Dépistage et identification des suppresseurs de silençage de l'ARN des agents d'effets sécrétés des pathogènes végétaux

Genetics

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Summary

Ici, nous présentons une méthode de criblage modifiée qui peut être employée intensivement pour examiner rapidement des suppresseurs de silençage d'ARN dans les agents pathogènes de plante.

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Shi, J., Jia, Y., Fang, D., He, S., Zhang, P., Guo, Y., Qiao, Y. Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens. J. Vis. Exp. (156), e60697, doi:10.3791/60697 (2020).

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Abstract

Le silençage de l'ARN est un mécanisme de régulation génétique spécifique à la séquence conservé par évolution chez les eucaryotes. Plusieurs pathogènes végétaux ont développé des protéines avec la capacité d'inhiber la voie de silençage de l'ARN de la plante hôte. À la différence des protéines d'effecteur de virus, seulement plusieurs protéines d'effectrice sécrétées ont montré la capacité de supprimer le silençage d'ARN dans les agents pathogènes bactériens, de oomycète, et de fongique, et les fonctions moléculaires de la plupart des effecteurs restent largement inconnues. Ici, nous décrivons en détail une version légèrement modifiée de l'assay de co-infiltration qui pourrait servir de méthode générale pour observer le silençage d'ARN et pour caractériser des protéines effectorssées par des pathogènes végétaux. Les étapes clés de l'approche sont le choix des feuilles saines et entièrement développées, l'ajustement de la culture bactérienne à la densité optique appropriée (OD) à 600 nm, et l'observation de la fluorescence des protéines fluorescentes vertes (GFP) au moment optimal sur l'infiltré pour éviter d'omettre les effecteurs ayant une faible activité de suppression. Ce protocole amélioré contribuera à un dépistage rapide, précis et étendu des suppresseurs de silençage de l'ARN et servira d'excellent point de départ pour étudier les fonctions moléculaires de ces protéines.

Introduction

Au cours des deux dernières décennies, l'accélération du séquençage du génome des micro-organismes qui causent les maladies des plantes a conduit à un écart de connaissances de plus en plus important entre l'information sur la séquence et les fonctions biologiques des protéines codées1. Parmi les molécules révélées par les projets de séquençage sont des molécules effectrices qui suppriment l'immunité innée et facilitent la colonisation de l'hôte; ces facteurs sont sécrétés par des agents pathogènes végétaux destructeurs, y compris les bactéries, les nématodes et les microbes filamenteux. Pour répondre à ces menaces, les plantes hôtes ont développé de nouveaux récepteurs qui reconnaissent ces effecteurs, permettant la restauration de la réponse immunitaire. Par conséquent, les effecteurs sont soumis à diverses pressions sélectives, ce qui conduit à la diversification des répertoires effecteurs parmi les lignées pathogènes2. Ces dernières années, il a été démontré que les effecteurs putatifs des pathogènes végétaux perturbent l'immunité innée des plantes en empêchant les processus cellulaires de l'hôte de bénéficier aux microbes de diverses façons, y compris la dysrégulation des voies de signalisation, la transcription, le transport intracellulaire, la stabilité du cytosquelette, le trafic de vésicules et le silençage de l'ARN3,4,5. Cependant, la grande majorité des effecteurs pathogènes, en particulier ceux des agents pathogènes filamenteux, sont restés énigmatiques.

Le silençage de l'ARN est une machinerie d'inactivation génique médiée par l'homologie qui est conservée chez les eucaryotes. Le processus est déclenché par de longs ARN à double brin (dsRNA) et cible l'ARN homologue à brin unique (ARS) d'une manière spécifique à la séquence, et il manipule un large éventail de processus biologiques, y compris la défense antivirale6. Pour surmonter les réponses immunitaires innées de l'hôte, certains virus ont évolué pour compenser le silençage de l'ARN, y compris la capacité de se répliquer à l'intérieur des compartiments intracellulaires ou de s'échapper du signal réorganisé au silençage. Néanmoins, la stratégie la plus générale par laquelle les virus protègent leurs génomes contre la perte dépendante du silençage de l'ARN de la fonction génique est d'encoder des protéines spécifiques qui suppriment le silençage de l'ARN7,8. Plusieurs approches mécanistes différentes ont été établies pour dépister et caractériser les suppresseurs viraux du silençage de l'ARN (RsS), y compris la co-infiltration des cultures tumefaciens Agrobacterium, les plantes transgéniques exprimant les suppresseurs putatifs, la greffe et la culture cellulaire9,10,11,12,13.

Chacun de ces essais présente des avantages et des inconvénients et identifie les RsV de façon distincte. L'une des approches les plus courantes est basée sur la co-infiltration de cultures individuelles A. tmuefaciens hébergeant la protéine virale potentielle et un gène reporter (protéine fluorescente typiquement verte [GFP]) sur les plantes Nicotiana benthamiana 16c exprimant constitutivement GFP sous le contrôle du virus de la mosaïque du chou-fleur 35S promoteur. En l'absence d'un suppresseur de silençage viral actif, le GFP est identifié comme exogène par les cellules hôtes et est réduit au silence dans les 3 jours suivant l'infiltration (dpi). En revanche, si la protéine virale possède une activité de suppression, le niveau d'expression du GFP reste stable au-delà de 3 à 9 dpi9. Ce test de co-infiltration est simple et rapide; cependant, il n'est ni très stable ni sensible. Néanmoins, l'assay a identifié de nombreux RsV avec diverses séquences et structures de protéines dans de nombreux virus de l'ARN7,8.

Récemment, plusieurs protéines effectrices qui peuvent inhiber l'activité de silençage de l'ARN cellulaire ont été caractérisées par des pathogènes bactériens, oomycètes et plantes fongiques14,15,16. Ces résultats impliquent que la suppression de silençage d'ARN est une stratégie commune pour faciliter l'infection qui est employée par des agents pathogènes dans la plupart des royaumes. En théorie, beaucoup, sinon tous, des effecteurs pourraient encoder suppresseurs de silençage d'ARN (RSSs); à ce jour, cependant, seuls quelques-uns ont été identifiés, principalement en raison de la pénurie de la stratégie de dépistage fiable et générale. En outre, les suppresseurs du silençage d'ARN n'ont pas été étudiés dans la grande majorité des pathogènes végétaux17.

Dans ce rapport, nous présentons un protocole optimisé et général pour identifier les effecteurs d'agents pathogènes végétaux qui peuvent supprimer le silençage local et systémique d'ARN utilisant l'analyse d'agro-infiltration. L'objectif principal de cette étude était de mettre l'accent sur les aspects clés du protocole et de décrire les étapes en détail, fournissant ainsi un test de dépistage qui convient à presque tous les effecteurs d'agents pathogènes végétaux.

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Protocol

REMARQUE : Toutes les étapes de la procédure doivent être effectuées à température ambiante (RT).

CAUTION: Déposer tous les supports contenant des microbes pathogènes, ainsi que les plantes et les tissus végétaux utilisés dans l'analyse, dans les conteneurs de déchets appropriés et autoclave avant de jeter.

1. Préparation de constructions plasmides contenant des effecteurs putatifs

  1. Sélectionnez les effecteurs sécrétés putatifs qui sont fortement exprimés pendant l'infection, tel que déterminé par le séquençage d'ARN (ARN-Seq), et plus loin par la technique quantitative de PCR en temps réel (qRT-PCR).
  2. Déterminer le site de clivage peptide de signal de chaque effecteur à l'aide d'un outil logiciel tel que SignalP18.
  3. Concevoir des amorces et effectuer PCR pour amplifier le gène codant l'effecteur d'intérêt à l'aide de polymérase d'ADN haute fidélité. Effectuer l'électrophorèse gel agarose pour vérifier le produit PCR, puis cloner l'amplicon dans Gateway entrée vector pQBV3 en utilisant le kit de clonage sans ligature (Tableau des matériaux), et par la suite dans le vecteur d'expression de destination pEG100 en utilisant la réaction de recombinaison LR19.
  4. Transformez le mélange de réaction LR en 100 oL de cellules E. coli compétentes (p. ex. TOP10, DH5MD), répandez les cellules bactériennes transformées sur le milieu d'agar Luria-Bertani (LB) complété par une kanamycine de 50 g/mL, et incubez à 37 oC pendant 16 à 20 h.
    REMARQUE : Les transformateurs positifs peuvent être identifiés par la colonie PCR20 et analysés plus en détail par minipréparation et séquençage plasmides.
  5. Introduire 50 à 100 ng de plasmides recombinants transportant des protéines effectrices dans 100 l de cellules A. tumefaciens chimiquement compétentes (p. ex. GV3101 ou C58C1), mélanger délicatement, puis congeler dans de l'azote liquide pendant 1 min. Dégeler les cellules dans un bain d'eau de 37 oC pendant 5 min.
  6. Ajouter 500 lde de bouillon LB et incuber à 30 oC pendant 4 à 6 h avec des secousses douces, puis transférer et étendre toutes les cellules d'agrobactéries sur le milieu de l'agar LB complétée s'ajouter à 50 g/mL de kanamycine et 50 g/mL de rifampicin à 30 oC pendant 2 jours.
    REMARQUE : Les clones positifs peuvent être vérifiés par la colonie PCR.
  7. Utilisez une seule colonie transformée pour des expériences d'agro-infiltration, sauf indication contraire.
    REMARQUE : Dans la présente recherche, aucun des gènes effecteurs testés ne contenait d'introns prédits; chacun des gènes a été directement amplifié à partir de l'ADN génomique d'un isolat phytophthora sojae. Un vecteur d'expression de plante Gateway sans aucune étiquette est recommandé, mais pas nécessaire.

2. Préparation des plantes N. benthamiana 16c

  1. Préparer des mélanges de sol en pot composés de (en volume) 50% de mousse de tourbe, 30% de perlite, et 20% de vermiculite, et autoclave à 120 oC pendant 20 min.
  2. Tremper les mélanges de sol autoclave avec la solution d'engrais végétaux (1 g/L) et les sous-emballer dans des pots plus petits (80 mm x 80 mm x 75 mm) stockés dans un plateau plus grand (540 mm x 285 mm x 60 mm).
  3. Semez une ou deux graines de N. benthamiana 16c sur la surface du sol de chaque pot. Couvrir le plateau d'un dôme en plastique et laisser germer les graines.
  4. Placer le plateau sous des chambres de croissance légères et à température contrôlée avec une température de 23 à 25 oC, une humidité relative de 50 à 60 % et une photopériode longue journée (14 h de lumière/10 h d'obscurité, avec un éclairage à 130 à 150 degrésE -2s-1).
  5. Enlevez le dôme en plastique après la germination des graines (3 à 4 jours) et laissez les semis pousser dans les mêmes conditions que pour l'étape de germination.
  6. Ajouter une quantité appropriée d'eau, en gardant le sol humide, mais sans trempage, tous les deux à trois jours; ajouter de l'engrais tous les 10 jours pour favoriser la croissance. Maintenir les plantes N. benthamiana 16c dans des conditions normales jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à l'emploi; à ce stade, la plante devrait avoir au moins cinq feuilles vraies entièrement développées et aucun bourgeon axillaire ou floral visible, et les feuilles devraient avoir un aspect vert sain).
  7. Utilisez des feuilles de N. benthamiana 16c pour les analyses de silençage de l'ARN locales et de jeunes plantes N. benthamiana 16c (10 à 14 jours) pour les analyses de silençage de l'ARN systémique.
    REMARQUE : Les conditions de croissance des installations et les installations varient d'un laboratoire à l'autre; choisir des feuilles saines, bien développées et entièrement élargies pour l'infiltration.

3. Préparation de la culture Agrobacterium pour l'infiltration

  1. Choisissez une colonie positive de la plaque LB et inoculez les cellules dans un tube de verre contenant 5 ml de lb-moyen complété par une kanamycine de 50 g/mL et une rifampicine de 50 g/mL. Cultivez les cellules à 30 oC en secouant à 200 tr/min pendant 24 à 48 h.
  2. Transférer 100 l de culture dans 5 ml de lb-moyen complété par les mêmes antibiotiques, 10 mM 2-(N-morpholino) d'acide éthanesulfonique (MES; pH 5,6) et 20 'M acetosyringone (AS). Cultivez des bactéries à 30 oC en secouant à 200 tr/min pendant 16 à 20 h.
  3. Centrifugeuses cellules à 4 000 x g pendant 10 min. Verser le supernatant et resuspendre la pastille dans 2 ml de 10 mM MgCl2 tampon.
  4. Répétez l'étape 3.3 pour assurer l'élimination complète des antibiotiques.
  5. Déterminer la densité de la culture Agrobacterium en mesurant la densité optique à 600 nm (OD600). Ajuster à un OD600 de 1,5 à 2,0 avec 10 mM de tampon MgCl2.
  6. Ajouter 10 mM MES (pH 5.6) et 150 'M AS aux cultures de suspension finale et incuber les cellules à RT pendant au moins 3 h sans trembler.
    REMARQUE: Ne laissez pas les cultures de suspension finale du jour au lendemain.

4. Co-infiltration N. benthamiana feuilles

  1. Mélanger des volumes égaux d'une culture Agrobacterium contenant 35S-GFP avec une culture Agrobacterium contenant 35S- concombre mosaïque virus suppresseur 2b (CMV2b), effecteur putatif, ou vecteur vide (EV).
  2. Infiltrer soigneusement et lentement les suspensions d'agrobacterium mixtes sur les côtés abaxiaux des feuilles de N. benthamiana 16c à l'aide d'une seringue sans aiguille de 1 ml.
  3. Retirez la suspension bactérienne restante des feuilles avec des essuie-glaces mous et encerclez les marges des patchs infiltrés avec un stylo de fabricant.
  4. Laissez les plantes infiltrées dans la chambre de croissance dans les mêmes conditions de croissance.
    REMARQUE : Pour des raisons de sécurité et de santé, des lunettes de protection et un masque doivent être portés pendant l'infiltration. Pour prévenir la contamination croisée, les gants doivent être changés ou stérilisés avec de l'éthanol entre les infiltrations. Normalement, au moins 1 ml de suspensions d'agrobacterium par feuille est nécessaire pour l'infiltration. Pour le silence systémique, au moins deux feuilles seront nécessaires pour l'infiltration.

5. Analyse d'imagerie GFP

  1. Détecter visuellement la fluorescence du GFP dans les feuilles nouvellement cultivées de plantes entières 2 semaines après l'infiltration (pour le silençage systémique de l'ARN) ou des plaques infiltrées de feuilles 3-4 dpi à l'aide d'une lampe ultraviolette à ondes longues (UV) sans prélèvement de feuilles.
  2. Photographie de plantes et/ou de feuilles détachées avec un appareil photo numérique équipé de filtres UV et jaunes.
    REMARQUE : Pour les essais de suppression locale de silence, enquêter sur les taches infiltrées des feuilles de N. benthamiana 16c, tandis que pour l'activité systémique de suppression de silence, enquêter sur les feuilles nouvellement cultivées. L'activité de suppression de silençage d'ARN peut varier selon les effecteurs individuels. Par conséquent, observez les taches ou les feuilles sur quelques jours à partir de 3 dpi. Utilisez cMV2b et EV comme contrôles positifs et négatifs, respectivement.

6. Analyse de tache nordique des niveaux d'ARNm de GFP dans les feuilles infiltrées

  1. Isolement de l'ARN total du tissu foliaire à l'aide du réactif d'isolement de l'ARN (Tableau des matériaux)
    1. Recueillir les tissus foliaires des patchs Infiltrés de N. benthamiana 16c à 4 x 7 dpi, pulvériser dans l'azote liquide en poudre fine, et transférer la poudre dans un tube stérile de 2 ml.
    2. Ajouter le réactif d'isolement de l'ARN (1 mL/100 mg de tissu) immédiatement au tube échantillonné dans une hotte, secouer vigoureusement pour homogénéner, et couver à RT pendant 5 min.
    3. Ajouter le chloroforme (200 l/1 mL de réagent d'isolement de l'ARN) à chaque tube d'un capot, secouer vigoureusement pendant 15 s et couver à RT pendant 5 min. Centrifuger l'homogénéisation à 12 000 x g pendant 15 min à 4 oC.
    4. Transférer le supernatant dans un nouveau tube sans RNase et jeter la pastille. Ajouter 0,7 volume d'isopropanol au supernatant, inverser doucement plusieurs fois, et incuber le mélange à RT pendant 10 min.
    5. Précipiter le granule d'ARN par centrifugation à 12 000 x g pendant 15 min à 4 oC.
    6. Jeter le supernatant, laver le granule avec 70% d'éthanol et sécher à l'air le granule dans une hotte. Dissoudre l'ARN dans l'eau traitée au pyrocarbonate de diethyl (DEPC) en coucubissant dans un bain d'eau de 65 oC pendant 10 à 20 min.
  2. Analyse de tache nordique du niveau d'ARNm de GFP dans les feuilles infiltrées
    1. Préparer un gel agarose dénaturant le formaldéhyde de 1,2 % dans un tampon de fonctionnement MOPS 1x.
    2. Mélanger l'ARN 1:1 avec le colorant de chargement d'ARN et la dénature par incubation à 65 oC pendant 10 min, refroidir immédiatement les échantillons dénaturés sur la glace pendant 1 min.
    3. Chargez les échantillons sur le gel et l'électrophorese à 100 V pendant 50 min jusqu'à ce que l'ARN soit bien séparé.
    4. Rincez le gel dans un tampon 20x de citrate saline-sodium (SSC) pour enlever le formaldéhyde et transférez le gel à la membrane de nylon par transfert capillaire dans le tampon 20x SSC pendant la nuit. Tremper la membrane dans 2x SSC et fixer l'ARN à la membrane en exposant la membrane humide à la liaison transversale UV.
    5. Ajouter la quantité appropriée de tampon d'hybridation (10 ml par 100 cm2 membrane; Tableau des matériaux) dans un tube d'hybridation et agiter à 60 oC dans un four d'hybridation.
    6. Mettre la membrane dans le tube d'hybridation et couver pendant 60 min à 60 oC. Diluer une sonde d'ADN étiquetée 5'DIG (concentration finale, 50 ng/mL) dans la solution d'hybridation contenant un tampon d'hybridation préchauffé.
    7. Jetez le tampon de préhybridation et remplacez immédiatement par une solution d'hybridation préchauffée contenant la sonde étiquetée DIG. Incuber la tache avec la sonde à 60 oC pendant la nuit, avec une douce agitation.
    8. Après l'hybridation, laver la membrane deux fois en tampons de la rigueur croissante à 60 oC pendant 20 min chacun. Essuyer doucement la membrane pour enlever le tampon de lavage supplémentaire et ajouter des réactifs comme suggéré dans le kit d'hybridation et de détection chemiluminescente (Tableau des matériaux).
    9. Détecter les signaux hybrides par réaction chemiluminescente combinée avec le système d'imagerie.

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Representative Results

Ci-dessus, nous décrivons la procédure étape par étape pour un test de dépistage amélioré pour évaluer l'activité RSS des effecteurs P. sojae RxLR. Au total, l'expérience dure de 5 à 6 semaines. Par la suite, les RSS identifiés par l'analyse peuvent être caractérisés en termes de fonction et de mécanisme moléculaire. Comme exemple de notre approche, nous avons utilisé le P. sojae RxLR effecto Phytophthora suppresseur du silençage 1 (PSR1), qui est sécrété et livré dans les cellules hôtes par haustoria pendant l'infection.

Pour confirmer que PSR1 a une activité RSS et est donc adapté à cette méthode, chaque souche d'agrobactérie transformée a été mélangée à une souche abritant 35S-GFP et a été infiltrée dans les feuilles de N. benthamiana 16c. EV et CMV2b ont été utilisés comme contrôles négatifs et positifs, respectivement (figure 1). L'expression gFP a atteint le niveau le plus élevé dans les feuilles infiltrées avec tous les mélanges à 2/3 dpi. L'intensité de la fluorescence verte est demeurée forte dans les patchs co-infiltrés avec 35S-GFP plus CMV2b au cours d'une période d'observation de 6 à 9 jours21. La co-infiltration de GFP avec PSR1 a également eu comme conséquence la fluorescence plus forte de GFP pendant une période de 3.5-4.5 jour d'observations, comme démontré par la fluorescence élevée dans les corrections infiltrées. Cependant, l'intensité de fluorescence dans les corrections infiltrées avec 35S-GFP et EV affaibli à 3 dpi. À 4 x 5 dpi, la fluorescence du PFG était à peine détectable(figure 1).

La tache nordique a indiqué que l'ARNm de GFP s'est accumulé plus haut dans les feuilles exprimant 35S-GFP plus 35S-CMV2b ou 35S-GFP plus 35S-PSR1 que dans les feuilles exprimant 35S-GFP plus EV (figure 2). Ainsi, l'expression transcriptionnelle de PSR1 aussi bien que CMV2b a contribué à la stabilisation de l'ARNm de GFP, qui a eu comme conséquence la fluorescence élevée de GFP.

Nous avons également utilisé l'exemple d'agro-infiltration pour évaluer la propagation du signal de silence dans les feuilles des semis N. benthamiana 16c de 2 semaines. À cette fin, nous avons généralement sélectionné 3 à 4 feuilles plus grosses pour l'injection de feuilles entières. À 14 dpi, plus de 98 % de l'EV n'a montré aucune signalisation gFP évidente dans les feuilles systémiques, tandis que les deux PSR1 et CMV2b ont efficacement inhibé la propagation systémique du signal de silençage en observant la fluorescence de GFP dans environ 80% des usines co-infiltrées, et dans les 20% restants des usines infiltrées avec seulement quelques veines rouges sont apparues dans les feuilles nouvellement émergées (figure 3).

Figure 1
Figure 1 : Phytophthora sojae RxLR effector PSR1 supprime le silençage local d'ARN dans nicotiana benthamiana (N. benthamiana) 16c plantes. Les feuilles entièrement développées des plantes N. benthamiana 16c de 3 à 4 semaines (panneau gauche) ont été co-infiltrées dans des parcelles avec des mélanges D'Agrobacterium portant 35S-GFP et les constructions indiquées au-dessus de chaque image. La fluorescence gFP de la zone infiltrée a été représentée sous la lumière naturelle (panneau du milieu) et la lumière UV à ondes longues (panneau droit) à 4 dpi. L'expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires. Les flèches rouges représentent des feuilles infiltrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Accumulation de l'ARNm GFP dans les feuilles infiltrées de N. benthamiana 16c. CK et EV représentent N. benthamiana 16c feuilles seules et 16c feuilles co-infiltrées avec 35S-GFP plus EV. Des échantillons de EV et de CMV2b ont été utilisés comme témoins négatifs et positifs, respectivement. En outre, l'ARNr a été utilisé comme un contrôle de chargement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : P. sojae RxLR effector PSR1 supprime le silençage systémique d'ARN dans les usines de N. benthamiana 16c. Trois ou quatre feuilles de semis N. benthamiana 16c vieux de deux semaines (panneau gauche) ont été concoctées transitoirement par Agrobacterium hébergeant 35S-GFP et EV ou vecteur exprimant PSR1 ou CMV2b du promoteur 35S. La fluorescence gFP des feuilles nouvellement cultivées a été représentée sous la lumière naturelle (panneau supérieur) et la lumière UV à ondes longues (panneau inférieur) à 14 dpi. Cette expérience a été répétée deux fois avec des résultats similaires. Les flèches rouges indiquaient des feuilles infiltrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le silençage de l'ARN est un mécanisme de défense clé utilisé par les plantes pour lutter contre les agents pathogènes viraux, bactériens, oomycètes et fongiques. À leur tour, ces microbes ont évolué des protéines suppressrices de silençage pour contrecarrer le silençage antiviral, et ces RSS interfèrent avec différentes étapes de la voie de silençage de l'ARN22,23. Plusieurs tests de dépistage ont été élaborés pour identifier les RSS10.

Ici, nous décrivons un protocole amélioré pour les protéines effectrices de criblage sécrétées par P. sojae dans la cellule d'hôte sur l'infection pour leur capacité à supprimer le silençage d'ARN dans l'hôte. Cet exemple modifié est basé sur un jeu de co-infiltration viral, mais diffère de plusieurs façons importantes. Tout d'abord, les bactéries et les plantes N.benthamiana 16c doivent être vigoureuses et saines; ceci est très important pour l'expression stable des effecteurs des bactéries et l'utilisation de N.benthamiana 16c entièrement développé assure la reproductibilité et la fiabilité expérimentales. Nous n'utilisons souvent que deux ou trois feuilles entièrement développées par plante au stade de croissance végétative, les feuilles anciennes et nouvellement émergées ne conviennent pas. Deuxièmement, l'OD600 de la culture bactérienne doit être ajusté à une valeur optimale, généralement 0,75 à 1,0 pour Agrobacterium. Un OD600 inférieur (même aussi bas que 0.2) peut être employé pour l'écran VSRs mais pas PSRs24. Troisièmement, le moment idéal pour étudier la fluorescence verte doit être optimisé pour chaque effecteur. Dans le virus, les feuilles co-injectées avec des cultures contenant gFP plus vsRs putatifs montrent une augmentation marquée de la fluorescence verte dans la zone infiltrée à 3 dpi, et le signal reste élevé jusqu'à 9 dpi22, mais il n'a été exposé à 4 ou 5 dpi pour LES PSR dans notre étude actuelle. Par conséquent, il est également important de confirmer davantage l'activité de silençage de l'ARN en quantifiant l'accumulation de l'ARNm GFP. Enfin, il est essentiel d'utiliser le contrôle approprié. Les RSV ne sont pas toujours les contrôles positifs idéaux pour identifier les protéines effectrices parce que ces protéines ont une activité suppressive beaucoup plus forte que les psR. Ceci pourrait avoir comme conséquence l'échec de détecter les suppresseurs faibles du silençage d'ARN.

Dans ce rapport, nous démontrons l'utilisation de notre analyse modifiée pour dépister des suppresseurs du silençage d'ARN dans les agents pathogènes de Phytophthora et de Puccinia graminis. Ainsi, notre méthode représente un outil utile pour caractériser les effecteurs potentiels qui codent RSSs, qui favorisent la susceptibilité de la maladie en inhibant la petite accumulation d'ARN15,16,17. Par conséquent, nous croyons que notre protocole pourrait être largement utilisé pour filtrer les effecteurs sécrétés par les pathogènes végétaux. Les travaux futurs porteront sur l'identification d'un plus grand nombre de RSS chez d'autres agents pathogènes et sur l'élucidation du rôle du silençage de l'ARN dans la défense des plantes contre les microbes envahissants.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions du « Programme Shuguang » de la Shanghai Education Development Foundation et de la Shanghai Municipal Education Commission, le National Key Research and Development Program of China National Key R-D Program of China ( 2018YFD0201500), la National Natural Science Foundation of China (no. 31571696 et 31660510), le Programme des Mille Talents pour les Jeunes Professionnels de Chine et la Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai (18DZ22660500).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) Biofroxx 1086GR500 Buffer
2xTaq Master Mix Vazyme Biotech P112-AA PCR
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) Amresco 0264C507-1KG MOPS Buffer
Acetosyringone (AS) Sigma-Aldrich D134406-5G Induction of Agrobacterium
Agar Sigma-Aldrich A1296-1KG LB medium
Agarose Biofroxx 1110GR100 Electrophoresis
Amersham Hybond -N+ GE Healthcare RPN303 B Nothern blot
Amersham Imager GE Healthcare Amersham Imager 600 Image
Bacto Tryptone BD Biosciences 211705 LB medium
Bacto Yeast Extraction BD Biosciences 212750 LB medium
Camera Nikon D5100 Photography
ChemiDoc MP Imaging System Bio-Rad
Chemiluminescent detection module component of dafa kits Thermo Fisher Scientific 89880 Luminescence detection
Chloramphenicol Amresco 0230-100G Antibiotics
ClonExpress II One Step Cloning Kit Vazyme Biotech C112-01 Ligation
DIG Easy Hyb Sigma-Aldrich 11603558001 Hybridization buffer
Easypure Plasmid Miniprep kit TransGen Biotech EM101-02 Plasmid Extraction
EasyPure Quick Gel Extraction Kit TransGen Biotech EG101-02 Gel Extraction
EDTA disodium salt dihydrate Amresco/VWR 0105-1KG MOPS Buffer
Electrophoresis Power Supply LiuYi DYY6D Nucleic acid electrophoresis.
FastDigest EcoRV Thermo Fisher Scientific FD0304 Vector digestion
Gel Image System Tanon Tanon3500 Image
Gentamycin Amresco 0304-5G Antibiotics
Kanamycin Sulfate Sigma-Aldrich K1914 Antibiotics
LR Clonase II enzyme Invitrogen 11791020 LR reaction
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um GE Healthcare 10600002 Northern
NORTH2south biotin random prime dna labeling kit Thermo Fisher Scientific 17075 Biotin labeling
PCR Thermal Cyclers Bio-Rad T100 PCR
Peat moss PINDSTRUP Dark Gold + clay Plants
Peters Water-Soluble Fertilizer ICE Peter Professional 20-20-20 Fertilizer
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase Vazyme Biotech P505-d1 Enzyme
Rifampicin MP Biomedicals 219549005 Antibiotics
RNA Gel Loading Dye (2X) Thermo Fisher Scientific R0641 RNA Gel Loading Dye
Sodium Acetate Hydrate Amresco/VWR 0530-1KG MOPS Buffer
Sodium Chloride Amresco 0241-10KG LB medium
Tri-Sodium citrate Amresco 0101-1KG SSC Buffer
Trizol Reagent Invitrogen 15596018 RNA isolation reagent
UV lamp Analytik Jena UVP B-100AP Observation
UVP Hybrilinker Oven Analytik Jena OV2000 Northern

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References

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