Modello di trapianto di Murine (ISWAT) del tessuto adiposo sottocutaneo inguinale (ISWAT)

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Summary

In questo protocollo, viene descritto un metodo di isolamento murine ilet e trapianto nel tessuto adiposo bianco sottocutaneo inguinale. Le isole di murine singeniche isolate vengono trapiantate in un recipiente murino utilizzando un idrogel di membrana sotterranea. Viene monitorato il livello di glucosio nel sangue dei destinatari e viene eseguita l'analisi istologia degli innesti di islet.

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Peng, Y., Zou, Z., Chen, J., Zhang, H., Lu, Y., Bittino, R., Fu, H., Cooper, D. K. C., Lin, S., Cao, M., Dai, Y., Cai, Z., Mou, L. Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets. J. Vis. Exp. (156), e60679, doi:10.3791/60679 (2020).

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Abstract

Il trapianto di islet pancreatico è un trattamento terapeutico consolidato per il diabete di tipo 1. La capsula renale è il sito più comunemente usato per il trapianto di isolotto nei modelli di roditori. Tuttavia, la capsula renale stretta limita il trapianto di isole sufficienti negli animali di grandi dimensioni e negli esseri umani. Il tessuto adiposo bianco sottocutaneo inguinale (ISWAT), un nuovo spazio sottocutaneo, è stato trovato come un sito potenzialmente prezioso per il trapianto di isolotto. Questo sito ha un migliore apporto di sangue rispetto ad altri spazi sottocutanei. Inoltre, l'ISWAT ospita una massa di isolotto più grande della capsula renale, e il trapianto in esso è semplice. Questo manoscritto descrive la procedura di isolamento e trapianto di isolotti di topo nel sito ISWAT dei destinatari di topi diabetici singenici. Utilizzando questo protocollo, le isole pancreatiche murine sono state isolate dalla digestione standard del collagenase e un idrogel a matrice di membrana seminterrato è stato utilizzato per fissare le isole purificate nel sito ISWAT. I livelli di glucosio nel sangue dei topi riceventi sono stati monitorati per più di 100 giorni. Gli innesti di isle sono stati recuperati al giorno 100 dopo il trapianto per l'analisi istologica. Il protocollo per il trapianto di isolotto nel sito ISWAT descritto in questo manoscritto è semplice ed efficace.

Introduction

L'incidenza e la prevalenza a livello mondiale del diabete mellito di tipo 1 (T1DM) sono in rapido aumento, secondo i dati statistici della Federazione Internazionale del Diabete (IDF)1. Il trapianto di islet è uno degli approcci più promettenti per il trattamento del T1DM4. Dal momento che è stata riportata la grande scoperta nel trapianto di isolotto clinico utilizzando il protocollo di Edmonton2, la sopravvivenza dell'innesto di isolotto funzionante nei destinatari T1DM dopo 5 anni raggiunge circa il 50%3.

In passato, sono stati esplorati diversi siti di trapianto, come il fegato, la capsula renale, la milza, la regione intramuscolare, lo spazio sottocutaneo, il midollo osseo e il sacchetto omentale per il trapianto sperimentale di isolotto5,6,7. Alcuni dei siti di cui sopra sono stati testati in ambienti clinici8. Anche se il trapianto di isolotto nel fegato rimane il metodo più utilizzato nell'applicazione clinica attualmente9, ci sono diversi problemi importanti da affrontare quando si utilizza questo sito. Per esempio, come ridurre la perdita precoce delle isole trapiantate causata dalla reazione infiammatoria mediata istantanea del sangue (IBMIR) e scarsa ossigenazione fornire10,11 e come recuperare gli innesti di isole se necessario, perché si differenziano diffusamente nel fegato. La capsula renale può essere un sito ideale per i destinatari dei roditori. Tuttavia, la capsula renale stretta limita il trapianto di sufficienti isolotti allogenici negli esseri umani, anche se può essere una soluzione migliore per lo xenotrapianto delle isole a causa dei preparati altamente purificati dell'isolotto di porcina utilizzati clinicamente5,12. Pertanto, è in corso la ricerca di un sito più adatto per il trapianto di isolotto.

Lo spazio sottocutaneo può essere utilizzato come sito clinicamente applicabile per il trapianto di isolotto a causa della sua accessibilità. Tuttavia, l'efficienza del trapianto di isolotto nello spazio sottocutaneo è estremamente bassa, richiedendo quindi un numero relativamente elevato di isoloseri per invertire l'iperglicemia13. Recentemente, un team di ricerca giapponese ha trovato l'ISWAT, un nuovo sito sottocutaneo superiore per il trapianto di isolotto in un modello murino rispetto al fegato14. L'ISWAT contiene l'arteria epigastrica e la vena, quindi il ricco apporto di sangue può garantire la rivascolarizzazione dell'innesto delle isolotti. In questo manoscritto, proponiamo un metodo di impianto facile utilizzando un idrogel a matrice di membrana seminterrato per fissare isolotti di murini singenici nell'ISWAT. Questo protocollo si dimostra efficace per il trapianto di islet.

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Protocol

Tutte le procedure descritte in questo protocollo hanno seguito i principi del benessere degli animali del Comitato di revisione etica dell'Ospedale del Secondo Popolo di Shenzhen. I destinatari e i donatori di innesti di isolotto erano topi maschi C57BL/6 di una settimana acquistati presso il Medical Animal Center della provincia del Guangdong. La procedura di raccolta, isolamento, coltura o somministrazione delle cellule raccolte è stata effettuata in condizioni asettiche.

1. Preparazione dell'isola

  1. Preparare una soluzione di lavoro di tipo G di collagenana. Pesare collagenase Tipo V e sciogliere con il buffer di D-Hank per una concentrazione finale di 1 mg/mL, filtrare utilizzando un'unità filtro a siringa da 0,22 m e una siringa da 60 mL e precool nel ghiaccio. È richiesto un volume di 5 mL per ogni donatore.
  2. Eutanasia un topo maschio C57BL/6 di 10 settimane (23 x 2 g) per lussazione cervicale e spruzzare la parte esterna del mouse con il 75% di etanolo per alcuni secondi. Nel frattempo, riempire una siringa da 5 mL con soluzione di collagenae e cambiare l'ago della siringa con un ago di perfusione a punta smussata (32 G).
  3. Mettere il topo donatore in posizione supina su una sacca di ghiaccio sotto il mirino di dissezione, tagliare un'apertura trasversale utilizzando forbici oftalmiche a punta dritta nella pelle della zona pubica e incise completamente la pelle verso la testa. Quindi aprire completamente l'addome tramite un'incisione a V dalla regione pubica al processo xifoideo.
  4. Esporre la cistifellea e l'intera lunghezza del dotto biliare comune riposizionando il fegato. Quindi bloccare l'apertura duodenale del dotto biliare comune con un morsetto vascolare e tagliare una piccola apertura nella cistifellea.
    NOTA: Il posizionamento ottimale dell'ago è importante per prevenire il riflusso nel fegato e nella cistifellea.
  5. Cannulare il dotto biliare comune dall'apertura della cistifellea utilizzando l'ago perfusione nel passaggio 1.2, quindi iniettare 2 mL di soluzione di collagena nel pancreas. Dopo di che, separare il pancreas perfuso dall'intestino, stomaco, e milza utilizzando due coppie di microtweezer non invasivi, e metterlo in un tubo conico 50 mL sul ghiaccio.
    NOTA: ripetere il processo per tutti i topi donatori. Tre pancreas perfusi consecutivamente (non più di 40 min a parte) possono essere combinati in un tubo conico da 50 mL preriempito con soluzione di collagenasi di 3 mL per ogni pancreas.
  6. Aggiungere 100 DNase I (10 mg/mL) per pancreas nei tubi conici da 50 mL e digerire il pancreas in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi agitando i tubi conici per 3-5 min.
    NOTA: Agitare vigorosamente i tubi 40x in intervalli di 10 s per dissociare il tessuto prima della digestione nel bagno d'acqua, quindi scuotere moderatamente i tubi durante la digestione.
  7. Aggiungere la soluzione di arresto (soluzione BSA-HBSS da 2,5 mg/mL) fino a un volume finale di 50 mL per bloccare la digestione, e centrifugare i tubi ad una velocità di 750 x g a 4 gradi centigradi e fermarsi rapidamente.
  8. Versare il supernatante e lavare i pellet 2x con una riassovia delicatamente di 15-25 mL di BSA-HBSS. L'impulso centrifuga recarsi al tubo con le stesse condizioni di velocità descritte al punto 1,7 per 1 min.
  9. Versare il supernatante e mettere in comune i pellet dei tre tubi conici in un tubo conico da 50 mL. Risospendere i pellet in un volume totale di 10 mL di itopaque-1119. Mescolare in modo omogeneo e aggiungere in sequenza 5 mL di itopaque-1077 e 5 mL di HBSS pipetting lentamente lungo il lato del tubo.
  10. Girare i campioni nella centrifuga a 750 x g a 4 gradi centigradi per 10 min senza freni.
  11. Aspirati le isole dell'interfaccia HBSS/histopaque-1077 in un tubo conico da 50 mL utilizzando una pipetta Pasteur usa e getta da 5 mL, aggiungere BSA-HBSS a un volume finale di 50 mL e centrifugare a impulsi a 750 x g a 4 gradi centigradi.
  12. Versare il supernatante e lavare le isole utilizzando 30 mL di BSA-HBSS. Centrifuga per 1 min a 750 x g a 4 gradi centigradi.
  13. Risospendere le isole utilizzando 30 mL di coltura media (10% FBS-1%P/S-CMRL-1066) per tubo e versare in un piatto di coltura leggero di 10 cm di diametro. Sotto uno stereoscopio, utilizzando 200 punte di pipet a carica gel, selezionare a mano le isole dalla soluzione in base alla loro morfologia (cioè sferoidale, bianco). Mettere in un piatto di coltura cellulare non trattata con 10 mL di mezzo di coltura.
    NOTA: Un secondo handpicking può essere effettuato se la purezza delle isole prime purificate non è ottimale dopo il primo prelievo.
  14. Controllare la purezza delle isole raccolte a mano con colorazione dithizone al microscopio luminoso e rilevare la fattibilità delle isolotti con fluoresceina diacetate (FDA)-propidium iodide (PI) colorazione al microscopio fluorescente.
  15. Cultura le isole isolate nel mezzo di coltura (come nel punto 1.13) in un'incubatrice a 37 gradi centigradi, 95% aria-5% CO2 prima del trapianto.

2. Trapianto di issotiera ISWAT

  1. Indurre il diabete nei topi Maschi Di 8 settimane C57BL/6 (22 x 2 g) con una singola iniezione di streptotototocina (ST). Il giorno -4, digiunare i topi per 4-6 h, quindi preparare una soluzione st di 0,1 M utilizzando buffer di citrato da 0,1 M (pH 4,4). Pesare, risospendere nel tampone e iniettare i topi intraperitamente ad una dose di 180 mg/kg.
    NOTA: La soluzione ST deve essere preparata al momento prima dell'uso e ricoperta di lamina di alluminio a causa della sua sensibilità alla luce. Dovrebbe essere usato immediatamente, perché perderà attività entro 15-20 min.
  2. Puntura le vene caudali dei topi iniettati da STT per raccogliere del sangue intorno alle 10 del giorno -1 e giorno 0 e misurare il livello di glucosio nel sangue non a digiuno utilizzando una striscia di prova e uno strumento di monitoraggio della glicemia di base. I topi saranno utilizzati come destinatari del trapianto di issolota se i livelli di glucosio nel sangue dei 2 giorni di prova consecutivi sono entrambi almeno 20 mmol/L.
  3. Il giorno 0, pesare e contrassegnare tutti i topi destinatari. Anestesizzaogni destinatario iniettando 60 mg/kg di sodio pentobarbital intraperitamente.
    NOTA: Somministrare un pizzico di punta per verificare la profondità dell'anestesia. Se il topo ricevente non ha un riflesso di ritiro, il livello di anestesia è sufficiente per l'intervento chirurgico. In caso contrario, somministrare un ulteriore sodio pentobarbitale aggiuntivo di 10 mg/kg. Il sodio pentobarbitale utilizzato è stato diluito in salina fisiologica sterile alla concentrazione del 2% (m/v).
  4. Togliere l'idrogel da un congelatore a -20 gradi e tenerlo sul ghiaccio per consentire lo scongelamento. L'idrogel è liquido a 4-10 gradi centigradi e si solidificherà ad una temperatura più elevata.
  5. Scegliete 450-500 equivalenti di ilettun (IEQ) per ogni ricevente in un tubo di centrifuga sterile da 1,5 mL sotto lo stereoscopio (come nel punto 1.13) con 200 - L di mezzo di coltura e tenetevi sul ghiaccio fino a quando non saranno pronti per il trapianto.
  6. Sampione dell'area inguinale sinistra del destinatario utilizzando il 75% di etanolo. Posizionarlo in posizione supina e fissare i quattro arti utilizzando nastro chirurgico. Rasare i capelli intorno al sito chirurgico con clipper elettrici e tamponare l'area con Iodophor.
  7. Fare un'incisione verticale della pelle in questa zona utilizzando le forbici oftalmiche e microtweezer non invasivi, identificare l'arteria epigastrica inferiore e la vena nell'ISWAT e creare una piccola tasca sopra i vasi.
  8. Girare il tubo delle isolotti per 30 s a 200 x g e rimuovere il supernatante il più possibile. Aspirate 20 -L di idrogel completamente scongelato e caricarlo nel tubo con le isole. Risospendere delicatamente le isole, evitando le bolle.
  9. Consegnare l'intera miscela di isolet-idrogel nel tubo nella tasca (passaggio 2,7) del recipiente con una punta di pipetta da 200 luna.
    NOTA: Questo processo richiede due tecnici, uno per raccogliere i bordi della tasca utilizzando microtweezer non invasivi e l'altro per fornire la miscela di istata in tasca.
  10. Aggiungere 20 l di cefalosporina (5-10 mg) nel sito di trapianto dopo che la miscela issottile-idrogel è completamente solidificata, quindi utilizzare una sutura chirurgica 5-0 per chiudere il muscolo e la pelle con il metodo di sutura continua.
    NOTA: L'idrogel ha bisogno di circa 3 min per solidificare a causa della temperatura corporea.
  11. Mettere il destinatario in una gabbia pulita e riscaldarsi utilizzando un cuscinetto termico. Mantenere il monitoraggio fino a quando il destinatario si riprende completamente e inizia a muoversi in modo autonomo. Quindi somministrare 0,03 mg/ml di Buprenorphina con sterile fisiologica salina intraperitonealmente, secondo 0,1 mg/kg dose.
  12. Ripetere i passaggi da 2,3 a 2,11 per ogni mouse destinatario.
  13. Misurare i livelli di glucosio nel sangue non a digiuno dei topi riceventi (come nel passaggio 2.2) 3–4x a settimana per il primo mese, e 1x a settimana dopo.
  14. Al termine del follow-up (100 giorni dopo il trapianto), in anestesia (effettuata come al punto 2.3) accisa l'ISWAT recante l'innesto dei destinatari seguendo le fasi sterili descritte al punto 2.6. Fissare il tessuto in formalina e paraformaldeide secondo i protocolli istologici per la colorazione ematosilia ed eosina (H&E) e immunofluorescenza di insulina e glucagone.
  15. Aggiungere la cefalosporina e chiudere l'incisione dei destinatari come nel punto 2.10, quindi prepararsi per il recupero come nel passaggio 2.11.

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Representative Results

In questo protocollo sono introdotte due procedure: preparazione dell'isolotto murine e trapianto di isolotto nel sito ISWAT. Nella prima procedura, dopo aver perfuso e digerito con la soluzione di collagenasi di tipo V, purificando con Histopaque-1119 e Histopaque-1077 e un ulteriore passo di raccolta a mano, le isole murine isolate saranno sufficientemente pure per il trapianto (come mostrato nella Figura 1) e le isole isolate che hanno un'elevata vitalità saranno utilizzate per il trapianto (come mostrato nella Figura 2). Nella seconda procedura, l'induzione del diabete con la sostanza chimica di STÀ è fondamentale. La dose ottimale di STT dipende dalla tensione e dall'età del topo, e l'induzione di successo del diabete è definita da livelli di glucosio nel sangue non veloci di oltre 16,7 mmol/L allo stesso tempo in due giorni consecutivi. I topi diabetici possono sopravvivere senza trapianto di isolotto per alcune settimane. Gli innesti dell'isolotto devono essere completamente miscelati con idrogel prima di essere trapiantati nel sito ISWAT, e alcuni minuti devono passare per l'innesto da fissare nell'IWSAT (Figura 3). Quando trapiantati nell'ISWAT, gli innesti di isolotto invertivano l'iperglicemia per circa un mese e il peso corporeo dei topi ricitari aumentava gradualmente (Figura 4). A 100 giorni dal trapianto, gli innesti dell'isolotto sono stati recuperati per l'analisi istologica (Figura 5). Come mostrato nella Figura 4, il sangue non a digiuno a 10 AM nei giorni di prova è rapidamente aumentato dopo la rimozione degli innesti. La colorazione H&E ha dimostrato che gli innesti di isolotto sono rimasti intatti. L'insulina e l'immunofluorescenza glucratra hanno mostrato che le isole trapiantate funzionavano bene (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Perfusione e digestione del pancreas e depurazione delle isolozioni. (A) Il processo di perfusione del pancreas (A1A6). (B) Il punto finale della digestione del pancreas, con particelle sospese. (C) Isole purificate osservate al microscopio della luce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Purezza e vitalità delle isole purificate. (A) Purezza dell'isola determinata dalla colorazione dithizone. Possibilità di isleta valutata dalla doppia colorazione FDA-PI. (B) Immagine microscopia leggera delle isolotti. (C) La colorazione FDA mostra cellule vitali in verde. (D) il rosso fluorescenza PI indica le cellule morte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Trapianto di isole. (A) Dopo l'anestesia, radere i capelli nel sito del trapianto con una lama del rasoio e fissare gli arti ricvenuto nella posizione addominale verso l'alto con nastro chirurgico. ((B)Dopo la laparotomia, è esposto il sito di trapianto ISWAT. (C) Le isole miste di idrogel vengono lentamente trapiantate nel sito ISWAT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Livelli di glucosio nel sangue e posttrapianto di peso corporeo. Livelli di glucosio nel sangue non a digiuno (linea rossa) e pesi corporei (linea blu) dei topi riceventi trapiantati con isole singeniche (n . 7). La freccia nera indica che gli innesti sono stati rimossi 100 giorni dopo il trapianto. Sono state osservate alcune variazioni nei livelli di glucosio nel sangue confrontando i vari destinatari, riflettendo le differenze nella qualità e nella funzione delle isolote. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Istologia e immunofluorescenza. Le sezioni di innesto sono state macchiate con H&E, DAPI (nuclei), anticorpi anti-tono insulino e anticorpi glucari antito-tono. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il trapianto di issolota del pancreas è una terapia promettente per il trattamento del T1DM. L'effetto di questa terapia è influenzato da molti fattori e la scelta di un sito ottimale per l'impianto delle isolotto è estremamente importante. Il sito anatomico ideale per il trapianto di isolotto dovrebbe avere le seguenti caratteristiche: accessibilità per semplici procedure di trapianto, biopsia e recupero dell'innesto; complicanze ridotte; alto tasso di successo del controllo della glicemia; e la sopravvivenza a lungo termine degli innesti di isolotto15,16.

Il nostro team ha descritto in precedenza un protocollo per il trapianto di isolotto nell'omentum in un murino modello17. Nell'omentum, il glucosio nel sangue normale è stato raggiunto in un secondo momento rispetto al trapianto di isolotto sotto la capsula renale. Di conseguenza, sono stati esplorati altri siti per l'impianto di isolotti.

L'ISWAT è stato segnalato come un sito alternativo al fegato, in quanto ha bisogno di meno isolotti per invertire l'iperglicemia dei destinatari rispetto al trapianto al fegato14. Inoltre, il trapianto delle isole è facile, così come visualizzare e recuperare gli innesti14. Nel nostro studio, i topi ricitari hanno ridotto l'iperglicemia entro un mese dal trapianto di issoleta, suggerendo che l'ISWAT richiede più tempo della capsula renale per produrre insulina sufficiente. Questi risultati indicano quindi che il sito ISWAT potrebbe non offrire condizioni migliori per la diffusione di ossigeno, sostanze nutritive, e per la rivascolarizzazione dell'innesto.

L'elevata purezza e l'attività delle isole isolate sono di vitale importanza per invertire l'iperglicemia dei destinatari diabetici nell'ambiente del trapianto allo stesso islet, e i protocolli di isolamento dell'isola non sono gli stessi tra i diversi ricercatori18,19,20. Il tempo di digestione è molto cruciale per ottenere isolotti di alta qualità. Secondo la nostra esperienza, non deve superare i 5 min. Le isole isolate possono essere coltivate in un incubatore di 37 gradi centigradi durante la notte per consentire il recupero dallo stress meccanico della procedura di digestione21.

L'idrogel utilizzato qui è una matrice di membrana seminterrato che contiene laminin, collagene IV, e fattori di crescita17. Si solidifica quando raggiunge la temperatura corporea e aiuta a mantenere gli innesti di isolotto nel sito ISWAT. Anche se non è tossico per le isole, se la presenza dell'idrogel influisce sull'innesto delle isole e la funzione rimane da determinare.

Preso collettivamente, l'ISWAT è un nuovo spazio sottocutaneo per il trapianto di isolotto in modelli di roditori e potenzialmente per uso clinico. Per una valutazione completa, sono necessari ulteriori studi che utilizzano modelli preclinici mammari più grandi.

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Disclosures

Gli autori non segnalano conflitti di interesse.

   

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Key R&D Program of China (2017YFC1103704)Fondi speciali per la costruzione di ospedali di alto livello nella provincia di Guangdong (2019), Sanming Project of Medicine a Shenzhen (S201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20229204849975, GJ-20170314171357555), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (S Scientific Research Foundation della Provincia cinese del Guangdong (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm Syringe-driven Filter Unit Merck Millipore SLHV033RB
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
5 mL Pasteur pipette JingAn Biological, China J00085
5 mL syringe Szboon, China 20170829
50 mL conical tube Corning 430829
5-0 surgical suture sh-Jinhuan, China CR537
60 mL syringe Szboon, China 20170623
75% Ethanol LIRCON, China 9180527
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) Invitrogen A21202 Dilution (1:200)
anti-mouse Glucagon antibody Abcam ab10988 Dilution (1:100)
anti-mouse insulin antibody Cell Signaling Technology 3014s Dilution (1:100)
blunt-pointed perfusion needle Oloey, China 005 32G, yellow
BSA Meilune, China MB4219
C57BL/6 Mice Medical Animal Center of Guangdong Province 8~10 weeks
cell culture dish BIOFIL, China TCD000100 General,Non-treated,87.8 mm diameter
centrifuge Thermo Scientific ST16R
cephalosporin Lukang medical, China 150303
CMRL-1066 Sigma-Aldrich C0422
Codos Pet Clipper Szcodos, China CP-8000
collagenase Type V Sigma C9262
DAPI Thermo Fisher D1306
D-hank's buffer Coolaber, China PM5140-10
dithizone Sigma-Aldrich D5130
Dnase I Sigma-Aldrich D4263
Eosin staining media Beyotime Biotech, China C0109
FBS GE Healthcare Life Sciences SH30084
fluorescein diacetate (FDA) Thermo Fisher F1303
fluorescent microscope Leica DMIL
gel-loading pipet tips Corning CLS4884
HBSS Coolaber, China PM5150-10
hematoxylin staining media Cell Signaling Technology 14166S
HISTOPAQUE-1077 Sigma-Aldrich RNBG0522
HISTOPAQUE-1119 Sigma-Aldrich RNBG0536
Hydrogel BD Biosciences 356234 Basement Membrane Matrix
Iodophor LIRCON, China 5190313
light-tight culture dish DVS, China AN-5058548 self-made, glass dish sprayed with black paint
Medical Adhesive Tape Cofoe, China K12001
non-invasive microtweezers RWD Life Science F11033-11 and F12016-15
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system Johnson & Johnson 33391713
ophthalmic scissors RWD Life Science S12012-12 and S11001-08
P/S (penicillin / streptomycin) Gibco 15140-122
pentobarbital sodium Sigma-Aldrich P-010
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
STZ (streptozotocin) Sigma-Aldrich S0130
Test Strip GenUltimate 100-50
TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) proteintech SA00007-2 Dilution (1:200)
vascular clamp RWD Life Science R31006-04

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