर ऊर्जा की कमी का प्रभाव। ग्लूकोज मुक्त रिंगर समाधान (ग्रे) और रिंगर समाधान (काली रेखा) में प्री-इनक्यूबेशन के बाद(ए)1 दिन,(बी)3 दिन,(सी)5 दिन, और(डी)7 दिनों के लिए, ग्लूकोज-फ्री रिंगर सॉल्यूशन (ग्रे) और रिंगर समाधान (ब्लैक लाइन) में प्री-इनक्यूबेशन के बाद, 0.4% हेमेटोक्रिट पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 माइक्रोम आयनमाइसिन के साथ इलाज किया गया एरिथ्रोसाइट्स के लिए आगे तितर बितर। समय के साथ आगे तितर बितर हिस्टोग्राम ग्लूकोज मुक्त बफर में एरिथ्रोसाइट सिकुड़न इंगित करता है । (ई)अंकगणित का अर्थ है ± एसडी (एन = 3) एरिथ्रोसाइट्स की आगे की तितर-बितर तीव्रता के लिए 1 μM ionomycin के साथ 2 घंटे के लिए 0.4% हेमेटोक्रिट पर 2 घंटे के लिए इलाज किया, रिंगर समाधान (काले सलाखों) और ग्लूकोज मुक्त रिंगर समाधान (सफेद सलाखों) में पूर्व ऊष्मायन के बाद 1 से 7 दिनों तक । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र6: एंथ्रोसाइट्स की कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियां (ए) 0 माइक्रोएम, (बी) और (सी) 1 माइक्रोएम आयनोमाइसिन 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.4% हेमेटोक्रिट पर 2 घंटे के लिए इलाज किया गया। 40x उद्देश्य आवर्धन पैनल ए और बी में छवियों के लिए इस्तेमाल किया गया था, और 100x उद्देश्य आवर्धन का उपयोग पैनल सी पीएस के लिए छवियों को स्वस्थ एरिथ्रोसाइट्स में लेने के लिए किया जाता था, कोशिका झिल्ली के आंतरिक पत्रक पर स्थित है, इसलिए पैनल ए में कोई फ्लोरेसेंस सिग्नल नहीं है। पैनलों में बी और सी एरिथ्रोसाइट्स को एरिप्टोसिस के लिए प्रेरित किया गया है और कोशिका झिल्ली के बाहरी पत्रक में स्थानांतरित एनेक्सिन-वी से पीएस के बंधन के परिणामस्वरूप एक उज्ज्वल फ्लोरेसेंस संकेत होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सेल घनत्व /हेमेटोक्रिट आयनमाइसिन एकाग्रता बफ़र पूर्व ऊष्मायन आयनमाइसिन के साथ उपचार का समय पता लगाने की विधि संदर्भ
1.65 x 108 कोशिकाएं/mL 0.3 एमएम बफर ए * बफर ए में 36 घंटे 1 घंटा एनेक्सिन वी 12
0.40% 1 एमएम रिंगर समाधान रिंगर में 48 घंटे 1 घंटा एनेक्सिन वी 17
50% 10 एमएम बफर बी ** - 3 घंटे मेरोस्यानाइन 540 18
0.40% 1 एमएम रिंगर समाधान रिंगर में 48 घंटे 1 घंटा एनेक्सिन वी 19
0.40% 1 एमएम रिंगर समाधान रिंगर में 48 घंटे 1 घंटा एनेक्सिन वी 20
2% 1 एमएम रिंगर समाधान - 4 घंटे एनेक्सिन वी 21
0.40% 1 एमएम रिंगर समाधान - 0.5 घंटे एनेक्सिन वी 22
10% 1 एमएम रिंगर समाधान - 3 घंटे एनेक्सिन वी 23
0.40% 10 एमएम रिंगर समाधान - 0.5 घंटे एनेक्सिन वी 24
0.40% 1 एमएम रिंगर समाधान रिंगर में 48 घंटे 0.5 घंटे एनेक्सिन वी 25
2 x 106 कोशिकाएं/mL 1 एमएम हेप्स-बफर लवलाइन (एचबीएस) - 0.5 घंटे एनेक्सिन वी 26
* बफर ए: 10 एमएम एचईपीईएस, 150 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम केसीएल, 1 एमएम एमजीसीएल2·6H2O, 10 mM ग्लूकोज, और 1.8 m CaCl2·2H2O
**बफर बी: 5 एमएम ट्रिस, 100 एमएम केसी1, 60 एमएम एनसीएल, और 10 एमएम ग्लूकोज

तालिका 1: साहित्य में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न प्रोटोकॉल आयनोमाइसिन का उपयोग करके एरिप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए।

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Discussion

इस प्रक्रिया का लक्ष्य आयनोफोर एकाग्रता, उपचार समय और बाह्य ग्लूकोज एकाग्रता के लिए इष्टतम मूल्य प्रदान करना है, जो एरिप्तोसिस के सफल शामिल ीकरण को सुनिश्चित करने में महत्वपूर्ण कारक हैं। प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम बाह्य ग्लूकोज की कमी है, जो इसके महत्व के बावजूद, साहित्य में पर्याप्त रूप से जोर नहीं दिया गया है । सामान्य रिंगर समाधान (5 mM) में चीनी की मात्रा का एरिप्तोसिस पर एक निरोधात्मक प्रभाव पड़ता है। एक्स्सेल्युलर वातावरण में ग्लूकोज की कमी सेलुलर तनाव को प्रेरित करती है और प्रोटीन किनेज सी (पीकेसी) को सक्रिय करती है, जिसके परिणामस्वरूप कैल्शियम और पोटेशियम चैनलों की सक्रियता होती है। इसके परिणामस्वरूप साइटोसोलिक अंतरिक्ष30,31,34 में सीए 2 + के प्रवेश में वृद्धि होती है और अंततः हाथापाई16को सक्रिय करता है, जो एरिप्तोसिस को बढ़ाता है। पोटेशियम चैनल की सक्रियता के परिणामस्वरूप कोशिका से पोटेशियम क्लोराइड रिसाव होता है, जिससे एरिथ्रोसाइट सिकुड़न35हो जाता है।

ऊपर उल्लिखित प्रक्रिया को हीमोलिसिस पर विशिष्ट ध्यान के साथ किया जाना चाहिए। एक अनुकूलित आयनोफोर एकाग्रता का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, जो एरिप्तोसिस को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त उच्च है, और हीमोलिसिस को रोकने के लिए पर्याप्त कम है। इसी तरह, थोड़े समय के लिए आयनोमाइसिन के साथ इनक्यूबेटिंग एरिथ्रोसाइट्स के परिणामस्वरूप कम एरिप्तोसिस होता है जबकि बहुत लंबे ऊष्मायन से कोशिका झिल्ली व्यवधान और हीमोलिसिस हो सकता है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि जबकि प्रस्तुत प्रोटोकॉल अत्यधिक विश्वसनीय है जब एक ही एरिथ्रोसाइट नमूने पर प्रदर्शन किया जाता है, तो विभिन्न व्यक्तियों की कोशिकाएं आयनोमाइसिन के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया करती हैं और विभिन्न नमूनों के बीच अंतर-विषय परिवर्तनशीलता हो सकती है।

फ्लो साइटोमेट्री से डेटा विश्लेषण पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। फ्लो साइटोमीटर से प्राप्त प्रतिशत एरिप्टोसिस उनके बाहरी पत्रक पर पीएस के साथ सेल आबादी के प्रतिशत को इंगित करता है। हालांकि, इस संख्या के आधार पर एनेक्सिन-वी बाध्यकारी की विभिन्न तीव्रता वाली कोशिकाओं को प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है। एनेक्सिन-वी सेल सतह पर उजागर पीएस को बांधता है, जिसमें पीएस36,37,38के लिए बहुत अधिक आत्मीयता और उच्च विशिष्टता होती है। हालांकि, जैसा कि इस रिपोर्ट में माइक्रोस्कोपी छवियों में दिखाया गया है, विभिन्न कोशिकाएं एनेक्सिन-वी बाध्यकारी तीव्रता में अंतर दिखाती हैं । उनकी झिल्ली पर कम पीएस वाली कोशिकाओं में कम फ्लोरेसेंस तीव्रता होती है, जबकि कोशिका झिल्ली पर उच्च पीएस अधिभोग के परिणामस्वरूप उच्च फ्लोरेसेंस तीव्रता होती है।

इस पेपर में पेश किए गए प्रोटोकॉल को एक्सट्रासेलुलर सीए2 + एकाग्रता बढ़ाकर संशोधित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, आयोनोमाइसिन का उपयोग 1 एमएम सीएसीएल2की उपस्थिति में एरिप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए किया गया था; उच्च सीए2 + सांद्रता से इंट्रासेल्युलर कैल्शियम का स्तर बढ़ सकता है और अधिक एरिप्टोसिस हो सकता है। इसके अलावा, विभिन्न कैल्शियम आयनोफोर, जैसे चयनोफोर और कैल्सिकसिन, आयनमाइसिन की तुलना में सीए2 +की इंट्रासेलुलर एकाग्रता को बढ़ाने की विभिन्न क्षमता हो सकती है, और इसके परिणामस्वरूप विभिन्न एरिप्टोसिस मूल्य हो सकते हैं। हालांकि, एरिथ्रोसाइट्स के लगातार एरिप्टोसिस को उल्लिखित प्रोटोकॉल के साथ आयनोमाइसिन का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है और प्रयोगशाला में एरिप्तोसिस के आणविक तंत्र की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, रोगग्रस्त स्थितियों39,40इन विट्रोकी नकल करता है, और अन्य अनुप्रयोगों के बीच एरिपेटोसिस को बाधित करने वाले स्क्रीन संभावित चिकित्सा विज्ञान।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच ग्रांट R15ES030140 और एनएसएफ ग्रांट CBET1903568 ने सपोर्ट किया। ओहियो विश्वविद्यालय में रस कॉलेज ऑफ इंजीनियरिंग एंड टेक्नोलॉजी और केमिकल एंड बायोमॉलिक्यूलर इंजीनियरिंग विभाग से वित्तीय सहायता को भी स्वीकार किया जाता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use

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References

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