Screening och identifiering av RNA-ljuddämpningssuppressorer från utsöndrade effektdämpare av växtpatogener

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här presenterar vi en modifierad screeningmetod som i stor utsträckning kan användas för att snabbt screena RNA-ljuddämpande suppressorer i växtpatogener.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Shi, J., Jia, Y., Fang, D., He, S., Zhang, P., Guo, Y., Qiao, Y. Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens. J. Vis. Exp. (156), e60697, doi:10.3791/60697 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

RNA tysta är en evolutionärt bevarad, sekvens-specifik gen reglering mekanism i eukaryoter. Flera växtpatogener har utvecklatproteiner med förmågan att hämma värdväxten RNA-ljuddämpningsvägen. Till skillnad från virus effekteller proteiner, endast flera utsöndras effekt eller proteiner har visat förmåga att undertrycka RNA ljuddämpning i bakteriella, oomycete och svamp patogener, och de molekylära funktionerna hos de flesta effektgivare är i stort sett okända. Här beskriver vi i detalj en något modifierad version av co-infiltration analys som kan fungera som en allmän metod för att observera RNA ljuddämpning och för att karakterisera effektor proteiner utsöndras av växtpatogener. De viktigaste stegen i metoden är att välja friska och fullt utvecklade blad, justera bakteriekulturen till lämplig optisk densitet (OD) vid 600 nm, och observera grönt fluorescerande protein (GFP) fluorescens vid optimal tidpunkt på infiltrerade för att undvika att utelämna effektorer med svag dämpningsaktivitet. Detta förbättrade protokoll kommer att bidra till snabb, korrekt och omfattande screening av RNA-ljuddämpande suppressorer och fungera som en utmärkt utgångspunkt för att undersöka dessa proteiners molekylära funktioner.

Introduction

Under de senaste två decennierna har acceleration en genomsekvensering av mikroorganismer som orsakar växtsjukdomar lett till en ständigt ökande kunskapsklyfta mellan sekvensinformation och de biologiska funktionerna hos kodade proteiner1. Bland de molekyler som avslöjas av sekvensering projekt är effektor molekyler som undertrycker medfödd immunitet och underlätta värd kolonisering; dessa faktorer utsöndras av destruktiva växtpatogener, inklusive bakterier, nematoder och filamentösa mikrober. För att svara på dessa hot har värdväxter utvecklatnya receptorer som känner igen dessa effektorer, vilket möjliggör återställande av immunsvaret. Effektorer utsätts därför för olika selektiva tryck, vilket leder till diversifiering av effekt eller repertoar bland patogenhärstamningar2. Under de senaste åren har förmodade effektgivare från växtpatogener visat sig störa anläggningens medfödda immunitet genom att hindra värdcellulära processer till förmån för mikroberna på olika sätt, inklusive dysreglering av signalvägar, transkription, intracellulär transport, cytoskelettstabilitet, vesikelhandel och tystaRNA 3,4,5. De allra flesta patogeneffektfaktorer, särskilt de från glödande patogener, har dock förblivit gåtfulla.

RNA tysta är en homologi-medierad gen inaktivering maskiner som bevaras bland eukaryoter. Processen utlöses av långa dubbelsträngade RNA (dsRNA) och riktar sig till homologa enkelsträngade RNA (ssRNA) på ett sekvensspecifikt sätt, och den manipulerar ett brett spektrum av biologiska processer, inklusive antiviralt försvar6. För att övervinna medfödda immunsvar av värden, vissa virus har utvecklats för att kompensera RNA ljuddämpning, inklusive förmågan att replikera inuti intracellulära fack eller fly från ljuddämpning omorganiserade signalen. Den mest allmänna strategi genom vilken virus skyddar sina genom mot RNA-ljuddämpningsberoende förlust av genfunktion är dock att koda specifika proteiner som undertrycker RNA-ljuddämpning7,8. Flera mekanistiskt olika metoder har fastställts för att screena och karakterisera viral suppressors av RNA-ljuddämpning (VSRs), inklusive co-infiltration av Agrobacterium tumefaciens kulturer, transgena växter uttrycker förmodade suppressorer, ympning och cellkultur9,10,11,12,13.

