القياس الكمي للنض المعدني في الفصل اللوني لتقارب المعادن

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نقدم فحصا للقياس الكمي السهل للمعادن التي تم إدخالها علي العينات المعدة باستخدام الكروماتوغرافي اللوني لتقارب المعادن. يستخدم الأسلوب هيدروكسينفثول الأزرق كما مؤشر المعادن اللونية والاشعه فوق البنفسجية-فيس الطيفية ككاشف.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Swaim, C. M., Brittain, T. J., Marzolf, D. R., Kokhan, O. Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60690, doi:10.3791/60690 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تلوث الانزيمات مع المعادن ترشح من المعادن غير المعباه اللوني تقارب (ايماك) الاعمده يشكل مصدر قلق كبير ل، كما العديد من الصفات الشائعة دي وثلاثي التكافؤ المستخدمة في راتنجات ايماك لها تاثير مثبط علي الانزيمات. ومع ذلك ، فان مدي الرشح المعدني وتاثير المواد الكاشفة المختلفة والحد منها غير مفهومين إلى حد كبير بسبب عدم وجود بروتوكولات بسيطه وعمليه للقياس الكمي للمعادن تستخدم المعدات المتاحة عاده في مختبرات الكيمياء الحيوية. ولمعالجه هذه المشكلة ، قمنا بوضع بروتوكول لتحديد كميه التلوث المعدني بسرعة في العينات المعدة باستخدام IMAC كخطوه تنقيه. يستخدم الأسلوب هيدروكسينفثول الأزرق (HNB) كمؤشر اللونية للمحتوي الموجبة المعادن في محلول عينه والاشعه فوق البنفسجية-فيس الطيفي كوسيلة لتحديد كميه المعادن الحالية, في نطاق نانومولار, استنادا إلى التغيير في الطيف HNB في 647 nm. في حين تم تحديد المحتوي المعدني في الحل تاريخيا باستخدام الطيفية الامتصاص الذري أو تقنيات البلازما مقترنة بشكل محفز ، وهذه الأساليب تتطلب معدات متخصصة والتدريب خارج نطاق مختبر الكيمياء الحيوية النموذجية. وتوفر الطريقة المقترحة هنا طريقه بسيطه وسريعة لعلماء الكيمياء الحيوية لتحديد المحتوي المعدني للعينات باستخدام المعدات والمعارف الموجودة دون التضحية بالدقة.

Introduction

منذ إنشائها من قبل Porath وزملاء العمل1، وقد تحولت اللونية تقارب المعادن (ايماك) وسيله للاختيار لفصل البروتينات بسرعة علي أساس قدرتها علي السندات مع الانتقال أيونات المعادن مثل الزنك2 +، Ni2 +، Cu2 +، وشارك2 +. هذا هو الأكثر شيوعا من خلال العلامات المهندسة بولي-histidine والآن واحده من تقنيات تنقيه الكروماتوغرافي الأكثر شيوعا لعزل البروتينات المؤتلف2. وقد وجد ايماك أيضا تطبيقات تتجاوز تنقيه البروتين المؤتلف كوسيلة لعزل الكينولونات ، التتراسيكلين ، امينونوغليكوسيدس ، الماكروليدات ، و β-اكتام لتحليل عينه الغذاء3 وكخطوه في تحديد علامات البروتين مصل الدم لسرطان الكبد والبنكرياس4،5. ليس من المستغرب, ايماك أصبح أيضا وسيله للاختيار لعزل عدد من الانزيمات طاقة الاصليه6,7,8,9,10. ومع ذلك ، فان التنفيذ الناجح لأساليب التنقية هذه للدراسات علي البروتينات الحيوية النشطة انزيمي يعتمد علي وجود مستويات تافه من الصفائح المعدنية التي يالم من مصفوفة العمود إلى الشطف وقد عرفت الكاتيونات المعادن ثنائي التكافؤ المستخدمة عاده في ايماك الاهميه البيولوجية باثولوجيك ، حتى في تركيزات منخفضه11،12. التاثير الفسيولوجي لهذه المعادن هو الأكثر وضوحا في النظم الحيوية ، حيث يمكن ان تكون مميته كمثبطات التنفس الخلوي أو التمثيل الضوئي13،14،15. وهناك مسائل مماثله لا مفر منها بالنسبة لغالبيه فئات البروتين حيث يمكن ان تتداخل معادن الملوثات المتبقية مع الوظائف البيولوجية للبروتين أو توصيفها بالتقنيات البيوكيميائية والبيوفيزيائية.

