Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

Cancer Research

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Summary

El enfoque descrito combina ensayos experimentales de metástasis de la vena de cola con imágenes animales vivos in vivo para permitir el monitoreo en tiempo real de la formación y el crecimiento de metástasis de cáncer de mama, además de la cuantificación del número y tamaño de metástasis en los pulmones.

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Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. J. Vis. Exp. (154), e60687, doi:10.3791/60687 (2019).

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Abstract

La metástasis es la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer y hay opciones terapéuticas limitadas para los pacientes con enfermedad metastásica. La identificación y prueba de nuevas dianas terapéuticas que faciliten el desarrollo de mejores tratamientos para la enfermedad metastásica requiere modelos preclínicos in vivo. Aquí se muestra un modelo de ratón singérico para decir la colonización metastásica del cáncer de mama y el crecimiento posterior. Las células cancerosas metastásicas se transduelen de forma estable con vectores virales que codifican la luciferasa de las luciérnagas y las proteínas ZsGreen. Los genes candidatos son manipulados de forma estable en células cancerosas que expresan luciferase/ZsGreen y luego las células se inyectan en ratones a través de la vena lateral de la cola para analizar la colonización y el crecimiento metastásicos. A continuación, se utiliza un dispositivo de imágenes in vivo para medir la bioluminiscencia o fluorescencia de las células tumorales en los animales vivos para cuantificar los cambios en la carga metastásica con el tiempo. La expresión de la proteína fluorescente permite cuantificar el número y el tamaño de las metástasis en los pulmones al final del experimento sin necesidad de seccionar o tinción histológica. Este enfoque ofrece una manera relativamente rápida y fácil de probar el papel de los genes candidatos en la colonización y el crecimiento metastásicos, y proporciona mucha más información que los ensayos tradicionales de metástasis venosa de cola. Con este enfoque, mostramos que la reducción de la reducción de la carga metastásica en los pulmones y el desenlace simultáneo de proteína asociada al Sí (YAP) y del activador transcripcional con un motivo de unión a la PDZ (TAZ) en las células de cáncer de mama reduce la carga metastásica en los pulmones y que esta carga reducida es el resultado de una colonización metastásica significativamente deteriorada y un crecimiento reducido de metástasis.

Introduction

El cáncer sigue siendo la segunda causa de muerte en todo el mundo1 y la metástasis es responsable de la mayoría de estas muertes2,3. Sin embargo, una comprensión limitada de los mecanismos moleculares que rigen la colonización metastásica y el crecimiento posterior ha obstaculizado el desarrollo de tratamientos eficaces para la enfermedad metastásica. La identificación de nuevas dianas terapéuticas requiere un ensayo para probar cómo la expresión o función perturbada de un gen candidato influye en la formación y el crecimiento de la metástasis. Mientras que los modelos de ratón autóctonos tienen sus ventajas, consumen mucho tiempo y son costosos de generar, lo que los hace más adecuados para la validación de destino en lugar de la detección de objetivos. Los sistemas modelo de trasplante en los que el gen candidato se perturba en las células cancerosas in vitro y luego se evalúan in vivo los efectos sobre el potencial metastásico, son menos costosos y de mayor rendimiento que los modelos autóctonos. Además, los vectores virales para la administración estable de ARNi, CRISPR/CAS9 y transgenes están ampliamente disponibles, por lo que es relativamente fácil perturbar prácticamente cualquier gen o genes de interés en las líneas celulares de una célula cancerosa. Este enfoque también se puede utilizar para analizar el papel de los genes candidatos en la colonización metastásica y el crecimiento en las líneas celulares de cáncer humano trasplantando las células en ratones inmunocomprometidos o humanizados.

Los dos tipos de ensayos utilizados para probar la formación de metástasis por células cancerosas trasplantadas in vivo son ensayos de metástasis espontáneas y ensayos experimentales de metástasis. En los ensayos espontáneos de metástasis4,5, las células cancerosas se inyectan en ratones, se les permite formar un tumor primario, y luego se analiza la formación espontánea de metástasis y el crecimiento posterior. La fuerza de este modelo es que las células deben completar todos los pasos del proceso metastásico para formar tumores metastásicos. Sin embargo, muchas líneas celulares cancerosas no hacen metástasis eficientemente en modelos de metástasis espontánea, y cualquier manipulación de las células que afecta el crecimiento del tumor primario puede confundir los resultados del ensayo de metástasis. Los ensayos experimentales de metástasis, en los que las células cancerosas se inyectan directamente en la circulación, se utilizan para evitar estos escollos. Los ensayos de metástasis experimentales comunes incluyen la inyección de vena de cola6,7,8 (y se demuestra aquí), inyección intracardiaca9,y la inyección de vena porta10.

El propósito del protocolo presentado aquí es proporcionar un ensayo experimental de metástasis in vivo que permita a un investigador monitorear la formación y el crecimiento de metástasis en tiempo real, así como cuantificar el número y el tamaño de la metástasis del punto final en los pulmones del mismo ratón. Para ello, los ensayos tradicionales de metástasis de la cola experimental6,7,8 se combinan con imágenes de animales vivos, utilizando un dispositivo de imagen in vivo9,11,12,13,14. Las células tumorales que expresan establemente tanto la luciferasa como una proteína fluorescente se inyectan en ratones a través de la vena lateral de la cola y luego el dispositivo de imágenes in vivo se utiliza para medir los cambios en la carga metastásica en los pulmones a lo largo del tiempo(Figura 1). Sin embargo, el dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo no puede distinguir ni medir el tamaño de las metástasis individuales. Por lo tanto, al final del experimento, se utiliza un estereomicroscopio fluorescente para contar el número y medir el tamaño de las metástasis fluorescentes en los pulmones sin necesidad de seccionamiento e histología o inmunohistoquímica(Figura 1). Este protocolo se puede utilizar para probar cómo la alteración de la expresión o función de un gen candidato influye en la formación y el crecimiento de la metástasis. También se pueden probar posibles compuestos terapéuticos como moléculas pequeñas o anticuerpos de bloqueo de funciones.

Para demostrar este enfoque, primero realizamos un experimento de prueba de concepto en el que el factor de replicación esencial, la proteína de replicación A3 (RPA3) se derriba en las células de cáncer de mama de ratón metastásico. Mostramos que los ratones inyectados con células de derribo de RPA3 tienen una carga metastásica significativamente menor en cada punto de tiempo en comparación con los ratones inyectados con células de control. El análisis de los pulmones que contienen metástasis muestra que esta carga metastásica reducida es el resultado de una colonización metastásica significativamente reducida y un crecimiento deteriorado de las metástasis que se forman. Para demostrar aún más esta técnica, probamos si el derribo simultáneo de proteína asociada al Sí (YAP) y coactivador transcripcional con un motivo de unión a pdZ (TAZ) afecta la colonización metastásica o el crecimiento posterior. YAP y TAZ son dos coactivadores transcripcionales relacionados que son los efectores descendentes críticos de Hippo Pathway. Nosotros15,16 y otros hemos implicado YAP y TAZ en metástasis (revisado en17,18,19), lo que sugiere que estas proteínas son buenas dianas terapéuticas. Consistentemente, encontramos que los ratones inyectados con células de derribo YAP/TAZ habían reducido significativamente la carga metastásica. El análisis de los pulmones mostró que las células de derribo YAP/TAZ formaban muchas menos metástasis y que las metástasis que se formaban eran más pequeñas. Estos experimentos demuestran cómo los ensayos experimentales de metástasis permiten a un investigador probar rápida y económicamente el papel de un gen candidato en la formación y el crecimiento de metástasis. Además, muestran cómo el uso combinado de imágenes de animales vivos y la cuantificación fluorescente de metástasis en pulmones enteros permite al investigador comprender mejor los pasos durante la colonización metastásica.

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Protocol

Este protocolo implica el uso de ratones y materiales biopeligrosos y requiere la aprobación de los comités de seguridad institucionales apropiados. Todo el trabajo in vivo descrito aquí es aprobado por el Comité Institucional de cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) por sus dados).

NOTA: Para obtener información general sobre el protocolo, consulte el esquema en la Figura 1.

1. Empaquetado de todos los retrovirus y lentivirus necesarios

NOTA: El protocolo descrito utiliza vectores lentivirales o retrovirales para expresar establemente una enzima luciferasa y una proteína fluorescente, así como para manipular la expresión de un gen candidato. Estos virus se empaquetan en células HEK-293FT como se describe a continuación.

  1. Día 1: Células de placa HEK-293FT en placas de 6 pocillos en 2 ml de medios de crecimiento completos (10% FBS en DMEM con 1% penicilina/estreptomicina y 2 mM de L-glutamina) para que sean un 40-60% de fluidez en el día 2. Incubar a 37oC, 5%CO2 durante la noche.
  2. Día 2: Para cada vector viral que se va a embalar, transfectar un 40-60% de conservación de células HEK-293FT con el vector retroviral o lentiviral y los vectores apropiados que codifican la capa viral y las proteínas de envasado.
    NOTA: Este protocolo utiliza VSVG como proteína de capa, psPAX2 para envases lentivirales y gag-pol para envases retrovirales (ver Tabla Suplementaria 1 para la lista de vectores).
  3. Haga una mezcla de co-transfección para cada uno de los siguientes productos:
    1. Combinar 4 l de solución lipídica para transfecciones (ver Tabla de Materiales)y 96 l de tampón de transfección e incubar durante 5 minutos.
    2. Añadir 1 g de vector viral, 0,5 g de vector de proteína de capa (VSVG) y 0,5 g de vector de proteína de envasado (psPAX2 o gag-pol) e incubar durante 20 minutos.
    3. Agregue suavemente la mezcla de co-transfección del paso 1.3.2 a las células HEK-293FT chapadas en el paso 1.1 e incuban a 37oC, 5% CO2 durante la noche.
  4. Día 3: Retire los medios que contienen transfección de cada pocal y agregue suavemente 2 ml de medios de crecimiento completos a cada pocal. Incubar a 37oC, 5%CO2 durante aproximadamente 24 horas.
  5. Día 4: Recoger el sobrenadante viral de cada pocal utilizando una jeringa de 3 ml y filtrar a través de un filtro de 0,45 m en un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
  6. Opcional: Si se desea la recolección de un segundo lote de virus, agregue suavemente 2 ml de medios de crecimiento completos a cada poca e incubaa a 37 oC, 5% co2 durante aproximadamente 24 horas.
  7. Día 5 (Opcional): Recoge una segunda ronda de sobrenadante viral como en el paso 1.5.
    NOTA: El protocolo puede estar en pausa congelando el sobrenadante viral.

2. Generación de células cancerosas expresando establemente la luciferasa y una proteína fluorescente

NOTA: El siguiente protocolo describe cómo etiquetar primero las células 4T1 con luciferasa de luciérnaga y una proteína fluorescente (ZsGreen) utilizando dos vectores con genes de selección únicos. A continuación, se utiliza un vectorviral 3 rd para manipular la expresión de un gen candidato. Sin embargo, los vectores virales que simultáneamente entregan una proteína fluorescente y una manipulación genética también se pueden utilizar como alternativa (como en los experimentos representativos a continuación). Se pueden utilizar otras células cancerosas, pero los números celulares deben optimizarse para los pasos 2.1 y 2.7.1.

  1. Células de placa 4T1 a 1,5 x 105 células/bien en una placa de 12 pocillos en medios de crecimiento completos (10% FBS en DMEM con 1% penicilina/estreptomicina y 2 mM de L-glutamina) e incuban a 37oC, 5% CO2 durante la noche.
  2. Infectar las células 4T1 con el sobrenadante viral generado en el paso 1 de la siguiente manera.
    1. Aspirar los medios de crecimiento de las células y añadir 500 l de sobrenadante viral luciferasa y 500 l de sobrenadante viral de proteína fluorescente para infectar simultáneamente las células con los supernatantes virales de proteína slucifera y fluorescente.
    2. Añadir 1 bromuro de hexadimetrina de 8 mg/ml (ver Tabla de Materiales).
    3. Incubar las células a 37 oC, 5% hasta 75-90% de confluente (normalmente 24-48 horas).
  3. Intente probar las células 4T1 con 500 ml de trippsina durante 2-5 minutos (las células deben enjuagar libremente la parte inferior del pozo). Transfiera todas las células a un plato de 6 cm en 4 ml de medios de selección (medios de crecimiento completos que contengan los antibióticos adecuados) que así se quemca la trippsina. Placa rlavar un plato de 6 cm de células de control no infectadas en el mismo medio de selección.
    NOTA: La concentración adecuada de antibióticos debe determinarse con antelación mediante la prueba de varias dosis. Además, la clasificación celular activada por fluorescencia también se puede utilizar para seleccionar las células etiquetadas fluorescentemente en lugar de la selección de fármacos.
  4. Incubar las células a 37 oC, 5%co2 en medios de selección y dividir las células cuando sea necesario hasta que todas las células de control no infectadas estén muertas (dependiendo del gen de selección y la línea celular).
  5. Confirme que las células 4T1 infectadas están expresando la proteína fluorescente ZsGreen utilizando una excitación verde (450-490 nm)/emisión (500-550 nm) filtro establecido en un microscopio fluorescente invertido en aumento de 50-100x.
  6. Confirme que las células 4T1 infectadas están expresando luciferasa utilizando un kit de actividad luciferasa disponible comercialmente de la siguiente manera.
    1. Utilice un volumen mínimo de 1 x tampón de lisis pasiva para lyse luciferase-expressing 4T1 células y controlar 4T1 células que no expresan luciferasa, agitando suavemente durante 30 minutos.
    2. Añadir 20 l de lisado celular a una placa de 96 pocillos de fondo blanco y luego 50 l de la luciferasa de ensayo reactivo del kit de actividad de la luciferasa.
    3. Utilice un lector de placas para medir la luminiscencia de las celdas en todas las longitudes de onda del espectro mediante el ajuste de luminiscencia.
      NOTA: El protocolo puede estar en pausa congelando las celdas transducidas de forma estable.
  7. Manipule la expresión del gen candidato de la siguiente manera:
    1. Placa 6 x 105 células 4T1 etiquetadas del paso 2.6 en un plato de 60 mm en 4 ml de medios de crecimiento completos e incubar a 37oC, 5% CO2 durante la noche.
    2. Aspirar los medios de crecimiento de cada pocal y añadir 2 ml de medios de crecimiento completos que contengan 4 ml de bromuro de hexadimetrina de 8 mg/ml.
    3. Añadir 2 ml de sobrenadante viral desde el paso 1 a las células chapadas desde el paso 2.7.2 e incubar a 37oC, 5% CO2 durante la noche.
    4. Intente probar las células 4T1 con 500 ml de trippsina durante 2-5 minutos (las células deben enjuagar libremente la parte inferior del pozo). Transfiera todas las células a un plato de 10 cm en 10 ml de medios de selección (medios de crecimiento completos que contengan los antibióticos adecuados) que así se quemca la trippsina. Placa algunas células 4T1 de control no infectadas en el mismo medio de selección.
    5. Incubar las células a 37 oC, 5%co2 en medios de selección y dividir las células cuando sea necesario hasta que todas las células no infectadas estén muertas.
    6. Confirmar que la expresión del gen candidato se altera utilizando un enfoque estándar como western blot20 o qPCR21.
    7. Ensayo de luminiscencia y fluorescencia como en los pasos 2.5-2.6 para determinar cuán similares son en las células de control y derribo, ya que esto puede cambiar (ver Discusión).
      NOTA: El protocolo puede estar en pausa congelando las celdas transducidas de forma estable.

3. Optimización del diseño experimental in vivo

  1. Optimice el número de celda adecuado y la duración del experimento para la carga metastásica deseada de la siguiente manera.
    1. Expanda las células fluorescentes y bioluminiscentes 4T1 del paso 2.6 en medios de crecimiento completos para que el exceso de células esté disponible en el día deseado de inyección.
    2. Prepare las células para las inyecciones de vena de cola como se describe en el paso 4.2. Para determinar el número de celda óptimo para las inyecciones, resuspenda las células en varias concentraciones diferentes en 100 s de 1x PBS.
      NOTA: Recomendamos probar un rango de números de celda/ratón de 25.000 a 500.000.
    3. Mantenga las suspensiones celulares en hielo hasta la inyección.
    4. Inyectar cada dilución de células 4T1 del paso 3.1.2 en ratones 3-4 a través de la vena lateral de la cola descrita en el paso 4.3 (ver más abajo).
    5. Devuelva el ratón a su jaula y monitor durante 15 minutos para garantizar una recuperación completa. Se debe revisar a los ratones en busca de signos de dolor o angustia 3 veces por semana.
    6. Monitoree a los ratones para la formación y el crecimiento de metástasis durante 3-6 semanas (dependiendo de la línea celular y de la tensión del ratón) utilizando un dispositivo de imágenes animal vivo in vivo (ver pasos 5 y 6).
      1. Euthanizar ratones 3-6 semanas después de la inyección de la vena de cola de acuerdo con las pautas institucionales estándar.
      2. Prepare los pulmones y evalúe el tamaño y el número de metástasis descritos en el paso 7.
      3. Elija el período de tiempo adecuado para que las metástasis crezcan para la carga metastásica deseada (ver discusión).

4. Inyección de vena de cola de células cancerosas etiquetadas

NOTA: El paso 4.2.4 se ha optimizado para células 4T1 que crecen en ratones singéricos de BALB/c. Si se utilizan otras líneas celulares cancerosas y cepas de ratón, primero se debe optimizar el número de células inyectadas y la longitud del ensayo.

  1. Expanda las líneas celulares 4T1 generadas en el paso 2 en dos platos de 15 cm en medios de crecimiento completos para que el exceso de células estén disponibles el día de la inyección.
  2. Prepare las células para la inyección de la vena de cola de la siguiente manera:
    1. Aspirar el medio y enjuagar las placas celulares con 1x PBS.
    2. Trippsinizar las células con 5 ml de tripsina por placa de 15 cm durante 2-5 minutos (las células deben enjuagar libremente la parte inferior del pozo). Transfiera todas las células a un tubo cónico. Lave las células restantes del plato de cultivo de tejido con suficientes medios de crecimiento completos para saciar la trippsina y agregar el lavado al mismo tubo cónico.
    3. Cuente las celdas usando un contador de celdas automatizado para determinar el número de celda total.
    4. Centrifugar las células a 122 x g durante 3 minutos, aspirar el sobrenadante, y resuspender las células en 1x PBS a la concentración deseada. Aquí, 2.5 x 104 células se inyectan en cada ratón en 100 l de PBS, por lo que las células resuspend a 2.5 x 105 células/ml. Mantenga las suspensiones celulares en hielo hasta la inyección.
      NOTA: es importante limitar la cantidad de tiempo entre la trippsinización de las células y la inyección de la vena de la cola a aproximadamente 1 hora.
  3. Inyectar células 4T1 del paso 4.2.5 en ratones a través de la vena lateral de la cola de la siguiente manera:
    1. Trabajando en una capucha en la instalación animal, mezcle suavemente pero completamente las células invirtiendo el tubo o usando una jeringa de 1 ml para asegurarse de que se resuspenden uniformemente. Asegúrese siempre de que las células se resuspenden antes de cargar la jeringa.
    2. Cargue una jeringa Luer-lock de 1 ml con suspensión celular y expulse el exceso de burbujas de aire. Coloque una aguja de calibre 30 de pulgada y media en la jeringa con el bisel hacia arriba y expulse las burbujas de aire.
    3. Coloque suavemente el ratón en un restrainer de roedores.
    4. Las venas laterales de la cola deben ser visibles y dilatadas. Si no es así, pellizca suavemente la base de la cola y sumerge la cola en agua tibia del grifo para dilatar las venas.
      NOTA: La dilatación de las venas también se puede lograr colocando la jaula del ratón debajo de una lámpara de calentamiento y/o encima de una almohadilla de calentamiento.
    5. Use una toallita con alcohol para limpiar la cola. Inserte la aguja en la vena de la cola, bisele hacia arriba e inyecte 100 ml de suspensión celular.
      NOTA: Si la aguja se inserta correctamente en la vena, debe deslizarse fácilmente ligeramente hacia adelante y hacia atrás, y no debe haber resistencia cuando se empuja el émbolo. Las inyecciones exitosas también deben dar lugar a un "flush" en el que el color azul de la vena se vuelve blanco durante unos segundos después de la inyección.
  4. Retire lentamente la aguja y con una gasa estéril, aplique presión en el lugar de la inyección para detener cualquier sangrado.
  5. Devuelva el ratón a su jaula y monitor durante 15 minutos para garantizar una recuperación completa. Se debe revisar a los ratones en busca de signos de dolor o angustia 3 veces por semana.
  6. Monitoree a los ratones para la formación y el crecimiento de metástasis durante 3-6 semanas (dependiendo de la línea celular y de la tensión del ratón) utilizando un dispositivo de imágenes animal vivo in vivo (ver pasos 5 y 6).

5. Monitoreo de la carga metastásica por fluorescencia con un dispositivo de imagen animal vivo in vivo

NOTA: No ilumine animales para fluorescencia con señal luminiscente activa.

  1. Si solo se toma imágenes de bioluminiscencia, vaya al paso 6.
  2. Encienda el dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo.
  3. Configure el sistema de anestesia por imágenes de animales vivos in vivo de acuerdo con las directrices del fabricante para entregar entre 1,5% y 2% isoflurano a la cámara de anestesia y la cámara de imágenes.
  4. Anestetiza ratones con metástasis etiquetadas fluorescentemente del paso 4 colocándolos en una cámara de anestesia y entregando 1.5-2.5% isoflurano.
  5. Abra el software de imagen (consulte Tabla de materiales)e inicie sesión.
  6. Haga clic en el botón Inicializar y espere a que se inicialice el equipo.
  7. Cambie el Campo de visión a D.
    NOTA: El campo de visión C también se puede utilizar si se requiere una vista más cercana de un ratón, pero esto limita el número de ratones que se pueden crear imágenes simultáneamente.
  8. Una vez que el software ha indicado que la cámara ha alcanzado la temperatura adecuada, haga clic en el botón Asistente de imágenes, elija Fluorescencia y, a continuación, elija el par de filtros adecuado en el menú desplegable.
    NOTA: Si el fluoróforo que se está utilizando no es una opción, elija Entrada EX/EM y escriba la excitación y la emisión requeridas.
  9. Coloque el ratón en la cámara como se describe en el paso 3.2.4.
  10. Haga clic en Adquirir secuencia.
  11. Después de la toma de imágenes, devuelva el ratón a su jaula y monitoree durante 15 minutos para garantizar una recuperación completa.
  12. Repita los pasos 5.2 y 5.7-5.9 con al menos un ratón que no contenga metástasis. NOTA: Este ratón se utilizará para cuantificar y restar la señal de fondo durante el análisis (paso 8).
  13. Imagen 2-3 veces por semana durante el experimento.

6. Control de la carga metastásica por bioluminiscencia con un dispositivo de imagen animal vivo in vivo

  1. Encienda el dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo y configure el programa de la siguiente manera.
    1. Abra el software de imagen (consulte Tabla de materiales)e inicie sesión. Haga clic en el botón Inicializar y espere a que se inicialice el equipo. Cambie el Campo de visión a D.
      NOTA: El campo de visión C se puede utilizar para una vista más cercana a la imagen del cuerpo completo del ratón; sin embargo, esto limita el número de ratones que se pueden crear imágenes a la vez.
    2. Para el uso por primera vez, edite la configuración de la exposición de la siguiente manera: haga clic en Editar . Preferencias ? Adquisición de la Exposición automática y cambie el tiempo máximo de exposición del valor predeterminado de 60 segundos a 300 segundos y haga clic en OK.
      NOTA: No cambie ningún otro parámetro en la pestaña de exposición automática.
  2. Configure el sistema de anestesia de acuerdo con las directrices del fabricante para entregar entre 1,5% y 2% isoflurano a la cámara de anestesia y la cámara de imágenes.
  3. Asegúrese de que la cámara ha alcanzado la temperatura adecuada antes de continuar con el paso 6.4.
  4. Anestetiza los ratones que contienen metástasis del paso 4 colocándolos en una cámara de anestesia y entregando 1.5-2.5% de isoflurano.
  5. Prepare ratones para la imagen de bioluminiscencia de la siguiente manera.
    1. Cargue una jeringa de 1 ml con D-luciferina (30 mg/ml en D-PBS) y luego agregue una aguja de calibre 30 de pulgada a la jeringa y expulse burbujas de aire.
    2. Mida y registre la masa del ratón anestesiado.
    3. Sujete el ratón pellizcando el escote de su cuello usando el pulgar y los dedos del puntero y agarrando la cola entre el dedo meñique y la base de la mano. Invierta el ratón en un ángulo de 45 grados, con la cabeza apuntando hacia abajo.
    4. Inserte la aguja, el lado bisel hacia arriba, en el espacio intraperitoneal izquierdo (IP) del ratón. Confirme la entrada en el espacio IP devolviendo un volumen pequeño. No debe haber color en la base de la aguja al dibujar de nuevo en el espacio IP.
    5. Inyectar el volumen adecuado de D-luciferina para una dosis de 150 mg/kg.
    6. Inmediatamente después de la administración de D-luciferin, inicie un temporizador y coloque el ratón plano sobre su espalda en el dispositivo de imágenes con la nariz en el cono nasal y asegúrese de que se está administrando 1.5-2.5% isoflurano. Coloque divisores entre cada ratón si toma imágenes de varios ratones. Asegúrese de que los ratones estén lo más planos posible (es decir, no se inclinen hacia un lado).
    7. Haga clic en los cuadros Luminiscente y Fotografía y, a continuación, haga clic en Adquirir en el Panel de control de adquisición.
  6. Adquiera continuamente imágenes bioluminiscentes hasta que se alcance la señal máxima y utilice la imagen con la señal bioluminiscente máxima para el análisis.
  7. Después de la toma de imágenes, devuelva el ratón a su jaula y monitoree durante 15 minutos para garantizar una recuperación completa.
  8. Imagen 2-3 veces por semana durante el experimento.

7. Cuantificación del número y tamaño de metástasis

NOTA: El tiempo que se permite que crezcan las metástasis debe determinarse para cada línea celular y la tensión del ratón, y se verá influenciado por el número de células inyectadas.

  1. Eutanasia a los ratones de acuerdo con las directrices institucionales estándar.
  2. Aísle y retire los pulmones de cada ratón y enjuague en 1 x PBS para eliminar el exceso de sangre.
  3. Separe suavemente los pulmones en lóbulos.
  4. Adquiere imágenes de metástasis ZsGreen en los lóbulos a 10x en campo brillante y fluorescencia utilizando un estereoscopio fluorescente con un filtro de banda ancha GFP (excitación 470/40x).
    NOTA: Mantenga el mismo aumento y brillo para todas las muestras. La ampliación utilizada puede variar en función del tamaño, el número y el brillo de las metástasis, así como del campo de visión del microscopio utilizado.
  5. Utilice el software de análisis de imágenes para cuantificar el tamaño y el número de metástasis de las imágenes.
    NOTA: El protocolo para el análisis de imágenes depende del software y podría optimizarse con tumores del paso 3. Alternativamente, cuente el número de metástasis en cada pulmón manualmente usando el estereoscopio fluorescente. El protocolo se puede pausar aquí y el paso 8 se puede hacer en cualquier momento después de que se hayan recopilado todas las imágenes in vivo.

8. Procesamiento y análisis de los datos de las imágenes adquiridas con el dispositivo de imagen animal vivo in vivo

  1. Abra todos los archivos de imagen para cada ratón en el software de imagen.
    NOTA: Utilice la imagen con la señal bioluminiscente máxima para el análisis
  2. Asegúrese de que las unidades están en Radiance para datos bioluminiscentes y Eficiencia para datos fluorescentes haciendo clic en la flecha en la parte superior izquierda de la ventana de la imagen y cambiándola a la unidad adecuada.
  3. Utilice la imagen del último punto de tiempo para crear una región de interés (ROI) como se indica a continuación.
    1. Haga clic en Herramientas de ROI en la ventana Paleta de herramientas. Inserte un ROI haciendo clic en la flecha y seleccionando 1.
    2. Haga clic en el borde del ROI y muévalo sobre el pecho del ratón. Ajuste el tamaño del ROI para que cubra el pecho del ratón y no excluya la señal.
  4. Haga clic en medir ROI y copie o escriba el número sin procesar en una hoja de Excel.
    NOTA: Para los datos bioluminiscentes, seleccione el flujo total (fotones/segundo), que es la suma de todos los resplandores en el ROI. Dado que las metástasis no necesariamente crecen uniformemente, el flujo total se prefiere sobre el resplandor promedio porque mide la suma de la carga metastásica. Del mismo modo, en el caso de los datos fluorescentes, se debe utilizar el porcentaje de eficiencia total (luz de emisión (fotones/segundo)/luz de excitación (fotones/segundo)) en lugar de eficiencia media.
  5. Haga clic con el botón derecho en el archivo de imagen para copiar el ROI utilizado en el paso 8.3 y pegarlo en cada archivo de imagen.
    NOTA: Al cuantificar imágenes fluorescentes, cuantifique la misma región en un ratón que se ha introducido una imagen sin metástasis. Utilice esta señal como señal de fondo y reste de cada imagen de ratón fluorescente que contenga metástasis adquirida.
  6. Mueva los ROI pegados sobre la misma región seleccionada en el paso 8.3.4 para cada imagen y repita el paso 8.4.
  7. Trazar y analizar los datos sin procesar de la siguiente manera (véase el Cuadro Suplementario 2).
    1. Realice una transformación de registro10 de los datos sin procesar para cada ratón utilizando la fórmula indicada(Tabla suplementaria 2) y trace como en la Figura 2D y la Figura 4F. La transformación log10 linealiza la curva de crecimiento que tiende a ser geométrica y minimiza la heterocedasticidad.
    2. Mediante la regresión lineal, calcule la pendiente de la línea ajustada al registro10 datos transformados para cada ratón trazado en el paso 8.7.1 (Tabla suplementaria 2). Consulte la fórmula de la Tabla Suplementaria 2 para ajustar la línea y calcular la pendiente en un solo paso.
    3. Trazar los valores numéricos de las taludes como en la Figura 2E y la Figura 4G. Utilice la prueba t de un estudiante o la ANOVA unidireccional (para más de 2 grupos) en las pendientes para determinar la significancia estadística.

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Representative Results

Para demostrar el enfoque anterior, realizamos un experimento de prueba de concepto en el que un factor de replicación crítico, RPA3 fue derribado en una línea celular de carcinoma mamario de ratón metastásico (4T122). Mientras que el protocolo describe la etiquetado de las células con luciferasa y proteínas fluorescentes antes de la manipulación genética, utilizamos un enfoque modificado porque los vectores RNAi también entregan ZsGreen(Figura 2A). En primer lugar, las células 4T1 fueron transducidas de forma estable con una construcción lentiviral que codificaba la luciferasa de luciérnaga y la resistencia a la higromicina (pHAGE-Luciferase-IRES-Hygro). Después de la selección de higromicina, se realizó un ensayo de luciferasa para confirmar la expresión estable de la luciferasa de luciérnaga(Figura 2A). A continuación, las células 4T1-Luciferasa fueron transducidas de forma estable con vectores retrovirales que expresan ZsGreen y un shRNA basado en miR30, o un shRNA basado en miR30 mostrado previamente para apuntar eficazmente al ratón RPA316,23,24. Las células se inyectaron en los ratones a través de la vena de la cola lateral y la señal bioluminiscente in vivo se midió dos veces por semana para controlar la carga metastásica(Figura 2B,C). La señal transformada del registro10 para cada ratón se trazaba como carga metastásica a lo largo del tiempo(Figura 2D)y se determinaron las pendientes de cada parcela (Figura 2E). Estos datos muestran que la tasa de cambio en la carga metastásica se reduce significativamente con el derribo de RPA3 en comparación con las células de control. Aunque las diferencias son llamativas, estos datos por sí solos no nos permiten determinar si la carga metastásica reducida es el resultado de menos metástasis o debido a un crecimiento más lento de las metástasis. Por lo tanto, las metástasis etiquetadas con ZsGreen en los pulmones también se analizaron al final del experimento. Los ratones inyectados con células de derribo de RPA3 casi no tenían metástasis en los pulmones, mientras que los ratones de control tenían numerosas metástasis grandes(Figura 3). Además, las metástasis que se formaron a partir de las células de derribo DE RPA3 eran claramente más pequeñas que las metástasis 4T1 de control(Figura 3A). De acuerdo con nuestros recuentos manuales(Figura 3B),el software de análisis de imágenes contó significativamente menos metástasis en los ratones knockdown RPA3(Figura 3C). Además, la carga metastásica total en los pulmones (suma de las áreas de cada metástasis en milímetros) también se redujo drásticamente mediante el derribo de RPA3(Figura 3D). Por último, el tamaño de las metástasis individuales que se formaron en los ratones knockdown RPA3 eran generalmente mucho más pequeños que los de los ratones de control(Figura 3E). Además de las grandes metástasis en los ratones de control, observamos numerosas metástasis pequeñas también, pero no podemos determinar si se trata de células tumorales que sembraron el pulmón y no crecieron o si son células tumorales derramadas de una de las metástasis más grandes que resembraron el pulmón en una nueva ubicación(Figura 3E). Colectivamente estos datos muestran que rpA3 es necesario para la formación de metástasis por las células 4T1. Estos hallazgos se esperaban porque nuestro trabajo anterior mostró que las células derribadas de RPA3 habían reducido significativamente la capacidad de formar metástasis en los pulmones después de la inyección de vena de cola16. Sin embargo, este experimento demuestra cómo se puede utilizar imágenes de animales vivos y cuantificación fluorescente del número y tamaño de metástasis para determinar si los cambios en la carga metastásica se deben a diferencias en la colonización o crecimiento metastásico.

Para demostrar cómo este enfoque se puede utilizar para responder a una pregunta más biológicamente relevante, preguntamos si YAP TAZ y TAZ son necesarios para la colonización metastásica y el crecimiento posterior en este modelo singéneo de cáncer de mama. La expresión y la actividad de YAP o TAZ se incrementan en muchos cánceres en comparación con el tejido normal y esto es predictivo del mal resultado del paciente25,26,27,28,29. Además, varios estudios han implicado YAP, TAZ o TEADs, los socios críticos de enlace YAP/TAZ, en metástasis15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. Dados estos datos, utilizamos nuestro enfoque para probar si YAP y TAZ son necesarios para la formación y el crecimiento de la metástasis. Para ello, utilizamos un vector retroviral que expresa shRNAs basados en miR30 en tándem dirigido tanto a YAP como a TAZ. Como se muestra, este shRNA en tándem reduce eficazmente la expresión de proteínas YAP y TAZ y la actividad transcripcional en células 4T1(Figura 4A,B). Las células 4T1-Luciferasa fueron transducidas establemente con una versión zsGreen-expressing de este tándem YAP/TAZ shRNA vector o un control miR30-basado shRNA(Figura 4C) y luego se ingirió por inyecciones de vena de cola en ratones Singéricos BALB/c. Como se muestra en la Figura 4, la velocidad a la que aumentó la carga metastásica fue significativamente más rápida en los ratones inyectados con células de control en comparación con los ratones inyectados con células knockdown YAP/TAZ(Figura 4D-F). Significativamente menos metástasis formadas en los ratones inyectados con células de derribo YAP/TAZ en comparación con ratones con células de control ya sea contadas manualmente(Figura 5A,B)o utilizando el software de análisis de imágenes(Figura 5C). No sólo se formaron muchas más metástasis en los ratones de control, sino que eran generalmente más grandes(Figura 5E). Consistentemente, la carga metastásica en los pulmones (área de metástasis total en mm) también se redujo drásticamente por derribo YAP/TAZ(Figura 5D). Es importante tener en cuenta que cuando las metástasis son grandes y juntas, el software puede ser incapaz de diferenciar metástasis distintas. Este fue el caso de algunas metástasis en ratones de control (ratón 3 y ratón 7). Por lo tanto, es importante comprobar la salida del software de análisis de imágenes para asegurarse de que está midiendo con precisión el área de tumores individuales. Esta es también la razón por la que es importante optimizar el número de células que se inyectan y la duración del experimento. Colectivamente, estos datos muestran que YAP y TAZ están obligados a mantener la velocidad a la que aumenta la carga metastásica en un modelo murino singéneo de cáncer de mama metastásico y que esto se debe a la incapacidad de las metástasis para formarse y a la reducción del crecimiento de las pocas metástasis que se formaron.

Figure 1
Figura 1: Esquema del protocolo. Todos los virus necesarios se empaquetan primero en células HEK-293FT. Las células deseadas para el estudio se infectan simultáneamente con virus luciferasa y fluorescentes que expresan cada una un gen único de selección de fármacos de mamíferos. Las células infectadas se expanden en los medios apropiados que contienen ambos fármacos para seleccionar las células transducidas de forma estable que expresan tanto la luciferasa como la proteína florescente. La expresión de ambas etiquetas se confirma como se describe en el protocolo. Las células etiquetadas son entonces transducidas con un tercer virus una manipulación genética que contiene (miR30 shRNA) y un tercer gen único de selección de fármacos. Después de la selección con el tercer fármaco, las células se inyectan en los ratones a través de la vena lateral de la cola. La carga metastásica se controla en los ratones durante todo el experimento con un sistema de imágenes de animales vivos in vivo. Al final del experimento, los ratones son eutanasiados, y las imágenes de todos los pulmones se toman usando un microscopio de disección fluorescente, y luego se utilizan para medir el número y el tamaño de las metástasis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Las imágenes de animales vivos in vivo basadas en Luciferase muestran que la desconexión del cáncer de mama reduce la carga metastásica del cáncer de mama. (A) Esquema que muestra cómo se generaron las celdas para este estudio in vivo. Las células 4T1 fueron transducidas de forma estable con un lentivirus que codificaba la resistencia a la luciferasa y a la higromicina. Las células infectadas fueron seleccionadas con 600 g/ml de higromicina B durante una semana y luego se midió la actividad luciferasa en células parentales o 4T1-luciferasa utilizando un kit de reportero de luciferasa y un lector de placas (n.o 1 experimento con pozos de réplica promediado). Las células 4T1-Luciferasa se infectaron entonces con retrovirus que suministran ZsGreen y miR30 shRNAs dirigidos a mCherry (control) o mRPA3. La selección de la puromicina (2,5 g/ml) durante 3 días se utilizó para seleccionar una integración estable del virus. (B-E) 4T1-luciferasa células que expresan establemente ZsGreen y control (sh-mCherry) o mRPA3 (sh-mRPA3-431) shRNAs fueron inyectados en ratones e imágenes para bioluminiscencia en los días indicados como se describe en el protocolo. (B&C) Imágenes bioluminiscentes para un ratón representativo de cada grupo en el día indicado después de la inyección (D) Gráfica del registro10 señal de luciferasa transformada medida para cada ratón en el transcurso del experimento. (E) Trazado de dispersión con media (línea sólida) para las pendientes de cada ratón en D (n a 6 para el control sh y 8 para sh-mRPA3-431). La significación estadística se probó utilizando la prueba t de un estudiante; *p a 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La cuantificación de las metástasis fluorescentes revela que el derribo de RPA3 previene la colonización metastásica y el crecimiento posterior de las células de cáncer de mama. (A) Imágenes fluorescentes (izquierda) y de campo brillante (derecha) de lóbulos representativos de cada ratón inyectados en la Figura 2 21 días después de la inyección. Asteriscos (*) indicaron bronquios autofluorescentes verdes. (C-E) Se utilizó un software de análisis de imágenes (consulte Tabla de materiales)para identificar y medir objetos utilizando un umbral de intensidad de 25 a 100 y un umbral de tamaño de 0,01 mm2 hasta el infinito. (B&C) Gráfico de dispersión con la media (barra sólida) del número total de metástasis en los pulmones de cada ratón cuando se cuenta (B) por software de análisis de imágenes (C). (D) El área total (mm) del pulmón que se midió con el software de análisis de imágenes se traza como carga metastásica con la media indicada por una barra sólida. (E) El tamaño de cada metástasis se traza para cada ratón. Los ratones de control están indicados por los puntos azules y los ratones de derribo mRPA3 por los puntos rojos. Tenga en cuenta que la barra de escala se separa a 1 mm para facilitar la visualización del tamaño y el número de metástasis pequeñas (n a 6 sh-control, 8 sh-mRPA3-431). La significación estadística se probó utilizando la prueba t de un estudiante; p a 0,06; ** p a 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La desconexión de YAP/TAZ reduce la carga metastásica del cáncer de mama. (A&B) Las células 4T1 que expresaban de forma estable el control basado en miR30 (mCherry) o los shRNA YAP/TAZ en tándem (sh-mYAP1/mTAZ6) fueron analizados por el análisis de la mancha occidental (A) o transfigurado con una construcción de reportero de luciferasa YAP/TAZ-TEAD y ensayada para la actividad transcripcional YAP/TAZ-TEAD como se describió anteriormente15,16 (B) (n a 5 para el control y 4 para YAP1/TAZ6). (C) Esquema que muestra cómo se generaron las celdas para el estudio in vivo. Las células 4T1-Luciferasa se infectaron con retrovirus que suministran ZsGreen y un miR30 shRNA dirigido a mCherry (control) o miR30 shRNAs en tándem dirigidos tanto a mYAP como a mTAZ. Las células infectadas se seleccionaron en Puromicina (2,5 g/ml) durante 3 días. Las células 4T1-luciferasa expresan establemente ZsGreen y control (sh-mCherry) o YAP/TAZ (sh-mYAP1/mTAZ1) se inyectaron en ratones e imágenes para bioluminiscencia en los días inyectados. (D&E) Imágenes bioluminiscentes para un ratón representativo de cada grupo en el día indicado después de la inyección. (F) Gráfica del registro10 señal de luciferasa transformada medida para cada ratón en el transcurso del experimento. (G) Trazado de dispersión con Media (barra sólida) para las pendientes de cada ratón en F (n a 7 para el control sh y 8 para sh-mRPA3-431). La media se indica mediante una línea sólida. La significación estadística se probó utilizando la prueba t de un estudiante; p a 0,06; •, p a 0,01; ***. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Se requieren YAP y TAZ para que las células de cáncer de mama metastásicas colonicen los pulmones. (A) Imágenes fluorescentes (izquierda) y de campo brillante (derecha) de lóbulos representativos de cada ratón inyectados en la Figura 4 21 días después de la inyección. (C-E) Las imágenes se procesaron con el software de análisis de imágenes como se describe en la Figura 3. (B&C) Gráfico de dispersión con la media (barra sólida) del número total de metástasis en los pulmones de cada ratón cuando se cuenta manualmente (B) o mediante software de análisis de imágenes (C). (D) El área total de todas las metástasis (mm) se midió con el software de análisis de imágenes y se traza como carga metastásica con la media (barra sólida). (E) El tamaño de cada metástasis se traza para cada ratón. Los ratones de control están indicados por los puntos azules y los ratones knockdown sh-mYAP1/mTAZ6 por los puntos rojos. Tenga en cuenta que la barra de escala se separa a 1 mm para visualizar mejor el tamaño y el número de metástasis pequeñas (n a 7 sh-control, 8 sh-mYA1/mTAZ6). La media se indica mediante una línea sólida. La significación estadística se probó utilizando la prueba t de un estudiante; *p a 0,05, **, p a 0,01; **. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla Suplementaria 1: Tabla de vectores. Se enumeran todos los vectores utilizados y se describen nuevos vectores. Se utilizaron técnicas de biología molecular estándar para clonar nuevos vectores y se incluyen secuencias para el shRNA de 97 mer recién descrito. Las citas se refieren a: [1]53, [2]16, [3]54Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria 2: Ejemplo de procesamiento y análisis de datos de imágenes de animales vivos in vivo. Hoja de cálculo que muestra cómo los datos sin procesar de las imágenes de animales vivos in vivo se convierten para su análisis como se describe en los pasos 6.7 y 6.8. Los datos sin procesar adquiridos a partir de la imagen animal en vivo in vivo se transformaron mediante una transformación log10. La tasa de cambio en la carga metastásica se calcula para cada ratón calculando la pendiente generada por el registro10 datos transformados. Algunos ejemplos son el análisis de la luciferasa de la Figura 2. Las columnas están codificadas por colores para indicar qué datos se utilizaron para generar cada valor de pendiente y las fórmulas se incrustados en la hoja de cálculo. Al hacer doble clic en el pozo se revelará la fórmula utilizada para procesar los datos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Pasos críticos del método
Es fundamental optimizar el número de células inyectadas (paso 3) para una línea celular dada y la tensión del ratón, ya que esto puede influir en gran medida en el número de metástasis que se forman y la longitud del experimento. Si se inyectan demasiadas células o las metástasis crecen durante demasiado tiempo, las metástasis pueden ser difíciles de contar haciendo que los efectos de la manipulación genética sean difíciles de evaluar. Sin embargo, si se inyectan muy pocas células, se pueden formar pocas o ninguna metástasis. Por lo tanto, se debe realizar un experimento preliminar utilizando diferentes números de celdas para determinar el número óptimo y el tiempo que crecen las metástasis. Para asegurar un número constante de metástasis dentro de un grupo, es importante inyectar el mismo número de celdas viables en cada ratón. Dado que las células pueden asentarse tanto en el tubo como en la jeringa, las células deben resuspenderse suavemente antes de cargar la jeringa, y las suspensiones celulares no deben dejarse en la jeringa durante demasiado tiempo (paso 4.3.2). La viabilidad celular disminuye cuanto más tiempo las células están en suspensión, por lo que la cantidad de tiempo entre la trippsinización y la inyección de las células no debe ser más de una hora (paso 4.2.5). Las burbujas de aire y grandes grupos de células no se deben inyectar ya que pueden causar émbolos que matan al ratón. Además, la obtención de células a través de la aguja puede cizallarlas, por lo que la jeringa debe cargarse sin la aguja. Para confirmar que se inyectó un número relativamente igual de células, se pueden tomar imágenes animales vivos in vivo poco después de la inyección(Figura 2B, Figura 4D).

La cuantificación precisa y consistente de la señal bioluminiscente es importante y depende de las células que toman y metabolizan la D-luciferina. Esto puede ser influenciado por muchas variables incluyendo, la dosis de D-luciferina, el momento de la inyección, la temperatura corporal del ratón, cómo anestesiado es el ratón cuando se inyecta, y cómo se coloca un ratón en la cámara de anestesia antes de la toma de imágenes. Por lo tanto, es fundamental mantener estos pasos consistentes para todas las sesiones de ratones e imágenes. Usamos una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal constante del ratón mientras estaba en la cámara de anestesia. Dado que la señal debe penetrar en el tejido para la detección bioluminiscente y fluorescente, también es fundamental mantener la posición del ratón consistente para cada imagen (plana en su espalda funciona mejor para la toma de imágenes de los pulmones). La cuantificación de imágenes fluorescentes a partir de imágenes de animales vivos in vivo debe realizarse siempre utilizando las unidades de porcentaje de eficiencia, ya que esto permite una comparación adecuada entre las imágenes. Del mismo modo, el flujo total (fotones/segundo) siempre debe utilizarse al cuantificar imágenes bioluminiscentes. Para el análisis de la carga metastásica, la transformación log10 convierte la curva de crecimiento (antes de que se alcance la señal máxima) en una gráfica lineal, que era necesaria para el análisis de pendiente.

Modificaciones y solución de problemas del método
En el protocolo presentado una población de células es primero transducida de manera estable con una proteína fluorescente y luciferasa, luego esa población es transducida con un vector de control o un vector dirigido al gen de interés. Esto garantiza que ambas poblaciones celulares tengan una proteína fluorescente similar y una expresión de luciferasa. Sin embargo, como alternativa, se podrían utilizar vectores virales que simultáneamente entregan dos de estos componentes. De hecho, en los experimentos representativos utilizamos ZsGreen expresando vectores retrovirales para expresar los shRNA en células 4T1-luciferasa. Se recomienda que la expresión de la luciferasa y la proteína fluorescente se ensaye en todos los grupos celulares después de que se altere el gen de interés. Diferentes niveles de expresión entre grupos pueden complicar la interpretación de los datos, por lo que es mejor si los diferentes grupos tienen una expresión similar tanto de la proteína fluorescente como de la luciferasa. Además, los glóbulos rojos pueden ser autofluorescentes y pueden dificultar la visualización de las metástasis fluorescentes en los pulmones. Si este es el caso, los glóbulos rojos se pueden eliminar de los pulmones mediante perfusión de PBS durante la eutanasia para reducir el fondo autofluorescente (se deben seguir técnicas y pautas de eutanasia apropiadas). Aunque las diferencias entre los grupos de control y derribo en nuestros experimentos representativos son dramáticas, la variabilidad inherente de ratón a ratón que a menudo existe en ensayos de metástasis in vivo es evidente en los ratones de control(Figura 3B y Figura 5B). Cuando esta variabilidad es alta, puede dificultar determinar la magnitud del efecto de derribo. Un enfoque alternativo que podría utilizarse para reducir esta variabilidad es etiquetar las células de control y las células de derribo con proteínas fluorescentes distintas y enzimas luciferasas distintas y luego mezclar las dos poblaciones en igual número e inyectar la mezcla. Por ejemplo, las células de control que expresan establemente el tomate y la renilla luciferasa podrían mezclarse con células de derribo que expresen ZsGreen y luciferas a la luciérnaga. Los dispositivos de imágenes de animales vivos in vivos pueden distinguir la renilla luciferasa de la luciferasa de la luciérnaga, y el tomate de ZsGreen, por lo que la fluorescencia o la luminiscencia se pueden utilizar para cuantificar de forma independiente cada población celular. De hecho, se ha demostrado la imagen de doble luciferasa de células 4T1 que crecen como tumores primarios en animales vivos utilizando un dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo4. Sin embargo, es importante tener en cuenta que puede haber superposición en la señal fluorescente, por lo que debe incluirse en este enfoque un paso de desmezcla espectral (ver directrices de los fabricantes). Además, la renilla luciferasa y la luciferas de luciérnaga deben ser imágenadas por separado con un retardo de tiempo adecuado que permita que la primera señal de luciferasa ya no sea detectable antes de tomar la imagen de la segunda. El uso de fluoróforos distintos todavía permite cuantificar el número y el tamaño de metástasis en los pulmones16. Para probar la colonización metastásica y el crecimiento en otros órganos además de los pulmones este protocolo se puede modificar y utilizar para inyecciones intracardiacas y venas porta9,10.

Limitaciones del método
El uso de un dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo para adquirir carga metastásica en tiempo real junto con células cancerosas etiquetadas fluorescentes proporciona un método potente para probar la colonización metastásica y el crecimiento posterior; sin embargo, hay limitaciones de este enfoque. Algunos genes pueden ser necesarios para la proliferación celular innata en lugar de funciones específicas en la metástasis. Los ensayos de proliferación de células in vitro podrían realizarse antes del experimento in vivo para determinar si el gen interrumpe el crecimiento in vitro. Al tomar imágenes de un animal vivo, la señal bioluminiscente o fluorescente de las metástasis debe ser lo suficientemente fuerte como para pasar a través del tejido. Además, las propiedades ópticas (es decir, absorción y dispersión) del tejido también influyen en la detección55. La fuente de luz de excitación debe ser capaz de pasar a través del tejido para excitar células cancerosas etiquetadas fluorescentmente y la bioluminiscencia tiene un rango dinámico mayor que la fluorescencia. Por lo tanto, aunque la fluorescencia se puede utilizar para la toma de imágenes de animales vivos, se prefiere la bioluminiscencia para detectar la señal en los órganos internos. Además, algunas cepas de ratón inmunocompetentes pueden rechazar las células que expresan proteínas fluorescentes. De hecho, encontramos que las células que expresaban tomate, GFP o mCherry eran rechazadas o reguladas por el fluoróforo cuando crecían en ratones BALB/c (datos no mostrados y15). Sin embargo, como se muestra aquí(Figura 3 y Figura 5)y anteriormente15,16,las células etiquetadas con ZsGreen son detectables en estos ratones. En los casos en que la expresión de la proteína fluorescente se vuelva indetectable, otra forma de cuantificar la colonización metastásica relativa es utilizar qPCR para cuantificar el gen fluorescente u otro gen en el vector viral integrado15. Aunque un dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo le permite detectar cambios en la carga metastásica, no permite determinar si estos cambios se deben al tamaño o número de metástasis alterados. Tampoco proporciona información espacial sobre la ubicación de las metástasis. Además, la fuerza de la señal puede verse influenciada por la profundidad del tejido.

La importancia del método y las posibles aplicaciones futuras
Hay muchas maneras en que este enfoque se puede modificar para obtener más o diferente información. En este ensayo se podría utilizar una variedad de líneas celulares cancerosas, incluidas las líneas celulares de cáncer humano o los xenoinjertos derivados del paciente. También se podrían utilizar otros modelos de ratón, incluidos los ratones transgénicos o noqueadores diseñados para probar cómo la orientación de las proteínas fabricadas por las células estromales influye en la colonización metastásica y el crecimiento de las células cancerosas inyectadas. Si hay múltiples genes candidatos a probar, este enfoque puede ser multiplexado porque los dispositivos de imágenes animales vivos in vivopueden detectar y distinguir una amplia gama de fluoróforos. Esto reduciría el número de ratones necesarios y aumentaría el número de objetivos que se pueden probar. Las imágenes de animales vivos in vivos también se pueden combinar con rayos X o imágenes por TC9 para proporcionar mucha más información espacial sobre la ubicación de las metástasis. Por último, este enfoque se puede modificar para analizar pasos más específicos dentro de la cascada de colonización metastásica. Por ejemplo, los pasos involucrados en la sembración de células tumorales (supervivencia intravascular, extravasación y supervivencia posterior a la extravasación) se pueden distinguir cuantificando el número de células tumorales en los pulmones en varios momentos dentro de los primeros 3 días después de la inyección (como se hace aquí16). En este caso, los pulmones también se pueden teñir con marcadores vasculares e imágenes ex vivo para determinar el porcentaje de células cancerosas que se han extravasado en cada punto de tiempo56,57.

En resumen, el uso de imágenes de animales vivos in vivo sin vivo en tiempo real de células cancerosas fluorescentes y luminiscentes después de la inyección de vena de cola permite un análisis más detallado de cómo un gen o genes candidatos influye en la colonización metastásica y el crecimiento posterior. Este enfoque es más rápido y menos costoso que los modelos de ratón autóctonos y evita algunas de las advertencias de los modelos de metástasis espontánea. El uso de la fluorescencia y la luminiscencia como medio para detectar y cuantificar metástasis ofrece a los investigadores lecturas independientes que mejoran la confianza en los resultados y permiten flexibilidad en el diseño experimental. El uso de fluorescencia para cuantificar el tamaño y el número de metástasis evita la necesidad de un procesamiento y análisis histológico que consume mucho tiempo y potencialmente costoso, y permite un uso adicional de los tejidos enteros. El protocolo se puede utilizar con una serie de técnicas diferentes para manipular la expresión o función del gen candidato, como el ARNi, la expresión transgénica o la edición mediada por CRISPR/Cas, y también se puede utilizar para probar moléculas pequeñas, anticuerpos de bloqueo de funciones u otros compuestos terapéuticos potenciales. Como se mencionó anteriormente, se pueden hacer varias modificaciones simples para mejorar el ensayo y proporcionar información adicional. Este enfoque es una manera ideal de identificar y probar genes pro-metastásicos que tienen potencial terapéutico para el tratamiento del cáncer.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Emily Norton por ayudar con las infecciones virales y la lectura crítica del manuscrito. También damos las gracias a Ryan Kanai por ayudar con la adquisición de imágenes de los pulmones y Kate E. Tubbesing por la ayuda con el análisis de imágenes de las metástasis verdes en los pulmones. Agradecemos al personal de la instalación de investigación animal por su apoyo y por la ayuda en la preparación de este video. Este trabajo fue apoyado por una beca Susan G. Komen Career Catalyst que otorgó a J.M.L. (#CCR17477184).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE Gel For western blot
2.5% Trypsin Gibco 15090-046 Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipes For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks) Taconic BALB-F For tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regular VWR Ameresco 97061-416 For western blot
Cell lysis buffer Cell Signaling For collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm Celltreat 40-229749-CS For filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamber For euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1960 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline Himedia TS1006 For PBS
EDTA VWR 97061-406 Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin VWR 97068-085 Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imager Fujifilm For western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAb Cell Signaling 2118 For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo Scientific 31460 For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT Invitrogen R70007 Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucose GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure Grade VWR Ameresco 97064-810 For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Imagej Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF Membrane Biorad 1620177 For western blot
Isoflurane For mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) PerkinElmer CLS136340 For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) Leica Microsystems Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-Glutamine Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 Life technologies L3000008 For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program) PerkinElmer Software for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1 Karmanos Cancer Institute Aslakson, CJ et al.,1992 Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0 Fujifilm Software for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer) Gibco 31985-062 For packaging virus and transfection
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225 For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32957 Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32953 Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 45-H9268 For infection
Puromycin Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainer For restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running buffer For western blot
TAZ (V3886) Antibody Cell Signaling 4883 For western blot
TBST buffer For western blot
TC20 automated cell counter Bio-Rad For counting cells
Vectors See Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence Microscope VWR 89404-464 For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer buffer For western blot
XenoLight D-Luciferin K+ Salt PerkinElmer 122799 Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) Roche 6365787001 For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb Cell Signaling 14074 For western blot

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References

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