Producción de partículas pseudotipadas de influenza infecciosa de alto valor con glicoproteínas envolventes de virus H5N1 altamente patógenos y aviares H7N9

Immunology and Infection

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Summary

Este protocolo describe un proceso experimental para producir partículas seudotipos virales infecciosas de alto valor (pp) con glicoproteínas envolventes de dos cepas de gripe A y cómo determinar su infectividad. Este protocolo es altamente adaptable para desarrollar pps de cualquier otro tipo de virus envueltos con diferentes glicoproteínas envolventes.

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Zhang, F., Wang, Y., Shang, X., Wang, S., Xiao, R., Zhou, H., Cai, L. Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses. J. Vis. Exp. (155), e60663, doi:10.3791/60663 (2020).

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Abstract

La transmisión directa ocasional del virus de la gripe aviar A altamente patógeno H5N1 (HPAI H5N1) y H7N9 a los seres humanos y su letalidad son graves problemas de salud pública y sugieren la posibilidad de una epidemia. Sin embargo, nuestra comprensión molecular del virus es rudimentaria, y es necesario estudiar las propiedades biológicas de sus proteínas envolventes como dianas terapéuticas y desarrollar estrategias para controlar la infección. Desarrollamos una plataforma sólida de partículas pseudotipo virales (pp) para estudiar el virus de la gripe aviar, incluyendo el análisis funcional de su hemagglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) envuelve glicoproteínas, las características de reordenación de los HA y NA, receptores, tropismos, anticuerpos neutralizantes, diagnóstico, infectividad, con fines de desarrollo de fármacos y diseño de vacunas. Aquí, describimos un procedimiento experimental para establecer pps con las glicoproteínas envolventes (HA, NA) de dos cepas de gripe A (HAPI H5N1 y 2013 aviar H7N9). Su generación se basa en la capacidad de algunos virus, como el virus de la leucemia murina (MLV), para incorporar glicoproteínas de envoltura en un pp. Además, también detallamos cómo estos pps se cuantifican con RT-qPCR, y la detección de infectividad de pps de virus nativos y no coincidentes dependiendo del origen de los HA y NA. Este sistema es altamente flexible y adaptable y se puede utilizar para establecer pps virales con glicoproteínas envolventes que se pueden incorporar en cualquier otro tipo de virus envuelto. Por lo tanto, esta plataforma de partículas virales se puede utilizar para estudiar virus salvajes en muchas investigaciones de investigación.

Introduction

La misión de una partícula viral es transportar su genoma desde una célula huésped infectada a una célula huésped no infectada y entregarlo en el citoplasma o el núcleo en unformulario1 competente para la replicación. Este proceso se desencadena inicialmente por la unión a los receptores celulares del huésped, seguido por la fusión de virión y membranas celulares. Para los virus envueltos, como los virus de la gripe, las glicoproteínas de pico son responsables de la unión de receptores y la fusión1,2. Las glicoproteínas de sobrevirales (p. ej., pirógenos, antígenos), están implicadas en muchas propiedades y eventos importantes, como el inicio del ciclo de vida del virus (unión y fusión), la patogénesis viral, la inmunogenicidad, la apoptosis de células huésped y el tropismo celular, la vía endocytica celular, así como la transmisión y reordenación entre especies1,3,4,5,6,7. La investigación sobre las glicoproteínas de sobres virales nos ayudará a comprender muchos aspectos del proceso de infección viral. Las partículas virales pseudotipo (pp), también denominadas pseudoviriones o pseudopartículas, se pueden generar a través de una técnica de pseudotipado8,9,10. Esta tecnología se ha utilizado para desarrollar partículas pseudotipo de muchos virus, incluyendo hepatitis C11,12,hepatitis B13,virus de la estomatitis vesicular (VSV)14,15, y virus de la gripe16,17,18,19. Esta tecnología se basa en la proteína Gag-Pol de lentivirus u otros retrovirus.

Las partículas virales pseudotipo se pueden obtener utilizando un sistema de tres plásmidos mediante la cotransfección de un plásmido de expresión de glicoproteína enenvolvente viral, un plásmido de envase saqueviral que falta el gen envolvente env, y un plásmido reportero separado en células productoras de pp. El retrovirus se ensambla por su proteína Gag, y brota de una membrana celular infectada que expresa la proteína envolvente del virus1. Por lo tanto, es posible obtener pps de gripe de alto titer utilizando la proteína gag retrovirus para producir cogollos en una membrana celular que expresa la gripe HA y NA. En nuestros estudios anteriores, los HAs/NAs en todas las combinaciones eran funcionales y capaces de realizar sus correspondientes funciones en el ciclo de vida viral16,17,18,20,21. Estos pps se utilizan para investigar las características biológicas de la gripe, incluyendo la hemaglutinación, la actividad de la neuraminidasa, el tropismo de unión a los receptores HA e infectividad. Debido a que HA y NA son proteínas funcionales superficiales importantes en el ciclo de vida viral, los HA y NA no coincidentes derivados de diferentes cepas de gripe pueden demostrar en parte un reordenamiento entre ellos. Aquí, generamos ocho tipos de pps de gripe combinando dos ABA y dos NA (derivadas de la cepa HPAI H5N1 y la mancha H7N9), utilizando un sistema de pseudotipado de tres plásmidos. Estos ocho tipos de pps incluyen dos pps nativos, H5N1pp, H7N9pp; dos pps no coincidentes, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; y cuatro pps que sólo albergan una sola glicoproteína (HA o NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Los estudios sobre el virus de la gripe, como H5N1 y H7N9, están limitados por los requisitos de bioseguridad. Todos los estudios de las cepas del virus de la gripe silvestre deben realizarse en un laboratorio de nivel 3 de bioseguridad (BSL-3). La tecnología de partículas virales pseudotipo se puede utilizar para empaquetar un virión artificial en un ajuste de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Por lo tanto, pps representa una herramienta más segura y útil para estudiar los procesos del virus de la gripe dependiendo de sus dos principales glicoproteínas: la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA).

Este protocolo describe la generación de estos pps con una estrategia de cofección de tres plásmdos (generalmente en la Figura 1),cómo cuantificar pps y detección de infectividad. La producción de pp implica tres tipos de plásmidos(Figura 1). El gen gag-pol, que codifica la proteína retrovirus Gag-Pol, fue clonado a partir de un kit de empaquetado de retrovirus e insertado en el plásmido pcDNA 3.1 y nombrado pcDNA-Gag-Pol. El gen mejorado de la proteína fluorescente verde (eGFP), que codifica la proteína fluorescente verde, fue clonado a partir del vector pTRE-EGFP, insertado en el plásmido pcDNA 3.1, y llamado pcDNA-GFP. Durante la clonación, se añadió una secuencia de señal de embalaje (o) a través de una imprimación. Los genes HA y NA fueron clonados en un plásmido pVRC, llamado pVRC-HA y pVRC-NA, respectivamente. El último plásmido codifica la proteína de fusión y puede ser reemplazado por cualquier otra proteína de fusión de interés. Nuestra plataforma de pseudotipado incluye dos plásmidos de expresión de glicoproteína: pVRC-HA y pVRC-NA. Esto puede simplificar la investigación sobre el resurtido entre diferentes cepas de virus en un entorno BSL-2.

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Protocol

1. Día 1: Cultivo celular y sembrado

  1. Cultivar células de riñón embrionario humano (HEK) 293T/17 en platos de 60 mm con el medio esencial modificado (DMEM) de Dulbecco complementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina (DMEM Complete Medium, DCM) en una incubadora de 37 oC, 5% dióxido de carbono (CO2).
    NOTA: Se recomiendan las células de paso bajo HEK 293T/17.
  2. Lave cuidadosamente las células con 5 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) 1x.
    NOTA: El manejo manual de las células HEK 293T/17 debe ser muy suave, ya que se separan fácilmente.
  3. Retire PBS y disocia las células con 1 ml de 0,25% de solución de ácido tetraacético de trippsina-etileno diamina (EDTA). Colocar el plato en una incubadora de CO2 de 37oC, 5% durante no más de 5 min hasta que las células se disocien.
  4. Desactive la trippsina añadiendo 5 ml de DCM. Disperse las células en una suspensión de una sola célula pipeteando varias veces.
  5. Transfiera las suspensiones celulares a un tubo centrífugo pretallado de 15 ml. Recoger las células por centrifugación a 250 x g durante 5 min a 4 oC.
  6. Decantar tanto del sobrenadante como sea posible. Resuspenda el pellet celular con 6 ml de medio DCM y cuente las células. Diluir las células a 1 x 106 células/ml con medio DCM.
  7. Sembrar las células en una placa de 6 pozos con 1 ml de suspensión celular por pozo. Toque suavemente la placa para distribuir uniformemente las células. Incubar la placa durante la noche (14-16 h) en una incubadora de CO2 de 37oC, 5%.

2. Día 2: Cotransfección de cuatro plásmidos mediada por lipofección

  1. Compruebe la morfología y la densidad celular bajo un microscopio de luz invertida. Idealmente, las células deben ser aproximadamente 85% confluente en la transfección. Sustituya el medio por 1 ml de medio DMEM sin suero por poca y, a continuación, vuelva a colocar la placa en la incubadora.
    NOTA: El manejo manual de las células HEK 293T/17 debe ser muy suave, ya que se separan fácilmente.
  2. Para cada pozo de células cultivadas que se va a transfitar, diluir 8 l del reactivo de transfección a un volumen de 150 ml con medio sérico reducido (tubo 1). Mezclar suavemente e incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT, aproximadamente 20 oC).
    NOTA: Para cada muestra de transfección, prepare dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, numerados 1 y 2.
  3. En el tubo 2, diluir 2,5 g de ADN plásmido en 150 ml de medio sérico reducido.
    NOTA: En el tubo 2, diluya cada ADN plásmido como se muestra en la Tabla 1. Se utilizó un plásmido que codifica el virus de la estomatitis vesicular (VSV) G glicoproteína (plásmido pLP-VSVG) como un control positivo, porque VSV es capaz de infectar una amplia gama de células. Las partículas de control negativas que carecen de glicoproteínas de sobre de la gripe (env pps) se generaron utilizando plásmidos pcDNA-Gag-Pol y pcDNA-GFP.
  4. Después de una incubación de 5 minutos, combine el ADN diluido con el reactivo de transfección diluido. Mezclar suavemente e incubar durante otros 15 minutos a RT.
  5. Agregue el complejo de lípidos de ADN al pozo correspondiente que contiene las células y el medio libre de suero. Mezcle suavemente meciéndose la placa de ida y vuelta.
  6. Después de la incubación durante 4-6 h en una incubadora de 37oC, 5%co2, retire el medio y reemplácelo por 2 ml de DMEM. Incubar durante otros 36-48 h en una incubadora de CO2 de 37oC, 5%.
    NOTA: Reemplace por DMEM libre de suero y anticuerpos. En este protocolo, dos HA y dos ABA se pueden utilizar para generar ocho tipos de pps (mostrados en el Cuadro 1).

3. Día 3: Sembración de células susceptibles

  1. Para el ensayo de infectividad, semilla cada tipo de células susceptibles a 1 x 104 células por pozo en una placa de 96 pocillos.
    NOTA: Utilice dos tipos de célulaobjetivo para realizar el ensayo de infectividad en este artículo: una línea celular humana derivada del alveolar (células A549) y las células del riñón canino Madin-Darby (MDCK). Las células MDCK son ampliamente utilizadas en la investigación de la gripe y pueden ser un buen control. Este paso es flexible. Cualquier otra línea celular objetivo se puede utilizar de acuerdo con los requisitos de investigación.
  2. Incubar la placa durante la noche (14-16 h) en una incubadora de CO2 de 37oC, 5%.

4. Día 4: Colección de partículas virales pseudotipo, cuantificación y ensayo de infectividad

  1. Colección de partículas virales pseudotipo
    1. Compruebe el color del medio. Idealmente, debe ser de color rosa claro o ligeramente naranja. Examine las células con un microscopio biológico fluorescente invertido de menos de 440–460 nm.
    2. A 36-48 h después de la transfección, cosechar el pps pasando a través de un filtro de membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0,45 m para eliminar los desechos celulares.
    3. Divida los pps en alícuotas de pequeño volumen.
    4. Almacene el pps a -80 oC.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Sin embargo, esto no se recomienda, porque la infectividad de los pps disminuirá bruscamente después de congelar y descongelar.
  2. Cuantificación de partículas virales pseudotipo
    1. Transfiera 20 ml de pps purificados a un tubo de microcentrífuga libre de ribonucleasa de 1,5 ml .5 ml.
    2. Añadir 1 l de nucleasa de benzonasa de 0,24 U/ml. Incubar a 37oC durante 1 h para eliminar cualquier contaminación por ADN y ARN.
      NOTA: El ARN objetivo, comúnmente el cytomegalovirus regulado (CMV)-GFP, se empaqueta en el PPs y puede evitar ser degradado por nucleasa de benzonase.
    3. Congele la muestra a -70 oC para inactivar la nucleasa de benzonase.
    4. Añadir 2 l de proteinasa K. Incubar a 50 oC durante 30 min para digerir las proteínas de envolvente y liberar el ARN CMV-GFP. Inactivar la proteinasa K a 100oC durante 3 min.
    5. Cuantifique el pps mediante la transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT)-PCR con un kit RT-qPCR de un solo paso de la sonda universal, utilizando la imprimación delantera 5'-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3', la imprimación inversa 5'-GGGTCTCCTCAGAGTGATTTACGAC-3', y la sonda 5'-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCCGAG-TAM-3', en un termociclador PCR en tiempo real. Normalizar el pps para el número de copia de ARN antes de la infectividad.
  3. Ensayo de infectividad
    1. Diluir cada tipo de pps en términos de los datos qRT-PCR a 4 x 105 copias/ml (normalización pp).
    2. Añadir Tosil-Fenilalanina Clorometil-Cetona (TPCK)-trippsina a una concentración final de 40 g/ml en pps que albergan H7N9 HA. Incubar a 37oC durante 1 h para formar sus subunidades funcionales HA1 y HA2.
      NOTA: No hay necesidad de tratar los pps que albergan H5 con TPCK-trippsin, porque tienen múltiples residuos de arginina y lisina en el sitio de escisión HA1-HA2. Este sitio de escote multibásico puede ser cleaved por proteasas celulares omnipresentes.
    3. Mezclar pps normalizados con medio DMEM (sin suero) en una relación 1:1 (volumen/volumen).
    4. Lleve la placa que contiene células susceptibles al gabinete de bioseguridad.
    5. Aspirar el sobrenadante y lavar las células una vez con 0,1 ml de PBS precalentado.
    6. Añadir 0,1 ml de mezcla pps-DMEM a un pozo. Triplicar las pruebas de infectividad de cada tipo de pps a una línea celular susceptible (vista general en la Figura 2).
    7. Incubar la placa de 96 pocillos durante 4-6 h en una incubadora de CO2 de 37oC, 5%.
    8. Aspirar el sobrenadante y reemplazar con 0,1 ml de DCM.
    9. Incubar la placa de 96 pocillos durante otras 24–36 h en una incubadora de 37oC, 5% co2.

5. Día 5 o 6: Detección de infectividad

  1. Lleve la placa de pozo 96 al gabinete de bioseguridad.
  2. Aspirar el sobrenadante y lavar las células 1x con 0.2 mL de PBS precalentado.
  3. Retire PBS y disocia las células con 0,1 ml de solución de trippsina-EDTA al 0,25%.
  4. Colocar el plato en una incubadora de CO2 de 37oC, 5% durante 3 min hasta que las células se disocien.
    NOTA: Evite incubar durante más de 5 minutos, ya que esto conducirá a la acumulación de células.
  5. Desactive la trippsina añadiendo 0,4 ml de DCM.
  6. Disperse las células en suspensión de una sola célula pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
  7. Transfiera las suspensiones celulares a un tubo de microcentrífuga refrigerado de 1,5 ml.
  8. Determinar las células positivas del reportero gFP con clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
    NOTA: Para determinar la proporción de celdas de destino positivas de reportero de GFP, establezca compuertas de citómetro de flujo utilizando las muestras de control (células A549 no tratadas o células MDCK) y, a continuación, cuente las celdas positivas de reportero de GFP de 10.000 celdas por muestra.

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Representative Results

Dependiendo del procedimiento general descrito anteriormente, hemos generado 10 tipos de pps combinando dos HAs/NAs de grupo o glicoproteína VSV-G o glicoproteínas sin sobre (mostradas en la Tabla 1). Siete de ellos son infecciosos. Los pps que albergan glicoproteína sin sobre o sólo puerto NA no mostraron ninguna infectividad aquí. El procedimiento de producción de influenza pp se ofrece en la Figura 1. Las micrografías electrónicas de transmisión de pps (por ejemplo, H5N1pp) se muestran en la Figura 3. Los resultados de los ensayos de infectividad de estos pps se muestran en la Figura 4. La infectividad de los siete tipos de pps se evaluó en un valor de 20 copias del genoma por célula (GCP) [similar a la multiplicidad de infección (MOI)]. En el grupo pps que alberga H5, la infectividad de H5N1, (H5+N9), y H5 fue de 90,05 a 4,05%, 17,78 a 1,58%, 10,15 a 2,85% para la línea celular A549 y 40,37 a 4,92%, 5,24 a 1,32%, 4,88 a 0,27% para MDCK, respectivamente. En el grupo pps que alberga H7, la infectividad de H7N9, (H7+N1), y H7 fue de 10,45 a 2,35%, 6,75 a 1,37%, 1,23 a 0,33% para la línea celular A549 y 7,61 a 1,04%, 4,12 a 1,29%, 1,08 a 0,02% para MDCK, respectivamente. Para los ensayos de infectividad de los pps, especialmente HApp (H5pp, H7pp), no se añadió neuraminidasa exógena. En este ensayo de infectividad, las células MDCK también se utilizaron como la línea celular de control para probar la infectividad pps. La infectividad de VSVGpp fue de 20,9 a 2,00% para A549 y de 16,02 a 2,41% para las células MDCK. Las glicoproteínas delta-sobre pp (env pp) no mostraron infectividad en nuestro estudio. Estos datos también mostraron que los Ha/NA de diversas cepas de virus son capaces de generar con éxito partículas virales infecciosas. En conjunto, nuestra plataforma de pseudotipado puede desarrollar partículas virales seudotipo infecciosos utilizadas en la investigación de la gripe.

Figure 1
Figura 1: Visión general del procedimiento de producción de la gripe pp. (A) El plásmido de embalaje pcDNA-Gag-pol, el plásmido reportero pcDNA-GFP, y los plásmidos de expresión de glicoproteína envolvente pVRC-HA y pVRC-NA, se cotransorizan en células HEK 293/17 que producen PP. (B) En las células HEK 293/17, las poliproteínas Gag-Pol son sintetizadas y transportadas por un mecanismo desconocido a la membrana celular. Las glicoproteínas HA y NA se transportan y anclan en la membrana celular a través de la vía secretora. El plásmido reportero pcDNA-GFP se transcribe en el ARN genómico GFP de una sola cadena. (C) Durante o después del transporte, la proteína Gag-Pol recluta el ARN genómico de una sola cadena de GFP a través de las señales de envasado de psi-RNA, formando así los complejos anteriores. (D) El complejo de Gag-pol-o-RNA montado induce la curvatura de la membrana, lo que conduce a la formación de un brote. Durante la floración, las glicoproteínas de envoltura viral HAs/NAs se incorporan a las partículas nacientes. El brote se completa a medida que la partícula se pellizca de la membrana celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Disposición general en el ensayo de infectividad. Las pruebas de infectividad de cada tipo de pps a una línea celular susceptible se midieron por triplicado. Las células humanas derivadas del alveolar A549 y MDCK se utilizan como células susceptibles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Micrografías electrónicas de transmisión de pps. Sobrenadante no concentrado (izquierda) y concentrado (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Infectividad de pps normalizados. La infectividad se presenta como el porcentaje medio de desviación estándar (SD) de las células infectadas (n.o 3). La infectividad de pps se evaluó en dos líneas celulares, las células A549 y MDCK. Siete tipos de pps mostraron varios perfiles de infectividad en dos celdas de destino. Los Pps que sólo albergan NA no se muestran aquí, ya que no manifestaron ninguna infectividad. Los Pps que albergan glicoproteínas sin sobre (env) tampoco mostraron infectividad en nuestro estudio. El porcentaje de infectividad denotó la proporción de células positivas de reportero según el PFP en 10.000 células por muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

preparaciones de plásmido
plásmido (L, 0,1 g/L) H5N1 (H5+N9) H7N9 (H7+N1) H5 N1 H7 N9 VSVG Env
pcDNA-Gag-pol 10.53 10.53 10.53 10.53 11.43 11.43 11.43 11.43 11.43 12.5
pcDNA-GFP 10.53 10.53 10.53 10.53 11.43 11.43 11.43 11.43 11.43 12.5
pVRC-HA 1.98 1.98 1.98 1.98 2.14 - 2.14 - - -
pVRC-NA 1.98 1.98 1.98 1.98 - 2.14 - 2.14 - -
pcDNA-VSVG - - - - - - - - 2.14 -

Tabla 1: Combinaciones de proteínas HA y NA derivadas de los virus H5N1 y H7N9 y las cantidades requeridas (volumen) de ADN plásmido para una transfección de pozo de una placa de 6 pocillos. Según la concentración de preparaciones de plásmido, calcule el volumen requerido de cada ADN plásmido. La cantidad total de ADN plásmido para la tranfección de un pozo es de 2,5 g. Para obtener la mayor eficiencia de transfección y los efectos no específicos más bajos, optimizamos las condiciones de transfección variando las concentraciones de ADN de plásmido y reactivos de tranfección. Después de optimizar, la relación de las cuatro cantidades de plásmidos se estableció como 16:16:1:1. El volumen del reactivo de transfección utilizado en un transfecto de pozo de una placa de 6 pocillos es de 8 l (no se muestra en la tabla). Se pueden utilizar dos HA y dos NA de virus H5N1 y H7N9 para generar ocho tipos de pps: H5N1pp, (H5 + N9)pp, H5pp, N1pp, H7N9pp, (H7 + N1)pp, H7pp y N9pp. Los pps que albergan glicoproteínas sin sobre (env) o sólo albergan glicoproteínas NA no mostraron infectividad en nuestro estudio.

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Discussion

En este protocolo, describimos un método para producir partículas pseudotipo del virus de la gripe (pp) en un ajuste BSL-2. El reportero plásmido pcDNA-GFP se incorpora en el pps y se puede utilizar para cuantificar pps por FACS en un ensayo de infectividad. Elegimos dos tipos de líneas celulares susceptibles porque son ampliamente utilizadas en la investigación de la gripe. Las células MDCK proporcionarían un buen control a las células humanas inmortalizadas variables utilizadas en estos estudios.

Este protocolo se basa en el retrovirus MLV, que puede incorporar un reportero de GFP y producir cogollos en la membrana celular. Esta técnica ha sido ampliamente desarrollada para el envasado de partículas del virus de la gripe4,22,23,24. Algunos otros sistemas se basan en el sistema lentiviral de pseudotipado VIH-11 19,25,26 o el sistema de expresión celular de insectos baculovirus27,28,29. Muchos otros genes reporteros también se han utilizado para la producción de pseudopartículas, como luciferasa (luminiscencia)30,31,32,33, gal/LacZ (por colorimetría)34,35, y fosfatasa alcalina secreta36,37. Millet et al. utilizaron el ensayo de luciferasa para cuantificar la infectividad de las partículas pseudotipo coronavirus33. En comparación con la luciferasa, la fluorescencia verde de GFP se observa fácilmente con un microscopio biológico fluorescente invertido. Esta es una manera conveniente de comprobar la transfección y la eficiencia de la infección. Para este estudio, la infectividad se puede determinar directamente mediante la detección de las células gFP positivas con FACS.

En este método, varios pasos afectan críticamente a los resultados. La densidad celular optimizada es un factor crítico para la transfección exitosa. En este protocolo, se encontró que una densidad celular en el rango de entre 80 y 90% de confluente era óptima para la producción de pp del virus de la gripe. Una mayor o menor densidad celular dará como resultado una menor eficiencia de transfección. Un buen estado fisiológico de las células productoras también es muy importante para la alta producción de partículas. Esta es la razón por la cual las células HEK 293T/17 del paso de celda inferior se recomiendan para producir pps en este protocolo. Además, el volumen del reactivo de transfección y la relación de las cuatro cantidades de plásmidos también pueden afectar a la eficiencia de la transfección. Para obtener la mayor eficiencia de transfección, se recomienda optimizar estos factores variando y probando su cantidad. Establecemos la proporción de cuatro cantidades de plásmidos como 16:16:1:1 y el volumen del reactivo de transfección en 8 l para una tranfección de pozos en una placa de 6 pocillos. Otro problema es el manejo de las células. Las células HEK 293T/17producer son de baja adherencia, por lo que el manejo manual de las células debe ser muy suave. La lipofección puede conducir a un aumento de la permeabilidad celular, y el suero y los anticuerpos en el medio pueden aumentar la citotoxicidad. Lo mejor es utilizar DMEM libre de suero y anticuerpos para cultivar células HEK 293T/17 post-transinfectadas. Además, el tiempo de recogida es importante. A 36–48 h después de la transfección, el color del sobrenadante celular debe comprobarse para asegurarse de que es rosa o naranja-rosa antes de la recolección pp. El sobrenadante amarillo indica que el medio es demasiado ácido para apoyar el crecimiento celular y generalmente conduce a rendimientos bajos de pp.

Realizamos el ensayo de transfección en una placa de 6 pocillos. Para obtener más volumen pp se puede aumentar el número de pozos de transfección y los sobrenadores que contienen los mismos pps se pueden agrupar juntos. Alternativamente, algún otro tipo de recipientes se pueden utilizar para aumentar el rendimiento de pp. Por ejemplo, se pueden utilizar 18 s de reactivo de transfección y 5,5 g de ADN plásmido para realizar la transfección con 2,2 x 106 células en un plato de 60 mm. Del mismo modo, un ensayo de infectividad se puede llevar a cabo en una placa de 24 pozos.

El éxito de esta técnica puede ser influenciado por muchos factores. Por lo tanto, el procedimiento debe optimizarse para el envasado de partículas de diferentes tipos de virus.

En este protocolo, se generaron partículas virales pseudotipo de HPAI H5N1 y H7N9, así como sus resortantes. En este método, utilizamos qRT-PCR del ARN-GFP en el ensayo de infectividad a nivel de una sola célula (como copias del genoma por célula) en lugar de la dosis infecciosa de cultivo de tejido 50 (TCID50) o MOI tradicional23,38,39. Los métodos de valoración de la infectividad por virus se basan en ensayos de placa o ensayos TCID50, que consumen mucho tiempo y consumen mucha mano de obra. Ambos ensayos se basan en la medición de los efectos citopáticos visibles (EPC) causados por la infección por virus en las líneas celulares, por lo que puede ser difícil valorar los virus de baja infectividad (es decir, H7pp en este estudio). Creemos que es un método conveniente, eficaz y rápido para normalizar pps con qRT-PCR del ARN GFP contenido en pps de gripe.

En conjunto, nuestra técnica es segura y adaptable, y se puede utilizar para estudiar los virus envueltos, incluyendo sus receptores, tropismos, función de glicoproteína envolvente, anticuerpos neutralizantes, desarrollo de fármacos antivirus, diagnóstico y diseño de vacunas y Evaluación.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Plan Provincial de Medicina y Ciencia y Tecnología de la Salud de Zhejiang (Números de subvención, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Números de subvención, OO20190070), Hangzhou Medical Science y Proyecto clave tecnológico (Números de subvención, 2014Z11) y proyecto de aplicación autónoma municipal de Hangzhou de desarrollo social e investigación científica (Números de subvención, 20191203B134).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase Nuclease Millipore 70664 Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) Corning 3599 Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
Individual alphanumeric codes for well identification
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) Costar 3516 Individual alphanumerical codes for well identification
Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma irradiation
Dulbecco's modified essential medium (DMEM) Gibco 11965092 A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells
Fetal bovine serum Excell FND500 fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) Beckman coulter cytoflex
Human alveolar adenocarcinoma A549 cells ATCC CRM-CCL-185
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells ATCC CRL-11268 A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines
Inverted fluorescent biological microscope Olympus BX51-32P01-FLB3
Inverted light microscope Olympus CKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668019 Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit NEB E3006L Will withstand up to 14,000 RCF
RNase-/DNase-free Nonpyrogenic
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells ATCC CCL-34
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Axygen MCT-150-C 33 mm, gamma sterilized
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF Millipore SLHV033RS an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 11058021 The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.
penicillin-streptomycin Gibco 15140122 Maximum RCF is 12,500 xg
Temperature range from -80 °C to 120 °C
RNase-/DNase-free
Sterile
PP Centrifuge Tubes (15 mL) Corning 430791 a stable and highly reactive serine protease
Proteinase K Beyotime ST532 Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
TC-treated Culture Dish (60mm) Corning 430166 Trypsin from bovine pancreas
TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein
TPCK-trypsin Sigma T1426 This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056

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