Induksjon av Eryptosis i røde blodlegemer ved hjelp av en kalsium Ionophore

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En protokoll for induksjon av eryptosis, programmert celle død i erytrocytter, ved hjelp av kalsium ionophore, ionomycin, er gitt. Vellykket eryptosis vurderes ved å overvåke lokalisering fosfatidylserin i membranen ytre pakningsvedlegget. Faktorer som påvirker suksessen til protokollen har blitt undersøkt og optimale forhold gitt.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Eryptosis, erytrocytt programmert celle død, forekommer i en rekke hematologiske sykdommer og under skade på erytrocytter. Et kjennetegn på eryptotic celler er tap av kant asymmetri i cellemembranen, noe som fører til translokasjon av fosfatidylserin til membranen ytre pakningsvedlegget. Denne prosessen utløses av økt intracellulære konsentrasjon av ca2 +, som aktiverer scramblase, et enzym som letter toveis bevegelse av fosfolipider mellom membran brosjyrer. Gitt viktigheten av eryptosis i ulike syke forhold, har det vært forsøk på å indusere eryptosis in vitro. Slike anstrengelser har generelt vært avhengig av kalsium ionophore, ionomycin, for å forbedre intracellulære ca2 + konsentrasjon og indusere eryptosis. Det er imidlertid rapportert om mange uoverensstemmelser i litteraturen om fremgangsmåten for å indusere eryptosis ved hjelp av ionomycin. Heri rapporterer vi en trinnvis protokoll for ionomycin-indusert eryptosis i menneskelige erytrocytter. Vi fokuserer på viktige trinn i prosedyren inkludert ionophore konsentrasjon, inkubasjonstid, og glukose tømming, og gi representative resultat. Denne protokollen kan brukes til å reproduserbar indusere eryptosis i laboratoriet.

Introduction

Programmert celle død i erytrocytter, også kjent som eryptosis, er vanlig i mange kliniske tilstander og hematologiske lidelser. Eryptosis er assosiert med celle krymping og tap av fosfolipid asymmetri i cellen plasma membran1,2. Tap av asymmetri resulterer i translokasjon av fosfatidylserin (PS), et lipid normalt lokalisert i det indre pakningsvedlegget3,4, til cellenes ytre pakningsvedlegget, som signaliserer til makrofager for å fagocyttere og fjerne defekte erytrocytter5,6,7,8. På slutten av den normale levetiden av erytrocytter, sikrer fjerning av eryptotic celler av makrofager balansen av erytrocytter i omløp. Men i syke forhold, slik som sigdcellesykdom og talassemi9,10,11, kan forsterket eryptosis føre til alvorlig anemi2. På grunn av sin betydning i hematologiske sykdommer, det er betydelig interesse for å undersøke faktorene inducing eller hemme eryptosis og molekylære mekanismer underliggende denne prosessen.

Plasma membranen av friske erytrocytter er asymmetrisk, med ulike fosfolipider lokalisere på ytre og indre brosjyrer. Membran asymmetri er primært regulert av virkningen av membran enzymer. Aminophospholipid translocase forenkler transport av aminophospholipids, PS og phosphatidylethanolamine (PE), ved å dirigere disse lipider til celle indre pakningsvedlegget. På den annen side, floppase transporterer kolin som inneholder fosfolipider, phosphatidylcholine (PC) og sphingomyelin (SM), fra den indre til den ytre pakningsvedlegget av cellemembranen12. Men i motsetning til friske celler, er membranen av eryptotic erytrocytter forvrengt. Dette skyldes virkningen av et tredje enzym, scramblase, som forstyrrer fosfolipid asymmetri ved å tilrettelegge toveis transport av aminophospholipids13,14,15,16. Scramblase aktiveres ved forhøyede intracellulære nivåer av ca2 +. Derfor er kalsium ionophores, som letter transporten av ca2 + på tvers av cellemembranen12, effektive induktorer av eryptosis.

Ionomycin, en kalsium ionophore, har blitt mye brukt til å indusere eryptosis i erytrocytter12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Ionomycin har både hydrofile og hydrofobe grupper, som er nødvendige for å binde og fange ca2 + ION, og transportere den til cytosolic plass27,28,29. Dette fører til aktivering av scramblase og translokasjon av PS til den ytre pakningsvedlegget, som lett kan oppdages ved hjelp av annexin-V, en mobilnettet protein med høy affinitet til PS12. Selv om utløser eryptosis av ionomycin er ofte rapportert, det er betydelig metode avvik i litteraturen (tabell 1). Bestanden av erytrocytter som gjennomgår eryptosis avhenger av ulike faktorer som ionophore konsentrasjon, behandlingstid med ionophore, og sukkerinnholdet i ekstracellulære miljø (glukose nedbryting aktiverer kanaler og Letter registreringen av ca2 + inn i cytosolic rommet)30,31. Det er imidlertid liten konsistens i disse faktorene i litteraturen, noe som gjør det vanskelig å utføre eryptosis reproduserbar in vitro.

I denne protokollen, presenterer vi en trinnvis fremgangsmåte for å indusere eryptosis i menneskelige erytrocytter. Faktorer som påvirker vellykkede eryptosis inkludert ca2 + konsentrasjon, ionophore konsentrasjon, behandlingstid, og pre-inkubasjons i glukose-utarmet buffer er undersøkt og optimale verdier rapporteres. Denne fremgangsmåten viser at pre-inkubasjons av erytrocytter i en glukose fri buffer øker betydelig prosentandelen av eryptosis sammenlignet med glukose inneholdende buffer. Denne protokollen kan brukes i laboratoriet for å produsere eryptotic erytrocytter for ulike bruksområder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle humane blodprøver brukt i protokollen beskrevet nedenfor ble kjøpt som de-identifiserte prøvene. Ingen menneskelig var direkte involvert eller rekruttert for denne studien. Retningslinjene for Declaration of Helsinki skal brukes når forskning involverer mennesker.

1. erytrocytt isolering fra hele blod

  1. Tilsett 500 μL av hele blod i syre citrate druesukker (ACD) (oppbevares ved 4 ° c) til et mikrosentrifugen rør.
    Merk: hele blod ble kjøpt i ACD. Ifølge selskapet tilsettes 1,5 mL av ACD til 7 mL hele blod (8,5 mL total volum).
  2. Sentrifuger hele blodet på 700 x g i 5 min ved romtemperatur (RT) og fjerne den klare plasma og tynn Buffy pelsen ved hjelp av en pipette å forlate den røde erytrocytt laget.
  3. Klargjør 1 L av ringe løsningen som inneholder 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 32 mm HEPES, 5 mm glukose og 1 mm CaCl2. Juster pH til 7,4 ved å legge til 2 μL dråper 1,0 M NaOH. For å klargjøre den glukose frie ringe løsningen, følg den samme protokollen, men ikke ta med glukose i løsningen.
  4. Vask erytrocytter 2x i ringe løsning ved å suspendere celle pellet i 1,5 mL ringe løsning, sentrifugering ved 700 x g i 5 min ved RT, og fjerne supernatanten.
  5. Lag en 0,4% hematokrit ved å blanding 40 μL av erytrocytt pellet i 9 960 μL glukose fri ringe løsning for å nå et endelig volum på 10 mL.
    Merk: hematokrit er et begrep som brukes for å referere til volumet brøkdel av erytrocytter i suspensjon. En 0,4% hematokrit er en suspensjon som inneholder 0,4% erytrocytter.
  6. Ruge celle fjæringen ved 37 ° c i 7 dager.

2. behandling av erytrocytter med ionomycin og måling av hemolyse

  1. Oppløse 1 mg ionomycin kalsium salt i 630 μL av dimethyl sulfoxide (DMSO) for å nå en endelig konsentrasjon på 2 mM. Alikvot og oppbevares ved-20 ° c.
  2. Ta 1 mL av 0,4% hematokrit fra trinn 1,5 og tilsett 0,5 μL av 2 mM ionomycin for å nå en endelig konsentrasjon på 1 μM. ruge for 2 timer ved 37 ° c.
    1. Bruk 1 mL av hematokrit uten ionomycin behandling som negativ kontroll.
  3. Sentrifuger den ionomycin og ubehandlet hematocrits ved 700 x g for 5 min ved RT, og fjerne deres supernatanter å forlate cellen pellets i bunnen av rørene.
  4. Vask cellene 3x med ringe løsning ved å suspendere celle pellets i 1,5 mL ringe løsning, sentrifugering ved 700 x g i 5 min ved RT og forkaste supernatanter.
  5. For å måle hemolyse, tilsett 1 mL ubehandlet 0,4% hematokrit fra trinn 1,5 til et mikrosentrifugen rør og ruge for 2 timer ved 37 ° c som negativ kontroll for hemolyse (0%).
  6. Tilsett 1 mL ubehandlet 0,4% hematokrit fra trinn 1,5 til et mikrosentrifugen rør og sentrifuger på 700 x g i 5 min ved RT. Fjern supernatanten og tilsett 1 ml destillert vann til celle pellet og ruge for 2 timer ved 37 ° c som positiv kontroll for hemolyse (100%).
  7. Tilsett 1 mL av den ionomycin 0,4% hematokrit fra trinn 2,2 til et mikrosentrifugen rør.
  8. Sentrifuger ubehandlet celler, behandlede celler, og cellene i destillert vann ved 700 x g i 5 min ved RT.
  9. Ta 200 μL av supernatanter og Legg til en 96-brønn plate.
  10. Mål absorbansen ved 541 NM ved hjelp av en mikroplate-leser.
  11. Beregn hemolyse ved hjelp av Formel 132:

    % Hemolyse = (AT -a0)/(a100 -a0) * 100

    der A0 er absorbansen av erytrocytter i ringe løsning, a100 er absorbansen av erytrocytter i vann, og aT er absorbansen av behandlede erytrocytter ved ionomycin.

3. Annexin-V bindende analysen

  1. Fortynne 2 mL av det 5x annexin V innbindingen buffer inne 8 mL av fosfat-bufret Saline (PBS) å få 1x innbindingen buffer.
  2. Resuspend de ionomycin og ubehandlede celle pellets fra trinn 2,4 i 1 mL 1x bindings buffer.
  3. Ta 235 μL av celle fjæringen i bindings bufferen og tilsett 15 μL av Annexin V-Alexa Flour 488 bøy.
  4. Ruge cellene ved RT i 20 minutter på et mørkt sted. Sentrifuger på 700 x g i 5 min ved RT og fjern supernatanten.
  5. Vask cellene 2x med 1x bindings buffer ved å suspendere celle pellet i 1,5 mL av innbindings bufferen, sentrifugering ved 700 x g i 5 min ved RT og fjerne supernatanten.
  6. Resuspend celle pellets i 250 μL av 1x bindings buffer for strømnings flowcytometri målinger.

4. Flow flowcytometri

  1. Overføring 200 μL av annexin-V beiset erytrocytter til 1 mL runde bunn polystyren rør kompatibel med Flow flowcytometri.
  2. Logg inn på flyt flowcytometri programvare og klikk på den nye eksperiment knappen. Klikk på den nye rør knappen. Velg det globale arket , og velg Bruk analyse for å måle fluorescens intensitet med en eksitasjon bølgelengde på 488 NM og en utslipps bølgelengde på 530 NM.
  3. Angi antall celler til 20 000 som skal samles for analyse av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS).
  4. Velg ønsket rør og klikk på Load knappen. Klikk på Record knappen for Forward scatter og side scatter målinger. Gjenta for alle prøvene.
  5. Rett falle i staver opp på eksemplar knapp og falle i staver opp på søke bakst analyse å utvikle resultatet arkiv.
  6. Høyreklikk på prøven knappen og klikk på generere FSC-filer.
  7. Legg flyten flowcytometri data (FSC-filer) på arbeidsplassen av Flow flowcytometri programvare.
  8. Analysere kontroll data ved å velge cellen befolkning av interesse og legge statistikk for eryptosis verdi.
    1. Dobbeltklikk på kontroll og velg histogram versus fluorescens intensitet.
    2. Klikk på gate-knappen for å tegne en port på histogrammet som indikerer prosentandelen av eryptosis.
  9. Bruk den samme statistikken for alle andre eksperimentelle rør for å få de eryptosis verdiene. Høyreklikk på kontroll og velg Kopier analyse til gruppe.
  10. Etter riktig gating alle prøvene, overføre de analyserte data ved å dra og slippe dem inn i layout editor.
    1. Overlapp de analyserte dataene med kontroll i redigeringsprogrammet for oppsett.
    2. Angi ønskede histogrammer og intensitet ved å endre x-og y-aksen i de overlappende diagrammene.
    3. Eksport image fil-størrelse av klikker opp på eksport knapp og bevare grafene inne ønsket plasseringen.

5. konfokalmikroskopi mikroskopi

  1. Overfør 5 μL av annexin-V-beiset celler på et mikroskop lysbilde og dekk den med en cover slip. Oppbevares på et mørkt sted for å hindre photobleaching.
  2. Bruk Argon laser av konfokalmikroskopi fluorescens mikroskop for å observere cellene spent på 488 NM med ønsket forstørrelser.
    Merk: et konfokalmikroskopi mikroskop er ikke nødvendigvis nødvendig, og alle mikroskop med fluorescens evner kan brukes til å skaffe fluorescens bilder som demonstrerer annexin-V binding.
  3. Skaff fluorescens bilder av kontrollen (ikke-behandlede celler) og behandlede celler.
    Merk: ikke-behandlede celler forventes å vise svært svake fluorescens signaler, mens behandlede celler forventes å vise lyse grønne fluorescens på sine membraner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optimalisering av ionomycin konsentrasjon

Mens ionomycin er nødvendig for å indusere eryptosis, økte ionomycin konsentrasjoner kan føre til hemolyse (dvs. lyse av erytrocytter og frigjøring av hemoglobin), som må unngås. Behandling av erytrocytter med 1 μM ionomycin i ringer løsning for 2 h er nok til å indusere eryptosis, noe som gjenspeiles av vellykket merking med annexin-V Alexa Flour 488 bøye og kvantifisering av FACS analyse (figur 1A). Høyere konsentrasjoner av ionomycin (5 og 10 μM) resulterer i en svak økning i eryptosis (figur 1a-D). Men slike konsentrasjoner også forbedre hemolyse (figur 1E), som ikke er ønskelig. For å holde deg under 5% hemolyse, skal 1 μM ionomycin brukes.

Behandlingstid med ionomycin

Inkubasjons av erytrocytter med ionomycin i ringer løsning for så lite som 30 min er nok til å indusere eryptosis (figur 2A). Økt inkubasjonstid øker nivået av eryptosis, målt ved den annexin V-bindende analysen, for opp til 2 h (figur 2B, C). Men videre inkubasjonstid resulterer i en liten nedgang i nivået av eryptosis (figur 2D). Maksimal eryptosis ble oppnådd etter 2 h behandling med 1 μM ionomycin, og for alle andre behandlingstider ble lavere eryptosis oppnådd (figur 2E). Representative Flow flowcytometri histogrammer er presentert i figur 2A-D. I tillegg er gjennomsnittlig prosentandel eryptosis og hemolyse, for ulike behandlingstider med 1 μM ionomycin, presentert i figur 2E og figur 2F, henholdsvis. Den høyeste verdien av hemolyse etter 180 min forklarer reduksjonen i eryptosis etter samme mengde inkubasjons (figur 2E) som mindre levedyktige celler eksisterer på 180 min. behandling med ionomycin.

Videre ble celler behandlet med lave konsentrasjoner av ionomycin, inkludert 0, 0,25, 0,5 og 1 μM for lengre behandlingstider, inkludert 6 og 12 timer, og eryptosis ble målt (Figur 3). Celler behandlet med ionomycin konsentrasjoner av lavere at 1 μM for 6 og 12 h viser lavere eryptosis sammenlignet med cellene behandlet med 1 μM ionomycin (Figur 3). Siden redusere konsentrasjonen og øke eksponeringstiden ikke forsterke eryptosis, 1 μM ble brukt til å utløse eryptosis.

Eryptosis er avhengig av inkubasjonstid og ekstracellulære glukose konsentrasjon

Ekstracellulære glukose konsentrasjon påvirker utfallet av prosessen. Høyere eryptosis verdier observeres når erytrocytter er pre-inkubert i glukose fri ringe løsning sammenlignet med glukose inneholdende ringe løsning før inkubasjons med 1 μM ionomycin for 2 timer. De høyeste eryptosis verdiene oppnås etter 7 dager med pre-inkubasjons i begge løsninger. Imidlertid er eryptosis høyere etter pre-inkubasjons i glukose fri ringe løsning sammenlignet med normal ringer løsning, som inneholder 5 mM glukose (se Figur 4A for representative tomter og Figur 4B for sammenligning av globale midler). I tillegg frem scatter histogrammer indikerer effekten av glukose tømming på erytrocytt krymping (figur 5A-D). Forward scatter er et mål for Cellestørrelse basert på lysbrytning, og nivået av lys spredt er direkte proporsjonal med størrelsen på cellene33. Cellene inkubert i glukose fri ringer løsning viser mindre fremover scatter i forhold til cellene inkubert i glukose-inneholdende buffer (figur 5E), indikerer celle krymping i glukose-fritt miljø.

I tillegg til strømnings flowcytometri målinger, ble celler observert under et konfokalmikroskopi fluorescens mikroskop for å bekrefte eryptosis. Erytrocytter uten behandling (figur 6A) og med ionomycin behandling (figur 6B) ble merket med annexin-V Alexa mel 488 bøye og observert under mikroskop. Behandlede celler viste en lys fluorescens signal (figur 6B) på grunn av bindingen av ANNEXIN-V til PS i den ytre pakningsvedlegget. I kontrast viste celler uten behandling en meget svak fluorescens signal (figur 6a) indikerer svært lav eryptosis. Ytterligere eksempel bilder av eryptotic erytrocytter merket med annexin-V med høy fluorescens signal er vist i figur 6C.

Figure 1
Figur 1: representative grafer av effekten av ulike ionomycin konsentrasjoner på eryptosis og hemolyse. Flow flowcytometri histogrammer av erytrocytter behandlet med (A) 1 μM, (B) 5 μm, og (C) 10 μM Ionomycin (grå) ved 37 ° c ved 0,4% hematokrit i ringe løsning for 2 h. svart linje indikerer ikke-behandlede celler. Prosentandelen av eryptosis er angitt i hver figur. Fosfatidylserin eksponering ble målt ved hjelp av annexin-V binding. (D) aritmetiske betyr ± SD (n = 3) av prosentandelen eryptosis av celler behandlet med ulike konsentrasjoner av ionomycin etter 2 h behandling, og (E) aritmetikk betyr ± SD (n = 3) av hemolyse av erytrocytter ved ulike konsentrasjoner av ionomycin under samme forhold. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representative tall på effekten av ulike ionomycin behandlingstider på eryptosis. Flow flowcytometri histogrammer av erytrocytter behandlet med 1 μM ionomycin (grå) ved 37 ° c for (A) 30 min, (B) 60 min., (C) 120 min. og (D) 180 min ved 0,4% hematokrit i ringe løsning. Svart linje angir ikke-behandlede celler. Prosentandelen av eryptosis er angitt i hver figur. Fosfatidylserin eksponering ble målt gjennom annexin-V binding. (E) aritmetikk betyr ± SD (n = 3) av prosentvis eryptosis av celler behandlet med 1 μM ionomycin for forskjellige tider. Den høyeste eryptosis ble oppnådd etter 120 min behandling. (F) aritmetiske midler ± SD (n = 3) av prosent hemolyse av celler behandlet med 1 μM ionomycin for forskjellige tider. For statistisk analyse, enveis ikke-parametrisk ANOVA med Kruskal-Wallis-test ble utført, og eryptosis etter 120 min behandling var signifikant høyere enn kontroll som angitt i panelet E. * er for p < 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: effekt av ulike ionomycin konsentrasjoner og behandlingstider på eryptosis. Aritmetiske betyr ± SD (n = 3) av prosentandelen eryptosis av celler behandlet med ulike konsentrasjoner av ionomycin er vist etter ulike behandlingstider. Cellene ble behandlet med lave konsentrasjoner av ionomycin, inkludert 0, 0,25, 0,5 og 1 μM for lengre eksponering (6 timer og 12 timer). Høyere konsentrasjoner og lengre behandlinger resulterte i høyere eryptosis verdier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: effekt av energiforbruk på eryptosis. (A) flyt flowcytometri histogram for erytrocytter behandlet med 1 μM ionomycin (grå) ved 37 ° c for 2 timer ved 0,4% hematokrit, etter pre-inkubasjons i glukose fri ringe løsning (topp tall) og ringe løsning (bunn tall) fra 1 til 7 dager, avslører at energi mangel Letter eryptosis. Svart linje angir ikke-behandlede celler. Prosenter av eryptosis er angitt i grafene for hver dag. (B) aritmetisk betyr ± SD (n = 3) av prosent eryptosis av erytrocytter behandlet med 1 μM ionomycin ved 37 ° c for 2 timer ved 0,4% hematokrit, etter pre-Inkubasjons i ringe løsning (svarte striper) og glukose fri ringe løsning (hvite striper) fra 1 til 7 dager. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: effekt av energiforbruk på Cellestørrelse. Videresend punktdiagram histogram for erytrocytter behandlet med 1 μM ionomycin ved 37 ° c for 2 h ved 0,4% hematokrit, etter inkubasjons i glukose fri ringe løsning (grå) og ringe løsning (svart linje) for (A) 1 dag, (B) 3 dager, (C) 5 dager, og (D) 7 dager. Den fremover scatter histogrammet over tid indikerer erytrocytt krymping i glukose fri buffer. (E) aritmetiske midler ± SD (n = 3) fremover scatter intensitet av erytrocytter behandlet med 1 μM ionomycin ved 37 ° c for 2 t ved 0,4% hematokrit, etter pre-Inkubasjons i ringer løsning (svarte striper) og glukose-fri ringer løsning (hvite søyler) fra 1 til 7 dager. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: konfokalmikroskopi fluorescens mikroskopi bilder av erytrocytter som er behandlet med (A) 0 μM, (B) og (C) 1 μM ionomycin ved 37 ° c i 2 timer ved 0,4% hematokrit. 40x objektiv forstørrelse ble brukt for bilder i panelene A og B, og 100 k objektiv forstørrelse ble brukt til å ta bilder for panel C. PS i friske erytrocytter er plassert på den indre pakningsvedlegget av cellemembranen, derfor er det ingen fluorescens signal i panel A. I paneler B og C erytrocytter har blitt indusert for eryptosis og det er en lys fluorescens signal som følge av bindingen av annexin-V til PS translocated til den ytre pakningsvedlegget av cellemembranen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Celle tetthet/hematocrit Ionomycin konsentrasjon Buffer Pre-inkubasjons Behandlingstid med ionomycin Gjenkjennings metode Referanse
1,65 x 108 celler/ml 0,3 mM Buffer A * 36 h i buffer A 1 time med Annexin V 12
0,40 prosent 1 mM med Ringe løsning 48 h i ringer 1 time med Annexin V 17
50 prosent 10 mM av Buffer B * * - 3 timer med Merocyanine 540 18
0,40 prosent 1 mM med Ringe løsning 48 h i ringer 1 time med Annexin V 19
0,40 prosent 1 mM med Ringe løsning 48 h i ringer 1 time med Annexin V 20
2 1 mM med Ringe løsning - 4 timer med Annexin V 21
0,40 prosent 1 mM med Ringe løsning - 0,5 h Annexin V 22
10 1 mM med Ringe løsning - 3 timer med Annexin V 23
0,40 prosent 10 mM av Ringe løsning - 0,5 h Annexin V 24
0,40 prosent 1 mM med Ringe løsning 48 h i ringer 0,5 h Annexin V 25
2 x 106 celler/ml 1 mM med HEPES-bufret saltvann (HBS) - 0,5 h Annexin V 26
* Buffer A: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2· 6h2O, 10 mM glukose og 1,8 mm CaCl2· 2h2O
* * Buffer B: 5 mM Tris, 100 mM KC1, 60 mM NaCl og 10 mM glukose

Tabell 1: ulike protokoller som brukes i litteraturen for å indusere eryptosis ved hjelp av ionomycin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med denne prosedyren er å gi optimale verdier for ionophore konsentrasjon, behandlingstid, og ekstracellulære glukose konsentrasjon, som er viktige faktorer for å sikre vellykket induksjon av eryptosis. Et kritisk trinn i protokollen er tømming av ekstracellulære glukose, som, til tross for dens betydning, ikke har blitt tilstrekkelig vektlagt i litteraturen. Sukkerinnholdet i normal ringe løsning (5 mM) har en hemmende effekt på eryptosis. Glukose reduksjon i ekstracellulære miljøet induserer cellulær stress og aktiverer protein kinase C (PKC), noe som resulterer i aktivering av kalsium og kalium kanaler. Dette resulterer i en økning i oppføringen av ca2 + i cytosolic Space30,31,34 og til slutt aktiverer scramblase16, noe som øker eryptosis. Aktivering av kalium kanal resulterer også i kalium klorid lekkasje ut av cellen, noe som fører til erytrocytt krymping35.

Prosedyren skissert ovenfor må utføres med spesiell oppmerksomhet til hemolyse. Det er viktig å bruke en optimalisert ionophore konsentrasjon, som er høy nok til å indusere eryptosis, og lav nok til å hindre hemolyse. Tilsvarende, incubating erytrocytter med ionomycin for en kort periode resulterer i lav eryptosis mens svært lang inkubasjons kan føre til celle membran avbrudd og hemolyse. Det bør også bemerkes at mens den presenterte protokollen er svært pålitelig når den utføres på samme erytrocytt prøven, celler fra forskjellige individer reagerer forskjellig på ionomycin og det kan være Inter-faget variasjon mellom ulike prøver.

Spesiell oppmerksomhet bør rettes mot dataanalyse fra Flow flowcytometri. Prosentandelen eryptosis oppnådd fra strømnings flowcytometer indikerer prosentandelen av celle populasjonen med PS på deres ytre pakningsvedlegg. Celler med ulik intensitet av annexin-V-binding kan imidlertid ikke skilles basert på dette tallet. Annexin-V binder seg til PS eksponert på celleoverflaten, med en svært høy affinitet og høy spesifisitet til PS36,37,38. Som vist i de mikroskopi bildene i denne rapporten, viser imidlertid forskjellige celler forskjeller i annexin-V-binding intensitet. Cellene med lav PS på sine membraner har lav fluorescens intensitet, mens høyere PS belegg på celle membran resulterer i høyere fluorescens intensitet.

Protokollen som presenteres i denne utredningen kan modifiseres ved å øke ekstracellulære ca2 + konsentrasjon. I denne protokollen ble ionomycin brukt til å indusere eryptosis i nærvær av 1 mM CaCl2; høyere ca2 + konsentrasjoner kan føre til forbedrede intracellulære kalsium nivåer og kan indusere mer eryptosis. I tillegg kan forskjellige kalsium-ionophores, for eksempel selectophore og calcimycin, ha ulik evne til å forsterke den intracellulære konsentrasjonen av ca2 +, sammenlignet med ionomycin, og kan resultere i forskjellige eryptosis verdier. Imidlertid kan konsistent eryptosis av erytrocytter oppnås ved hjelp ionomycin med skissert protokollen og kan brukes i laboratoriet for å undersøke molekylære mekanismer av eryptosis, etterligne syke forhold39,40in vitro, og skjermen potensielle legemiddel legemidler som hemmer eryptosis, blant andre programmer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH gi R15ES030140 og NSF Grant CBET1903568. Finansiell støtte fra Russ College of Engineering and Technology og Institutt for kjemisk og Biomolecular Engineering ved Ohio University er også anerkjent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bratosin, D., et al. Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria. Cell Death and Differentiation. 8, (12), 1143-1156 (2001).
  2. Lang, E., Lang, F. Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).
  3. Garnier, M., et al. Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition. Metabolism. 39, (8), 794-798 (1990).
  4. Verkleij, A. J., et al. The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323, (2), 178-193 (1973).
  5. de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story. Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).
  6. Fadok, V. A., et al. A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells. Nature. 405, (6782), 85-90 (2000).
  7. Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, (8), 627-633 (2001).
  8. Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells. BioEssays. 22, (10), 878-881 (2000).
  9. Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 27, (9), 717-722 (2010).
  10. Kuypers, F. A., et al. Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V. Blood. 87, (3), 1179-1197 (1996).
  11. Lang, F., Lang, E., Fller, M. Physiology and Pathophysiology of Eryptosis. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39, (5), 308-314 (2012).
  12. Wróbel, A., Bobrowska-Hägerstrand, M., Lindqvist, C., Hägerstrand, H. Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC. Cellular and Molecular Biology Letters. 19, (2), 262-276 (2014).
  13. Mohandas, N., Gallagher, P. G. Red Cell Membrane: Past, Present, and Future. Blood. 112, (10), 3939-3948 (2008).
  14. Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations. British Journal of Haematology. 146, (4), 447-455 (2009).
  15. Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. A Comprehensive Review on Eryptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 39, (5), 1977-2000 (2016).
  16. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F. Nature. 468, (7325), 834-838 (2010).
  17. Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib. Cellular Physiology and Biochemistry. 43, (4), 1472-1486 (2017).
  18. Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 902, (2), 253-262 (1987).
  19. Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone. Toxins (Basel). 6, (12), 3596-3612 (2014).
  20. Jacobi, J., et al. Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane. Cellular Physiology and Biochemistry. 4, (33), 1516-1526 (2014).
  21. Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia. PLoS One. 6, (10), e26575 (2011).
  22. Borst, O., et al. Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302, (4), C644-C651 (2011).
  23. Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38, (10), 1649-1651 (2015).
  24. Mahmud, H., et al. Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia. Cardiovascular Research. 98, (1), 37-46 (2013).
  25. Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol. Cellular Physiology and Biochemistry. 38, (6), 2300-2310 (2016).
  26. Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol. Biochemistry. 46, (8), 2233-2238 (2007).
  27. Lang, F., et al. Eryptosis, a Window to Systemic Disease. Cellular Physiology and Biochemistry. 22, (6), 373-380 (2008).
  28. Gil-Parrado, S., et al. Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members. Journal of Biological Chemistry. 277, (30), 27217-27226 (2002).
  29. Liu, C. M., Hermann, T. E. Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore. Journal of Biological Chemistry. 253, (17), 5892-5894 (1978).
  30. Klarl, B. A., et al. Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290, (1), C244-C253 (2006).
  31. Danilov, Y. N., Cohen, C. M. Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins. FEBS Letters. 257, (2), 431-434 (1989).
  32. Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes. Environmental Science Nano. 6, (4), 1219-1232 (2019).
  33. Jaroszeski, M. J., Heller, R. Flow Cytometry Protocols. Humana Press. Totowa, NJ. (2003).
  34. Ghashghaeinia, M., et al. The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis. British Journal of Haematology. 157, (5), 1365 (2012).
  35. Repsold, L., Joubert, A. M. Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death. Biomed Research International. 2018, (5), 9405617 (2018).
  36. Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family. Journal of Biological Chemistry. 264, (14), 7944-7949 (1989).
  37. Andree, H. A. M., et al. Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers. Journal of Biological Chemistry. 265, (9), 4923-4928 (1990).
  38. Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy. Analytical Biochemistry. 329, (1), 112-119 (2004).
  39. Jiang, P., et al. Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia. Cellular Physiology and Biochemistry. 40, (6), 1391-1400 (2016).
  40. Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders. Proteomics - Clinical Applications. 10, (4), 403-414 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics