Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Cancer Research

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Summary

Der beschriebene Ansatz kombiniert experimentelle Schwanzvenenmetastasierungs-Assays mit in vivo Live-Tier-Imaging, um neben der Quantifizierung der Metastasenzahl und -größe in der Lunge auch die Echtzeit-Überwachung der Bildung und des Wachstums von Brustkrebsmetastasen zu ermöglichen.

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Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. J. Vis. Exp. (154), e60687, doi:10.3791/60687 (2019).

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Abstract

Metastasen sind die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle und es gibt nur begrenzte therapeutische Möglichkeiten für Patienten mit metastasierenden Erkrankungen. Die Identifizierung und Erprobung neuartiger therapeutischer Ziele, die die Entwicklung besserer Behandlungen für metastasierende Erkrankungen erleichtern, erfordert präklinische In-vivo-Modelle. Gezeigt wird hier ein syngenes Mausmodell zur Assaying-Metatonisierung von Brustkrebs und anschließendem Wachstum. Metastasierende Krebszellen werden stabil mit viralen Vektoren transduziert, die Glögfeuer-Luziferase und ZsGreen-Proteine kodieren. Kandidatengene werden dann in luziferase/ZsGrün-exezierenden Krebszellen stabil manipuliert und dann werden die Zellen über die laterale Schwanzvene in Mäuse injiziert, um metastasierende Besiedlung und Wachstum zu assay. Ein In-vivo-Bildgebungsgerät wird dann verwendet, um die Biolumineszenz oder Fluoreszenz der Tumorzellen bei den lebenden Tieren zu messen, um Veränderungen der metastasierenden Belastung im Laufe der Zeit zu quantifizieren. Die Expression des fluoreszierenden Proteins ermöglicht es, die Anzahl und Größe der Metastasen in der Lunge am Ende des Experiments zu quantifizieren, ohne dass eine Schnitt- oder histologische Färbung erforderlich ist. Dieser Ansatz bietet eine relativ schnelle und einfache Möglichkeit, die Rolle von Kandidatengenen bei der metastasierenden Kolonisation und dem Wachstum zu testen, und bietet viel mehr Informationen als herkömmliche Schwanzvenenmetastasasasen. Mit diesem Ansatz zeigen wir, dass der gleichzeitige Knockdown von Yes assoziiertem Protein (YAP) und Transkriptions-Co-Aktivator mit einem PDZ-bindenden Motiv (TAZ) in Brustkrebszellen zu einer reduzierten metastasierenden Belastung in der Lunge führt und dass diese reduzierte Belastung das Ergebnis einer signifikant beeinträchtigten metastasierenden Kolonisation und eines reduzierten Wachstums von Metastasen ist.

Introduction

Krebs bleibt die zweithäufigste Todesursache weltweit1 und Metastasen sind für die Mehrheit dieser Todesfälle verantwortlich2,3. Ein begrenztes Verständnis der molekularen Mechanismen, die die metastasierende Kolonisation und das anschließende Wachstum steuern, hat jedoch die Entwicklung wirksamer Behandlungen für metastasierende Krankheiten behindert. Die Identifizierung neuartiger therapeutischer Ziele erfordert einen Test, um zu testen, wie gestörte Expression oder Funktion eines Kandidatengens die Metastasenbildung und das Wachstum beeinflusst. Autochthone Mausmodelle haben zwar ihre Vorteile, sind aber zeitaufwändig und teuer zu generieren, wodurch sie besser für die Zielvalidierung als für die Zielermittlung geeignet sind. Transplantationsmodellsysteme, bei denen das Kandidatengen in vitro in Krebszellen gestört wird und dann Die Auswirkungen auf das metastasierende Potenzial in vivo bewertet werden, sind kostengünstiger und höherer Durchsatz als autochthone Modelle. Darüber hinaus sind virale Vektoren für die stabile Lieferung von RNAi, CRISPR/CAS9 und Transgenen weit verbreitet, was es relativ einfach macht, praktisch jedes Gen oder Gene zu stören, die an einer Krebszelllinie interessiert sind. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um die Rolle von Kandidatengenen bei der metastasierenden Besiedlung und dem Wachstum menschlicher Krebszelllinien zu untersuchen, indem die Zellen in immungeschwächte oder humanisierte Mäuse transplantiert werden.

Die beiden Arten von Assays, die verwendet werden, um die Metastasenbildung durch transplantierte Krebszellen in vivo zu testen, sind spontane Metastasen-Assays und experimentelle Metastasen-Assays. In spontanen Metastasen-Assays4,5werden Krebszellen in Mäuse injiziert, erlaubt, einen Primärtumor zu bilden, und dann werden spontane Metastasenbildung und anschließendes Wachstum untersucht. Die Stärke dieses Modells besteht darin, dass die Zellen alle Schritte des metastasierenden Prozesses ausführen müssen, um metastasierende Tumoren zu bilden. Jedoch, viele Krebszelllinien nicht effizient in spontanen Metastasen-Modelle metastasieren, und jede Manipulation der Zellen, die primäre Tumorwachstum beeinflusst, kann die Ergebnisse der Metastasierung Assay verwirren. Experimentelle Metastasen-Assays, bei denen Krebszellen direkt in den Kreislauf injiziert werden, werden verwendet, um diese Fallstricke zu vermeiden. Häufige experimentelle Metastasen-Assays sind die Schwanzveneninjektion6,7,8 (und hier gezeigt), intrakardiale Injektion9und Portalveneninjektion10.

Der Zweck des hier vorgestellten Protokolls ist es, einen in vivo experimentellen Metastasen-Assay bereitzustellen, der es einem Forscher ermöglicht, die Metastasenbildung und das Wachstum in Echtzeit zu überwachen, sowie die Anzahl und Größe von Endpunktmetastasen in der Lunge derselben Maus zu quantifizieren. Um dies zu erreichen, werden traditionelle experimentelle Schwanzvenenmetastasen6,7,8 mit Live-Tierbildgebung kombiniert, mit einem in vivo Bildgebungsgerät9,11,12,13,14. Tumorzellen, die sowohl Luziferase als auch ein fluoreszierendes Protein stabil exezieren, werden über die laterale Schwanzvene in Mäuse injiziert und dann wird das in vivo Bildgebungsgerät verwendet, um Veränderungen der metastasierenden Belastung in der Lunge im Laufe der Zeit zu messen (Abbildung 1). Das in vivo Live-Tierbildbildgerät kann jedoch die Größe einzelner Metastasen nicht unterscheiden oder messen. So wird am Ende des Experiments ein fluoreszierendes Stereomikroskop verwendet, um die Anzahl zu zählen und die Größe der fluoreszierenden Metastasen in der Lunge zu messen, ohne dass Schnittund und Histologie oder Immunhistochemie erforderlich sind (Abbildung 1). Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zu testen, wie die Veränderung der Expression oder Funktion eines Kandidatengens die Metastasenbildung und das Wachstum beeinflusst. Mögliche therapeutische Verbindungen wie kleine Moleküle oder funktionsblockierende Antikörper können ebenfalls getestet werden.

Um diesen Ansatz zu demonstrieren, führten wir zunächst ein Proof-of-Concept-Experiment durch, bei dem der wesentliche Replikationsfaktor, das Replikationsprotein A3 (RPA3), in metastasierenden Maus-Brustkrebszellen niedergeschlagen wird. Wir zeigen, dass Mäuse, die mit RPA3-Knockdown-Zellen injiziert werden, zu jedem Zeitpunkt eine signifikant geringere metastasierende Belastung aufweisen als Mäuse, die mit Kontrollzellen injiziert werden. Die Analyse der metastasierenden Lunge zeigt, dass diese reduzierte metastasierende Belastung das Ergebnis einer signifikant reduzierten metastasierenden Kolonisation und eines beeinträchtigten Wachstums der metastasierenden Metastasen ist. Um diese Technik weiter zu demonstrieren, haben wir getestet, ob der gleichzeitige Abschlag von Yes-assoziiertem Protein (YAP) und Transkriptions-Co-Aktivator mit einem PDZ-bindenden Motiv (TAZ) die metastasierende Kolonisation oder das nachfolgende Wachstum beeinträchtigt. YAP und TAZ sind zwei verwandte Transkriptions-Coaktivatoren, die die kritischen downstream-Effektoren des Hippo-Pfads sind. Wir15,16 und andere haben YAP und TAZ in Metastasen verwickelt (rezensiert in17,18,19), was darauf hindeutet, dass diese Proteine gute therapeutische Ziele sind. Konsequenterweise fanden wir heraus, dass Mäuse, die mit YAP/TAZ-Knockdown-Zellen injiziert wurden, die metastasierende Belastung signifikant reduziert hatten. Die Analyse der Lunge zeigte, dass die YAP/TAZ-Knockdown-Zellen viel weniger Metastasen bildeten und dass die Metastasen, die sich bildeten, kleiner waren. Diese Experimente zeigen, wie experimentelle Metastasen-Assays es einem Forscher ermöglichen, schnell und kostengünstig die Rolle eines Kandidatengens bei der Metastasenbildung und dem Wachstum zu testen. Sie zeigen ferner, wie der kombinierte Einsatz von Live-Tierbildgebung und fluoreszierender Quantifizierung von Metastasen in ganzen Lungen es dem Forscher ermöglicht, die Schritte während der metastasierenden Besiedlung besser zu verstehen.

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Protocol

Dieses Protokoll umfasst die Verwendung von Mäusen und biogefährlichen Stoffen und bedarf der Zustimmung der zuständigen institutionellen Sicherheitsausschüsse. Alle hier beschriebenen In-vivo-Arbeiten werden vom institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss des Albany Medical College (IACUC) genehmigt.

HINWEIS: Eine Protokollübersicht finden Sie im Schaltplan in Abbildung 1.

1. Verpackung aller erforderlichen Retroviren und Lentiviren

HINWEIS: Das beschriebene Protokoll verwendet lentivirale oder retrovirale Vektoren, um ein Luziferase-Enzym und fluoreszierendes Protein stabil auszudrücken und die Expression eines Kandidatengens zu manipulieren. Diese Viren werden wie unten beschrieben in HEK-293FT-Zellen verpackt.

  1. Tag 1: Platte HEK-293FT-Zellen auf 6-Well-Platten in 2 ml komplettem Wachstumsmedium (10% FBS in DMEM mit 1% Penicillin/Streptomycin und 2 mM L-Glutamin), so dass sie am 2. Tag 40-60% konfluent sind. Bei 37 °C inkubieren, 5%CO2 über Nacht.
  2. Tag 2: Für jeden zu verpackenden viralen Vektor einen 40-60% Konfluentbrunnen der HEK-293FT-Zellen mit dem retroviralen oder lentiviralen Vektor und den entsprechenden Vektoren, die die viralen Mantel- und Verpackungsproteine kodieren, transfezieren.
    HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet VSVG als Deckprotein, psPAX2 für lentivirale Verpackungen und Knebelpol für retrovirale Verpackungen (siehe Ergänzende Tabelle 1 für Vektorliste).
  3. Machen Sie eine Co-Transfektion-Mischung für jeden Brunnen wie folgt:
    1. Kombinieren Sie 4 l Lipidlösung für Transfektionen (siehe Materialtabelle)und 96 l Transfektionspuffer und inkubieren Sie 5 Minuten lang.
    2. Fügen Sie 1 g viralen Vektor, 0,5 g Mantelproteinvektor (VSVG) und 0,5 g Verpackungsproteinvektor (psPAX2 oder Gag-pol) hinzu und brüten 20 Minuten lang.
    3. Fügen Sie die Co-Transfektionsmischung aus Schritt 1.3.2 vorsichtig zu den HEK-293FT-Zellen hinzu, die in Schritt 1.1 plattiert sind, und brüten Sie bei 37 °C, 5%CO2 über Nacht.
  4. Tag 3: Entfernen Sie die transfetionshaltigen Medien aus jedem Brunnen und fügen Sie vorsichtig 2 ml komplette Wachstumsmedien zu jedem Brunnen hinzu. Bei 37 °C inkubieren, 5% CO2 für ca. 24 Stunden.
  5. Tag 4: Sammeln Sie den viralen Überstand von jedem Brunnen mit einer 3 ml Spritze und filtern Sie durch einen 0,45 m Filter in ein 2 ml Mikrozentrifugenrohr.
  6. Optional: Wenn die Sammlung einer zweiten Viruscharge gewünscht wird, fügen Sie vorsichtig 2 ml komplette Wachstumsmedien zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C, 5%CO2 für ca. 24 Stunden.
  7. Tag 5 (Optional): Sammeln Sie eine zweite Runde viralen Überstandwies wie in Schritt 1.5.
    HINWEIS: Das Protokoll kann durch Einfrieren des viralen Überstandes angehalten werden.

2. Erzeugung von Krebszellen, die eine luziferase und ein fluoreszierendes Protein stabil ausdrücken

HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt, wie man zuerst 4T1-Zellen mit Galleifeferase und einem fluoreszierenden Protein (ZsGreen) mit zwei Vektoren mit einzigartigen Selektionsgenen stabil kennzeichnen kann. Dann wird ein3. viraler Vektor verwendet, um die Expression eines Kandidatengens zu manipulieren. Aber auch virale Vektoren, die gleichzeitig ein fluoreszierendes Protein und eine genetische Manipulation liefern, können als Alternative eingesetzt werden (wie in den repräsentativen Experimenten unten). Andere Krebszellen können verwendet werden, aber die Zellzahlen sollten für die Schritte 2.1 und 2.7.1 optimiert werden.

  1. Platte 4T1-Zellen bei 1,5 x 105 Zellen/Gut in einer 12-Well-Platte in kompletten Wachstumsmedien (10% FBS in DMEM mit 1% Penicillin/Streptomycin und 2 mM L-Glutamin) und bei 37 °C, 5%CO2 über Nacht inkubieren.
  2. Infizieren Sie die 4T1-Zellen mit dem viralen Überstand, der in Schritt 1 wie folgt erzeugt wird.
    1. Saugen Sie die Wachstumsmedien aus den Zellen und fügen Sie 500 L luziferase viralen Überstand und 500 l fluoreszierendes Protein viralen Überstand hinzu, um die Zellen gleichzeitig mit der Luziferase und fluoreszierenden Protein viralen Übertreibungen zu infizieren.
    2. Fügen Sie 1 l von 8 mg/ml Hexadimethrinbromid hinzu (siehe Materialtabelle).
    3. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5% bis 75-90% konfluent (in der Regel 24-48 Stunden).
  3. Trypsinisieren Sie die 4T1-Zellen mit 500 l Trypsin für 2-5 Minuten (Zellen sollten frei von der Unterseite des Brunnens abspülen). Übertragen Sie alle Zellen auf eine 6 cm Schale in 4 ml Selektionsmedien (komplette Wachstumsmedien, die die entsprechenden Antibiotika enthalten) und löschen Sie so das Trypsin. Platte eine 6 cm Schale von nicht infizierten Kontrollzellen in den gleichen Selektionsmedien.
    HINWEIS: Eine angemessene Antibiotikakonzentration sollte im Voraus durch Tests mehrerer Dosen bestimmt werden. Zusätzlich kann die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung auch verwendet werden, um die fluoreszierend markierten Zellen anstelle der Arzneimittelauswahl auszuwählen.
  4. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5%CO2 in Selektionsmedien und spalten Sie die Zellen bei Bedarf, bis alle nicht infizierten Kontrollzellen tot sind (abhängig vom Selektionsgen und der Zelllinie).
  5. Bestätigen Sie, dass die infizierten 4T1-Zellen das ZsGreen-Fluoreszenzprotein mit einem grünen Anregungsfilter (450-490 nm)/Emission (500-550 nm) auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop bei 50-100-facher Vergrößerung ausdrücken.
  6. Bestätigen Sie, dass die infizierten 4T1-Zellen Luziferase mit einem kommerziell erhältlichen Luciferase-Aktivitätskit wie folgt exexzieren.
    1. Verwenden Sie ein minimales Volumen von 1x passivem Lysepuffer, um luziferase-exprimierende 4T1-Zellen zu lyseundisieren und 4T1-Zellen zu steuern, die keine Luziferase ausdrücken und 30 Minuten lang sanft schütteln.
    2. Fügen Sie 20 L Zelllysat zu einer weißen 96-Well-Platte und dann 50 l des Luziferase-Assay-Reagenz aus dem Luciferase-Aktivitätskit hinzu.
    3. Verwenden Sie einen Plattenleser, um die Lumineszenz der Zellen bei allen Wellenlängen im Spektrum mithilfe der Lumineszenzeinstellung zu messen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann angehalten werden, indem die stabil endenden Zellen eingefroren werden.
  7. Manipulieren Sie die Expression des Kandidatengens wie folgt:
    1. Platte 6 x 105 beschriftet 4T1-Zellen ab Schritt 2,6 auf einer 60-mm-Schale in 4 ml komplettem Wachstumsmedium und bei 37 °C, 5%CO2 über Nacht inkubieren.
    2. Saugen Sie die Wachstumsmedien aus jedem Brunnen und fügen Sie 2 ml vollständige Wachstumsmedien hinzu, die 4 l mit 8 mg/ml Hexadimethrinbromid enthalten.
    3. Fügen Sie 2 ml viralen Überstand aus Schritt 1 zu den Zellen, die ab Schritt 2.7.2 plattiert sind, und inkubieren bei 37 °C, 5%CO2 über Nacht.
    4. Trypsinisieren Sie die 4T1-Zellen mit 500 l Trypsin für 2-5 Minuten (Zellen sollten frei von der Unterseite des Brunnens abspülen). Übertragen Sie alle Zellen auf eine 10 cm Schale in 10 ml Selektionsmedien (vollständige Wachstumsmedien, die die entsprechenden Antibiotika enthalten) und löschen Sie so das Trypsin. Platte einige nicht infizierte Steuerelemente mit 4T1-Zellen im selben Auswahlmedium beschriftet.
    5. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5%CO2 in Selektionsmedien und spalten Sie die Zellen bei Bedarf, bis alle nicht infizierten Zellen tot sind.
    6. Bestätigen Sie, dass die Expression des Kandidatengens mit einem Standardansatz wie Western Blot20 oder qPCR21verändert wird.
    7. Assay Lumineszenz und Fluoreszenz wie in den Schritten 2.5-2.6, um zu bestimmen, wie ähnlich sie in Kontroll- und Knockdown-Zellen sind, da sich dies ändern kann (siehe Diskussion).
      HINWEIS: Das Protokoll kann angehalten werden, indem die stabil endenden Zellen eingefroren werden.

3. Optimierung des in vivo experimentellen Designs

  1. Optimieren Sie die geeignete Zellzahl und Die Dauer des Experiments für die gewünschte metastasierende Belastung wie folgt.
    1. Erweitern Sie die fluoreszierenden und biolumineszierenden 4T1-Zellen ab Schritt 2.6 in kompletten Wachstumsmedien, so dass überschüssige Zellen am gewünschten Injektionstag verfügbar sind.
    2. Bereiten Sie die Zellen für Schwanzveneninjektionen vor, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Um die optimale Zellzahl für Injektionen zu bestimmen, setzen Sie die Zellen in verschiedenen Konzentrationen in 100 l 1x PBS wieder aus.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Bereich von Zellennummern/Maus von 25.000 bis 500.000 zu testen.
    3. Halten Sie die Zellsuspensionen bis zur Injektion auf Eis.
    4. Injizieren Sie jede Verdünnung von 4T1-Zellen aus Schritt 3.1.2 in 3-4 Mäuse über die in Schritt 4.3 beschriebene laterale Schwanzvene (siehe unten).
    5. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig und Monitor für 15 Minuten, um eine vollständige Wiederherstellung zu gewährleisten. Mäuse sollten 3x wöchentlich auf Anzeichen von Schmerzen oder Schmerzen überprüft werden.
    6. Überwachen Sie Mäuse 3-6 Wochen lang auf Metastasenbildung und Wachstum (Zelllinie und Mausstammabhängig) mit einem in vivo Live-Tierbildgebungsgerät (siehe Schritte 5 und 6).
      1. Euthanisieren Sie Mäuse 3-6 Wochen nach der Injektion der Schwanzvene nach den üblichen institutionellen Richtlinien.
      2. Bereiten Sie die Lunge vor und bewerten Sie die Größe und Anzahl der Metastasen, die in Schritt 7 beschrieben sind.
      3. Wählen Sie die geeignete Zeitdauer für die Metastasen, um für die gewünschte metastasierende Belastung zu wachsen (siehe Diskussion).

4. Schwanzveneninjektion von markierten Krebszellen

HINWEIS: Schritt 4.2.4 wurde für 4T1-Zellen optimiert, die in syngenischen BALB/c-Mäusen wachsen. Wenn andere Krebszelllinien und Mausstämme verwendet werden, sollten zuerst die Anzahl der injizierten Zellen und die Länge des Assays optimiert werden.

  1. Erweitern Sie die in Schritt 2 erzeugten 4T1-Zelllinien auf zwei 15 cm großen Schalen in kompletten Wachstumsmedien, so dass am Tag der Injektion überschüssige Zellen zur Verfügung stehen.
  2. Bereiten Sie die Zellen für die Injektion der Schwanzvene wie folgt vor:
    1. Aspirieren Sie die Medien und spülen Sie die Zellplatten mit 1x PBS.
    2. Trypsinisieren Sie die Zellen mit 5 ml Trypsin pro 15 cm Platte für 2-5 Minuten (Zellen sollten frei abspülen die Unterseite des Brunnens). Übertragen Sie alle Zellen in ein konisches Rohr. Waschen Sie die verbleibenden Zellen aus der Gewebekulturschale mit genügend vollständigen Wachstumsmedien, um das Trypsin zu löschen und fügen Sie die Wäsche in das gleiche konische Rohr.
    3. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines automatisierten Zellenzählers, um die Gesamtzahl der Zellen zu bestimmen.
    4. Zentrifugieren Sie die Zellen 3 Minuten lang bei 122 x g, aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1x PBS in der gewünschten Konzentration wieder aus. Hierwerden werden 2,5 x 104 Zellen in jede Maus in 100 l PBS injiziert, so dass die Resuspendzellen bei 2,5 x 105 Zellen/ml. Halten Sie die Zellsuspensionen bis zur Injektion auf Eis.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Zeit zwischen der Trypsinisierung der Zellen und der Schwanzveneninjektion auf etwa 1 Stunde zu begrenzen.
  3. Injizieren Sie 4T1-Zellen aus Schritt 4.2.5 in Mäuse über die laterale Schwanzvene wie folgt:
    1. Arbeiten Sie in einer Haube in der Tieranlage, mischen Sie die Zellen sanft, aber gründlich, indem Sie das Rohr invertieren oder eine 1 ml Spritze verwenden, um sicherzustellen, dass sie gleichmäßig resuspendiert werden. Stellen Sie immer sicher, dass die Zellen vor dem Beladen der Spritze resuspendiert werden.
    2. Laden Sie eine 1 ml Luer-Lock Spritze mit Zellsuspension und vertreiben Sie überschüssige Luftblasen. Legen Sie eine Nadel mit 1,2 Zoll und 30-Spur auf die Spritze mit der Abschrägung und vertreiben Sie Luftblasen.
    3. Legen Sie die Maus vorsichtig in einen Nagetier-Restrainer.
    4. Die seitlichen Schwanzvenen sollten sichtbar und erweitert sein. Wenn nicht, kneifen Sie vorsichtig die Basis des Schwanzes und tauchen Sie den Schwanz in warmes Leitungswasser, um die Venen zu verdünnen.
      HINWEIS: Eine Erweiterung der Venen kann auch erreicht werden, indem der Mauskäfig unter einer Heizlampe und/oder auf einem Heizkissen platziert wird.
    5. Verwenden Sie ein Alkoholtuch, um den Schwanz zu reinigen. Setzen Sie die Nadel in die Schwanzvene ein, fasen Sie seite nach oben, und injizieren Sie 100 l Zellsuspension.
      HINWEIS: Wenn die Nadel richtig in die Vene eingeführt wird, sollte sie leicht nach vorne und hinten gleiten, und es sollte kein Widerstand vorhanden sein, wenn der Kolben gedrückt wird. Erfolgreiche Injektionen sollten auch zu einem "Flush" führen, bei dem die blaue Farbe der Vene für einige Sekunden nach der Injektion weiß wird.
  4. Entfernen Sie langsam die Nadel und mit einer sterilen Gaze, Druck auf die Injektionsstelle ausüben, um jede Blutung zu stoppen.
  5. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig und Monitor für 15 Minuten, um eine vollständige Wiederherstellung zu gewährleisten. Mäuse sollten 3x wöchentlich auf Anzeichen von Schmerzen oder Schmerzen überprüft werden.
  6. Überwachen Sie Mäuse 3-6 Wochen lang auf Metastasenbildung und Wachstum (Zelllinie und Mausstammabhängig) mit einem in vivo Live-Tierbildgebungsgerät (siehe Schritte 5 und 6).

5. Überwachung der metastasierenden Belastung durch Fluoreszenz mit einem in vivo Live-Tierbildgebungsgerät

HINWEIS: Bildtiere nicht für Fluoreszenz mit aktivem Leuchtsignal abbilden.

  1. Wenn sie nur die Biolumineszenz abbilden, fahren Sie mit Schritt 6 fort.
  2. Schalten Sie das in vivo Live-Tier-Bildgebungsgerät ein.
  3. Richten Sie das In-vivo-Anästhesiesystem für lebende Tiere gemäß den Herstellerrichtlinien ein, um zwischen 1,5% und 2% Isofluran in die Anästhesiekammer und die Bildgebungskammer zu liefern.
  4. Anästhesisieren Sie Mäuse mit fluoreszierend markierten Metastasen ab Schritt 4, indem Sie sie in eine Anästhesiekammer legen und 1,5-2,5% Isofluran liefern.
  5. Öffnen Sie die Bildsoftware (siehe Tabelle der Materialien) und melden Sie sich an.
  6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Initialisieren, und warten Sie, bis der Computer initialisiert wurde.
  7. Ändern Sie das Feld der Ansicht in D.
    HINWEIS: Feld der Ansicht C kann auch verwendet werden, wenn eine nähere Ansicht einer Maus erforderlich ist, aber dies begrenzt die Anzahl der Mäuse, die gleichzeitig abgebildet werden können.
  8. Sobald die Software angezeigt hat, dass die Kamera die entsprechende Temperatur erreicht hat, klicken Sie auf die Schaltfläche Imaging Wizard, wählen Sie Fluoreszenz und wählen Sie dann das entsprechende Filterpaar aus dem Dropdown-Menü aus.
    HINWEIS: Wenn das verwendete Fluorophor keine Option ist, wählen Sie Input EX/EM aus und geben Sie die erforderliche Anregung und Emission ein.
  9. Platzieren Sie die Maus in der Kammer, wie in Schritt 3.2.4 beschrieben.
  10. Klicken Sie auf Sequenz erwerben.
  11. Nach der Bildgebung kehren Sie die Maus für 15 Minuten in ihren Käfig und Monitor zurück, um eine vollständige Wiederherstellung zu gewährleisten.
  12. Wiederholen Sie Schritt 5.2 und die Schritte 5.7-5.9 mit mindestens einer Maus, die keine Metastasen enthält. HINWEIS: Diese Maus wird verwendet, um Hintergrundsignale während der Analyse zu quantifizieren und zu subtrahieren (Schritt 8).
  13. Bild 2-3 mal wöchentlich für die Dauer des Experiments.

6. Überwachung der metastasierenden Belastung durch Biolumineszenz mit einem in vivo Live-Tierbildgebungsgerät

  1. Schalten Sie das Live-Tierbildgerät in vivo ein und richten Sie das Programm wie folgt ein.
    1. Öffnen Sie die Bildsoftware (siehe Tabelle der Materialien) und melden Sie sich an. Klicken Sie auf die Schaltfläche Initialisieren, und warten Sie, bis der Computer initialisiert wurde. Ändern Sie das Feld der Ansicht in D.
      HINWEIS: Feld der Ansicht C kann für eine nähere Ansicht verwendet werden, um den gesamten Mauskörper abzubilden; Dies begrenzt jedoch die Anzahl der Mäuse, die gleichzeitig abgebildet werden können.
    2. Bearbeiten Sie bei der ersten Verwendung die Belichtungseinstellungen wie folgt: Klicken Sie auf Bearbeiten | Präferenzen | Akquisition | Automatische Belichtung und ändern Sie die maximale Belichtungszeit von der Standardeinstellung 60 Sekunden auf 300 Sekunden und klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Ändern Sie keine anderen Parameter auf der Registerkarte Autobelichtung.
  2. Richten Sie das Anästhesiesystem nach herstellerspezifischen Richtlinien ein, um zwischen 1,5% und 2% Isofluran in die Anästhesiekammer und die Bildgebungskammer zu liefern.
  3. Stellen Sie sicher, dass die Kamera die entsprechende Temperatur erreicht hat, bevor Sie mit Schritt 6.4 fortfahren.
  4. Anästhesieren Sie metastasierende Mäuse ab Schritt 4, indem Sie sie in eine Anästhesiekammer legen und 1,5-2,5% Isofluran liefern.
  5. Bereiten Sie Mäuse wie folgt auf die Biolumineszenz-Bildgebung vor.
    1. Laden Sie eine 1 ml Spritze mit D-Luciferin (30 mg/ml in D-PBS) und fügen Sie dann eine 1/2 Zoll 30-Spur-Nadel in die Spritze und vertreiben Luftblasen.
    2. Messen und aufzeichnen Sie die Masse der anästhesierten Maus.
    3. Halten Sie die Maus zurück, indem Sie die Schürfzeit ihres Halses mit Daumen und Zeigerfingern kneifen und den Schwanz zwischen dem Pinkiefinger und der Basis der Hand greifen. Invertieren Sie die Maus in einem 45-Grad-Winkel, mit dem Kopf nach unten gerichtet.
    4. Setzen Sie die Nadel, Abschrägung Seite nach oben, in die linke Seite der Maus intraperitoneal (IP) Raum. Bestätigen Sie den Eintrag in den IP-Bereich, indem Sie ein kleines Volume zurückzeichnen. Es sollte keine Farbe an der Basis der Nadel vorhanden sein, wenn sie im IP-Bereich zurückgezeichnet wird.
    5. Injizieren Sie das entsprechende Volumen von D-Luciferin für eine Dosis von 150 mg/kg.
    6. Unmittelbar nach der Verabreichung von D-Luciferin starten Sie einen Timer und legen Sie die Maus flach auf den Rücken in das Bildgebungsgerät mit der Nase im Nasenkegel und stellen Sie sicher, dass 1,5-2,5% Isofluran verabreicht wird. Platzieren Sie Trennwände zwischen jeder Maus, wenn Sie mehrere Mäuse bildgeben. Stellen Sie sicher, dass Mäuse so flach wie möglich positioniert sind (d. h. nicht zur Seite geneigt sind).
    7. Klicken Sie auf die Felder Luminescent und Photograph, und klicken Sie dann in der Erfassungssteuerungauf Übernehmen .
  6. Erfassen Sie kontinuierlich biolumineszierende Bilder, bis das Spitzensignal erreicht ist, und verwenden Sie das Bild mit dem Peak-Biolumineszenzsignal für die Analyse.
  7. Nach der Bildgebung kehren Sie die Maus für 15 Minuten in ihren Käfig und Monitor zurück, um eine vollständige Wiederherstellung zu gewährleisten.
  8. Bild 2-3 mal wöchentlich für die Dauer des Experiments.

7. Quantifizierung der Anzahl und Größe der Metastasen

HINWEIS: Die Dauer des Anbaus der Metastasen sollte für jede Zelllinie und jeden Mausstamm bestimmt werden und wird durch die Anzahl der injizierten Zellen beeinflusst.

  1. Euthanisieren Sie die Mäuse nach standardinstitutionellen Richtlinien.
  2. Isolieren und entfernen Sie die Lunge von jeder Maus und spülen Sie in 1x PBS, um überschüssiges Blut zu entfernen.
  3. Die Lunge vorsichtig in Lappen trennen.
  4. Erfassen Sie Bilder von ZsGreen-Metastasen in den Lappen bei 10x im hellen Feld und fluoreszenz mit einem fluoreszierenden Stereoskop mit einem GFP-Breitbandfilter (Erregung 470/40x).
    HINWEIS: Behalten Sie die gleiche Vergrößerung und Helligkeit für alle Proben bei. Die verwendete Vergrößerung kann je nach Größe, Anzahl und Helligkeit der Metastasen sowie dem Sichtfeld für das verwendete Mikroskop variieren.
  5. Verwenden Sie Bildanalysesoftware, um die Größe und Anzahl der Metastasen aus den Bildern zu quantifizieren.
    HINWEIS: Das Protokoll für die Bildanalyse ist softwareabhängig und könnte mit Tumoren von Schritt 3 optimiert werden. Alternativ können Sie die Anzahl der Metastasen in jeder Lunge manuell mit dem fluoreszierenden Stereoskop zählen. Das Protokoll kann hier angehalten werden und Schritt 8 kann jederzeit durchgeführt werden, nachdem alle In-vivo-Bilder gesammelt wurden.

8. Verarbeitung und Analyse der Daten aus den mit dem Live-Tierbildgerät in vivo aufgenommenen Bildern

  1. Öffnen Sie alle Bilddateien für jede Maus in der Bildsoftware.
    ANMERKUNG: Verwenden Sie das Bild mit dem Spitzen-Biolumineszenzsignal zur Analyse
  2. Stellen Sie sicher, dass sich die Einheiten in Radiance befinden, um biolumineszierende Daten und Effizienz für fluoreszierende Daten zu erhalten, indem Sie auf den Pfeil oben links im Bildfenster klicken und ihn in die entsprechende Einheit ändern.
  3. Verwenden Sie das Bild vom letzten Zeitpunkt, um eine Region von Interesse (ROI) wie folgt zu erstellen.
    1. Klicken Sie im Fenster Werkzeugpalette auf ROI-Werkzeuge. Fügen Sie einen ROI ein, indem Sie auf den Pfeil klicken und 1auswählen.
    2. Klicken Sie auf den Rand des ROI und bewegen Sie ihn über die Brust der Maus. Passen Sie die Größe des ROI so an, dass er die Brust der Maus abdeckt und das Signal nicht ausschließt.
  4. Klicken Sie auf ROIs messen, und kopieren oder geben Sie die unformatierte Zahl in ein Excel-Blatt ein.
    HINWEIS: Wählen Sie für biolumineszierende Daten den Gesamtfluss (Photonen/Sekunde) aus, der die Summe aller Strahlungen im ROI darstellt. Da Metastasen nicht notwendigerweise gleichmäßig wachsen, wird der Gesamtfluss gegenüber der durchschnittlichen Ausstrahlung bevorzugt, da er die Summe der metastasierenden Belastung misst. Ebenso sollte für fluoreszierende Daten der Gesamtwirkungsgrad %(Emissionslicht (Photonen/Sekunde)/Anregungslicht (Photonen/Sekunde)) anstelle der durchschnittlichen Effizienz verwendet werden.
  5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in die Bilddatei, um den roi in Schritt 8.3 zu kopieren und in jede Bilddatei einzufügen.
    HINWEIS: Quantifizieren Sie bei der Quantifizierung von fluoreszierenden Bildern dieselbe Region auf einer Maus, die ohne Metastasierung abgebildet wurde. Verwenden Sie dieses Signal als Hintergrundsignal und subtrahieren Sie es von jedem fluoreszierenden metastasenhaltigen Mausbild, das erfasst wurde.
  6. Verschieben Sie eingefügte ROIs über denselben Bereich, der in Schritt 8.3.4 für jedes Bild ausgewählt wurde, und wiederholen Sie Schritt 8.4.
  7. Plotten und analysieren Sie die Rohdaten wie folgt (siehe Ergänzende Tabelle 2).
    1. Führen Sie eine Log10-Transformation der Rohdaten für jede Maus mit der angegebenen Formel (Ergänzende Tabelle 2) und Diagramm wie in Abbildung 2D und Abbildung 4Fdurch. Die log10-Transformation linearisiert die Wachstumskurve, die zu geometrischer Weise ist, und minimiert die Heteroskedastizität.
    2. Berechnen Sie mithilfe der linearen Regression die Steigung der angepassten Linie zu den transformierten Protokolldaten10 für jede in Schritt 8.7.1 dargestellte Maus (Ergänzende Tabelle 2). Beziehen Sie sich auf die Formel in Ergänzungstabelle 2, um die Linie anzupassen und die Neigung in einem Schritt zu berechnen.
    3. Zeichnen Sie die numerischen Werte der Steigungen wie in Abbildung 2E und Abbildung 4G. Verwenden Sie einen Schüler-T-Test oder eine einseitige ANOVA (für mehr als 2 Gruppen) auf der Piste, um die statistische Signifikanz zu bestimmen.

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Representative Results

Um den obigen Ansatz zu demonstrieren, führten wir ein Proof-of-Concept-Experiment durch, bei dem ein kritischer Replikationsfaktor, RPA3, in einer metastasierenden Maus-Mammakarzinom-Zelllinie niedergeschlagen wurde (4T122). Während das Protokoll beschreibt, dass die Zellen vor der genetischen Manipulation sowohl mit Luziferase als auch mit fluoreszierenden Proteinen gekennzeichnet werden, haben wir einen modifizierten Ansatz verwendet, da DIE RNAi-Vektoren auch ZsGreen liefern (Abbildung 2A). Zunächst wurden 4T1-Zellen mit einem lentiviralen Konstrukt, das Glühwürmchen-Luziferase und Hygromycinresistenz (pHAGE-Luciferase-IRES-Hygro) kodiert, stabil transduziert. Nach der Hygromycin-Auswahl wurde ein Luziferase-Assay durchgeführt, um einen stabilen Ausdruck der Glühwürmchen-Luzifferase zu bestätigen (Abbildung 2A). Als nächstes wurden die 4T1-Luciferase-Zellen stabil mit retroviralen Vektoren transduktiert, die ZsGreen und entweder eine Kontroll-miR30-basierte shRNA oder eine miR30-basierte shRNA exprimieren, die zuvor gezeigt wurde, dass sie effektiv auf Maus RPA316,23,24abzielen. Die Zellen wurden dann über die laterale Schwanzvene in die Mäuse injiziert und das in vivo biolumineszierende Signal wurde zweimal pro Woche gemessen, um die metastasierende Belastung zu überwachen (Abbildung 2B,C). Das log10 transformierte Signal für jede Maus wurde als metastasierende Belastung im Laufe der Zeit dargestellt (Abbildung 2D) und die Steigungen jedes Diagramms wurden bestimmt (Abbildung 2E). Diese Daten zeigen, dass die Veränderungsrate der metastasierenden Belastung mit RPA3-Knockdown im Vergleich zu Kontrollzellen signifikant reduziert wird. Obwohl die Unterschiede frappieren, erlauben uns diese Daten allein nicht festzustellen, ob die reduzierte metastasierende Belastung das Ergebnis weniger Metastasen oder eines langsameren Wachstums von Metastasen ist. Daher wurden am Ende des Experiments auch die ZsGreen-markierten Metastasen in der Lunge analysiert. Mäuse, die mit RPA3-Knockdown-Zellen injiziert wurden, hatten fast keine Metastasen in der Lunge, während die Kontrollmäuse zahlreiche große Metastasen hatten (Abbildung 3). Darüber hinaus waren die Metastasen, die sich aus RPA3-Knockdown-Zellen bildeten, deutlich kleiner als Kontroll-4T1-Metastasen (Abbildung 3A). In Übereinstimmung mit unseren manuellen Zählungen (Abbildung 3B) zählte die Bildanalysesoftware deutlich weniger Metastasen in den RPA3-Knockdown-Mäusen (Abbildung 3C). Zusätzlich wurde die gesamte metastasierende Belastung in der Lunge (Summe der Bereiche jeder Metastasierung in Millimetern) durch RPA3-Knockdown drastisch reduziert (Abbildung 3D). Schließlich war die Größe der einzelnen Metastasen, die sich in den RPA3-Knockdown-Mäusen bildeten, im Allgemeinen viel kleiner als bei den Kontrollmäusen(Abbildung 3E). Zusätzlich zu den großen Metastasen in den Kontrollmäusen haben wir auch zahlreiche kleine Metastasen beobachtet, können aber nicht feststellen, ob es sich um Tumorzellen handelt, die die Lunge säten und nicht wuchsen, oder ob es sich um Tumorzellen handelt, die aus einer der größeren Metastasen vergossen wurden, die die Lunge an einem neuen Ort wieder aussäten (Abbildung 3E). Zusammen zeigen diese Daten, dass RPA3 für die Metastasierungsbildung durch 4T1-Zellen erforderlich ist. Diese Ergebnisse wurden erwartet, weil unsere früheren Arbeiten zeigten, dass RPA3-Knock-down-Zellen die Fähigkeit, Metastasen in der Lunge nach der Schwanzveneninjektion zu bilden, signifikant vermindert hatten16. Dieses Experiment zeigt jedoch, wie die Verwendung von Live-Tierbildgebung und fluoreszierende Quantifizierung von Metastasenzahl und -größe verwendet werden kann, um festzustellen, ob Veränderungen der metastasierenden Belastung auf Unterschiede in der metastasierenden Besiedlung oder dem Wachstum zurückzuführen sind.

Um zu zeigen, wie dieser Ansatz verwendet werden kann, um eine biologisch relevante Frage zu beantworten, haben wir gefragt, ob YAP und TAZ für die metastasierende Kolonisation und das anschließende Wachstum in diesem syngenischen Modell von Brustkrebs erforderlich sind. Die Expression und Aktivität von YAP oder TAZ sind bei vielen Krebsarten im Vergleich zu normalem Gewebe erhöht und dies ist Vorhersage von schlechten Patientenergebnis25,26,27,28,29. Darüber hinaus haben mehrere Studien YAP, TAZ oder TEADs, die kritischen YAP/TAZ-bindenden Partner, in Metastasen15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. Angesichts dieser Daten haben wir unseren Ansatz verwendet, um zu testen, ob YAP und TAZ für metastasierende Bildung und Wachstum erforderlich sind. Dazu verwenden wir einen retroviralen Vektor, der Tandem-miR30-basierte shRNAs exizipierungsmittel ausdrückt, die sowohl auf YAP als auch auf TAZ abzielen. Wie gezeigt, reduziert diese Tandem-SHRNA effektiv die YAP- und TAZ-Proteinexpression und Transkriptionsaktivität in 4T1-Zellen (Abbildung 4A,B). 4T1-Luciferase-Zellen wurden mit einer ZsGreen-exezierenden Version dieses Tandem-YAP/TAZ shRNA-Vektors oder einer Kontroll-miR30-basierten shRNA (Abbildung 4C) stabil transduziert und dann durch Schwanzveneninjektionen bei syngenischen BALB/c-Mäusen untersucht. Wie in Abbildung 4dargestellt, war die Rate, mit der die metastasierende Belastung zunahm, bei den Mäusen, die mit Kontrollzellen injiziert wurden, signifikant schneller als bei den Mäusen, die mit YAP/TAZ-Knockdown-Zellen injiziert wurden ( Abbildung4D-F). Deutlich weniger Metastasen, die in den Mäusen gebildet wurden, die mit YAP/TAZ-Knockdown-Zellen injiziert wurden, im Vergleich zu Mäusen mit Kontrollzellen, ob manuell gezählt (Abbildung 5A,B) oder mit der Bildanalysesoftware (Abbildung 5C). In den Kontrollmäusen bildeten sich nicht nur viel mehr Metastasen, sondern sie waren im Allgemeinen größer (Abbildung 5E). Konsequent wurde auch die metastasierende Belastung in der Lunge (Gesamtmetastasenbereich in mm) durch YAP/TAZ-Knockdown drastisch reduziert (Abbildung 5D). Es ist wichtig zu beachten, dass, wenn die Metastasen groß und nah beieinander sind, die Software möglicherweise nicht in der Lage ist, unterschiedliche Metastasen zu unterscheiden. Dies war bei einigen Metastasen bei Kontrollmäusen der Fall (Maus 3 und Maus 7). Daher ist es wichtig, die Ausgabe der Bildanalyse-Software zu überprüfen, um sicherzustellen, dass sie die Fläche einzelner Tumoren genau misst. Aus diesem Grund ist es auch wichtig, die Anzahl der injizierten Zellen und die Länge des Experiments zu optimieren. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass YAP und TAZ erforderlich sind, um die Rate aufrechtzuerhalten, mit der die metastasische Belastung in einem syngenischen murinen Modell von metastasierendem Brustkrebs zunimmt, und dass dies auf die Unfähigkeit von Metastasen zur Bildung und das reduzierte Wachstum der wenigen Metastasen zurückzuführen ist, die sich bildeten.

Figure 1
Abbildung 1: Schemades Protokoll. Alle notwendigen Viren werden zuerst in HEK-293FT-Zellen verpackt. Die gewünschten Zellen für die Studie werden dann gleichzeitig mit Luziferase und fluoreszierenden Viren infiziert, die jeweils ein einzigartiges Säugetier-Wirkstoff-Selektionsgen exprimieren. Infizierte Zellen werden dann in den entsprechenden Medien, die beide Medikamente enthalten, erweitert, um für stabil transduzierte Zellen auszuwählen, die sowohl Luziferase als auch das blühende Protein exezieren. Der Ausdruck beider Bezeichnungen wird wie im Protokoll beschrieben bestätigt. Die markierten Zellen werden dann mit einem dritten Virus, einem generbierten Virus (miR30 shRNA) und einem dritten einzigartigen Wirkstoffselektionsgen transduziert. Nach der Selektion mit dem dritten Medikament werden die Zellen über die seitliche Schwanzvene in die Mäuse injiziert. Die metastasierende Belastung wird bei den Mäusen während des gesamten Experiments mit einem in vivo Live-Tier-Bildgebungssystem überwacht. Am Ende des Experiments werden Mäuse eingeschläfert, und Bilder der gesamten Lunge werden mit einem fluoreszierenden Sezierendes Mikroskop aufgenommen und dann verwendet, um die Anzahl und Größe von Metastasen zu messen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Luziferase-basierte In-vivo-Live-Tierbildgebung zeigt, dass RPA3-Knockdown die metastasierende Belastung von Brustkrebs reduziert. (A) Schematisch, wie die Zellen für diese in vivo-Studie erzeugt wurden. 4T1-Zellen wurden stabil mit einem Lentivirus transduziert, das Luziferase und Hygromycinresistenz kodiert. Infizierte Zellen wurden mit 600 g/ml Hygromycin B für eine Woche ausgewählt und dann wurde die Luziferaseaktivität in elterlichen oder 4T1-Luziferase-Zellen mit einem Luziferase-Reporterkit und plattenleser n =1 gemessen (n = 1 Experiment mit replizierten Bohrungen gemittelt). 4T1-Luciferase-Zellen wurden dann mit Retrovirus infiziert, das ZsGreen und miR30 shRNAs liefert, die entweder auf mCherry (Kontrolle) oder mRPA3 abzielen. Puromycin-Auswahl (2,5 g/ml) für 3 Tage wurde verwendet, um für eine stabile Integration des Virus zu wählen. (B-E) 4T1-Luciferase-Zellen, die zsGreen stabil ausdrücken und (sh-mCherry) oder mRPA3 (sh-mRPA3-431) shRNAs wurden mäusen injiziert und an den angegebenen Tagen, wie im Protokoll beschrieben, zur Biolumineszenz abgebildt. (B&C) Biolumineszierende Bilder für eine repräsentative Maus jeder Gruppe am angegebenen Tag nach der Injektion (D) Diagramm des Log10 transformierten Luziferase-Signals, das für jede Maus im Laufe des Experiments gemessen wurde. (E) Streudiagramm mit Mittelwert (feste Linie) für die Steigungen jeder Maus in D (n = 6 für sh-control und 8 für sh-mRPA3-431). Die statistische Signifikanz wurde mit einem Schüler-t-Test getestet; *p bei 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Die Quantifizierung fluoreszierender Metastasen zeigt, dass RPA3-Knockdown die metastasierende Besiedlung und das anschließende Wachstum von Brustkrebszellen verhindert. (A) Fluoreszierende (links) und hellfeldfarbene (rechts) Bilder repräsentativer Lappen von jeder Maus, die in Abbildung 2 21 Tage nach der Injektion injiziert wird. Sternchen (*) zeigten grüne autofluoreszierende Bronchien. (C-E) Bildanalysesoftware (siehe Tabelle der Materialien) wurde verwendet, um Objekte mit einem Intensitätsschwellenwert von 25 bis 100 und einem Größenschwellenwert von 0,01 mm2 bis unendlich zu identifizieren und zu messen. (B&C) Streudiagramm mit dem Mittelwert (fester Balken) der Gesamtzahl der Metastasen in der Lunge jeder Maus, wenn sie gezählt wird (B) durch Bildanalysesoftware (C). (D) Die Gesamtfläche (mm) der Lunge, die mit Bildanalysesoftware gemessen wurde, wird als metastasierende Belastung dargestellt, wobei der Mittelwert durch einen festen Balken angegeben wird. (E) Die Größe jeder Metastasierung wird für jede Maus geplottet. Kontrollmäuse werden durch die blauen Punkte und mRPA3 Knockdown-Mäuse durch die roten Punkte angezeigt. Beachten Sie, dass die Skalenleiste um 1 mm getrennt ist, um die Visualisierung der Größe und Anzahl kleiner Metastasen zu erleichtern (n = 6 sh-Control, 8 sh-mRPA3-431). Die statistische Signifikanz wurde mit einem Schüler-t-Test getestet; p = 0,06; ** p bei 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: YAP/TAZ-Knockdown reduziert die metastasierende Belastung von Brustkrebs. (A&B) 4T1-Zellen, die miR30-basierte Steuerung (mCherry) oder Tandem YAP/TAZ shRNAs (sh-mYAP1/mTAZ6) stabil ausdrücken, wurden durch Western Blot Analysis (A) oder transfec analysiert mit einem YAP/TAZ-TEAD-Luziferase-Reporterkonstrukt und Assayed für YAP/TAZ-TEAD Transkriptionsaktivität, wie zuvor beschrieben15,16 (B) (n = 5 für die Steuerung und 4 für YAP1/TAZ6). (C) Schematisch, wie die Zellen für die in vivo-Studie erzeugt wurden. 4T1-Luciferase-Zellen wurden mit Retroviren infiziert, die ZsGreen und entweder eine miR30 shRNA liefern, die auf mCherry (Kontrolle) oder Tandem miR30 shRNAs abzielt, die sowohl auf mYAP als auch auf mTAZ abzielen. Infizierte Zellen wurden 3 Tage lang in Puromycin (2,5 g/ml) ausgewählt. 4T1-Luciferase-Zellen, die ZsGreen und Kontrolle (sh-mCherry) oder YAP/TAZ (sh-mYAP1/mTAZ1) stabil ausdrücken, wurden dann in Mäuse injiziert und an den injizierten Tagen zur Biolumineszenz abgebildt. (LuBs) Biolumineszierende Bilder für eine repräsentative Maus jeder Gruppe am angegebenen Tag nach der Injektion. (F) Diagramm des log10 transformierten Luziferase-Signals, das für jede Maus im Laufe des Experiments gemessen wurde. (G) Streudiagramm mit Mittelwert (Vollbalken) für die Steigungen jeder Maus in F (n = 7 für sh-control und 8 für sh-mRPA3-431). Der Mittelwert wird durch eine durchgezogene Linie angezeigt. Die statistische Signifikanz wurde mit einem Schüler-t-Test getestet; p = 0,06; - p, 0,01; ***. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: YAP und TAZ sind erforderlich, damit metastasierende Brustkrebszellen die Lunge besiedeln können. (A) Fluoreszierende (links) und hellfeldfarbene (rechts) Bilder repräsentativer Lappen von jeder Maus, die in Abbildung 4 21 Tage nach der Injektion injiziert wird. (C-E) Bilder wurden mit Bildanalysesoftware wie in Abbildung 3beschrieben verarbeitet. (B&C) Streudiagramm mit dem Mittelwert (Solid bar) der Gesamtzahl der Metastasen in der Lunge jeder Maus, wenn manuell gezählt (B) oder durch Bildanalysesoftware (C). (D) Die Gesamtfläche aller Metastasen (mm) wurde mit Bildanalysesoftware gemessen und als metastasierende Belastung mit dem Mittelwert (Volumenbalken) dargestellt. (E) Die Größe jeder Metastasierung wird für jede Maus geplottet. Kontrollmäuse werden durch die blauen Punkte und sh-mYAP1/mTAZ6 Knockdown-Mäuse durch die roten Punkte angezeigt. Beachten Sie, dass die Skalenleiste bei 1 mm getrennt ist, um die Größe und Anzahl der kleinen Metastasen besser zu visualisieren (n = 7 sh-control, 8 sh-mYA1/mTAZ6). Der Mittelwert wird durch eine durchgezogene Linie angezeigt. Die statistische Signifikanz wurde mit einem Schüler-t-Test getestet; *p bei 0,05, **, p bei 0,01; **. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle 1: Tabelle der Vektoren. Alle verwendeten Vektoren werden aufgelistet und neue Vektoren beschrieben. Standard-Molekularbiologie-Techniken wurden verwendet, um neue Vektoren zu klonen und Sequenzen für neu beschriebene 97-mer shRNA sind enthalten. Zitate beziehen sich auf: [1]53, [2]16, [3]54Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Beispiel für die Verarbeitung und Analyse von Live-Tierbildern in vivo. Tabellenkalkulation zeigt, wie die Rohdaten aus den in vivo Live-Tierbildern zur Analyse konvertiert werden, wie in den Schritten 6.7 und 6.8 beschrieben. Rohdaten aus der in vivo Live-Tierbildgebung, die mithilfe einer Log10-Transformation transformiert wurde. Die Änderungsrate der metastasierenden Last wird für jede Maus berechnet, indem die Neigung berechnet wird, die durch die transformiertenLog-10-Daten erzeugt wird. Beispiele hierfür sind die Luziferase-Analyse aus Abbildung 2. Die Spalten sind farbcodiert, um anzugeben, welche Daten zum Generieren der einzelnen Neigungswerte verwendet wurden, und die Formeln sind in die Kalkulationstabelle eingebettet. Durch Doppelklick auf den Brunnen wird die Formel zur Verarbeitung der Daten wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Kritische Schritte der Methode
Es ist wichtig, die Anzahl der injizierten Zellen (Schritt 3) für eine bestimmte Zelllinie und Mausdehnung zu optimieren, da dies die Anzahl der Metastasen, die sich bilden, und die Länge des Experiments stark beeinflussen kann. Wenn zu viele Zellen injiziert werden oder die Metastasen zu lange wachsen, können die Metastasen schwer zu zählen sein, was die Auswirkungen der genetischen Manipulation schwer einschätzen kann. Wenn jedoch zu wenige Zellen injiziert werden, können sich nur wenige oder gar keine Metastasen bilden. Daher sollte ein vorläufiges Experiment mit unterschiedlicher Anzahl von Zellen durchgeführt werden, um die optimale Anzahl und die Dauer des Wachstums der Metastasen zu bestimmen. Um eine konsistente Anzahl von Metastasen innerhalb einer Gruppe zu gewährleisten, ist es wichtig, jede Maus in gleiche Anzahl lebensfähiger Zellen einzuschleusen. Da sich zellenweise sowohl in der Röhre als auch in der Spritze absetzen können, sollten die Zellen vor dem Beladen der Spritze vorsichtig resuspendiert werden, und Zellsuspensionen sollten nicht zu lange in der Spritze gelassen werden (Schritt 4.3.2). Die Zelllebensfähigkeit verringert sich, je länger die Zellen in Suspension sind, so dass die Zeit zwischen Trypsinisierung und Injektion der Zellen nicht mehr als eine Stunde betragen sollte (Schritt 4.2.5). Luftblasen und große Zellklumpen sollten nicht injiziert werden, da diese Emboli verursachen können, die die Maus töten. Darüber hinaus kann das Zeichnen von Zellen durch die Nadel sie scheren, so dass die Spritze ohne die Nadel geladen werden sollte. Um zu bestätigen, dass eine relativ gleiche Anzahl von Zellen injiziert wurde, können in vivo lebende Tierbilder kurz nach der Injektion aufgenommen werden (Abbildung 2B, Abbildung 4D).

Eine genaue und konsistente Quantifizierung des biolumineszierenden Signals ist wichtig und hängt davon ab, dass die Zellen das D-Luziferin aufnehmen und verstoffwechseln. Dies kann durch viele Variablen beeinflusst werden, einschließlich, die Dosis von D-Luziferin, Timing der Injektion, Maus Körpertemperatur, wie anästhetisiert die Maus ist, wenn injiziert, und wie eine Maus in der Anästhesiekammer vor der Bildgebung positioniert wird. Daher ist es wichtig, diese Schritte für alle Mäuse und Bildgebungssitzungen konsistent zu halten. Wir verwendeten ein Heizkissen, um eine konstante Körpertemperatur der Maus in der Anästhesiekammer zu halten. Da das Signal sowohl für den biolumineszenten als auch für den fluoreszierenden Nachweis in das Gewebe eindringen muss, ist es auch wichtig, die Mausposition für jedes Bild konsistent zu halten (flach auf dem Rücken funktioniert am besten für die Bildgebung der Lunge). Die Quantifizierung von fluoreszierenden Bildern aus der in vivo Live-Tierbildgebung sollte immer mit den Effizienz %-Einheiten erfolgen, da dies einen angemessenen Vergleich zwischen Denbildern ermöglicht. Ebenso sollte bei der Quantifizierung biolumineszierender Bilder immer der Gesamtfluss (Photonen/Sekunde) verwendet werden. Für die Analyse der metastasierenden Belastung wandelt die Log10-Transformation die Wachstumskurve (bevor das maximale Signal erreicht wird) in ein lineares Diagramm um, das für die Neigungsanalyse notwendig war.

Änderungen und Fehlerbehebung der Methode
Im vorgestellten Protokoll wird eine Population von Zellen zunächst stabil mit einem fluoreszierenden Protein und einer Luziferase transduziert, dann wird diese Population entweder mit einem Kontrollvektor oder einem Vektor transduziert, der auf das gen von Interesse abzielt. Dadurch wird sichergestellt, dass beide Zellpopulationen eine ähnliche fluoreszierende Protein- und Luziferase-Expression haben. Als Alternative könnten jedoch virale Vektoren verwendet werden, die gleichzeitig zwei dieser Komponenten liefern. Tatsächlich haben wir in den repräsentativen Experimenten ZsGreen verwendet, um retrovirale Vektoren auszudrücken, um die shRNAs in 4T1-Luziferase-Zellen auszudrücken. Es wird empfohlen, die Expression der Luziferase und des fluoreszierenden Proteins in allen Zellgruppen zu assayen, nachdem das Gen von Interesse verändert wurde. Unterschiedliche Expressionsebenen zwischen Gruppen können die Interpretation der Daten erschweren, daher ist es am besten, wenn die verschiedenen Gruppen eine ähnliche Expression sowohl des fluoreszierenden Proteins als auch der Luziferase haben. Darüber hinaus können rote Blutkörperchen autofluoreszierend sein und es schwierig machen, die fluoreszierenden Metastasen in der Lunge zu visualisieren. Wenn dies der Fall ist, können rote Blutkörperchen durch PBS-Perfusion während der Euthanasie aus der Lunge entfernt werden, um den autofluoreszierenden Hintergrund zu reduzieren (geeignete Euthanasie-Techniken und Richtlinien sollten befolgt werden). Obwohl die Unterschiede zwischen Kontroll- und Knockdown-Gruppen in unseren repräsentativen Experimenten dramatisch sind, zeigt sich die inhärente Variabilität von Maus zu Maus, die häufig in In-vivo-Metastasen-Assays besteht, in den Kontrollmäusen (Abbildung 3B und Abbildung 5B). Wenn diese Variabilität hoch ist, kann es schwierig sein, die Größe des Knockdown-Effekts zu bestimmen. Ein alternativer Ansatz, der verwendet werden könnte, um diese Variabilität zu reduzieren, besteht darin, die Kontrollzellen und Knockdown-Zellen mit unterschiedlichen fluoreszierenden Proteinen und unterschiedlichen Luziferase-Enzymen zu kennzeichnen und dann die beiden Populationen in gleicher Anzahl zu mischen und die Mischung zu injizieren. Zum Beispiel könnten Kontrollzellen, die stabil Tomaten und Renilla-Luziferase ausdrücken, mit Knockdown-Zellen gemischt werden, die ZsGreen und Galleluzifferase exemitenzieren. In vivo live Tier bildgebungsmittel können Renilla luciferase von Glühwürmchen luziferase unterscheiden, und Tomate von ZsGreen, so dass entweder Fluoreszenz oder Lumineszenz verwendet werden kann, um unabhängig jede Zellpopulation unabhängig zu quantifizieren. Tatsächlich wurde die duale Luziferase-Bildgebung von 4T1-Zellen, die als Primärtumoren bei lebenden Tieren wachsen, mit einem in vivo Live-Tier-Bildgebungsgerät4nachgewiesen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass es zu Überschneidungen bei fluoreszierenden Signalen kommen kann, so dass ein spektraler Unmixing-Schritt (siehe Herstellerrichtlinien) in diesen Ansatz einbezogen werden sollte. Darüber hinaus sollten die Renilla-Luziferase und die Galleifeife getrennt mit einer ausreichenden Zeitverzögerung abgebildet werden, die es ermöglicht, dass das erste Luziferasesignal vor der Abbildung des zweiten nicht mehr nachweisbar ist. Die Verwendung von ausgeprägten Fluorophoren ermöglicht es immer noch, die Anzahl und Größe der Metastasen in der Lunge zu quantifizieren16. Um die metastasierende Besiedlung und das Wachstum in anderen Organen neben der Lunge zu testen, kann dieses Protokoll modifiziert und für intrakardiale und Portalveneninjektionen9,10verwendet werden.

Einschränkungen der Methode
Die Verwendung eines in vivo Live-Tier-Bildgebungsgeräts zur Erfassung von metastasierender Echtzeitbelastung in Verbindung mit fluoreszierend markierten Krebszellen bietet eine leistungsstarke Methode, um die metastasierende Besiedlung und das anschließende Wachstum zu untersuchen; Dieser Ansatz ist jedoch eingeschränkt. Einige Gene können für die angeborene Zellproliferation anstelle spezifischer Rollen in der Metastasierung erforderlich sein. In-vitro-Zellproliferationstests könnten vor dem In-vivo-Experiment durchgeführt werden, um festzustellen, ob das Gen das In-vitro-Wachstum stört. Bei der Abbildung eines lebenden Tieres muss das biolumineszierende oder fluoreszierende Signal von Metastasen stark genug sein, um das Gewebe passieren zu können. Zusätzlich beeinflussen die optischen Eigenschaften (d.h. Absorption und Streuung) des Gewebes auch den Nachweis55. Die Anregungslichtquelle muss in der Lage sein, Gewebe zu passieren, um fluoreszierend markierte Krebszellen zu anregen, und die Biolumineszenz hat einen größeren Dynamikbereich als Fluoreszenz. Obwohl fluoreszenz für die Bildgebung lebender Tiere verwendet werden kann, wird die Biolumineszenz für den Nachweis von Signalen in inneren Organen bevorzugt. Darüber hinaus können einige immunkompetente Mausstämme Zellen ablehnen, die fluoreszierende Proteine exdrücken. Tatsächlich fanden wir heraus, dass Zellen, die Tomaten, GFP oder mCherry exdrücken, beim Anbau in BALB/c-Mäusen abgelehnt oder nach unten reguliert wurden (Daten nicht dargestellt und15). Wie hier gezeigt (Abbildung 3 und Abbildung 5) und zuvor15,16, sind ZsGreen-markierte Zellen bei diesen Mäusen nachweisbar. In Fällen, in denen die fluoreszierende Proteinexpression nicht mehr nachweisbar wird, besteht eine andere Möglichkeit, die relative metastasierende Kolonisation zu quantifizieren, darin, qPCR zu verwenden, um entweder das fluoreszierende Gen oder ein anderes Gen im integrierten Viralvektor15zu quantifizieren. Obwohl ein in vivo Live-Tier-Bildgebungsgerät es Ihnen ermöglicht, Veränderungen der metastasierenden Belastung zu erkennen, erlaubt es einem nicht, festzustellen, ob diese Änderungen auf eine veränderte Größe oder Anzahl von Metastasen zurückzuführen sind. Es bietet auch keine räumlichen Informationen über die Position der Metastasen. Darüber hinaus kann die Stärke des Signals dadurch beeinflusst werden, wie tief es im Gewebe ist.

Die Bedeutung der Methode und mögliche zukünftige Anwendungen
Es gibt viele Möglichkeiten, wie dieser Ansatz geändert werden kann, um mehr oder andere Informationen zu erhalten. Eine Vielzahl von Krebszelllinien, einschließlich menschlicher Krebszelllinien oder von Patienten abgeleiteter Xenografts, könnten in diesem Test verwendet werden. Andere Mausmodelle könnten ebenfalls verwendet werden, darunter transgene oder Knockout-Mäuse, die getestet werden sollen, wie die Ausrichtung von Proteinen von Stromalzellen die metastasierende Besiedlung und das Wachstum der injizierten Krebszellen beeinflusst. Wenn mehrere Kandidatengene getestet werden müssen, kann dieser Ansatz multiplexiert werden, da in vivo live Tierbildgebungsgeräte eine breite Palette von Fluorophoren erkennen und unterscheiden können. Dies würde die Anzahl der benötigten Mäuse reduzieren und die Anzahl der Getesteten erhöhen. In vivo Live-Tier-Bildgebung kann auch mit Röntgen- oderCT 9-Bildgebung kombiniert werden, um viel mehr räumliche Informationen über den Standort der Metastasen zu liefern. Schließlich kann dieser Ansatz geändert werden, um spezifischere Schritte innerhalb der metastasierenden Kolonisationskaskade zu überprüfen. Beispielsweise können die Schritte bei der Tumorzellaussaat (intravaskuläres Überleben, Extravasation und Überleben nach der Extravasation) unterschieden werden, indem die Anzahl der Tumorzellen in der Lunge zu mehreren Zeitpunkten innerhalb der ersten 3 Tage nach der Injektion quantifiziert wird (wie hier16). In diesem Fall kann die Lunge auch mit Gefäßmarkern gefärbt und ex vivo abgebildet werden, um den Prozentsatz der Krebszellen zu bestimmen, die zu jedem Zeitpunkt extravasiert wurden56,57.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verwendung von Echtzeit-In-vivo-Live-Tierbildern fluoreszierender und lumineszierender Krebszellen nach der Injektion von Schwanzvenen eine detailliertere Analyse ermöglicht, wie ein Kandidatengen oder -gene die metastasierende Besiedlung und das anschließende Wachstum beeinflusst. Dieser Ansatz ist schneller und kostengünstiger als autochthone Mausmodelle und vermeidet einige der Vorbehalte spontaner Metastasenmodelle. Die Verwendung von Fluoreszenz und Lumineszenz als Mittel zur Detektion und Quantifizierung von Metastasen gibt Forschern unabhängige Auslesungen, die das Vertrauen in die Ergebnisse verbessern und Flexibilität im experimentellen Design ermöglichen. Die Verwendung von Fluoreszenz zur Quantifizierung von Metastasengröße und -anzahl vermeidet die Notwendigkeit zeitaufwändiger und potenziell kostspieliger histologischer Verarbeitung und Analyse und ermöglicht eine zusätzliche Verwendung des gesamten Gewebes. Das Protokoll kann mit einer Reihe verschiedener Techniken verwendet werden, um die Expression oder Funktion des Kandidatengens zu manipulieren, wie RNAi, Transgenexpression oder CRISPR/Cas-vermittelte Bearbeitung, und kann auch verwendet werden, um kleine Moleküle, Funktionsblocker-Antikörper oder andere potenzielle therapeutische Verbindungen zu testen. Wie oben erwähnt, können mehrere einfache Änderungen vorgenommen werden, um den Test zu verbessern und zusätzliche Informationen bereitzustellen. Dieser Ansatz ist ein idealer Weg, um pro-metastasierende Gene zu identifizieren und zu testen, die ein therapeutisches Potenzial für die Behandlung von Krebs haben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Emily Norton für die Unterstützung bei Virusinfektionen und die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken auch Ryan Kanai für die Hilfe beim Erfassen von Bildern der Lunge und Kate E. Tubbesing für Hilfe bei der Bildanalyse der grünen Metastasen in der Lunge. Wir danken den Mitarbeitern der Tierforschungseinrichtung für die Unterstützung und unterstützung bei der Erstellung dieses Videos. Diese Arbeit wurde von einem Susan G. Komen Career Catalyst Grant unterstützt, der J.M.L. (#CCR17477184) verliehen wurde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE Gel For western blot
2.5% Trypsin Gibco 15090-046 Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipes For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks) Taconic BALB-F For tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regular VWR Ameresco 97061-416 For western blot
Cell lysis buffer Cell Signaling For collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm Celltreat 40-229749-CS For filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamber For euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1960 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline Himedia TS1006 For PBS
EDTA VWR 97061-406 Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin VWR 97068-085 Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imager Fujifilm For western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAb Cell Signaling 2118 For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo Scientific 31460 For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT Invitrogen R70007 Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucose GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure Grade VWR Ameresco 97064-810 For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Imagej Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF Membrane Biorad 1620177 For western blot
Isoflurane For mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) PerkinElmer CLS136340 For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) Leica Microsystems Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-Glutamine Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 Life technologies L3000008 For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program) PerkinElmer Software for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1 Karmanos Cancer Institute Aslakson, CJ et al.,1992 Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0 Fujifilm Software for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer) Gibco 31985-062 For packaging virus and transfection
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225 For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32957 Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32953 Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 45-H9268 For infection
Puromycin Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainer For restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running buffer For western blot
TAZ (V3886) Antibody Cell Signaling 4883 For western blot
TBST buffer For western blot
TC20 automated cell counter Bio-Rad For counting cells
Vectors See Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence Microscope VWR 89404-464 For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer buffer For western blot
XenoLight D-Luciferin K+ Salt PerkinElmer 122799 Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) Roche 6365787001 For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb Cell Signaling 14074 For western blot

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References

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