Var och en av dessa analyser har fördelar och nackdelar, och identifierar VSRs på sitt eget säregna sätt. En av de vanligaste metoderna är baserad på co-infiltration av enskilda A. tmuefaciens kulturer hysa potentiella virusprotein och en reporter gen (vanligtvis grönt fluorescerande protein [GFP]) på Nicotiana benthamiana 16c växter som utgör gfp under kontroll av blomkål mosaikvirus 35S promotorn. I avsaknad av en aktiv virusdämpande suppressor identifieras GFP som exogent av värdcellerna och tystas inom 3 dagar efter infiltration (dpi). Däremot, om virusproteinet har undertryckande aktivitet, förblir uttrycksnivån för GFP stabil bortom 3−9 dpi9. Denna co-infiltration analys är enkel och snabb; Det är dock varken mycket stabilt eller känsligt. Icke desto mindre har analysen identifierat många VSRs med olika proteinsekvenser och strukturer i många RNA-virus7,8.

Nyligen har flera effektrproteiner som kan hämma den cellulära RNA-ljuddämpningsaktiviteten karakteriserats från bakteriella, oomycete och svampväxtpatogener14,15,16. Dessa resultat innebär att RNA tysta dämpning är en gemensam strategi för att underlätta infektion som används av patogener i de flesta riken. I teorin kan många, om inte alla, av effektorerna koda RNA-ljuddämpande suppressorer (RSS). Hittills har dock endast ett fåtal identifierats, främst på grund av bristen på tillförlitlig och allmän screeningstrategi. Dessutom har suppressorer av RNA-ljuddämpning inte undersökts i de allra flesta växtpatogener17.

I denna rapport presenterar vi ett optimerat och allmänt protokoll för att identifiera växtpatogena effektorer som kan undertrycka lokala och systemiska RNA-ljuddämpning med hjälp av agro-infiltration sats. Det främsta syftet med denna studie var att betona de viktigaste aspekterna av protokollet och beskriva stegen i detalj, vilket ger en screening analys som är lämplig för nästan alla effektfaktorer av växtpatogener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla steg i förfarandet bör utföras vid rumstemperatur (RT).

VARNING: Deponera alla medier som innehåller patogena mikrober, liksom de växter och växtvävnad som används i analysen, i lämpliga avfallsbehållare och autoklav innan de kasseras.

1. Beredning av plasmiderkonstruktioner som innehåller förmodade effektgivare

  1. Välj förmodade utsöndrande effektorer som uttrycks högt under infektion, som bestäms av RNA-sekvensering (RNA-Seq) och ytterligare av kvantitativ PCR-teknik (qRT-PCR).
  2. Bestäm signalen peptid klyvning plats för varje effektor med hjälp av ett programverktyg som SignalP18.
  3. Design primers och utföra PCR för att förstärka genen kodning effektor av intresse med hjälp av high fidelity DNA polymeras. Utför agarose gel elektrofores för att kontrollera PCR produkten, sedan klona amplicon till Gateway ingång vektor pQBV3 med hjälp av ligering-fri kloning kit (Table of Materials), och därefter i destinationsuttrycket vektor pEG100 med hjälp av LR rekombination reaktion19.
  4. Omvandla 3–5 μL LR-reaktionsblandning till 100 μl av kompetenta E. coli-celler (t.ex. TOP10, DH5α), sprida de omvandlade bakteriecellerna på Luria-Bertani (LB) agarmedium kompletterat med 50 μg/ml kanamycin och inkubera vid 37 °C för 16−20 h.
    OBS: Positiva transformanter kan identifieras av kolonin PCR20 och ytterligare analyseras av plasmid miniprep och sekvensering.
  5. Införa 50−100 ng rekombinant plasmider som bär effektorprotein i 100 μl kemiskt kompetenta A. tumefaciens celler (t.ex. GV3101 eller C58C1), blanda försiktigt och frys sedan i flytande kväve i 1 min. Tina cellerna i ett 37 °C vattenbad i 5 min.
  6. Tillsätt 500 μL LB buljong och inkubera vid 30 °C för 4−6 h med mild skakning, och överför och sprid sedan alla agrobakterier celler på LB agar medium kompletteras med 50 μg/ml kanamycin och 50 μg/mL rifampicin vid 30 °C i 2 dagar.
    OBS: Positiva kloner kan verifieras av koloniPCR.
  7. Använd en enda transformerad koloni för agro-infiltration experiment om inte annat riktas.
    OBS: I den aktuella forskningen innehöll ingen av de testade effektorgenerna förväntade introner; var och en av generna förstärktes direkt från genomiskt DNA från ett Phytophthora sojae isolat. En gateway-växtuttrycksvektor utan tagg rekommenderas, men inte nödvändigt.

2. Beredning av N. benthamiana 16c växter

  1. Förbered krukväxtjordblandningar som består av (i volym) 50 % torvmossa, 30 % perlite och 20 % vermikulit och autoklav vid 120 °C i 20 min.
  2. Blötlägg autoklaverade jordblandningar med växtgödsellösning (1 g/l) och fyll dem i mindre krukor (80 mm x 80 mm x 75 mm) som förvaras i ett större fack (540 mm x 285 mm x 60 mm).
  3. Sugga ett eller två frön av N. benthamiana 16c på jordytan på varje kruka. Täck brickan med en plastkupol och låt fröngro.
  4. Placera brickan under ljus- och temperaturstyrda tillväxtkammare med en temperatur på 23−25 °C, 50−60% relativ luftfuktighet och en lång dags fotoperiod (14 h ljus/10 h mörk, med belysning vid 130−150 μE·m-2s-1).
  5. Ta av plastkupolen efter fröna groddar (3−4 dagar) och låt plantorna växa under samma förhållanden som används för grobarhetssteget.
  6. Tillsätt en lämplig mängd vatten, hålla jorden fuktig men inte blötläggning, var 2−3 dagar; tillsätt gödselmedel var 10:e dag för att främja ytterligare tillväxt. Underhåll N. benthamiana 16c växter under normala förhållanden tills de är klara för användning; i detta skede anläggningen bör ha minst fem fullt utvecklade sanna blad och inga synliga axillary eller blomknoppar, och bladen bör ha en hälsosam grön utseende).
  7. Använd 3−4 veckor gamla blad av N. benthamiana 16c för lokala RNA tysta analyser, och unga N. benthamiana 16c växter (10−14 dagar gammal) för systemiska RNA tysta analyser.
    OBS: Växttillväxtförhållandena och anläggningarna varierar mellan laboratorier. välja friska, välutvecklade och helt expanderade blad för infiltration.

3. Beredning av agrobacteriumkultur för infiltration

  1. Välj en positiv koloni från LB-plattan och inokulera cellerna i glasrör som innehåller 5 ml LB medium kompletterat med 50 μg/ml kanamycin och 50 μg/ml rifampicin. Väx cellerna vid 30 °C med skakning vid 200 varv/min i 24−48 h.
  2. Överför 100 μL kultur till 5 ml LB medium kompletterat med samma antibiotika, 10 mM 2-(N-morolno) etanesulfonsyra (MES; pH 5.6) och 20 μM acetosyringone (AS). Odla bakterier vid 30 °C med skakningar vid 200 varv/min i 16−20 h.
  3. Centrifugceller vid 4 000 x g i 10 min. Häll av supernatanten och omfördela pelleten i 2 ml 10 mM MgCl2 buffert.
  4. Upprepa steg 3.3 för att säkerställa ett fullständigt avlägsnande av antibiotika.
  5. Bestäm densiteten hos Agrobacterium-kulturen genom att mäta den optiska densiteten vid 600 nm (OD600). Justera till en OD600 på 1,5−2,0 med 10 mM MgCl2 buffert.
  6. Tillsätt 10 mM MES (pH 5.6) och 150 μM AS till de slutliga fjädringskulturerna och inkubera cellerna vid RT i minst 3 timmar utan att skaka.
    OBS: Lämna inte den slutliga suspension kulturer över natten.

4. Co-infiltration N. benthamiana blad

  1. Blanda lika volymer av en Agrobacterium kultur som innehåller 35S-GFP med en Agrobacterium kultur som innehåller 35S- gurka mosaik virus suppressor 2b (CMV2b), förmodade effector, eller tom vektor (EV).
  2. Försiktigt och långsamt infiltrera blandade agrobacterium suspensioner på abaxial sidorna av N. benthamiana 16c blad med hjälp av en 1 ml nållös spruta.
  3. Ta bort den återstående bakteriesuspensionen från bladen med mjukdelarstorkare och cirkla marginalerna för de infiltrerade plåstren med en makerpenna.
  4. Lämna de infiltrerade växterna i tillväxtkammaren under samma tillväxtförhållanden.
    OBS: Av säkerhets- och hälsoskäl ska skyddsglasögon och en mask bäras under infiltration. För att förhindra korskontaminering bör handskar bytas eller steriliseras med etanol mellan infiltrationer. Normalt behövs minst 1 ml agrobacteriumsuspensioner per blad för infiltration. För systemisk ljuddämpning krävs minst två blad för infiltration.

5. GFP-bildanalys

  1. Visuellt upptäcka GFP fluorescens i nyvuxna blad av hela växter 2 veckor efter infiltration (för systemisk RNA-ljuddämpning) eller infiltrerade fläckar av blad 3−4 dpi med hjälp av en lång våg ultraviolett (UV) lampa utan blad samling.
  2. Fotografi samlade växter och/eller fristående blad med en digitalkamera utrustad med både UV-filter och gula filter.
    OBS: För analyser av lokala ljuddämpning dämpning, undersöka infiltrerade fläckar av N. benthamiana 16c blad, medan för systemisk tysta dämpning aktivitet, undersöka nyvuxna blad. RNA-ljuddämpningssuppressionsaktiviteten kan variera mellan enskilda effektgivare. Observera därför patcharna eller bladen under några dagar med början vid 3 dpi. Använd CMV2b respektive EV som positiva och negativa kontroller.

6. Nordlig blot analys av GFP mRNA nivåer i infiltrerade blad

  1. Isolering av totala RNA från bladvävnad med hjälp av RNA-isoleringsreagens (Materialförteckning)
    1. Samla bladvävnader från infiltrerade N. benthamiana 16c fläckar vid 4−7 dpi, pulverisera i flytande kväve till ett fint pulver, och överföra pulvret till en steril 2 ml rör.
    2. Tillsätt RNA-isoleringsreagens (1 ml/100 mg vävnad) omedelbart till det provtagna röret i en huva, skaka kraftigt till homogenat och inkubera vid RT i 5 min.
    3. Tillsätt kloroform (200 μL/1 ml RNA isoleringsreagens) till varje rör i en huva, skaka kraftigt i 15 s och inkubera vid RT i 5 min. Centrifug homogenatet vid 12 000 x g i 15 min vid 4 °C.
    4. Överför supernatanten till ett nytt RNase-fritt rör och kassera pelleten. Tillsätt 0,7 volym isopropanol till supernatant, försiktigt invertera flera gånger, och inkubera blandningen vid RT i 10 min.
    5. Fäll ut RNA-pelleten genom centrifugering vid 12 000 x g i 15 min vid 4 °C.
    6. Kassera supernatanten, tvätta pelleten med 70% etanol och lufttorka pelleten i en huva. Lös upp RNA i dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlat vatten genom att inkubera i ett vattenbad på 65 °C i 10–20 min.
  2. Nordlig blot analys av GFP mRNA nivå i infiltrerade blad
    1. Förbered en 1,2% formaldehyd denaturing agarose gel i 1x MOPS kör buffert.
    2. Blanda RNA 1:1 med RNA-lastningsfärgämne och denaturering genom inkubation vid 65 °C i 10 min, kyl omedelbart de denaturerad proverna på is en minut.
    3. Ladda proverna på gelen och elektrophorese på 100 V i 50 min tills RNA är väl åtskilda.
    4. Skölj gelen i 20x saltlösning-natriumcitrat (SSC) buffert för att ta bort formaldehyd och överföra gelen till nylonmembranet genom kapilläröverföring i 20x SSC buffert över natten. Blötlägg membranet i 2x SSC och fäst RNA på membranet genom att utsätta det våta membranet för UV-korslänkning.
    5. Tillsätt lämplig mängd hybridiseringsbuffert (10 ml per 100 cm2 membran; Materialförteckning) i ett hybridiseringsrör och agitera vid 60 °C i en hybridiseringsugn.
    6. Sätt membranet i hybridiseringsröret och inkubera i 60 min vid 60 °C. Späd en 5'DIG-märkt DNA-sond (slutlig koncentration, 50 ng/ml) i hybridiseringslösningen som innehåller förvärmd hybridiseringsbuffert.
    7. Kassera prehybridiseringsbufferten och ersätt omedelbart med förvärmd hybridiseringslösning som innehåller DEN DIG-märkta avsökningen. Inkubera blodproppen med sond vid 60 °C över natten, med mild agitation.
    8. Efter hybridisering, tvätta membranet två gånger i buffertar för ökande stringency vid 60 °C i 20 min vardera. Torka försiktigt av membranet för att ta bort extra tvättbuffert och tillsätt reagenser enligt föreslås i chemiluminescerande hybridiserings- och detektionssats(Materialförteckning).
    9. Upptäck hybridiserade signaler genom chemiluminescent reaktion i kombination med bildsystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ovan beskriver vi steg-för-steg-förfarandet för en förbättrad screening analys för att bedöma RSS-verksamhet P. sojae RxLR effektorer. Sammantaget tar experimentet 5−6 veckor. Därefter kan de RSS som identifieras av analysen ytterligare karakteriseras i form av funktion och molekylär mekanism. Som ett exempel på vårt tillvägagångssätt använde vi P. sojae RxLR effecto Phytophthora suppressor av RNA tysta 1 (PSR1), som utsöndras och levereras till värdceller genom haustoria under infektion.

För att bekräfta att PSR1 har RSS-aktivitet och är därmed lämplig för denna metod, var och en omvandlad agrobacterium stam blandades med en stam hysa 35S-GFP och infiltrerades i blad av N. benthamiana 16c. EV och CMV2b användes som negativa respektive positiva kontroller(figur 1). GFP-uttryck nådde den högsta nivån i blad infiltrerade med alla blandningar vid 2−3 dpi. Grön fluorescensintensitet förblev stark i plåster med 35S-GFP plus CMV2b under en 6−9-dagars observationsperiod21. Samfiltrering av GFP med PSR1 resulterade också i starkare GFP fluorescens under en 3,5−4,5 dagars observationsperiod, vilket framgår av förhöjdfluorescens i de infiltrerade plåstren. Dock försvagades fluorescensintensiteten i patchar med 35S-GFP och EV vid 3 dpi. Vid 4–5 dpi var GFP-fluorescens knappast detekterbar (figur 1).

Northern blot visade att GFP mRNA ackumulerade högre i bladen som uttrycker 35S-GFP plus 35S-CMV2b eller 35S-GFP plus 35S-PSR1 än i bladen som uttrycker 35S-GFP plus EV(figur 2). Således bidrog transkriptionsuttryck av PSR1 as well as CMV2b till stabiliseringen av GFP mRNA, som resulterade i förhöjd GFP fluorescens.

Vi använde också agro-infiltration assay för att utvärdera spridningen av ljuddämpning signal i bladen av 2 veckor gamla N. benthamiana 16c plantor. För detta ändamål valde vi vanligtvis 3−4 större blad för hela blad injektion. Vid 14 dpi uppvisade mer än 98% av EV uppenbart ingen GFP signalering i systemiska blad, medan både PSR1 och CMV2b effektivt hämmade den systemiska spridningen av ljuddämpning signal genom att observera GFP fluorescens i cirka 80% av co-infiltrerade växter, och i de återstående 20% av infiltrerade växter med endast ett fåtal röda vener dök upp i nyligen framkom blad(figur 3).

Figure 1
Figur 1: Phytophthora sojae RxLR effektor PSR1 undertrycker lokala RNA tysta i Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) 16c växter. Fullt utvecklade blad av 3-4 veckor gamla N. benthamiana 16c växter (vänster panel) var co-infiltrerade i fläckar med Agrobacterium blandningar transporterar 35S-GFP och de konstruktioner som anges ovanför varje bild. GFP fluorescens av det infiltrerade området avbildades under naturligt ljus (mellanpanel) och lång våg UV-ljus (höger panel) vid 4 dpi. Experimentet upprepades två gånger med liknande resultat. Röda pilar representerar infiltrerade löv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Ackumulering av GFP mRNA i infiltrerade N. benthamiana 16c blad. CK och EV representerar N. benthamiana 16c lämnar ensam och 16c blad co-infiltreras med 35S-GFP plus EV. Prover från EV och CMV2b användes som en negativ respektive positiv kontroll. Dessutom användes rRNA som lastkontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: P. sojae RxLR effektor PSR1 undertrycker systemisk RNA ljuddämpning i N. benthamiana 16c växter. Tre eller fyra blad av 2 veckor gamla N. benthamiana 16c plantor (vänster panel) var tillfälligt co-infiltreras av Agrobacterium hysa 35S-GFP och antingen EV eller vektor uttrycker PSR1 eller CMV2b från 35S promotorn. GFP fluorescens av nyvuxna blad avbildades under naturligt ljus (övre panelen) och lång våg UV-ljus (nedre panelen) vid 14 dpi. Detta experiment upprepades två gånger med liknande resultat. Röda pilar indikerade infiltrerade löv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RNA tysta är en viktig försvarsmekanism som används av växter för att bekämpa viral, bakteriell, oomycete och svamppatogener. I sin tur har dessa mikrober utvecklats ljuddämpande suppressor proteiner för att motverka antiviral ljuddämpning, och dessa RSS stör olika steg i RNA-ljuddämpning väg22,23. Flera screening analyser har utvecklats för att identifiera RSSs10.

Här beskriver vi ett förbättrat protokoll för screening effector proteiner utsöndras av P. sojae i värdcellen vid infektion för deras förmåga att undertrycka RNA tysta i värd. Denna modifierade analys är baserad på en viral co-infiltration analys men skiljer sig på flera viktiga sätt. För det första bör både bakterier och N.benthamiana 16c växter vara kraftfulla och friska; Detta är mycket viktigt för ett stabilt uttryck för effektorer från bakterierna och användningen av fullt utvecklade N.benthamiana 16c säkerställer experimentell reproducerbarhet och tillförlitlighet. Vi använder ofta endast två eller tre fullt utvecklade blad per anläggning vid vegetativ tillväxt skede, de gamla och nyuppkomna bladen är olämpliga. För det andra måste OD600 av bakteriekulturen anpassas till ett optimalt värde, vanligtvis 0,75−1,0 för Agrobacterium. En lägre OD600 (även så låg som 0,2) kan användas för att screena VSRs men inte PSRs24. För det tredje måste den idealiska tidpunkten för att undersöka grön fluorescens optimeras för varje effektor. I virus, blad co-injiceras med kulturer som innehåller GFP plus förmodade VSRs uppvisar en markant ökning av grön fluorescens i infiltrerade området vid 3 dpi, och signalen är fortfarande hög tills 9 dpi22, men det var bara utpå 4 eller 5 dpi för PSRs i vår nuvarande studie. Därför är det också viktigt att ytterligare bekräfta RNA-ljuddämpningsaktiviteten genom att kvantifiera ackumuleringen av GFP mRNA. Slutligen är det viktigt att använda lämplig kontroll. VSRs är inte alltid den idealiska positiva kontroller för att identifiera effekteller proteiner eftersom dessa proteiner har mycket starkare suppressiv aktivitet än PSRs. Detta kan leda till underlåtenhet att upptäcka svaga suppressorer av RNA-ljuddämpning.

I detta betänkande visar vi användningen av vår modifierade analys för att screena för suppressorer av RNA-ljuddämpning i Phytophthora och Puccinia graminis patogener. Således representerar vår metod ett användbart verktyg för att karakterisera potentiella effektfaktorer som kodar RSSs, som främjar sjukdomkänslighet genom att hämma små RNA ackumulering15,16,17. Därför tror vi att vårt protokoll skulle kunna användas i stort sett för att screena effekteller utsöndras av växtpatogener. Framtida arbete kommer att fokusera på att identifiera fler RSS s i andra patogener, och på att belysa rollen som RNA tysta i växtförsvar mot invaderande mikrober.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av bidrag från "Shuguang Program" i Shanghai Education Development Foundation och Shanghai Municipal Education Commission, National Key Research and Development Program i Kina National Key R & D Program i Kina ( 2018YFD0201500), National Natural Science Foundation of China (nr 31571696 och 31660510), Thousand Talents Program för unga yrkesverksamma i Kina, och Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18DZ2260500).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) Biofroxx 1086GR500 Buffer
2xTaq Master Mix Vazyme Biotech P112-AA PCR
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) Amresco 0264C507-1KG MOPS Buffer
Acetosyringone (AS) Sigma-Aldrich D134406-5G Induction of Agrobacterium
Agar Sigma-Aldrich A1296-1KG LB medium
Agarose Biofroxx 1110GR100 Electrophoresis
Amersham Hybond -N+ GE Healthcare RPN303 B Nothern blot
Amersham Imager GE Healthcare Amersham Imager 600 Image
Bacto Tryptone BD Biosciences 211705 LB medium
Bacto Yeast Extraction BD Biosciences 212750 LB medium
Camera Nikon D5100 Photography
ChemiDoc MP Imaging System Bio-Rad
Chemiluminescent detection module component of dafa kits Thermo Fisher Scientific 89880 Luminescence detection
Chloramphenicol Amresco 0230-100G Antibiotics
ClonExpress II One Step Cloning Kit Vazyme Biotech C112-01 Ligation
DIG Easy Hyb Sigma-Aldrich 11603558001 Hybridization buffer
Easypure Plasmid Miniprep kit TransGen Biotech EM101-02 Plasmid Extraction
EasyPure Quick Gel Extraction Kit TransGen Biotech EG101-02 Gel Extraction
EDTA disodium salt dihydrate Amresco/VWR 0105-1KG MOPS Buffer
Electrophoresis Power Supply LiuYi DYY6D Nucleic acid electrophoresis.
FastDigest EcoRV Thermo Fisher Scientific FD0304 Vector digestion
Gel Image System Tanon Tanon3500 Image
Gentamycin Amresco 0304-5G Antibiotics
Kanamycin Sulfate Sigma-Aldrich K1914 Antibiotics
LR Clonase II enzyme Invitrogen 11791020 LR reaction
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um GE Healthcare 10600002 Northern
NORTH2south biotin random prime dna labeling kit Thermo Fisher Scientific 17075 Biotin labeling
PCR Thermal Cyclers Bio-Rad T100 PCR
Peat moss PINDSTRUP Dark Gold + clay Plants
Peters Water-Soluble Fertilizer ICE Peter Professional 20-20-20 Fertilizer
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase Vazyme Biotech P505-d1 Enzyme
Rifampicin MP Biomedicals 219549005 Antibiotics
RNA Gel Loading Dye (2X) Thermo Fisher Scientific R0641 RNA Gel Loading Dye
Sodium Acetate Hydrate Amresco/VWR 0530-1KG MOPS Buffer
Sodium Chloride Amresco 0241-10KG LB medium
Tri-Sodium citrate Amresco 0101-1KG SSC Buffer
Trizol Reagent Invitrogen 15596018 RNA isolation reagent
UV lamp Analytik Jena UVP B-100AP Observation
UVP Hybrilinker Oven Analytik Jena OV2000 Northern

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (41), 15967-15972 (2008).
  2. Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
  3. Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
  4. Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9, (2), 535-547 (2019).
  5. Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
  6. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, (7006), 356-363 (2004).
  7. Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11, (11), 745-760 (2013).
  8. Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
  9. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126, (3), 930-938 (2001).
  10. Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, (7), 879-890 (2008).
  11. Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103, (1), 157-167 (2000).
  12. Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313, (5783), 68-71 (2006).
  13. Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (5), 1350-1355 (2004).
  14. Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312, (5772), 436-439 (2006).
  15. Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45, (3), 330-333 (2013).
  16. Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222, (3), 1561-1572 (2019).
  17. Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223, (2), 839-852 (2019).
  18. Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8, (10), 785-786 (2011).
  19. Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45, (4), 616-629 (2006).
  20. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42, (1), Appendix 3D 1-7 (2016).
  21. Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79, (20), 13018-13027 (2005).
  22. Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16, (5), 265-272 (2011).
  23. Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18, (7), 382-392 (2013).
  24. Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376, (2), 346-356 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics