Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Açıklanan yaklaşım, akciğerlerdeki metastaz sayısı ve boyutunun ölçülmesine ek olarak meme kanseri metastazı oluşumunun ve büyümesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlamak için deneysel kuyruk ven metastazı tahlillerini in vivo canlı hayvan görüntülemeile birleştirir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. J. Vis. Exp. (154), e60687, doi:10.3791/60687 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Metastaz kansere bağlı ölümlerin ana nedenidir ve metastatik hastalığı olan hastalar için sınırlı tedavi seçenekleri vardır. Metastatik hastalık için daha iyi tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştıracak yeni tedavi hedeflerinin tanımlanması ve test edilmesi, in vivo modellerinde preklinik preklinik gerektirir. Burada gösterilen meme kanseri metastatik kolonizasyon ve sonraki büyüme atamak için bir syngeneic fare modelidir. Metastatik kanser hücreleri, ateş böceği luciferase ve ZsGreen proteinlerini kodlayan viral vektörlerle şantiye edilir. Aday genler daha sonra koably luciferase / ZsGreen ifade kanser hücrelerinde manipüle edilir ve daha sonra hücreler metastatik kolonizasyon ve büyüme saymak için lateral kuyruk damarı ile fareleriçine enjekte edilir. Bir in vivo görüntüleme cihazı daha sonra zaman içinde metastatik yük değişiklikleri ölçmek için canlı hayvanlarda tümör hücrelerinin biyolüminesans veya floresan ölçmek için kullanılır. Floresan proteinin ekspresyonu, deney sonunda kesit veya histolojik boyama ya da metastaz gerekkalmadan akciğerlerdeki metastazların sayısının ve boyutunun ölçülmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, metastatik kolonizasyon ve büyüme aday genlerin rolünü test etmek için nispeten hızlı ve kolay bir yol sunuyor, ve geleneksel kuyruk ven metastazı tahlilleri çok daha fazla bilgi sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, meme kanseri hücrelerinde PDZ bağlayıcı motifli (TAZ) ile Evet ilişkili protein (YAP) ve transkripsiyonel koaktivatörün aynı anda yıkılması nın akciğerlerde metastatik yükün azalmasına yol açtığını ve bu azaltılmış yükün metastatik kolonizasyonun ve metastazların büyümesinin azalmasısonucu olduğunu göstermektedir.

Introduction

Kanser ölüm dünya çapında ikinci önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir1 ve metastaz bu ölümlerin çoğunluğu sorumludur2,3. Ancak, metastatik kolonizasyon ve sonraki büyüme yöneten moleküler mekanizmaların sınırlı bir anlayış metastatik hastalık için etkili tedavilerin gelişimini engellemiştir. Yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi, bir aday genin metastaz oluşumunu ve büyümesini nasıl etkilediğini test etmek için bir test gerektirir. Otokton fare modellerinin avantajları olsa da, zaman alıcı dır ve oluşturmak pahalıdır, bu da onları hedef bulma yerine hedef doğrulama için daha uygun hale getirir. Aday genin kanser hücrelerinde in vitro olarak tedirgin olduğu ve metastatik potansiyel üzerindeki etkilerinin in vivo olarak değerlendirildiği nakil modeli sistemleri, otokton modellere göre daha ucuz ve daha yüksek iş âldeki sistemlerdir. Buna ek olarak, RNAi, CRISPR/CAS9 ve transgenlerin istikrarlı teslimatı için viral vektörler yaygın olarak mevcuttur, bu da kanser hücresi hatlarında ilgi çeken hemen hemen her geni veya geni tedirgin etmeyi nispeten kolaylaştırır. Bu yaklaşım aynı zamanda insan kanser hücresi hatlarında metastatik kolonizasyon ve büyüme de immünozveya insanlaşmış fareler içine hücreleri naklederek aday genlerin rolünü titretmek için kullanılabilir.

Nakledilen kanser hücrelerinin in vivo tarafından metastaz oluşumunu test etmek için kullanılan iki tip tahlilssi spontan metastaz tahlilleri ve deneysel metastaz tahlilleridir. Spontan metastaz tahlillerinde4,5, kanser hücreleri farelere enjekte edilir, primer tümör oluşturmasına izin verilir, ve daha sonra spontan metastaz oluşumu ve sonraki büyüme tahlil edilir. Bu modelin gücü hücrelerin metastatik tümörler oluşturmak için metastatik sürecin tüm adımlarını tamamlamak gerekir. Ancak, birçok kanser hücre hatları spontan metastaz modellerinde verimli metastaz yok, ve primer tümör büyümesini etkileyen hücrelerin herhangi bir manipülasyon metastaz tahsin sonuçlarını şaşırtmak olabilir. Kanser hücrelerinin doğrudan dolaşıma enjekte edildiği deneysel metastaz tahlilleri bu tuzakları önlemek için kullanılır. Yaygın deneysel metastaz tahlilleri kuyruk ven enjeksiyonuiçerir 6,7,8 (ve burada gösterilmiştir), intrakardiyak enjeksiyon9, ve portal venenjeksiyonu 10.

Burada sunulan protokolün amacı, bir araştırmacının metastaz oluşumunu ve büyümesini gerçek zamanlı olarak izlemesine olanak tanıyan in vivo deneysel metastaz testi sağlamak ve aynı farenin akciğerlerindeki nokta metastaz sayısını ve boyutunu ölçmektir. Bunu başarmak için, geleneksel deneysel kuyruk ven metastaz tahlilleri6,7,8 canlı hayvan görüntüleme ile birleştirilir, in vivo görüntüleme cihazı kullanarak9,11,12,13,14. Hem luciferase hem de floresan proteini ifade eden tümör hücreleri lateral kuyruk damarı ile farelere enjekte edilir ve daha sonra in vivo görüntüleme cihazı zamanla akciğerlerdeki metastatik yükteki değişiklikleri ölçmek için kullanılır(Şekil 1). Ancak, in vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı ayırt edemez veya bireysel metastaz boyutunu ölçmek. Bu nedenle, deney sonunda, bir floresan stereomikroskop sayısını saymak ve kesit ve histoloji veya immünohistokimya gerek kalmadan akciğerlerde floresan metastaz boyutunu ölçmek için kullanılır(Şekil 1). Bu protokol, aday genin ekspresyonunun veya işlevinin değiştirilmesinin metastaz oluşumunu ve büyümeyi nasıl etkilediğini test etmek için kullanılabilir. Küçük moleküller veya fonksiyon bloke antikorlar gibi potansiyel terapötik bileşikler de test edilebilir.

Bu yaklaşımı göstermek için, ilk olarak metastatik fare meme kanseri hücrelerinde temel replikasyon faktörü olan replikasyon proteini A3'ün (RPA3) yıkıldığı kavram deneyinin bir kanıtını gerçekleştirdik. RPA3 nakavt hücreleri enjekte edilen farelerin kontrol hücreleri ile enjekte edilen farelere kıyasla her zaman önemli ölçüde daha az metastatik yüke sahip olduğunu gösteriyoruz. Metastaz içeren akciğerlerin analizi, bu azalan metastatik yükün metastatik kolonizasyonun önemli ölçüde azalması ve oluşan metastazların büyüme bozukluğunun bir sonucu olduğunu göstermektedir. Bu tekniği daha da göstermek için, EVET ilişkili proteinin (YAP) ve transkripsiyonel koaktivatörün PDZ bağlayıcı motifli (TAZ) aynı anda yıkılması metastatik kolonizasyonu mu yoksa sonraki büyümeyi mi bozduğunu test ettik. YAP ve TAZ, Hippo Pathway'in kritik downstream efektörleri olan iki ilgili transkripsiyonel ko-aktivatörlerdir. Biz15,16 ve diğerleri metastaz YAP ve TAZ karıştığı var(17içinde gözden ,18,19),Bu proteinleriyi tedavi hedefleri olduğunu düşündüren. Sürekli olarak, YAP/TAZ nakavt hücrelerine enjekte edilen farelerin metastatik yükü önemli ölçüde azalttığını gördük. Akciğerlerin analizi YAP/TAZ knockdown hücrelerinin çok daha az metastaz oluşturduğunu ve oluşan metastazların daha küçük olduğunu gösterdi. Bu deneyler, deneysel metastaz tahlillerinin bir araştırmacının metastaz oluşumu ve büyümesinde aday genin rolünü hızlı ve ucuz bir şekilde test etmesine nasıl olanak sağladığını göstermektedir. Ayrıca canlı hayvan görüntüleme ve tüm akciğerlerde metastaz floresan nicel kombine kullanımı nın araştırmacının metastatik kolonizasyon sırasındaki adımları daha iyi anlamasına nasıl olanak sağladığını göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokol farelerin ve biyolojik tehlikeli maddelerin kullanımını içerir ve ilgili kurumsal güvenlik komitelerinin onayını gerektirir. Burada açıklanan tüm in vivo çalışma Albany Tıp Koleji kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

NOT: Protokole genel bakış için Şekil 1'dekişema'ya bakın.

1. Gerekli tüm retrovirüslerin ve lentivirüslerin paketlenmesi

NOT: Açıklanan protokol, bir luciferase enzimini ve floresan proteini stably ifade etmek ve aday genin ekspresyonunu manipüle etmek için lentiviral veya retroviral vektörler kullanır. Bu virüsler aşağıda açıklandığı gibi HEK-293FT hücrelerde paketlenir.

  1. 1. Gün: Tam büyüme ortamının 2 mL'lik 6 kuyulu plakalı plakalı HEK-293FT hücreleri (DMEM'de %10 FBS, %1 penisilin/streptomisin ve 2 mM L-Glutamin) böylece 2. 37 °C'de kuluçka, bir gecede %5 CO2.
  2. 2. Gün: Her viral vektörün paketlenmesi için, retroviral veya lentiviral vektör ve viral kat ve ambalaj proteinlerini kodlayan uygun vektörler ile HEK-293FT hücrelerin %40-60'lık bir konfluent kuyusunu transfect.
    NOT: Bu protokolde kat proteini olarak VSVG, lentiviral ambalaj için psPAX2 ve retroviral ambalajlar için gag-pol kullanılır (vektör listesi için Ek Tablo 1'e bakınız).
  3. Aşağıdaki gibi her biri için bir co-transfection karışımı olun:
    1. Transfeksiyonlar için 4 μL lipid çözeltisini (Bkz. Malzeme Tablosu)ve 96 μL transfeksiyon tamponu ve kuluçka 5 dakika boyunca birleştirin.
    2. 1 μg viral vektör, 0,5 g kat protein vektörü (VSVG) ve 0,5 g ambalaj protein vektörü (psPAX2 veya gag-pol) ekleyin ve 20 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. 1.3.2 adımdan itibaren co-transfection karışımını adım 1.1'de kaplanmış HEK-293FT hücrelere hafifçe ekleyin ve bir gecede %5 CO2 ile 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  4. 3. Gün: Transfeksiyon içeren medyayı her kuyudan çıkarın ve her kuyuya 2 mL'lik tam büyüme ortamı ekleyin. 37 °C'de kuluçka, yaklaşık 24 saat boyunca %5 CO2.
  5. 4. Gün: 3 mL şırınga kullanarak her kuyudan viral süpernatant toplayın ve 0,45 μm'lik bir filtreden 2 mL mikrosantrifüj tüpüne filtre uygulayın.
  6. İsteğe bağlı: İkinci bir virüs grubu isteniyorsa, her kuyuya 2 mL tam büyüme ortamı ekleyin ve yaklaşık 24 saat boyunca %5 CO2,% 5'te 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  7. Gün 5 (İsteğe bağlı): adım 1.5 gibi viral supernatant ikinci bir tur toplamak.
    NOT: Protokol viral supernatant dondurularak duraklatılmış olabilir.

2. Kanser hücrelerinin oluşumu luciferase ve floresan proteini ifade

NOT: Aşağıdaki protokol, 4T1 hücrelerini ilk olarak ateş böceği luciferase ve floresan protein (ZsGreen) ile benzersiz seçim genlerine sahip iki vektör kullanarak nasıl etiketlenerebildiğini açıklamaktadır. Daha sonra bir aday genin ekspresyonunu manipüle etmek için 3.viral vektör kullanılır. Ancak, aynı anda bir floresan protein ve genetik manipülasyon teslim viral vektörler de alternatif olarak kullanılabilir (aşağıdaki temsili deneylerde olduğu gibi). Diğer kanser hücreleri kullanılabilir, ancak hücre numaraları adımlar 2.1 ve 2.7.1 için optimize edilmelidir.

  1. Plaka 4T1 hücreleri 1.5 x 105 hücreleri / iyi tam büyüme medya 12-iyi plaka (1% penisilin / streptomisin ile DMEM% 10 FBS ve 2 mM L-Glutamin) ve kuluçka 37 °C, 5% CO2 gecede.
  2. 4T1 hücrelerini aşağıdaki gibi adım 1'de üretilen viral supernatant ile enfekte edin.
    1. Hücrelerden büyüme ortamını aspire edin ve 500 μL luciferase viral supernatant ve 500 μL floresan protein viral supernatant ekleyin aynı anda hem luciferase ve floresan protein viral supernatants ile hücreleri enfekte.
    2. 8 mg/mL hekaksimethrine bromür 1 μL ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
    3. Hücreleri 37 °C'de , %5 ila %75-90 oranında (genellikle 24-48 saat) kuluçkaya yatırın.
  3. 4T1 hücrelerini 500 μL trypsin ile 2-5 dakika trypinlayın (hücreler kuyunun alt kısmında serbestçe durulanmalıdır). Tüm hücreleri 4 mL'lik seçim ortamında (uygun antibiyotikleri içeren komple büyüme ortamı) 6 cm'lik bir tabağa aktarın ve bu da tripsinin söndürülmesini sağlar. Aynı seçim ortamlarında 6 cm'lik enfekte olmayan kontrol hücrelerini kaplayın.
    NOT: Uygun antibiyotik konsantrasyonu birkaç doz test edilerek önceden belirlenmelidir. Ayrıca, floresan aktive hücre sıralama da ilaç seçimi yerine floresan etiketli hücreleri seçmek için kullanılabilir.
  4. Hücreleri 37 °C,% 5 CO2 seçim ortamlarında kuluçka ve tüm enfekte olmayan kontrol hücreleri ölü kadar gerektiğinde hücreleri bölmek (seçim geni ve hücre hattı na bağlı).
  5. Enfekte 4T1 hücreleri yeşil bir uyarma (450-490 nm)/emisyon (500-550 nm) filtre 50-100x büyütme bir ters floresan mikroskop üzerinde ayarlanmış kullanarak ZsGreen floresan protein ifade olduğunu onaylayın.
  6. Enfekte 4T1 hücrelerinin aşağıdaki gibi ticari olarak kullanılabilen luciferase aktivite kiti ni kullanarak luciferase ifade ettiğini doğrulayın.
    1. Luciferase ifade eden 4T1 hücrelerini lyse ve luciferase ifade etmez 4T1 hücreleri kontrol etmek için 1x pasif lysis tampon minimal hacim kullanın, yavaşça 30 dakika sallayarak.
    2. Beyaz alt 96-iyi plaka ya da luciferase aktivite kitinden luciferase asay reaktifinin 50 μL'sini ekleyin.
    3. Parlaklık ayarını kullanarak spektrumdaki tüm dalga boylarındaki hücrelerden gelen Parlaklığı ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.
      NOT: Protokol, stably-transduced hücreleri dondurarak duraklatılmış olabilir.
  7. Aday genin ifadesini aşağıdaki gibi manipüle edin:
    1. Plaka 6 x 105, tam büyüme ortamının 4 mL'inde 60 mm'lik bir çanak üzerinde adım 2.6'dan 4T1 hücreleri etiketlenmiş ve 37 °C,%5 CO2 gecede kuluçkaya yatırılır.
    2. Her kuyudan büyüme ortamını aspire edin ve 4 μL 8 mg/mL heksadimethrine bromür içeren 2 mL tam büyüme ortamı ekleyin.
    3. Adım 1'den 2.7.2'den kaplanmış hücrelere 2 mL viral süpernatant ekleyin ve bir gecede %5 CO2'de 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    4. 4T1 hücrelerini 500 μL trypsin ile 2-5 dakika trypinlayın (hücreler kuyunun alt kısmında serbestçe durulanmalıdır). Tüm hücreleri 10 mL'lik seçim ortamında (uygun antibiyotikleri içeren komple büyüme ortamı) 10 cm'lik bir tabağa aktarın ve bu da tripsinin söndürülmesini sağlar. Aynı seçim ortamlarında 4T1 hücreleri etiketli bazı enfekte olmayan kontrol plakası.
    5. Hücreleri 37 °C,%5 CO2'de seçim ortamlarında kuluçkaya yatırın ve enfekte olmayan tüm hücreler ölünceye kadar gerektiğinde hücreleri bölün.
    6. Aday genin ekspresyonunun western blot20 veya qPCR21gibi standart bir yaklaşımla değiştirildiğini doğrulayın.
    7. 2.5-2.6 adımlarında olduğu gibi parlaklık ve floresanları kontrol ve devirme hücrelerinde ne kadar benzer olduklarını belirlemek için, bu değişebildiği için parlaklık ve floresanlığı belirleyin (bkz. Tartışma).
      NOT: Protokol, stably-transduced hücreleri dondurarak duraklatılmış olabilir.

3. In vivo deneysel tasarımın optimizasyonu

  1. İstenilen metastatik yük için uygun hücre numarasını ve deneme süresini aşağıdaki gibi optimize edin.
    1. Aşırı hücreler enjeksiyon istenilen gün kullanılabilir böylece tam büyüme medya adım 2.6 floresan ve biyolüminesans 4T1 hücreleri genişletin.
    2. Adım 4.2'de açıklandığı gibi kuyruk damar enjeksiyonları için hücreleri hazırlayın. Enjeksiyonlar için en uygun hücre numarasını belirlemek için, 100 μL 1x PBS'de birkaç farklı konsantrasyonda hücreleri yeniden askıya alın.
      NOT: 25.000 ile 500.000 arasında bir dizi hücre numarası/fareyi test etmenizi öneririz.
    3. İğne yenene kadar hücre süspansiyonlarını buzda tutun.
    4. Adım 4.3'te açıklanan lateral kuyruk damarı aracılığıyla adım 3.1.2'den 3-4 fareye 4T1 hücrelerinin her seyreltmesini enjekte edin (aşağıya bakın).
    5. Tam bir iyileşme sağlamak için fareyi kafesine ve monitöre 15 dakika döndürün. Fareler ağrı veya sıkıntı 3x haftalık belirtileri için kontrol edilmelidir.
    6. In vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı kullanarak 3-6 hafta boyunca metastaz oluşumu ve büyüme için fareleri izleyin (bkz. 5 ve 6. adımlar).
      1. Standart kurumsal kurallara göre kuyruk damar enjeksiyonundan 3-6 hafta sonra farelere ötenazi.
      2. Akciğerleri hazırlayın ve 7.
      3. Metastazların istenilen metastatik yük için büyümesi için uygun süreyi seçin (tartışmaya bakın).

4. Etiketli kanser hücrelerinin kuyruk ven enjeksiyonu

NOT: Adım 4.2.4 sinjenik BALB/c farelerde büyüyen 4T1 hücreleri için optimize edilmiştir. Diğer kanser hücresi hatları ve fare suşları kullanılırsa, enjekte edilen hücre sayısı ve töz uzunluğu öncelikle optimize edilmelidir.

  1. Enjeksiyon gününde fazla hücrelerin kullanılabilmesi için tam büyüme medyasında iki 15 cm'lik tabaklarda adım 2'de oluşturulan 4T1 hücre hatlarını genişletin.
  2. Aşağıdaki gibi kuyruk ven enjeksiyonu için hücreleri hazırlayın:
    1. Ortamı aspire edin ve hücre plakalarını 1x PBS ile durula.
    2. Hücreleri 15 cm'lik tabak başına 5 mL trypsin ile 2-5 dakika boyunca trypin ile tarar (hücreler kuyunun alt kısmında serbestçe durulanmalıdır). Tüm hücreleri konik bir tüpe aktarın. Tripsini söndürmek ve aynı konik tüpe yıkama eklemek için yeterli tam büyüme ortamı ile doku kültürü çanak kalan hücreleri yıkayın.
    3. Toplam hücre sayısını belirlemek için otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri say.
    4. Hücreleri 122 x g'de 3 dakika santrifüj edin, süpernatantı aspire edin ve 1x PBS'deki hücreleri istenilen konsantrasyonda yeniden askıya alın. Burada, 2.5 x 104 hücre pbs 100 μL her fare içine enjekte edilir, böylece 2.5 x 105 hücreleri / mL resuspend hücreleri. İğne yenene kadar hücre süspansiyonlarını buzda tutun.
      NOT: Hücrelerin tripsinizasyonu ile kuyruk damar enjeksiyonu arasındaki süreyi yaklaşık 1 saat ile sınırlamak önemlidir.
  3. Aşağıdaki gibi yanal kuyruk damarı ile fareleriçine adım 4.2.5 4T1 hücreleri enjekte:
    1. Hayvan tesisinde bir başlık içinde çalışmak, tüpleri ters çevirerek veya 1 mL şırınga kullanarak hücreleri eşit bir şekilde yeniden askıya alındıktan emin olarak hafifçe ancak iyice karıştırın. Şırıngayı yüklemeden önce hücrelerin her zaman askıya alınmasını sağlayın.
    2. Hücre süspansiyonu ile 1 mL Luer-lock şırınga yükleyin ve aşırı hava kabarcıkları dışarı. 1/2 inç, 30-gauge iğne yontucu ile şırınga yerleştirin ve hava kabarcıkları dışarı.
    3. Fareyi nazikçe bir kemirgen dizginleyiciye yerleştirin.
    4. Lateral kuyruk damarları görünür ve genişlemiş olmalıdır. Değilse, yavaşça kuyruk tabanı çimdik ve damarları dilate için sıcak musluk suyuna kuyruk daldırma.
      NOT: Fare kafesinin ısıtma lambasının altına ve/veya ısıtma yastığının üzerine yerleştirilerek damarların genişlemesi de sağlanabilir.
    5. Kuyruğu temizlemek için alkol mendil kullanın. İğneyi kuyruk damarına takın, eğimli tarafı yukarı doğru ve 100 μL hücre süspansiyonu enjekte edin.
      NOT: İğne damara düzgün bir şekilde yerleştirilirse, kolayca ileri ve geri kaydırmalı ve piston itildiğinde direnç olmamalıdır. Başarılı enjeksiyonlar da hangi ven mavi renk enjeksiyondan sonra birkaç saniye için beyaz döner bir "floş" neden olmalıdır.
  4. Yavaş yavaş iğne kaldırmak ve steril bir gazlı bez kullanarak, herhangi bir kanamayı durdurmak için enjeksiyon bölgesine basınç uygulayın.
  5. Tam iyileşmesağlamak için fareyi kafesine ve monitöre 15 dakika döndürün. Fareler ağrı veya sıkıntı 3x haftalık belirtileri için kontrol edilmelidir.
  6. In vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı kullanarak 3-6 hafta boyunca metastaz oluşumu ve büyüme için fareleri izleyin (bkz. 5 ve 6. adımlar).

5. Metastatik yükün floresan ile in vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı ile izlenmesi

NOT: Aktif parlak sinyalile floresan için hayvan görüntüetmeyin.

  1. Eğer sadece görüntüleme biyolüminesans, adım 6 atlayın.
  2. In vivo canlı hayvan görüntüleme cihazını açın.
  3. İn vivo canlı hayvan görüntüleme anestezi sistemini üreticinin yönergelerine göre kurup anestezi odasına ve görüntüleme odasına %1,5 ila %2 isofluran e-posta ile tonuyla teslim edin.
  4. 4. basamaktan floresan etiketli metastazlı fareleri anestezi odasına yerleştirerek ve %1,5-2,5 izofluran vererek anesteize edin.
  5. Resim yazılımını açın (bkz. Malzemeler Tablosu)ve oturum açın.
  6. Initialize düğmesini tıklatın ve makinenin başlatılmasını bekleyin.
  7. Görüş Alanını Dolarak değiştirin.
    NOT: Bir farenin daha yakın bir görünümü gerekiyorsa C Görüş Alanı da kullanılabilir, ancak bu aynı anda görüntülenebilir fare sayısını sınırlar.
  8. Yazılım kameranın uygun sıcaklığa ulaştığını belirttikten sonra Görüntüleme Sihirbazı düğmesini tıklatın, Floresan'ı seçin ve açılan menüden uygun filtre çiftini seçin.
    NOT: Kullanılan florofor bir seçenek değilse, GIRIŞ EX/E M'yi seçin ve gerekli uyarma ve emisyonu yazın.
  9. Fareyi adım 3.2.4'te açıklandığı gibi odaya yerleştirin.
  10. Sıra Yı Edinin'itıklatın.
  11. Görüntülemeden sonra, tam iyileşmesağlamak için fareyi kafesine ve monitöre 15 dakika döndürün.
  12. Metastaz içermeyen en az bir fare ile adım 5.2 ve adımları 5.7-5.9 tekrarlayın. NOT: Bu fare, analiz sırasında arka plan sinyalini ölçmek ve çıkarmak için kullanılacaktır (adım 8).
  13. Resim deneme süresi boyunca haftada 2-3 kez.

6. Bir in vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı ile biyolüminesans ile metastatik yükün izlenmesi

  1. In vivo canlı hayvan görüntüleme cihazını açın ve programı aşağıdaki gibi kurlayın.
    1. Resim yazılımını açın (bkz. Malzemeler Tablosu)ve oturum açın. Initialize düğmesini tıklatın ve makinenin başlatılmasını bekleyin. Görüş Alanını Dolarak değiştirin.
      NOT: Görüş Alanı C tam fare gövdesi görüntü lemek için daha yakın bir görünüm için kullanılabilir; ancak, bu aynı anda görüntülenebilir fare sayısını sınırlar.
    2. İlk kez kullanım için pozlama ayarlarını aşağıdaki gibi edin: Edit | Tercihler | Satın Alma | Otomatik Pozlama ve varsayılan 60 saniyeden 300 saniye maksimum pozlama süresini değiştirin ve OK'yitıklatın.
      NOT: Otomatik pozlama sekmesindeki diğer parametreleri değiştirmeyin.
  2. Anestezi sistemini üreticinin yönergelerine göre kurup anestezi odasına ve görüntüleme odasına %1,5 ile %2 arasında isofluran e-posta ile tonu.
  3. Adım 6.4'e geçmeden önce kameranın uygun sıcaklığa ulaştığından emin olun.
  4. 4. basamaktan metastaz içeren fareleri anestezi odasına yerleştirerek ve %1.5-2.5 isofluran vererek anestezi edin.
  5. Aşağıdaki gibi biyolüminesans görüntüleme için fareler hazırlayın.
    1. D-luciferin (D-PBS 30 mg /mL) ile 1 mL şırınga yükleyin ve sonra şırınga için bir inç 30-gauge iğne ekleyin ve hava kabarcıkları dışarı.
    2. Anestezili farenin kütlesini ölçün ve kaydedin.
    3. Başparmak ve işaretçi parmaklarını kullanarak ve serçe parmağı ile elin tabanı arasındaki kuyruğu kavrayarak, boynunun ensesini çimdikleyerek fareyi dizginle. Fareyi 45 derecelik bir açıyla ters çevirin ve başı aşağı doğru işaret edin.
    4. İğneyi, eğimli tarafı yukarı, farenin sol tarafındaki intraperitoneal (IP) boşluğa yerleştirin. Küçük bir hacim çizerek IP alanına girişi onaylayın. IP alanında geri çekerken iğnenin tabanında renk olmamalıdır.
    5. 150 mg/kg doz için uygun d-luciferin hacmini enjekte edin.
    6. D-luciferin uygulamasından hemen sonra, bir zamanlayıcı başlatın ve burun koni burnu ile görüntüleme cihazı sırtına fare düz yerleştirin ve% 1.5-2.5 isoflurane uygulandığından emin olun. Birden çok fare yi görüntüleseniz, her fare arasına bölücüler yerleştirin. Farelerin mümkün olduğunca düz konumlandırıldığından emin olun (yani bir tarafa yaslanmamalı).
    7. Luminescent ve Fotoğraf kutularını tıklatın ve sonra Edinme Kontrol Paneli'nde Edinme'yi tıklatın.
  6. Pik sinyal elde edilene kadar sürekli olarak biyolüminesans görüntüler elde edin ve analiz için en yüksek biyolüminesans sinyali ile görüntüyü kullanın.
  7. Görüntülemeden sonra, tam iyileşmesağlamak için fareyi kafesine ve monitöre 15 dakika döndürün.
  8. Resim deneme süresi boyunca haftada 2-3 kez.

7. Metastaz sayısının ve büyüklüğünün ölçülmesi

NOT: Metastazların büyümesine izin verilen süre, her hücre çizgisi ve fare türü için belirlenmeli ve enjekte edilen hücre sayısından etkilenecektir.

  1. Fareleri standart kurumsal kurallara göre ötenazi.
  2. İzole ve her fare den akciğerleri çıkarın ve fazla kan kaldırmak için 1x PBS durular.
  3. Akciğerleri yavaşça loblara ayırın.
  4. GFP geniş bant filtresi (uyarma 470/40x) ile floresan stereoskop kullanarak parlak alanda ve floresan 10x de loblarda ZsGreen metastaz görüntüleri edinin.
    NOT: Tüm numuneler için aynı büyütme ve parlaklığı koruyun. Kullanılan büyütme, metastazların büyüklüğüne, sayısına ve parlaklığına ve kullanılan mikroskobun görüş alanına bağlı olarak değişebilir.
  5. Görüntülerdeki metastazların boyutunu ve sayısını ölçmek için görüntü analizi yazılımını kullanın.
    NOT: Görüntü analizi protokolü yazılıma bağlıdır ve step3'teki tümörlerle optimize edilebilir. Alternatif olarak, floresan stereoskop kullanarak el ile her akciğermetastaz sayısını saymak. Protokol burada duraklatılmış olabilir ve adım 8 tüm in vivo görüntüleri toplandıktan sonra herhangi bir noktada yapılabilir.

8. In vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı ile elde edilen görüntülerden elde edilen verilerin işlenmesi ve analizi

  1. Görüntü yazılımındaki her fare için tüm görüntü dosyalarını açın.
    NOT: Analiz için en yüksek biyolüminesans sinyali ile görüntüyü kullanın
  2. Ünitelerin, görüntü penceresinin sol üst kısmındaki oku tıklatArak ve uygun birime değiştirerek, floresan veriler için biyolüminesans veriler ve verimlilik için Parlaklıkta olduğundan emin olun.
  3. Aşağıdaki gibi ilgi alanı (YG) oluşturmak için son zaman noktasından görüntüyü kullanın.
    1. Araç Paleti penceresinde YG Araçlarını tıklatın. Ok atıklayın ve 1seçerek bir YG ekleyin.
    2. YG'nin kenarlığı'nı tıklatın ve farenin göğsüne doğru hareket ettirin. Farenin göğsünü kaplayabilmesi ve sinyali dışlamaması için YG'nin boyutunu ayarlayın.
  4. ROI'ları ölçün ve ham sayıyı bir excel sayfasına kopyalayın veya yazın.
    NOT: Biyolüminesans veriler için toplam akı (fotonlar/ saniye), hangi Yatırım Getirisi tüm parlaklık toplamı seçin. Metastazlar mutlaka düzgün büyümek zorunda olmadığından, metastatik yükün toplamını ölçer çünkü toplam akı ortalama parlaklık üzerinde tercih edilir. Benzer şekilde, floresan veriler için ortalama verimlilik yerine toplam verimlilik % (emisyon ışığı (foton/saniye)/uyarma ışığı (foton/saniye)) kullanılmalıdır.
  5. Adım 8.3'te kullanılan YG'yi kopyalamak ve her resim dosyasına yapıştırmak için resim dosyasına sağ tıklayın.
    NOT: Floresan görüntüleri ölçerken, metastaz olmadan görüntülenmiş bir fareüzerinde aynı bölgeyi ölçün. Bu sinyali arka plan sinyali olarak kullanın ve elde edilen her floresan metastaz içeren fare görüntüsünden çıkarın.
  6. Yapıştırılan RO'ları her görüntü için adım 8.3.4'te seçilen aynı bölgeye taşıyın ve 8.4 adımını yineleyin.
  7. Ham verileri aşağıdaki gibi çizin ve analiz edin (bkz. Ek Tablo 2).
    1. Belirtilen formülü(Ek Tablo 2)kullanarak her fare için ham verilerin günlük10 dönüşümü yapın ve Şekil 2D ve Şekil 4F'dekigibi çizim yapın. Günlük10 dönüşümü, geometrik olma eğiliminde olan büyüme eğrisini doğrusallaştırır ve heteroscedastisiteyi en aza indirir.
    2. Doğrusal regresyon kullanarak, 8.7.1(Ek Tablo 2)olarak çizilen her fare için log10 dönüştürülmüş verilere monte edilen hattın eğimini hesaplayın. Satıra uymak ve eğimi tek adımda hesaplamak için Ek Tablo 2'deki formüle bakın.
    3. Şekil 2E ve Şekil 4G'dakigibi yamaçların sayısal değerlerini çizin. İstatistiksel anlamlılık belirlemek için yamaçlarda öğrencinin t-testini veya tek yönlü ANOVA'sını (2'den fazla grup için) kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıdaki yaklaşımı göstermek için, kritik bir çoğaltma faktörü olan RPA3'ün metastatik fare meme karsinomu hücre hattında (4T122)yıkıldığı bir kavram deneyinin kanıtını gerçekleştirdik. Protokol, hücrelerin genetik manipülasyondan önce hem luciferase hem de floresan proteinlerle etiketlendiğini açıklarken, rnai vektörleri de ZsGreen'i teslim ettiği için modifiye edilmiş bir yaklaşım kullandık (Şekil 2A). İlk olarak, 4T1 hücreleri ateş böceği luciferase ve higromisin direnci (pHAGE-Luciferase-IRES-Hygro) kodlama bir lentiviral yapı ile stably transduced edildi. Higromisin seçiminden sonra, ateş böceği luciferasein kararlı ekspresyonunu doğrulamak için luciferase bir titrek yapıldı (Şekil 2A). Sonra, 4T1-Luciferase hücreleri stably ZsGreen ifade retroviral vektörler ile transe ve ya bir kontrol miR30 tabanlı shRNA, ya da bir miR30 tabanlı shRNA daha önce etkili fare RPA316hedef gösterilir,23,24. Hücreler daha sonra lateral kuyruk damarı ile farelere enjekte edildi ve in vivo biyolüminesans sinyali metastatik yükü izlemek için haftada iki kez ölçüldü(Şekil 2B,C). Her fare için log10 dönüştürülmüş sinyal zaman içinde metastatik yük olarak çizildi (Şekil 2D) ve her bir çizimin eğimleri belirlendi (Şekil 2E). Bu veriler, kontrol hücrelerine kıyasla RPA3 nakavtı ile metastatik yükteki değişim oranının önemli ölçüde azaldığını göstermektedir. Farklılıklar çarpıcı olsa da, bu veriler tek başına metastatik yükün azalmasının mı yoksa metastazların yavaş büyümesinden mi kaynaklandığını belirlememize izin vermemaktadır. Bu nedenle, akciğerlerde ZsGreen etiketli metastazlar da deney sonunda analiz edildi. RPA3 knockdown hücreleri ile enjekte fareler akciğerlerde hemen hemen hiç metastaz vardı, kontrol fareler çok sayıda büyük metastaz lar ise(Şekil 3). Ayrıca, RPA3 nakavt hücrelerinden oluşan metastazlar kontrol 4T1 metastazlarından açıkça daha küçüktü (Şekil 3A). Bizim manuel sayımları ile tutarlı(Şekil 3B),görüntü analiz yazılımı RPA3 knockdown farelerde önemli ölçüde daha az metastaz sayılır (Şekil 3C). Ayrıca, akciğerlerdeki toplam metastatik yük (milimetre cinsinden her metastaz alanlarının toplamı) da RPA3 nakavtı ile büyük ölçüde azaltıldı (Şekil 3D). Son olarak, RPA3 nakavt farelerde oluşan bireysel metastazların boyutu genellikle kontrol farelerinden çok daha küçüktü(Şekil 3E). Kontrol farelerinde büyük metastazlara ek olarak, çok sayıda küçük metastaz da gözlemledik, ancak bunların akciğeri tohumlayan ve büyümeyen tümör hücreleri mi yoksa akciğeri yeni bir yerde yeniden tohumlayan büyük metastazlardan dökülen tümör hücreleri olup olmadığını belirleyemedik (Şekil 3E). Bu veriler, RPA3'ün 4T1 hücreleri tarafından metastaz oluşumu için gerekli olduğunu göstermektedir. Bu bulgular beklenmektedir çünkü önceki çalışmamız RPA3 knock down hücrelerinin kuyruk damar enjeksiyonu16sonrasında akciğerlerde metastaz oluşturma yeteneğini önemli ölçüde azalttığını göstermiştir. Ancak bu deney, metastatik kolonizasyon veya büyüme deki farklılıklardan kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için canlı hayvan görüntüleme ve metastaz sayısı ve boyutunun floresan nicelleştirilmesinin nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu yaklaşımın biyolojik olarak daha alakalı bir soruyu cevaplamak için nasıl kullanılabileceğini göstermek için, bu sinjenik meme kanseri modelinde metastatik kolonizasyon ve sonraki büyüme için YAP ve TAZ gerekip gerekmediği soruldu. YAP veya TAZ'ın ekspresyonu ve aktivitesi normal dokuya göre birçok kanserde artmaktadır ve bu kötü hasta sonucunun tahmincisidir 25,26,27,28,29. Ayrıca, çeşitli çalışmalar YAP, TAZ veya TEADs, kritik YAP / TAZ bağlayıcı ortakları, metastaz15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42, ima var 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. Bu veriler göz önüne alındığında, metastaz oluşumu ve büyümesi için YAP ve TAZ gerekip gerekmeden gerek olup olmadığını test etmek için yaklaşımımızı kullandık. Bunun için hem YAP hem de TAZ'ı hedefleyen miR30 tabanlı shRNA'ları ifade eden retroviral vektör kullanıyoruz. Görüldüğü gibi, bu tandem shRNA 4T1 hücrelerinde YAP ve TAZ protein ekspresyonunu ve transkripsiyonel aktivitesini etkin bir şekilde azaltır(Şekil 4A,B). 4T1-Luciferase hücreleri bu tandem YAP/TAZ shRNA vektörünün ZsGreen-ekspres versiyonu veya kontrol miR30 tabanlı shRNA(Şekil 4C)ile ve daha sonra syngeneic BALB/c farelerde kuyruk damar enjeksiyonları ile teşrip ile teşrif edildi. Şekil 4'tegösterildiği gibi, kontrol hücreleri enjekte edilen farelerde, YAP/TAZ nakavt hücreleri enjekte edilen farelere göre metastatik yükün artma hızı anlamlı olarak daha hızlıdır(Şekil 4D-F). YAP/TAZ nakavt hücreleri ile enjekte edilen farelerde, elle sayılan kontrol hücreleri olan farelere göre(Şekil 5A,B)veya görüntü analiz yazılımı kullanılarak(Şekil 5C)önemli ölçüde daha az metastaz oluşmuştur. Sadece kontrol farelerde çok daha fazla metastaz formu yaptı, ama genellikle daha büyüktü(Şekil 5E). Sürekli olarak, akciğerlerdeki metastatik yük (mm'deki toplam metastaz alanı) da YAP/TAZ nakavtı ile önemli ölçüde azaltıldı (Şekil 5D). Metastazlar büyük ve birbirine yakın olduğunda, yazılımın farklı metastazları ayırt edemeyeceğini unutmayın. Bu kontrol fareler (fare 3 ve fare 7) birkaç metastaz için durum du. Bu nedenle, doğru tek tümörlerin alanı ölçüm olduğundan emin olmak için görüntü analiz yazılımının çıkış kontrol etmek önemlidir. Bu nedenle enjekte edilen hücre sayısını ve deney süresini optimize etmek de önemlidir. Bu veriler, YAP ve TAZ'ın metastatik meme kanserinin sinjenik bir murine modelinde metastatik yükün artma oranını sürdürmesi gerektiğini ve bunun metastazların oluşamaması ve oluşan birkaç metastazın büyümelerinin azalmasından kaynaklandığını göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Protokolün şeması. Gerekli tüm virüsler ilk olarak HEK-293FT hücrelerde paketlenir. Çalışma için istenilen hücreler daha sonra aynı anda her benzersiz bir memeli ilaç seçim geni ifade luciferase ve floresan virüsler ile enfekte. Enfekte hücreler daha sonra hem luciferase ve floresan protein ifade stably transduced hücreleri seçmek için her iki ilaç içeren uygun ortamda genişletilir. Her iki etiketin ifadesi protokolde açıklandığı gibi doğrulanır. Etiketli hücreler daha sonra üçüncü bir virüs içeren genetik manipülasyon (miR30 shRNA) ve üçüncü bir benzersiz ilaç seçim geni ile transduced vardır. Üçüncü ilaç ile seçimden sonra, hücreler lateral kuyruk ven yoluyla fareler içine enjekte edilir. Metastatik yük bir in vivo canlı hayvan görüntüleme sistemi ile deney boyunca farelerde izlenir. Deneyin sonunda, fareler ötenazi yezadet edilir ve tüm akciğerlerin görüntüleri floresan bir parçalama mikroskobu kullanılarak alınır ve metastazların sayısını ve boyutunu ölçmek için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Luciferase tabanlı in vivo canlı hayvan görüntüleme RPA3 knockdown meme kanseri metastatik yükü azaltır gösterir. (A) Bu in vivo çalışma için hücrelerin nasıl oluşturulduğunu gösteren şema. 4T1 hücreleri luciferase ve higromisin direncini kodlayan bir lentivirus ile birlikte transene neden oldu. Enfekte hücreler bir hafta boyunca 600 μg/mL higromisin B ile seçilmiş ve daha sonra luciferase aktivitesi bir luciferase reporter kiti ve plaka okuyucu kullanılarak ebeveyn veya 4T1-luciferase hücrelerinde ölçüldü (n = 1 ortalama çoğaltma kuyuları ile deneme). 4T1-Luciferase hücreleri daha sonra zsGreen ve miR30 shRNA'lar ya mCherry (kontrol) veya mRPA3 hedefleyen teslim retrovirüs ile enfekte edildi. Virüsün kararlı entegrasyonu için 3 gün boyunca puromisin seçimi (2.5 g/mL) kullanıldı. (B-E) 4T1-luciferase hücreleri stably ZsGreen ve kontrol (sh-mCherry) veya mRPA3 (sh-mRPA3-431) shRNA'lar ifade fareler içine enjekte edildi ve protokolde açıklandığı gibi belirtilen günlerde biyolüminesans için görüntülendi. (B & C) Belirtilen gün sonrası enjeksiyon her grubun temsili bir fare için biyolüminesans görüntüler (D) Deneme boyunca her fare için ölçülen log10 dönüştürülmüş luciferase sinyalin arsa. (E) D'deki her farenin eğimleri için ortalama (düz çizgi) dağılım çizimi (sh-control için n = 6 ve sh-mRPA3-431 için 8). İstatistiksel anlamlılık, öğrencinin t testi kullanılarak test edilmiştir; *p ≤ 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Floresan metastazların sayısallaştırılması RPA3 nakavt metastatik kolonizasyon ve meme kanseri hücrelerinin sonraki büyümesini önler ortaya koymaktadır. (A) Floresan (solda) ve brightfield (sağda) her fareden temsili lobgörüntüleri Şekil 221 gün enjeksiyondan sonra enjekte edilir. Yıldız (*) yeşil otofloresan bronşları işaret eder. (C-E) Görüntü analiz yazılımı (bkz. Malzeme Tablosu)nesneleri tanımlamak ve ölçmek için 25-100 ve 0,01 mm2 ile sonsuzluk arasındaki yoğunluk eşiği kullanılarak kullanılmıştır. (B & C) Görüntü analiz yazılımı(C)tarafından sayıldığında her farenin akciğerlerindeki toplam metastaz sayısının Ortalaması (katı çubuğu) ile dağılım çizimi (B). (D) Görüntü analiz yazılımı ile ölçülen akciğerin toplam alanı (mm) katı bir çubukla gösterilen Ortalama ile metastatik yük olarak çizilir. (E) Her metastazın boyutu her fare için çizilir. Kontrol fareleri mavi nokta ve mRPA3 nakavt fareler kırmızı nokta ile gösterilir. Not, ölçek çubuğu küçük metastazların boyutunu ve sayısını görselleştirmeyi kolaylaştırmak için 1 mm olarak ayrılır (n = 6 sh-control, 8 sh-mRPA3-431). İstatistiksel anlamlılık, öğrencinin t testi kullanılarak test edilmiştir; p = 0,06; ** p ≤ 0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: YAP/TAZ nakavt meme kanseri metastatik yükünü azaltır. (A&B) 4T1 hücreleri miR30 tabanlı kontrol (mCherry) veya tandem YAP/TAZ shRNA'ları (sh-mYAP1/mTAZ6) ifade eden hücreler Batı leke analizi (A) veya trans tarafından analiz edildi YAP/TAZ-TEAD luciferase muhabiri yapısı ile önceden 15,16(B) (n = 5 kontrol ve 4 YAP1/TAZ6) açıklandığı gibi YAP/TAZ-TEAD transkripsiyonel aktivitesi için teşvitlenmiştir. (C) İn vivo çalışma için hücrelerin nasıl oluşturulduğunu gösteren şema. 4T1-Luciferase hücreleri ZsGreen ve mCherry (kontrol) veya hem mYAP ve mTAZ hedefleyen tandem miR30 shRNA'ları hedefleyen bir miR30 shRNA sağlayan retrovirüsler le enfekte edildi. Enfekte hücreler Puromisin (2.5 μg/mL) içinde 3 gün süreyle seçildi. ZsGreen ve control (sh-mCherry) veya YAP/TAZ (sh-mYAP1/mTAZ1) shRNA'larını ifade eden 4T1-luciferase hücreleri daha sonra farelere enjekte edildi ve enjekte edilen günlerde biyolüminesans için görüntülendi. (D&E) Belirtilen gün sonrası enjeksiyon her grubun temsili bir fare için Biyolüminesans görüntüler. (F) Log10 dönüştürülmüş luciferase sinyal in çizimi deney boyunca her fare için ölçülür. (G) F'deki her farenin eğimleri için Ortalama (katı çubuk) ile dağılım çizimi (sh-control için n = 7 ve sh-mRPA3-431 için 8). Ortalama düz bir çizgi ile gösterilir. İstatistiksel anlamlılık, öğrencinin t testi kullanılarak test edilmiştir; p = 0,06; #, p ≤ 0.01; ***. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: YAP ve TAZ metastatik meme kanseri hücrelerinin akciğerleri kolonize etmesi için gereklidir. (A) Floresan (solda) ve brightfield (sağda) her fareden temsili lobgörüntüleri Şekil 4 21 gün sonra enjekte. (C-E) Görüntüler Şekil 3'teaçıklandığı gibi görüntü analiz yazılımı ile işlenmiştir. (B & C) El ile(B)veya görüntü analiz yazılımı(C)ile sayıldığında her farenin akciğerlerindeki toplam metastaz sayısının Ortalaması (katı çubuğu) ile dağılım çizimi . (D) Tüm metastazların (mm) toplam alanı görüntü analiz yazılımı ile ölçüldü ve Ortalama (katı çubuk) ile metastatik yük olarak çizildi. (E) Her metastazın boyutu her fare için çizilir. Kontrol fareleri mavi nokta ve sh-mYAP1/mTAZ6 nakavt fareleri kırmızı noktalarla gösterilir. Not, küçük metastazların boyutunu ve sayısını daha iyi görselleştirmek için ölçek çubuğu 1 mm olarak ayrılır (n = 7 sh-control, 8 sh-mYA1/mTAZ6). Ortalama düz bir çizgi ile gösterilir. İstatistiksel anlamlılık, öğrencinin t testi kullanılarak test edilmiştir; *p ≤ 0.05, **, p ≤ 0.01; **. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Vektörler tablosu. Kullanılan tüm vektörler listelenir ve yeni vektörler tanımlanır. Yeni tanımlanan 97-mer shRNA için yeni vektörleri klonlamak için standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılmıştır. Alıntılar: [1]53, [2]16, [3]54Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: In vivo canlı hayvan görüntüleme veri işleme ve analizi örneği. In vivo live animal images'dan elde edilen ham verilerin 6.7 ve 6.8 adımlarında açıklandığı gibi analiz için nasıl dönüştürüldüğünü gösteren elektronik tablo. In vivo canlı hayvan görüntüleme elde ham veri bir günlük10 dönüşüm kullanılarak dönüştürülmüştür. Metastatik yükteki değişim oranı, log10 dönüştürülmüş veriler tarafından oluşturulan eğim hesaplanarak her fare için hesaplanır. Örnekler şekil 2'denluciferase analizi içerir. Sütunlar, her eğim değerini oluşturmak için hangi verilerin kullanıldığını belirtmek için renk kodlur ve formüller elektronik tabloya yerleştirilir. Kuyuyu çift tıklatmak, verileri işlemek için kullanılan formülü ortaya çıkarır. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yöntemin kritik adımları
Belirli bir hücre hattı ve fare zorlanması için enjekte edilen hücre sayısını (adım 3) optimize etmek önemlidir, çünkü bu, oluşan metastaz sayısını ve deneyin uzunluğunu büyük ölçüde etkileyebilir. Çok fazla hücre enjekte edilirse veya metastazlar çok uzun süre büyürse, metastazların genetik manipülasyonun etkilerini değerlendirmek zorlaştıkça sayılması zor olabilir. Ancak, çok az hücre enjekte edilirse, az veya hiç metastaz oluşabilir. Bu nedenle, metastazların büyüme süresini ve en uygun sayıyı ve süreyi belirlemek için farklı sayıda hücre kullanılarak bir ön deney yapılmalıdır. Bir grup içinde metastaz tutarlı sayıda sağlamak için, her fare içine canlı hücrelerin eşit sayıda enjekte önemlidir. Hücreler hem tüpe hem de şırıngaya yerleşebildiği için, hücreler şırınga yüklemeden önce hafifçe askıya alınmalı ve hücre süspansiyonları şırıngada çok uzun süre bırakılmamalıdır (adım 4.3.2). Hücre canlılığı, hücrelerin askıya alınması uzun süre azalır, bu nedenle tripsinizasyon ve hücrelerin enjeksiyonu arasındaki süre en fazla bir saat olmalıdır (adım 4.2.5). Hava kabarcıkları ve büyük hücre kümeleri enjekte edilmemelidir, çünkü bunlar fareyi öldüren emboliye neden olabilir. Buna ek olarak, iğne yoluyla hücreleri çizim onları makas olabilir, bu yüzden şırınga iğne olmadan yüklenmelidir. Nispeten eşit sayıda hücre enjekte edildiğini doğrulamak için, in vivo canlı hayvan görüntüleri enjeksiyondan kısa bir süre sonra çekilebilir (Şekil 2B, Şekil 4D).

Biyolüminesans sinyalinin doğru ve tutarlı bir şekilde ölçülmesi önemlidir ve D-luciferin'i alan ve metabolize eden hücrelere bağlıdır. Bu, D-luciferin dozu, enjeksiyon un zamanlaması, farenin vücut ısısı, farenin enjekte edildiğinde nasıl anestezi yediğini ve bir farenin görüntülemeden önce anestezi odasına nasıl yerleştirilmeleri gibi birçok değişkenden etkilenebilir. Bu nedenle, bu adımları tüm fareler ve görüntüleme oturumları için tutarlı tutmak önemlidir. Biz anestezi odasında iken tutarlı fare vücut ısısını korumak için bir ısıtma yastığı kullanılır. Sinyal hem biyolüminesans hem de floresan tespiti için dokuya nüfuz etmesi gerektiğinden, fare konumunu her görüntü için tutarlı tutmak da önemlidir (sırtındaki düz lük akciğerlerin görüntülenmesi için en iyi sonucudur). İn vivo canlı hayvan görüntülemefloresan görüntülerin sayısallaştırılması her zaman verimlilik % birimleri kullanılarak yapılmalıdır, çünkü bu görüntüler arasında uygun karşılaştırma sağlar. Aynı şekilde, biyolüminesans görüntüleri ölçerken her zaman toplam akı (fotonlar/saniye) kullanılmalıdır. Metastatik yükün analizi için, günlük10 dönüşümü büyüme eğrisini (maksimum sinyale ulaşılmadan önce) eğim analizi için gerekli olan doğrusal bir çizime dönüştürür.

Değişiklikler ve yöntemin sorun giderme
Sunulan protokolde bir hücre popülasyonu ilk olarak floresan protein ve luciferase ile transe edilir, daha sonra bu popülasyon ya bir kontrol vektörü ya da ilgi genini hedefleyen bir vektör le transe edilir. Bu, her iki hücre popülasyonunda da benzer floresan protein ve luciferase ekspresyonuna sahip olmasını sağlar. Ancak, alternatif olarak, aynı anda bu bileşenlerden ikisini teslim eden viral vektörler kullanılabilir. Nitekim, temsili deneylerde biz 4T1-luciferase hücrelerinde shRNA ifade retroviral vektörleri ifade ZsGreen kullanılır. İlgi geni değiştirildikten sonra luciferase ve floresan proteinin ekspresyonunun tüm hücre gruplarında titretilmesi önerilir. Gruplar arasındaki farklı ifade düzeyleri verilerin yorumlanmasını zorlaştırabilir, bu nedenle farklı grupların hem floresan protein hem de luciferase benzer bir ifadeye sahip olması en iyisidir. Ayrıca, kırmızı kan hücreleri otofloresan olabilir ve zor akciğerlerde floresan metastazgörselleştirmek için yapabilir. Bu durumda, kırmızı kan hücreleri otofloresan arka planı azaltmak için ötanazi sırasında PBS perfüzyonu ile akciğerlerden temizlenebilir (uygun ötenazi teknikleri ve yönergeleri takip edilmelidir). Temsili deneylerimizdeki kontrol ve nakavt grupları arasındaki farklar dramatik olsa da, in vivo metastaz tahlillerinde genellikle bulunan fareden fareye değişkenlik kontrol farelerinde belirgindir(Şekil 3B ve Şekil 5B). Bu değişkenlik yüksek olduğunda, nakavt etkisinin büyüklüğünü belirlemeyi zorlaştırabilir. Bu değişkenliği azaltmak için kullanılabilecek alternatif bir yaklaşım, kontrol hücrelerini ve nakavt hücrelerini farklı floresan proteinler ve farklı luciferase enzimleri ile etiketlemek ve sonra iki popülasyonu eşit sayılarda karıştırıp karışımı enjekte etmektir. Örneğin, kontrol hücreleri stably domates ve renilla luciferase ifade eden knockdown hücreleri ZsGreen ve firefly luciferase ifade ile karıştırılabilir. In vivo canlı hayvan görüntüleme cihazları firefly luciferase renilla luciferase ayırt edebilirsiniz, ve ZsGreen domates, böylece ya floresan veya parlaklık bağımsız olarak her hücre popülasyonu ölçmek için kullanılabilir. Gerçekten de canlı hayvanlarda primer tümör olarak büyüyen 4T1 hücrelerinin çift luciferase görüntülemesi in vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı kullanılarak gösterilmiştir4. Ancak, floresan sinyalde çakışma olabileceğini, bu nedenle spektral karıştırmasız adımın (bkz. üreticilerin yönergelerine bakınız) bu yaklaşıma dahil edilmesi gerektiğini belirtmek önemlidir. Ayrıca, renilla luciferase ve firefly luciferase ilk luciferase sinyal in saniye görüntüleme önce artık tespit edilebilir sağlayan yeterli bir zaman gecikmesi ile ayrı ayrı görüntülenmelidir. Farklı floroforların kullanımı hala akciğerlerde metastaz sayısı ve boyutu16sayısal olmasını sağlar. Akciğerler in yanı sıra diğer organlarda metastatik kolonizasyon ve büyüme yi test etmek için bu protokol değiştirilebilir ve intrakardiyak ve portal ven enjeksiyonları için kullanılabilir9,10.

Yöntemin sınırlamaları
Floresan etiketli kanser hücreleri ile birlikte gerçek zamanlı metastatik yük elde etmek için bir in vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı kullanarak metastatik kolonizasyon ve sonraki büyüme saymak için güçlü bir yöntem sağlar; ancak, bu yaklaşımın sınırlamaları vardır. Metastazda belirli roller yerine doğuştan gelen hücre çoğalması için bazı genler gerekebilir. In vitro hücre proliferasyon tahlilleri gen in vitro büyüme bozan olup olmadığını belirlemek için in vivo deney öncesinde yapılabilir. Canlı bir hayvan görüntülenirken metastazlardan gelen biyolüminesans veya floresan sinyal dokudan geçecek kadar güçlü olmalıdır. Ayrıca, doku optik özellikleri (yani, emilimi ve saçılma) da algılama55etkiler. Uyarma ışık kaynağı floresan etiketli kanser hücrelerini heyecanlandırmak için doku geçmesi gerekir ve biyolüminesans floresan daha büyük bir dinamik aralığı vardır. Bu nedenle, floresan canlı hayvan görüntüleme için kullanılabilir rağmen, biyolüminesans iç organlarda sinyal tespit için tercih edilir. Buna ek olarak, bazı immünobeceriksiz fare suşları floresan proteinleri ifade hücreleri reddedebilir. Nitekim, balb/c farelerinde büyürken domates, GFP veya mCherry'yi ifade eden hücrelerin florofor un reddedildiğini veya aşağı doğru düzenlendiğini gördük (veriler gösterilmedi ve15). Ancak, burada gösterildiği gibi(Şekil 3 ve Şekil 5) ve daha önce15,16, ZsGreen etiketli hücreler bu farelerde tespit edilebilir. Floresan protein ekspresyonunun saptanamayan durumlarda, bağıl metastatik kolonizasyonu ölçmenin başka bir yolu da entegre viral vektör15'tekifloresan geni veya başka bir geni ölçmek için qPCR kullanmaktır. Bir in vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı metastatik yük değişiklikleri algılamak için izin verir rağmen, bu değişikliklerin metastaz ların boyutu veya sayısı değiştirilmiş nedeniyle olup olmadığını belirlemek için izin vermez. Ayrıca metastazların yeri hakkında uzamsal bilgi sağlamaz. Ayrıca, sinyalin gücü doku da ne kadar derin etkilenebilir.

Yöntemin önemi ve gelecekteki olası uygulamalar
Bu yaklaşımın daha fazla veya farklı bilgi elde etmek için değiştirilebileceği birçok yol vardır. İnsan kanser hücre hatları veya hasta türetilen ksenogreftler de dahil olmak üzere kanser hücre hatları çeşitli bu tözde kullanılabilir. Diğer fare modelleri de kullanılabilir, stromal hücreler tarafından yapılan proteinlerin hedeflenmesinin enjekte edilen kanser hücrelerinin metastatik kolonizasyonunu ve büyümesini nasıl etkilediğini test etmek için tasarlanmış transgenik veya nakavt fareler de dahil. Test edilecek birden fazla aday gen varsa, in vivo canlı hayvan görüntüleme cihazları tespit ve floroforlar geniş bir yelpazede ayırt çünkü bu yaklaşım çok katlı olabilir. Bu, gerekli fare sayısını azaltacak ve test edilebilen hedef sayısını artıracak. In vivo canlı hayvan görüntüleme de metastazların yeri hakkında çok daha fazla mekansal bilgi sağlamak için X-Ray veya CT9 görüntüleme ile kombine edilebilir. Son olarak, bu yaklaşım metastatik kolonizasyon basamak içinde daha spesifik adımları tetkik etmek için değiştirilebilir. Örneğin, tümör hücre tohumlama dahil adımlar (intravasküler sağkalım, ekstravazasyon, ve ekstravazasyon sonrası sağkalım) enjeksiyonu izleyen ilk 3 gün içinde birkaç zaman noktalarında akciğerlerde tümör hücrelerinin sayısı nın ölçülmesi ile ayırt edilebilir (burada yapılır16). Bu durumda, akciğerler de vasküler belirteçleri ve her zaman noktası56,57extravazated kanser hücrelerinin yüzdesini belirlemek için görüntülenmiş ex vivo ile lekeli olabilir.

Özetle, kuyruk damar enjeksiyonu sonrasında floresan ve ışıldayan kanser hücrelerinin vivo canlı hayvan görüntülemegerçek zamanlı kullanımı, bir aday gen veya genlerin metastatik kolonizasyonu ve sonraki büyümeyi nasıl etkilediğinin daha ayrıntılı bir analizini sağlar. Bu yaklaşım otokton fare modellerine göre daha hızlı ve daha az pahalıdır ve spontan metastaz modellerinin bazı uyarılarından kaçınır. Metastazları tespit etmek ve ölçmek için hem floresan hem de Parlaklığın kullanılması, araştırmacılara sonuçlara olan güveni artıran ve deneysel tasarımda esneklik sağlayan bağımsız okumalar sağlar. Metastaz boyutunu ve sayısını ölçmek için floresan kullanımı zaman alıcı ve potansiyel olarak maliyetli histolojik işleme ve analiz ihtiyacını önler ve tüm dokuların ek kullanımına olanak sağlar. Protokol, aday genin ifadesini veya işlevini rnai, transgen ekspresyonu veya CRISPR/Cas aracılı düzenleme gibi manipüle etmek için çeşitli tekniklerle kullanılabilir ve küçük molekülleri, işlevi engelleyen antikorları veya diğer potansiyel terapötik bileşikleri test etmek için de kullanılabilir. Yukarıda belirtildiği gibi, birkaç basit değişiklikler tsay geliştirmek ve ek bilgi sağlamak için yapılabilir. Bu yaklaşım, kanser tedavisi için tedavi potansiyeli olan pro-metastatik genleri tanımlamak ve test etmek için ideal bir yoldur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Emily Norton'a viral enfeksiyonlara ve el yazmasının eleştirel okumaya yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Biz de akciğerlerde yeşil metastaz görüntü analizi ile yardım için akciğer ve Kate E. Tubbesing görüntüleri elde yardımcı olmak için Ryan Kanai teşekkür ederiz. Biz destek ve bu video hazırlanmasında yardım için hayvan araştırma tesisi personeli teşekkür ederiz. Bu çalışma, J.M.L.'ye (#CCR17477184) verilen Susan G. Komen Career Catalyst Grant tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE Gel For western blot
2.5% Trypsin Gibco 15090-046 Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipes For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks) Taconic BALB-F For tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regular VWR Ameresco 97061-416 For western blot
Cell lysis buffer Cell Signaling For collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm Celltreat 40-229749-CS For filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamber For euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1960 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline Himedia TS1006 For PBS
EDTA VWR 97061-406 Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin VWR 97068-085 Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imager Fujifilm For western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAb Cell Signaling 2118 For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo Scientific 31460 For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT Invitrogen R70007 Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucose GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure Grade VWR Ameresco 97064-810 For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Imagej Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF Membrane Biorad 1620177 For western blot
Isoflurane For mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) PerkinElmer CLS136340 For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) Leica Microsystems Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-Glutamine Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 Life technologies L3000008 For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program) PerkinElmer Software for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1 Karmanos Cancer Institute Aslakson, CJ et al.,1992 Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0 Fujifilm Software for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer) Gibco 31985-062 For packaging virus and transfection
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225 For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32957 Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32953 Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 45-H9268 For infection
Puromycin Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainer For restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running buffer For western blot
TAZ (V3886) Antibody Cell Signaling 4883 For western blot
TBST buffer For western blot
TC20 automated cell counter Bio-Rad For counting cells
Vectors See Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence Microscope VWR 89404-464 For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer buffer For western blot
XenoLight D-Luciferin K+ Salt PerkinElmer 122799 Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) Roche 6365787001 For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb Cell Signaling 14074 For western blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferlay, J. S. I., et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. Available from: http://globocan.iarc.fr (2013).
  2. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, (4), 679-695 (2006).
  3. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, (6024), 1559-1564 (2011).
  4. Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  5. Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  6. Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  7. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  8. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15, (3), 272-306 (1997).
  9. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  10. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  11. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  12. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  13. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  14. Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  15. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294, (7), 2302-2317 (2019).
  16. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109, (37), 2441-2450 (2012).
  17. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10, (4), (2018).
  18. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28, (11), 1761-1772 (2016).
  19. Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114, (4), 457-467 (2003).
  20. Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. (2019).
  21. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  22. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52, (6), 1399-1405 (1992).
  23. Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41, (6), 733-746 (2011).
  24. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122 (2012).
  25. Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10, (8), 0135119 (2015).
  26. Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
  27. Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6, (11), 27529 (2011).
  28. Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30, (25), 2810-2822 (2011).
  29. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36, (5), 375-384 (2013).
  30. Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36, (4), 520-535 (2017).
  31. Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134, (1), 123-132 (2014).
  32. Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34, (31), 4056-4068 (2015).
  33. Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33, (5), 468-481 (2014).
  34. Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, (21), 89647 (2016).
  35. Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, Pt 7 1523-1536 (2014).
  36. Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8, (34), 56635-56650 (2017).
  37. Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496, (1), 76-82 (2018).
  38. Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36, (2), 729-736 (2016).
  39. Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35, (11), 1940-1951 (2015).
  40. Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34, (6), 681-690 (2015).
  41. Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 5 Pt A 1744-1753 (2018).
  42. Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9, (413), (2016).
  43. Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26, (9), 694-704 (2016).
  44. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, (48), 5879-5889 (2015).
  45. Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19, (2), 106-119 (2017).
  46. Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6, (19), 17206-17220 (2015).
  47. Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19, (8), 1495-1502 (2017).
  48. Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129, (10), 1963-1974 (2016).
  49. Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8, (1), 310 (2017).
  50. Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35, (21), 2789-2800 (2016).
  51. Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13, (6), 957-968 (2015).
  52. Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122 (2017).
  53. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70, (8), 5701-5705 (1996).
  54. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, Pt 1 217-225 (2005).
  55. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10, (4), 41210 (2005).
  56. Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76, (9), 2513-2524 (2016).
  57. Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20, (5), 576-590 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics