Detección de especies totales reactivas de oxígeno en células adherentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

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Biochemistry

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Summary

Aquí, presentamos un protocolo para detectar especies totales de oxígeno reactivo celular (ROS) usando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Este método puede visualizar la localización de ROS celular en células adherentes con un microscopio de fluorescencia y cuantificar la intensidad ROS con un lector de placas de fluorescencia. Este protocolo es simple, eficiente y rentable.

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Kim, H., Xue, X. Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining. J. Vis. Exp. (160), e60682, doi:10.3791/60682 (2020).

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Abstract

El estrés oxidativo es un evento importante en condiciones fisiológicas y patológicas. En este estudio, demostramos cómo cuantificar el estrés oxidativo midiendo las especies de oxígeno reactivo total (ROS) utilizando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) tinción en líneas celulares de cáncer colorrectal como ejemplo. Este protocolo describe los pasos detallados, incluida la preparación de la solución DCFH-DA, la incubación de células con solución DCFH-DA y la medición de la intensidad normalizada. La tinción DCFH-DA es una forma sencilla y rentable de detectar ROS en las células. Se puede utilizar para medir la generación de ROS después de un tratamiento químico o modificaciones genéticas. Por lo tanto, es útil para determinar el estrés oxidativo celular sobre el estrés ambiental, proporcionando pistas para estudios mecanicistas.

Introduction

Tres especies principales de oxígeno reactivo (ROS) producidas por el metabolismo celular que son de significado fisiológico son anión superóxido, radical hidroxilo, y peróxido de hidrógeno1. A bajas concentraciones, participan en procesos celulares fisiológicos, pero a altas concentraciones tienen efectos adversos en las vías de señalización celular1. Nuestro cuerpo ha desarrollado sistemas antioxidantes, que son eficaces contra el exceso de ROS. Sin embargo, el estrés oxidativo puede ocurrir cuando ROS abruma la capacidad desintoxicante de nuestro cuerpo, lo que contribuye a muchas condiciones patológicas, incluyendo inflamación, cáncer, y enfermedad neurodegenerativa2,,3,4. El propósito de este método es determinar el total de ROS celular en las células adherentes utilizando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) tinción. La razón es que la oxidación de DCFH-DA a 2'-7'diclorofluoresceína (DCF) se ha utilizado ampliamente para la detección total de ROS, incluidos los radicales hidroxilo (•OH) y el dióxido de nitrógeno (•NO2). Mecánicamente, DCFH-DA es tomado por células donde la esterasa celular se corta fuera de los grupos de acetil, lo que resulta en DCFH. La oxidación de DCFH por ROS convierte la molécula a DCF, que emite fluorescencia verde a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm. En comparación con la detección de fluorescencia con citometría de flujo y otros métodos alternativos5,las ventajas de este método utilizando un microscopio de fluorescencia y un lector de placas son que produce imágenes fluorescentes claramente visibles, y es fácil de realizar, eficiente y rentable. Este método ha sido ampliamente utilizado para detectar ROS celular para el estudio de diversas condiciones6,7,8. Este protocolo se utiliza para detectar ROS total en células adherentes. El uso de este método para detectar ROS en las células de suspensión puede necesitar algunas modificaciones.

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Protocol

1. Siembra celular

  1. Semilla 2 x 105 células de cáncer colorrectal HCT116 por pozo en una placa de 24 pozos y mantener las células en el medio águila modificado (DMEM) de Dulbecco durante la noche a 37 oC.
  2. Sustituya el medio de cultivo por o sin sulfato ferroso de 100 m (FS) o doxorubicina (DOX) de 10 oM que contenga medio e incubar durante 24 h.

2. Preparación de la solución DCFH-DA

  1. Disolver 4,85 mg de DCFH-DA en 1 ml de dimetilsólfóxido (DMSO) para realizar una solución de 10 mM en stock.
  2. Diluir la solución de stock con DMEM precalegado en una solución de trabajo de 10 m justo antes de añadirla a los pozos.
  3. Vortex la solución de trabajo para 10 s.

3. Tinción DCFH-DA

  1. Retire el medicamento que contiene el medio y lávelo una vez con DMEM.
  2. Añadir 500 l de la solución de trabajo DCFH-DA en cada pocóptica e incubar a 37 oC durante 30 min.
  3. Quite la solución de trabajo DCFH-DA. Lavar una vez con DMEM y 2x con 1 solución salina tamponada por fosfato (PBS).
  4. Añadir 500 l de 1x PBS a cada pocól.

4. Adquisición de imágenes y medición de intensidad

  1. Tome imágenes fluorescentes representativas para cada pozo utilizando el canal de proteína fluorescente verde (GFP) en un microscopio de fluorescencia.
  2. Después de tomar imágenes, retire pbS y agregue 200 ml de búfer de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) a cada pocól.
  3. Incubar sobre hielo durante 5 min, luego recoger el lysate celular en tubos de 1,5 ml.
  4. Centrifugar a 21.130 x g durante 10 min a 4oC.
  5. Transfiera 100 l del sobrenadante a una placa negra de 96 pozos y mida la intensidad de la fluorescencia utilizando una fluorescencia de un lector de microplacas a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm.
  6. Transfiera 1 l del sobrenadante a una placa transparente de 96 pocillos que contenga 100 l de solución de ensayo de proteína 1x para medir la concentración de proteínas utilizando el ensayo de Bradford9.
  7. Normalizar las intensidades de fluorescencia con concentraciones de proteínas.

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Representative Results

Las células cancerosas colorrectales HCT116 fueron tratadas con 100 m FS o 10 m DOX para inducir estrés oxidativo7. Como se muestra en la Figura 1,la fluorescencia verde se incrementó drásticamente tanto por FS como en DOX como se esperaba. Para cuantificar el cambio de intensidad relativa, las células fueronizadas después de tomar imágenes y normalizadas con concentraciones de proteínas. La intensidad de fluorescencia cuantificada se incrementó significativamente con FS o DOX en células HCT116.

Figure 1
Figura 1: El tratamiento con hierro aumenta la ROS en las células cancerosas colorrectales. Imágenes fluorescentes representativas tomadas por un microscopio de fluorescencia y cuantificación de intensidad por un lector de microplacas de fluorescencia para tinción de diacetato de 2',7'-diclorodihydrofluorescein (DCFH-DA) en HCT116 células después del control no tratado (Ctrl), (A) 100 m de sulfato ferroso (FS) o (B) tratamiento de doxorubicina (DOX) de 10 m para 24 h. Barra de escala a 400 m. * p < 0.05; p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo experimental descrito aquí es fácilmente reproducible para medir el total celular ROS. Los pasos críticos incluyen hacer que la solución DCFH-DA sea fresca y evitar la exposición a la luz, minimizar las perturbaciones del estado de las células y el lavado extenso de PBS justo antes de tomar imágenes. Para la preparación de la solución de trabajo DCFH-DA, la solución de stock debe añadirse a DMEM precalentado justo antes de añadir en la placa de 24 pozos. La razón es que las soluciones antiguas que generan alta fluorescencia de fondo o exposición a la luz conducirán a la fotoblancada. La mayoría de los estudios utilizan 1x PBS o 1x solución de sal equilibrada de Hanks (HBSS) para diluir DCFH-DA y usarlo como buffer de reacción10. Sin embargo, cuando se utiliza HCT116 y RKO, la dilución de la solución de stock DCFH-DA con PBS y DMEM libre de suero bovino fetal generó una señal de fondo alta incluso en células no tratadas. Esto puede deberse a una alteración del estado de la célula. Además, la solución de trabajo DCFH-DA debe agregarse lentamente a lo largo de la pared del pozo. La perturbación del estado de la célula generará una señal de alta fluorescencia en comparación con el área cercana sin perturbaciones. También es fundamental lavar al menos dos veces con PBS antes de tomar imágenes para reducir la autofluorescencia del fenol que contiene DMEM. DMEM libre de fenol puede ser una mejor opción, pero mostramos aquí que el lavado PBS fue suficiente para minimizar la autofluorescencia. Como se muestra en la Figura 1,incluso en grupos de control no tratados dos lotes diferentes de experimentos podrían dar lugar a diferentes imágenes representativas. Para controlar las variaciones experimentales, recomendamos tratar las células con solución de trabajo DCFH-DA diluida (como en el protocolo) en lugar de agregar una solución de stock directamente a las células. Además, las imágenes deben tomarse en campos con densidades celulares similares y el mismo tiempo de exposición. Por último, es importante realizar experimentos en todos los grupos de comparación al mismo tiempo.

Debido a la importancia de ROS, también se ha desarrollado la detección roscenes específica, además de la detección total de ROS. Por ejemplo, la producción celular de superóxido puede ser detectada por dihidroetio, que tras la oxidación resulta en hidroxilación en la 2 posiciones para formar 2-hidroxitidium. Como 2-hidroxiyetio se intercala en el ADN celular, se puede observar fluorescencia roja con longitudes de onda de excitación y emisión de 535 nm y 635 nm, respectivamente. El superóxido mitocondrial se puede visualizar con el reactivo MitoSOX, un derivado catiónico del dihidroetio que entra en las células vivas y se dirige específicamente a las mitocondrias. El producto de oxidación de Mitosox que genera fluorescencia roja puede intercalarse en ADN mitocondrial. La sonda de peróxido de naftalina fluorescente quimioselectiva fue desarrollada para la detección H2O2 11. Además, también se notificó la detección de radicales hidroxilo utilizando espectrofotometría de fluorescencia12.

En resumen, aquí describimos un protocolo simple y optimizado para detectar ROS total celular utilizando tinción rentable de DCFH-DA.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (K01DK114390), una Beca de Becas de Investigación de la Sociedad Americana contra el Cáncer (RSG-18-050-01-NEC), un Proyecto Piloto de Investigación Subvención del Programa de Firma de Salud Ambiental y Superfundo de la Universidad de Nuevo México (P42 ES025589), un Premio al Proyecto Piloto de Recursos Compartidos y un Premio al Proyecto Piloto de Apoyo al Programa de Investigación del Centro Oncológico Integral de la UNM (P30CA118100) , y un nuevo premio de investigador de los Fondos De Investigación Sanitaria Dedicados de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nuevo México.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate Cayman Chemical, Ann Arbor, MI 20656
Doxorubicin hydrochloride TCI America, Portland, OR D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium Corning, Corning, NY 45000-304
Ferrous Sulfate Heptahydrate VWR, Radnor, PA 97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System Thermo Fisher Scientific Waltham, MA AMAFD1000 or any other fluorescence microscope
Protein assay Bradford solution Bio-Rad, Hercules, CA 5000001
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devices, Radnor, PA 89429-532 or any other fluorescence microplate reader

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References

  1. Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5, (1), 9-19 (2012).
  2. Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24, (4), 325-340 (2015).
  3. Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
  4. Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19, (6), 1202-1213 (2017).
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  8. Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
  9. Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
  10. Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67, (2), 56-60 (2013).
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