في حين ان مستويات التلوث المعدني في ظل الظروف المؤكسدة واستخدام ايميدازول كالتملص هي عاده منخفضه16، عزل البروتين التي أجريت في وجود عوامل الحد السيستين (dtt ، β-mercaptoethanol ، الخ) أو مع البخاخات اقوي مثل حامض17،18 أو حمض ايثيلليندياميتاتاتاستيك (أدتا) يؤدي إلى مستويات اعلي بكثير من تلوث المعادن19،20. المثل ، نظرا لان الأيونات المعدنية في راتنجات IMAC كثيرا ما تنسقها المجموعات الكربوكسيليه ، فان الشوائب البروتينية التي تتم في ظل الظروف الحمضية من المرجح ان يكون لها مستويات اعلي بكثير من التلوث المعدني. ويمكن تقييم المحتوي المعدني في الحلول باستخدام القياس الطيفي للامتصاص الذري (العاص) والبلازما المقترنة بالحث علي الطيف الكتلي (برنامج المقارنات الدولية) وصولا إلى حد الكشف في نطاق ppb-ppt21،22،23،24. ولسوء الحظ ، فان البرنامج والبرنامج ليسا وسيلتين واقعيتين للكشف في مختبر الكيمياء الحيوية التقليدية لان هذه الأساليب تتطلب الحصول علي المعدات المتخصصة والتدريب.

العمل السابق من قبل بريتن25,26 التحقيق في استخدام هيدروكسينفثول الأزرق (hnb) كوسيلة لتحديد وجود المعادن الانتقالية في الحل. ومع ذلك ، كانت هناك تناقضات داخلية عديده في البيانات20 ولم تقدم تلك الاعمال بروتوكولا ملائما. الدراسات التي قام بها Temel et al.27 و فيريرا وآخرون28 الموسعة علي العمل البرية مع hnb كمؤشر المعادن المحتملة. ومع ذلك ، وضعت Temel بروتوكول الذي يجعل من استخدام العاص لتحليل العينة ، وذلك باستخدام HNB فقط كعامل مخلبيه. وقد استخدمت دراسة فيريرا التغيير في أطياف الامتصاص HNB في 563 نانومتر ، وهي منطقه من أطياف الصبغة الحرة HNB التي تتداخل بشكل كبير مع أطياف المجمعات المعدنية HNB في الأس الهيدروجيني 5.7 ، مما يجعل حساسية الفحص منخفضه إلى حد ما ، فضلا عن الناتجة في ضعف نسبيا تقارب ربط المعادن20. لمعالجه القضايا في المختبر الخاص بنا مع Ni2 + الرشح من ايماك ، قمنا بتوسيع العمل الذي قام به البرية25،26 و ferreria28 لتطوير اختبار سهله قادره علي الكشف عن مستويات نانومولار العديد من المعادن الانتقالية. وأظهرنا ان HNB يربط النيكل وغيرها من المشتركة للمعادن ايماك مع التقارب النانومولار ملزمه وشكل مجمع 1:1 علي مجموعه واسعه من القيم pH20. ويستند الفحص المذكور هنا إلى هذه النتائج ويستخدم التغيرات الماصة في طيف HNB في 647 نانومتر للقياس الكمي للمعادن. ويمكن اجراء الفحص في نطاق الحموضة الفسيولوجية باستخدام المخازن المؤقتة المشتركة والاجهزه الموجودة في مختبر الكيمياء الحيوية النموذجية باستخدام الكشف عن ألوان والكمية من المعادن صبغ المجمعات والتغيير المرتبطة بها في الامتصاص من صبغ الحرة عندما يربط إلى المعدن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-اعداد مكون المقايسة

  1. تحديد كسور اللوني ليتم التهاوي باستخدام الامتصاص البصرية في 280 نانومتر أو الطرق البديلة لتحديد كميه البروتين للتعرف علي البروتين المخصب الكسور.
    ملاحظه: لهذا العمل ، استخدمنا صفيف الصمام الثنائي UV-فيس الطيف الطيفي. لزيادة الانتاجيه ، يمكن استخدام قارئ لوحه قادره علي قياس امتصاص الاشعه فوق البنفسجية-فيس.
  2. اعداد مكونات الفحص اللازمة
    1. اعداد أو الحصول علي 10-100 mM المخزن المؤقت ("نموذج المخزن المؤقت") مع درجه الحموضة بين 7 و 12.
      ملاحظه: المخازن الحيوية البيوكيميائية الشائعة مثل تريس ، HEPES ، MOPS ، والفوسفات في درجه الحموضة المحايدة أو الاساسيه كلها مقبوله لفحص. ويمكن استخدام tricine و حامض ولكن سوف تتطلب منحنيات المعايرة لأنها علي حد سواء مخلب الأيونات المعدنية إلى حد كبير. ويرد مثال لمعايره الدين في المرجع20.
    2. اعداد 12 ٪ ث/الخامس (20-اضعاف المركزة) حل من تشتت هيدروكسينفثول الأزرق (HNB) في المخزن المؤقت عينه باستخدام 120 ملغ من كاشف HNB لكل ملليلتر من محلول الأسهم أعدت.
      تحذير: يمكن ان يسبب تعرض HNB للعين ضررا وتهيجا خطيرين. يجب استخدام حماية العين عند التعامل مع HNB ويجب غسل اليدين جيدا بعد المناولة.
      ملاحظه: يتم بيع HNB كتشتت علي KCl من قبل الموردين الرئيسيين للكواشف العلمية. علي هذا النحو ، فان التركيز الفعلي في الحل تختلف من المصنوعات المختلفة ، ودفعات ، وحيث في الزجاجة يتم أخذ تشتت HNB من. من الناحية المثالية ، والامتصاص بين 0.5-0.8 في 647 نانومتر بعد تخفيف 20 اضعاف المخزون ينبغي ان يتحقق.

2. اعداد العينات والقياس

  1. اعداد مقياس الطيف الطيفي لجمع البيانات
    1. تشغيل وتسخين الاشعه فوق البنفسجية-فيس الطيفي. تعيين مقياس الطيف لجمع البيانات في 647 نانومتر.
      ملاحظه: إذا كان المقياس الطيفي يسمح ، بالاضافه إلى ذلك جمع البيانات في 850 نانومتر ، أو بعض الطول الموجي الأخرى دون تغييرات كبيره ذات الصلة بأطياف صبغ المعادن وصبغ ، لاستخدامها لتصحيح خط الأساس.
    2. فارغه مقياس الطيف باستخدام المخزن المؤقت نموذج.
      ملاحظه: يمكن استخدام الكوارتز أو البلاستيك cuvettes القابل للتصرف. ويفضل الكوارتز cuvettes للتحليل الكمي لأنها سوف تسمح بدقه اعلي ودقه أكثر من البلاستيك cuvettes القابل للتصرف. ومع ذلك ، البلاستيك cuvettes كتله ضوء الاشعه فوق البنفسجية ، والتي قد تكون موجودة في الحزم قياس بعض الصمام الثنائي صفيف الطيف الطيفي. التعرض ل HNB للضوء الاشعه فوق البنفسجية المكثفة يسبب تدهور الصبغة ملحوظ وانخفاض الامتصاص بطيئه غير المرغوب فيها التي يمكن الخلط بينها وبين المعادن بطيئه ملزمه (علي سبيل المثال ، انظر الشكل 1 في دعم المعلومات من المرجع 20).
  2. اعداد وقياس امتصاص السيطرة
    1. اعداد حل التحكم التي تحتوي علي 50 μL من الأسهم HNB لكل ملليلتر من حجم الفحص الكلي. لضمان المزج الجيد لجميع العينات ، قم بماصه الكميات الصغيرة أولا ثم أضف المخزن المؤقت العينة متبوعا بالمزج بواسطة الأنابيب. وينبغي اعداد محلول HNB المخفف الطازجة ولكن يمكن تخزين الأسهم HNB في 4 درجه مئوية ومحمية من الضوء لأسابيع دون تدهور كبير.
    2. السماح للسيطرة علي احتضان لمده لا تقل عن 3 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
      ملاحظه: قد يكون وقت الحضانة الأطول ضروريا للعينات في درجه الحموضة القلوية أو في وجود الفوسفات بسبب تشكيل المجمعات المعدنية سيئه الذوبان مما ادي إلى تباطؤ تاخيرمن.
    3. قياس وتسجيل الامتصاص في 647 نانومتر لعينه التحكم.
  3. اعداد وقياس امتصاص العينات
    1. اعداد عينات الفحص عن طريق خلط 50 μL من الأسهم HNB مع 950 μL من كسور البروتين المخفف بشكل مناسب مع المخزن المؤقت عينه.
      ملاحظه: بما ان مستويات التلوث المعدنية المبلغ عنها في الأدبيات تختلف بعامل يزيد عن 1000 اعتمادا علي ظروف الامتصاص16،20، قد يكون من الضروري محاولة بعض التخفيفات من كسور البروتين المصابة بالمحلول العازل العينة (انظر الخطوة 1.2.1 أعلاه) لتحقيق تغييرات الماصة داخل النطاق الديناميكي للمقايسة.
      تحذير: من المعروف ان النيكل والمعادن الأخرى المستخدمة في IMAC مهيجه للبشرة ، يشتبه في كونها مسرطنه ، وقادره علي اتلاف الكلي والدم بعد التعرض لفترات طويلة. يجب استخدام القفازات وحماية العين عند التعامل مع عينات البروتين التي تم اعدادها باستخدام IMAC.
    2. السماح للعينه لاحتضان لمده لا تقل عن 3 دقيقه في درجه حرارة الغرفة وقياس الامتصاص في 647 نانومتر.
      ملاحظه: الخطوة المقيدة لمقايسة من حيث الوقت المستثمر هي خطوه الحضانة. تم جمع البيانات لهذه الورقة باستخدام كوفيت الكوارتز واحده التي تم غسلها بعناية بين كل عينه. حتى مع الوقت الغسيل المضافة واعداد الأسهم HNB, جمع البيانات ل 14 عينات والسيطرة استغرق ما يقرب من ساعة ونصف وعلي هذا النحو, يمكن الانتهاء من البروتوكول بسهوله دون الحاجة إلى انقطاع.
    3. كرر الخطوات 2-3-1 و 2-3-2 لكل كسر سيتم قياسه.
      ملاحظه: إذا كان سيتم استخدام عده cuvettes لعينات متعددة ، يجب ان يتم اعداد عينات بطريقه تسمح للمقارنة وقت الحضانة والتعرض للضوء المحيط.

3-القياس الكمي للمعادن

  1. تحديد تركيز المعدن في كل عينه
    1. العثور علي الفرق من كل امتصاص عينه في 647 nm من السيطرة HNB.
    2. تحديد تركيز المعادن (في μM) باستخدام الصيغة أدناه:

      Equation 1

      حيث DF هو عامل التخفيف لكسر المقايسة ، δabs647 هو تغيير الامتصاص في 647 nm ، 3.65 x10-2 يمثل معامل الانقراض من hnb (ε = 36.5 مم-1· سم-1 انظر المرجع20 لمزيد من التفاصيل) و l هو المسار البصري cuvette في سم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الطيف من HNB الحرة في درجه الحموضة محايده (الخط الأسود) والأطياف التمثيلية من الكسور المؤيدة ل Ni2 + من عزل MSP1E3D129 وترد في الشكل 2. سلسله اختبار ناجحه يجب ان تظهر انخفاض الامتصاص في 647 نانومتر مقارنه مع السيطرة HNB ، الذي يتوافق مع تشكيل المجمعات HNB في وجود المعادن الانتقال. سيشار إلى الفحص الفاشل بزيادة في الامتصاص عند 647 نانومتر. بدلا من ذلك ، فان أكثر من 90 ٪ انخفاض من الامتصاص الاولي في 647 نانومتر تشير إلى محتوي المعادن عاليه جدا والحاجة إلى فحص كسور أكثر المخفف. الفحص مع عدم وجود تغييرات الامتصاص من التحكم HNB الحرة لا يشير بالضرورة إلى فشل. فمن الممكن ان العينات تحتوي أساسا لا المعادن اللي. ومع ذلك ، وهذا أمر مستبعد وأي عينه تظهر اي تغيير الامتصاص يجب ان تكون مستعدة وتقاس مره أخرى ، ويفضل مع تخفيف اقل ، لتاكيد النتيجة. وفي المجموع ، يمكن ان يعزي معظم حالات الإخفاق في ملاحظه التغير المتوقع في الامتصاص إلى التنضيد غير السليم اثناء اعداد العينة ، أو عدم كفاية وقت الحضانة قبل القياس ، أو قيم الحموضة خارج نطاق 7-12 الموصي به.

لإثبات تطبيق هذا الفحص ، حللنا 2 له العلامة غشاء سقالة البروتينات MSP1E3D1 (معزولة كما هو 500 الأمر في دنيسوف ، وانا g. وآخرون29) ، MSP2N2 (معزولة كما هو الأمر في Grinkova ، y. v.30) ، ورواية 3-heme ج-نوع سيتوكروم GSU0105 من سولفوريدوسينس الملوية ، والتي تم ريكومبينانتلي التعبير عنها في e. كولاي لمحات التملص من Ni2 + من العمود الراتنج ني-NTA (انظر جدول المواد) والملفات الشخصية المرتبطة البروتين التملص لهذه البروتينات 3 وترد في الشكل 3. اي بروتين سيكون له النيكل فريدة من نوعها التي قد أو قد لا محاذاة مع الملف الشخصي البروتين التملص كما تقاس في 280 nm. علي سبيل المثال ، يبين الشكل 3ج ان البروتين و Ni2 + محتوي كل كسر لGSU0105 يتم تحويلها بشكل كبير من بعضها البعض بينما الكسور لMSP1E3D1 و MSP2N2 (الشكل 3ا ، ب) التي تحتوي علي معظم البروتين أيضا لديها اعلي Ni2 + المحتوي. ويوضح الشكل 3ا و ب أيضا ان المحتوي المعدني قد لا يوزع بالتساوي بين الكسور التي يتم جمعها باستخدام IMAC. اعتمادا علي التعبئة العمود ، وتكوين المخزن المؤقت التملص ، ومعدات الضخ والظروف ، فمن الممكن ان يكون الوت المعدنية في كسور متتالية في تركيزات مختلفه جدا مستقله عن محتوي البروتين من تلك الكسور.

Figure 1
الشكل 1: هيكل هيدروكسينفثول الأزرق (HNB). وفي نطاق الأس الهيدروجيني الوظيفي لعمليه الفحص ، تكون جميع مجموعات سلفونات المشبعة بالفلور وواحده من مجموعات الهيدروكسيل متاينه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: أطياف الامتصاص لكسور MSP1E3D1 مختاره و HNB. يتم عرض الامتصاص النسبي لثلاثه أجزاء من MSP1E3D1 (ألوان) مقارنه بعنصر تحكم HNB (خط سميك اسود). تم اعداد عينات في تريس 20 مم ، pH 7.5. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: Ni2 + القياس الكمي ل 3 ممثلين البروتينات العلامة. البروتين والنيكل2 + لمحات عن (ا) MSP1E3D1 ، (ب) MSP2N2 ، و (ج) GSU0105. تم تنفيذ البروتين الشطف باستخدام 300 mM ، 300 mM ، و 500 mM ايميدازول ، علي التوالي. Ni2 + تم اجراء القياس الكمي في تريس 20 مم ، pH 7.5. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الكشف اللوني للمعادن باستخدام HNB يوفر طريقه بسيطه لقياس درجه تلوث البروتين من قبل الأيونات المعدنية الانتقالية من راتنجات ايماك. كما انشانا في المرجع 20 ، Ni2 + يربط إلى hnb مع 1:1 القياس والتفكك ثابت للتغيرات المعقدة NI-hnb مع درجه الحموضة. ومع ذلك ، فان المركب Kd في النطاق الفرعي لجميع القيم الموصي بها (7-12) لدرجه الحموضة. من الناحية العملية ، وهذا يعني ان جميع Ni2 + في اي كسور اختبار سيربط hnb طالما لا الكواشف الأخرى قويه مخلبي ، مثل أدتا ، موجودة. كل هذه الخصائص معا يؤدي إلى الخطي ني2 + منحنيات المعايرة ، والتي لاحظنا بالتجربة. في ذلك التقرير20، ونحن أيضا ثبت ان التغيرات الطيفية بسبب تشكيل المعادن صبغ معقده ستكون هي نفسها علي مدي كامل 7-12 درجه الحموضة. الكشف محدود بواسطة قياسات الامتصاص الحد الأدنى الموثوق بها تغيير (10-4 -10-3 OD اعتمادا علي مقياس الطيف المستخدم) المقابلة ل 2.7-27 nM Ni2 +. النطاق العلوي محدود بمقدار الحاضر HNB. في عملنا ، ونحن نستخدم ~ 15 μM ، المقابلة ل ~ 0.6 OD في 647 nm. ومع ذلك ، يمكن زيادة هذا يصل إلى 50-80 μM HNB ، إذا لزم الأمر. عمليا ، لاحظنا Ni2 + مستويات التلوث في كسور الكروماتوغرافي مقارنه أو اعلي من الحد الأعلى إجبارنا علي جعل 10-إلى 50-اضعاف التخفيفات من الكسور السفلي. ومع ذلك ، يمكن لهذه الخطوة تخفيف اضافيه زيادة الأخطاء النسبية اثناء تحديد تركيز النيكل في كسر.

علي الرغم من اننا لم التحقيق في التفاصيل ، يبدو ان ملزم من المعادن الأخرى المستخدمة في راتنجات ايماك (Co ، الزنك ، Fe) لديها أيضا ثوابت التفكك الفرعية ميكرون وتقريبا اي تداخل بين صبغ وصبغ المعادن الامتصاص الأطياف في 647 nm ، ذروه الطول الموجي من الحرة HNB. ولذلك ، يمكن استخدام الربط المعدني الكامل لصبغه والتغيرات الطيفية المرتبطة بها لتحديد المعادن المطلقة علي مدي كامل الموصي بها نطاق الأس الهيدروجيني.

تنفيذ البروتوكول هو واضح ويعتمد بشكل كبير علي تقنيه المختبر السليم. المقاييس الطيفية الحديثة لها استجابات خطيه للغاية ونطاقات ديناميكية من 3-4 أوامر الحجم. التالي ، فان المكان الأكثر احتمالا لإدخال الخطا في الأسلوب هو من خلال خطوات التنضيد لاعداد العينة. كما هو موضح في هذا النص ، ويستند الأسلوب علي القياس الكمي للمحتوي المعدني علي أساس الفرق في ذروه الامتصاص HNB في 647 نانومتر من السيطرة HNB الحرة والعينات مع المعقدة HNB مع معدن. إذا لم يتم اتخاذ الرعاية لماصه بدقه الارصفه HNB أو احجام العازلة ، والمقارنة بين عنصر التحكم والامتصاص عينه في 647 نانومتر يصبح نقطه الخطا. المثل ، فان سوء وضع الأنابيب لكسور البروتين لاعداد العينة يمكن ان يحرف تركيز المعدن المتصور في كسر. ويوصي بان يتم ، بسبب حساسية الفحص ، معايره اي ماصات تستخدم في التحليلات التي يلزم فيها القياس الكمي الدقيق قبل الاستخدام.

القيود الاساسيه للأسلوب تاتي مع نطاق الأس الهيدروجيني وظيفية من الفحص ووجود وكلاء مخلبي قويه. ويستخدم أفضل المقايسة في نطاق الأس الهيدروجيني من 7-12. تحت درجه الحموضة 7 ، والطيف من التغيرات صبغ HNB الحرة ، وفقدان الذروة في 647 nm المستخدمة للقياس الكمي20. فوق pH 12 ، يبدا العديد من الهيدروكسيل المعدنية في الترسيب ، بما في ذلك المعادن الموجودة عاده في الراتنجات IMAC ، مما يجعل القياس الكمي إبطا واقل استنساخا. وفي حين ان الحد الأقصى القلوي لا يشكل مشكله كبيره لان إجراءات التنقية نادرا ما تستدعي مثل هذه الدرجة العالية من الحموضة ، فان الحد الأدنى الحمضي هو أكثر عرضه لان يكون عاملا مقيدا. منذ حدود الكشف عن Ni2 + وغيرها من المعادن الانتقالية هي تقريبا 1000 اضعاف مستويات التلوث المعدنية المبينة أعلاه (الشكل 3) ، يمكن التحايل علي حد الأس الهيدروجيني منخفض لفحص عن طريق تخفيف كسور البروتين الحمضية في المخازن المؤقتة مع قيم الحموضة محايده وقدره التخزين المؤقت عاليه بما بدلا من ذلك ، يمكن تعديل درجه الحموضة من الكسور تحليلها أو الحل الأسهم HNB يمكن ان يكون أكثر بقوة مخزنه للحفاظ علي pH المطلوب بعد الاختلاط.

إذا كان اجراء العزل للبروتين المنقي يتطلب استخدام الكواشف مع خصائص معدنيه معروفه أو مشتبه فيها لنقل المعادن ، سيكون من الضروري تعديل الطريقة للسماح بالتحديد الكمي المناسب للمعادن المخففة. ومن الضروري ان يكون المنحني القياسي معدا باستخدام عامل أزاله المعدن المستخدم لامتصاص البروتين والتركيزات المعروفة لمعايير المعادن لتحديد كميات تركيز المعدن المخفف بدقه في وجوده. ومن الامثله علي القياس الكمي للمعادن في وجود الطعام الموجود في كوشان & مارزولف20.

ولا يزال القياس الكمي الدقيق للمعادن في العينات البيولوجية يعتمد إلى حد كبير علي استخدام التقنيات التحليلية والاجهزه التي لا تزال خارج نطاق الكيمياء الحيوية النموذجية31،32. وقد وصفت bonta et al. اعداد بسيطه من العينات البيولوجية علي ورقه فلتر مشتركه للتحليل من قبل برنامج المقارنات الكيميائية-MS ، ومع ذلك ، طريقتهم لا تزال تعتمد علي الاجهزه غير القياسية لكيمياء حيوية31. وتسمح الطريقة التي نقوم بوصفها بقياس المحتوي المعدني في العينة الذي سيؤخذ دون تدريب إضافي علي الاجهزه الجديدة أو الاستعانة بمصادر خارجيه للآخرين. وقد وضعت بروتوكولات مماثله للقياس اللوني لتحليل المعادن في العينات البيولوجية33. ومع ذلك ، تعتمد الطريقة الموصوفة من قبل شيمال وآخرون33 علي فحص مضان باستخدام مسبار فلوري غير متوفر تجاريا والذي يعطي حدا اعلي من الكشف عن ذلك في هذه الورقة. النظر إلى السهولة النسبية التي يمكن بها تنفيذ الطريقة الموصوفة والاهتمام الأخير بتطوير بروتوكولات الكشف عن المعادن المحمولة للعينات المائية34،35، فانه يمكن تكييفها بسهوله للاختبار الميداني لعينات المياه. وكاختبار محمول ، يمكن تعديل طريقتنا للاستخدام مع مقياس طيفي محمول للقياس الكمي أو كتدبير نوعي لتحديد العينات لمزيد من التحليل في موقع اختبار ثابت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

وتستند هذه المواد علي العمل الذي تدعمه المؤسسة الوطنية للعلوم تحت المنحة MCB-1817448 وجائزه من توماس ف. وكيت ميلر جيفريس التذكارية الاستئماني ، بنك أمريكا ، الوصي والمانحة المحددة هازل ثورب كارمان وجورج غاي كارمان الاستئماني.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2xYT broth Fisher Scientific BP9743-500 media for E.coli growth
HEPES, free acid BioBasic HB0264 alternative buffer
HisPur Ni-NTA resin Thermo Scientific 88222
Hydroxynaphthol blue disoidum salt Sigma-Aldrich 219916-5g
Imidazole Fisher Scientific O3196-500
Imidazole BioBasic IB0277
MOPS, free acid BioBasic MB0360 alternative buffer
Sodium chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium phosphate Fisher Scientific S369-500 alternative buffer
Tricine Gold Bio T870-100
Tris base Fisher Scientific BP152-500
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258, (5536), 598-599 (1975).
  2. Block, H., et al. Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
  3. Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs. Chromatographia. 72, (1/2), 127-131 (2010).
  4. Felix, K., et al. Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia. Life sciences. 88, (5-6), 218-225 (2011).
  5. Wu, C., et al. Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24, (1), 55-62 (2009).
  6. Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1276, (3), 171-175 (1996).
  7. Guergova-Kuras, M., et al. Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides. Protein Expression and Purification. 15, (3), 370-380 (1999).
  8. Mitchell, D. M., Gennis, R. B. Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography. FEBS Letters. 368, (1), 148-150 (1995).
  9. Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 274, (11), 7146-7152 (1999).
  10. Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 273, (43), 27953-27959 (1998).
  11. Louie, A. Y., Meade, T. J. Metal complexes as enzyme inhibitors. Chemical Reviews. 99, (9), 2711-2734 (1999).
  12. Tamás, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation. Biomolecules. 4, (1), 252-267 (2014).
  13. Gerencser, L., Maroti, P. Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues. Biochemistry. 40, (6), 1850-1860 (2001).
  14. Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1553, (3), 177-182 (2002).
  15. Link, T. A., von Jagow, G. Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group. Journal of Biological Chemistry. 270, (42), 25001-25006 (1995).
  16. Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Schäfer, F. Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy. Protein Expression and Purification. 57, (2), 244-254 (2008).
  17. Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding. Journal of Biological Chemistry. 285, (29), 22522-22531 (2010).
  18. Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies. Journal of Biological Chemistry. 285, (29), 22513-22521 (2010).
  19. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).
  20. Kokhan, O., Marzolf, D. R. Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue. Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).
  21. Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol. Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).
  22. Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B. Inorganic Chemical Biology. Gasser, G. (2014).
  23. Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS. Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).
  24. Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS. Microchemical Journal. 49, (2), 305-318 (1994).
  25. Brittain, H. G. Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes. Analytical Letters. 10, (13), 1105-1113 (1977).
  26. Brittain, H. G. Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue. Analytical Letters. 11, (4), 355-362 (1978).
  27. Temel, N. K., Sertakan, K., Gürkan, R. Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry. Biological Trace Element Research. 186, (2), 597-607 (2018).
  28. Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue. Microchimica Acta. 122, (1), 109-115 (1996).
  29. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size. Journal of the American Chemical Society. 126, (11), 3477-3487 (2004).
  30. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Engineering, Design and Selection. 23, (11), 843-848 (2010).
  31. Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples. Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).
  32. Olmedo, P., et al. Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry. Analytica Chimica Acta. 659, (1), 60-67 (2010).
  33. Shyamal, M., et al. Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature. ACS Sensors. 1, (6), 739-747 (2016).
  34. Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration. Micromachines. 8, (4), 127 (2017).
  35. Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water. Sensors and Actuators B: Chemical. 236, (C), 35-43 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics