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Analisi della metilazione LINE-1 nelle cellule staminali mesenchietratta con Vescicoli Extracellulari Derivati dall'Osteosarcoma

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Genetics

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Summary

Di seguito è descritto l'uso di un metodo di amplificazione della sonda specifico per la metilazione per analizzare i livelli di metilazione degli elementi LINE-1 nelle cellule staminali mesenchymiche trattate con vescicle extracellulari derivate dall'osteosarcoma. È inoltre dimostrata l'ultracentrifuga, una procedura popolare per separare le vesciche extracellulari dal siero bovino fetale.

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Sinha, S., Mannerström, B., Seppänen-Kaijansinkko, R., Kaur, S. LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (156), e60705, doi:10.3791/60705 (2020).

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Abstract

L'amplificazione della sonda specifica per la metilazione (MSPA) è una tecnica semplice e robusta che può essere utilizzata per rilevare differenze relative nei livelli di metilazione dei campioni di DNA. È pieno di risorse, richiede piccole quantità di DNA e richiede circa 4-5 h di lavoro pratico. Nella tecnica presentata, i campioni di DNA vengono prima denaturati e quindi ibridati su sonde che prendono di mira il DNA in siti metilati o di riferimento come controllo. Il DNA ibridato è separato in reazioni parallele, una sottoposta solo a legatura e l'altra sottoposta a legatura seguita dalla digestione mediata da HhaI in sequenze GCGC non metilate. I frammenti di DNA risultanti sono amplificati dalla PCR e separati dall'elettroforesi capillare. I siti GCGC metilati non vengono digeriti da HhaI e producono segnali di picco, mentre i siti GCGC non metilati vengono digeriti e non vengono generati segnali di picco. Confrontando i picchi normalizzati dal controllo delle versioni digerite e non digerite di ogni campione si fornisce il rapporto di dosaggio della metilazione di un campione di DNA. Qui, MSPA viene utilizzato per rilevare gli effetti delle vesciche extracellulari derivate dall'osteosarcoma (EV) sullo stato di metilazione dell'elemento nucleare a lungo intervallato-1 (LINE-1) nelle cellule staminali mesenmalmalmal. I LINE-1 sono elementi di DNA ripetitivi che in genere subiscono l'ipometilazione nel cancro e, in questa capacità, possono fungere da biomarcatore. L'ultracentrifugato è anche usato come metodo conveniente per separare le vesciche extracellulari dai fluidi biologici (cioè, durante la preparazione del siero bovino fetale impoverito di EV [FBS] e l'isolamento dei vescitabi dai media condizionati dall'osteosarcoma [centrifugazione differenziale]). Per l'analisi della metilazione, le sonde LINE-1 personalizzate sono progettate per indirizzare tre siti di metilazione nella sequenza promotrice LINE-1 e sette siti di controllo. Questo protocollo dimostra l'uso di MSPA per l'analisi della metilazione LINE-1 e descrive la preparazione di FBS impoverito da EV per ultracentrifugazione.

Introduction

La metilazione del DNA è una grande modifica epigenetica che si verifica nelle cellule umane. La metilazione del DNA si riferisce al collegamento dei gruppi metilici ai residui di citosina nei dinucleotidi CpG. Tali dinucleotidi si trovano di solito negli ammassi (isole CpG) nella regione 5' dei geni1. Nelle cellule normali, la maggior parte di questi dinucleotidi esiste in uno stato non metilato, che consente la trascrizione del DNA. Per inciso, molti tumori sono associati con le isole CpG ipermetillate e il silenziamento trascrittomico2, soprattutto nei geni soppressori tumorali, che a loro volta contribuiscono a vari segni distintivi del cancro3.

D'altra parte, lunghi elementi nucleari interspersati-1 (LINE-1 o L1) sono elementi di DNA ripetitivi e trasponibili che normalmente hanno alti livelli di metilazione nelle isole CpG. La metilazione di LINE-1 previene la traslocazione e aiuta a mantenere l'integrità del genoma. In diversi tipi di cancro, LINE-1 è ipometilato, con conseguente attivazione e successiva instabilità cromosomica retrotrassima mediata4. LINE-1 rappresenta quasi il 17% del genoma umano5e il suo stato di metilazione può fungere da indicatore dei livelli di metilazione genomica globale6. Si ritiene che l'ipometilazione line-1 globale preceda la transizione delle cellule a un fenotipo tumorale7; quindi, promette come potenziale marcatore per l'insorgenza precoce del cancro.

Attualmente, ci sono diversi metodi per l'analisi della metilazione, tra cui la pigzoncazione, la metilazione specifica PCR, microarray e l'immunoprecipitazioni della cromatina1. L'uso del sequenziamento di nuova generazione ha anche permesso di incorporare approcci a livello di genoma per la rilevazione della metilazione del DNA. Molti di questi metodi si basano sul DNA trattato con bisulfite, in cui le citosine non metilate vengono convertite in uracile e le citosine metilate rimangono invariate. Tuttavia, lavorare con il DNA trattato con bisulfite ha diverse insidie, come conversioni incomplete di citosine non metilate in uracili, amplificazione di biasima delle sequenze e errori di sequenza8.

Nell'amplificazione della sonda specifica per la metilazione (MSPA), le sonde composte da due oligonucleotidi prendono di mira sequenze di DNA contenenti un sito di restrizione (GCGC) per l'enzima di restrizione sensibile alla metilazione HhaI9. Dopo che le sonde si ibridano al DNA, ogni campione viene diviso in due set. Le sonde nel primo set vengono sottoposte a legatura, mentre le sonde nel secondo set vengono sottoposte a legatura seguita da una digestione mediata di HhaI in siti CGCG non metilati. Entrambi i set di campioni vengono poi amplificati dalla PCR e i prodotti sono separati da elettroforesi capillare. Le sonde nei siti non metilati vengono digerite da HhaI e non vengono amplificate durante la PCR, con conseguente assenza di segnali di picco. Al contrario, le sonde nei siti metilati sono protette dalla digestione e sono quindi amplificate durante la PCR, generando successivamente segnali di picco10.

MSPA presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi. In primo luogo, richiede una bassa quantità di DNA (50-100 ng) ed è adatto per l'analisi del DNA da campioni incorporati di paraffina fissati in formalina10. Non richiede DNA trattato con bisulfiti; infatti, non è adatto per il DNA che viene modificato in questo modo. Molti campioni possono essere analizzati contemporaneamente e le sonde MSPA possono essere progettate in modo che si rivolgono a più geni o sequenze contemporaneamente. Inoltre, le sonde sono specifiche e sensibili per il DNA metilato come il sito di restrizione HhaI corrisponde a una sequenza che è tipica delle isole CpG10.

Questo studio ha studiato gli effetti delle vesciche extracellulari derivate dall'osteosarcoma (OS) (EV) sulla metilazione LINE-1 nelle cellule staminali mesenchimale derivate da tessuto adiposo (AT-MSC; Figura 1). Gli EV sono su nanoscala, vesciche legate a membrana secrete dalla maggior parte dei tipi di cellule. Trasportano proteine, lipidi, mRNA, microRNA e molecole aggiuntive dalle cellule dei genitori11,12. Gli EV mediano la comunicazione intercellulare e svolgono ruoli importanti in diverse condizioni patofisiologiche13,14. Uno studio recente ha dimostrato che gli EV derivati dal cancro possono trasferire line-1 attivi alle cellule ricevente15. È stato riferito in precedenza che i veicoli elettrici della linea cellulare HOS-143B possono alterare lo stato di metilazione di LINE-1 nelle MSC, oltre ad altri effetti genetici16.

Quando si coltivano cellule per l'isolamento EV, è importante utilizzare il siero bovino fetale impoverito di EV [FBS] nel mezzo di crescita, poiché gli EV derivati da FBS possono interferire con i veicoli elettrici provenienti da altre fonti e ostacolare i risultati17,18. L'ultracentrifugazione è uno dei metodi più comuni per esaurire i VE da FBS. Si tratta di una procedura relativamente semplice ed economica rispetto ad alternative come l'ultrafiltrazione e l'esaurimento commerciale di FBS19. Qui, il protocollo dimostra anche come preparare FBS impoverito da EV per ultracentrifugazione.

In questo articolo viene presentata un protocollo dettagliato per le tecniche di cui sopra, dall'isolamento dei veicoli elettrici da una linea cellulare del sistema operativo all'analisi della metilazione di LINE-1 negli MSC trattati con OS-EV (Figura 1).

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Protocol

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico di Helsinki e distretto ospedaliero Di Uusimaa (approvazione etica D. N. 217/13/03/02/2015).

1. Preparazione dell'EV impoverito FBS per ultracentrifugazione

  1. Prendere FBS in (ultra)centrifugare tubi e metterli in secchi di ultracentrifuga. Per garantire che l'ultracentrifugazione funzioni senza intoppi e in modo sicuro, bilanciare i secchi entro 10 mg l'uno dall'altro.
  2. Caricare i secchi su un rotore oscillante (tipo SW28, k-factor 246). Posizionare il rotore nell'ultracentrifuga e correre a 100.000 x g per 19 h a 4 gradi centigradi.
  3. Raccogliere con attenzione lo strato superiore di colore chiaro del supernatante (circa nove decimi) e trasferirlo in un tubo da 50 mL. Non disturbare o pipette il pellet marrone scuro, in quanto contiene EV da FBS.
  4. Passare il supernatante attraverso un filtro da 0,22 m in un nuovo tubo da 50 mL.
  5. Aggiungere l'FBS con criteri sterilizzati e impoveriti agli EV ai supporti per la coltura cellulare durante la coltivazione delle cellule per l'isolamento EV.

2. Isolamento degli EV derivati dall'osteosarcoma

  1. Cellule OS a piastre (hoS-143B linea cellulare) in un pallone T-175 con flÈ 1640 medio RPMI 1640, integrato con 10% fBS normale e 1% antibiotici (100 U / mL penicillina, 0,1 mg/mL streptomicina). Collocare il pallone in un'incubatrice a 37 gradi centigradi e al 5% di CO2.
  2. Quando il pallone è 70%-80% confluente, lavare le cellule con salina tampone di fosfato (PBS) quindi farle crescere in supporti contenenti 10% EV-deplato FBS (in seguito indicato come supporto impoverito EV).
    NOTA: 1 x 106 cellule HOS-143B placcate in un pallone T175 raggiunge il 70% di confluenza dopo circa 60 h.
  3. Durante i successivi 48 h, raccogliere supporti condizionati dalle cellule di osteosarcoma dopo ogni 24 h e aggiungere nuovi supporti editii.
  4. Centrifugare il supporto condizionato a 2500 x g per 20 min a 4 gradi centigradi per rimuovere le cellule e i detriti cellulari. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo, lasciando circa 2 mL di supporti nella parte inferiore.
    NOTA: Se non procede direttamente con l'isolamento EV in questa fase, il supernatanto può essere conservato a -80 oC.
  5. Versare il supernatante in tubi di ultracentrifuga e bilanciarli come prima. Centrifugare i tubi a 100.000 x g per 2 h a 4 gradi centigradi.
  6. Scartare con cura il supernatante, lasciando circa 1 mL nella parte inferiore. Aggiungere delicatamente circa 20 mL di PBS (0,1 m filtrati) al tubo e alla pipetta per lavare e sospendere il pellet EV.
  7. Bilanciare i tubi ed eseguire un altro giro di ultracentrifugazione con le stesse impostazioni.
  8. Rimuovere con cura il supernatante e risospendere il pellet EV in 200 -L di PBS con un pipettaggio delicato. Conservare i VE in tubi a bassa legatura.
    NOTA: Gli EV possono essere utilizzati immediatamente, altrimenti, ma in -80 gradi centigradi fino a quando non sono necessari.

3. Caratterizzazione di OS-EV

NOTA: gli EV purificati possono essere caratterizzati da gonfiore occidentale (WB), analisi del monitoraggio delle nanoparticelle (NTA) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM)16.

  1. Eseguire WB come secondo il protocollo standard16 con i marcatori EV CD63, TSG101 e Hsp70 e con calnexin come controllo negativo per indicare la purezza del campioneEV 20.
  2. Per NTA, diluire prima il campione EV in 0,1 m filtrato il PBS di Dulbecco per ottenere (idealmente) 30–100 particelle per fotogramma.
    1. Portare circa 500 l l del campione in una siringa da 1 mL e caricarlo nella porta di ingresso dello strumento NTA. Verificare che ci siano abbastanza particelle per fotogramma, per misurazioni accurate.
    2. Aprire il software NTA e registrare cinque video della durata di 60 s, utilizzando il livello di telecamera 13 a temperatura ambiente. Durante l'analisi, utilizzare la soglia di rilevamento: 5 e ottenere 10.
  3. Analizzare i campioni EV di TEM come descritto in precedenza21.

4. Cultura AT-MSC

NOTA: Il tessuto adiposo umano per l'isolamento mesenchymal delle cellule staminali è stato fornito come liposuzione aspirato (Department of Plastic Surgery, Laser Tilkka Ltd., Finlandia). Il consenso informato scritto è stato preso dai donatori di lipoaspira, che erano sottoposti a procedure di liposuzione elettiva.

  1. Isolare gli AT-MSC dagli aspirazioni di liposuzione utilizzando metodi di isolamento meccanici ed enzimatici standard22.
    NOTA: possono essere utilizzati anche MSC provenienti da altre fonti (comprese le linee cellulari commerciali).
  2. Cellule di coltura nei media DMEM/F-12 integrate con 10% FBS e 1% antibiotici.

5. Trattamento di MSC con OS-EV

  1. Piastra 15.000 AT-MSC per pozzo in una piastra 24 pozzo.
  2. Dopo 24 h, rimuovere il vecchio supporto, lavare le celle con PBS e passare al supporto esaurito EV.
  3. Trattare le cellule con OS-EV (a una concentrazione di particelle di 1 x 106 EV per cella) il Giorno 1 (24 h dopo l'adesione cellulare), Giorno 3 (48 h dopo il Giorno 1) e Giorno 5 (96 h dopo il Giorno 1).
    1. Interrompere il trattamento OS-EV per i campioni di timepoint (TP) 0 il giorno 1, 3 campioni di TP sui campioni del giorno 3 e 7 il giorno 7 (48 h dopo il giorno 5).
      NOTA: possono essere seguiti anche altri programmi di timepoint in base ai piani sperimentali.
  4. Estrarre il DNA dagli MSC utilizzando un metodo appropriato. Includere campioni di controllo positivi e negativi per l'analisi dei dati.

6. Saggio di metilazione LINE-1

  1. Progettare i primer della sonda LINE-1 personalizzati, come fatto in precedenza da Pavicic et al.23. Per le sonde di metilazione, selezionare tre sequenze contenenti il sito di restrizione HhaI all'interno della regione promotrice di LINE-1. Per le sonde di controllo, selezionare sette sequenze prive del sito di restrizione HhaI dal resto della sequenza LINE-1.
    NOTA: la sequenza LINE-1 è disponibile presso il database GenBank24 (L1.2, candidatialazione n. AH005269.2). Utilizzare le istruzioni del produttore MSPA per la progettazione delle sonde25.
  2. Diluire 70 ng di campione di DNA nel buffer TE fino a un volume di 5.L.
  3. Eseguire le successive fasi di termociclista e PCR come indicato nella tabella 1. Riscaldare i campioni per 10 minuti a 98 gradi centigradi, quindi raffreddare a 25 gradi centigradi.
  4. Aggiungere 3 l di miscela di ibridazione della sonda ad ogni campione ed eseguire il termociclore per consentire alle sonde di ibridarsi al DNA.
  5. A temperatura ambiente (RT), aggiungere 13 - L di miscela post-ibridazione ad ogni campione. Trasferire 10 o l in un secondo tubo.
  6. Collocare entrambi i set di tubi nel termociclore e incubare a 48 gradi per almeno 1 min.
    1. Mentre i campioni sono a 48 gradi centigradi, aggiungere 10 l del mix di legatura al primo set di tubi (serie non digerita) e 10 l del mix legatura-digestione al secondo set di tubi (serie digerita). Eseguire il successivo programma termociclista.
  7. Abbassare i tubi e contemporaneamente impostare il termociclore a 72 .
  8. Aggiungere 5 - L di miscela di polimerasi ad ogni tubo e posizionare i tubi nel termociclore. Eseguire il programma PCR.
  9. Mentre il programma PCR è in esecuzione, preparare una soluzione di 1 mL formamide contenente 2,5 l'l di dimensioni standard. Pipetta 10 -L di questa soluzione per ogni pozzo di una piastra ottica 96 po ' (con codice a barre).
  10. Dopo la PCR, diluire i campioni non digeriti e digeriti rispettivamente a 1:100 e 1:200 in acqua ultrapura. Aggiungere 2 - L di prodotto PCR diluito alla piastra 96. Centrifugare la piastra a 200 x g per 15-20 s per rimuovere le bolle d'aria.
  11. Eseguire l'analisi dei frammenti di campioni mediante elettroforesi capillare.
    NOTA: La piastra deve essere conservata a 4 gradi centigradi al buio fino all'analisi.

7. Analisi dei dati dei frammenti

  1. Aprire l'elettroforesi capillare in un software di analisi dell'elettroferografia.
    1. Nella colonna Pannello, per uno degli esempi, scegliere MLPA dal menu. Fare clic sull'intestazione del pannello e premere Ctrl -D per applicare MLPA a tutti i campioni.
    2. Allo stesso modo, impostare il metodo di analisi su Microsatellite di default per tutti i campioni.
    3. Selezionare tutti i campioni e fare clic sul pulsante Riproduzione verde per analizzare i campioni in base alle impostazioni scelte.
    4. Selezionare tutti i campioni e fare clic sul pulsante Grafico per visualizzare i picchi della sonda.
    5. Ingrandire la regione di picco per una risoluzione più elevata dei singoli picchi di sonda. Assicurarsi che tutti i 10 picchi corrispondenti alle sonde della sonda LINE-1 siano etichettati. Eliminare i picchi aggiuntivi (<95 bp e >160 bp).
    6. Nella scheda Genotipi esportare i risultati nel formato CSV (Comma-Separated-Values).
  2. Aprire il file CSV in un software di analisi dei dati e ordinare i dati in colonne.
    1. Etichettare i tre picchi del sito di metilazione in base alle loro dimensioni approssimative (L1-1m a 153 bp, L1-2m a 119 bp, L1-3m a 133 bp). I restanti sette picchi corrispondono alle sonde di controllo.
      NOTA: Qui vengono utilizzati i valori dei picchi di sonda L1-2m, che hanno una dimensione di 117 bp, dal momento che tale regione è stata utilizzata nella maggior parte dei saggi di metilazione LINE-123.
    2. Per ogni campione (non digerito e digerito), calcolare l'area di picco della somma di tutti e sette i picchi di controllo. Dividere l'area di picco di ogni sonda LINE-1 per questa somma.
    3. Per ogni campione di DNA, dividere il valore del campione digerito per quello del campione non digerito per ottenere il rapporto di dosaggio di metilazione (DM)utilizzando la seguente equazione:
      Equation 1
      Dove: DM è il rapporto di dosaggio di metilazione, Ax è l'area sotto il picco x (ad esempio, l1-2m picco), e Actrl è l'area di picco di somma di tutte e sette le sonde di controllo.

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Representative Results

L'obiettivo principale di questo studio era valutare gli effetti epigenetici degli OS-EV sulle MSC. OS-EV sono stati isolati dalle cellule HOS-143B utilizzando il metodo di centrifugazione differenziale standard. L'espressione dei tipici marcatori EV CD63, Hsp70 e TSG101 da oscillazioni occidentali ha confermato la presenza di OS-EV. (Figura 2A). L'assenza di segnale di calnexina indicava la purezza dell'isolamento OS-EV. Ulteriori indicazioni di purezza sono state osservate con TEM, con vesciche intatte di varie dimensioni presenti (Figura 2B). La concentrazione media di particelle OS-EV era 7,63x1011/mL (Figura 2C). La distribuzione delle dimensioni dei veicoli elettrici variava da 50 a 500 nm, con circa l'80% delle particelle che rientravano nell'intervallo di 50-200 nm (Figura 2D).

Gli AT-MSC sono stati trattati con OS-EV e il DNA è stato estratto dagli MSC in tempi diversi. La metilazione LINE-1 è stata analizzata da MS-MLPA e calcolata in termini di rapporto di dosaggio della metilazione. I risultati del TP 0 sono stati utilizzati per determinare i livelli di metilazione di base (linea tratteggiata) (Figura 3). A TP 3 (colonne verdi), è stata osservata una diminuzione del rapporto medio di dosaggio di metilazione LINE-1 nelle MSC quando trattata con OS-EV, che cade sotto i livelli di metilazione di base. Questo fenomeno ipometilante era più sottile a TP 7 (colonne blu), e il rapporto medio di dosaggio di metilazione era leggermente superiore sia nelle MSC non trattate che in quelli trattati con EV rispetto alla linea di base.

Figure 1
Figura 1: flusso di lavoro sperimentale. Gli EV sono stati isolati dalle cellule HOS-143B per centrifugazione differenziale e caratterizzati da gonfiore occidentale, TEM e NTA. Gli AT-MSC sono stati trattati con OS-EV in momenti diversi (TP 0, 3, an 7). Il DNA è stato estratto da MSC e la metilazione LINE-1 è stata analizzata dalla MSPA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Caratterizzazione dei veicoli elettrici. (A) La presenza di marcatori EV CD63, Hsp70 e TSG101 ha confermato la presenza di eV mediante gonfiore occidentale, mentre non sono state osservate bande per la calnexina, indicando la purezza dell'isolato EV. Sono stati caricati 10 g di proteine sia per il lisata proteica HOS-143B che per OS-EV. (B) TEM ha confermato la presenza di VEICOLi elettrici intatti di varie dimensioni nell'isolato. (C) La concentrazione delle particelle e la distribuzione delle dimensioni (D) degli OS-EV sono state determinate dalle misurazioni NTA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Rapporti di dosaggio di metilazione di LINE-1 da MSC non trattati o trattati con OS-EV. La linea grigia tratteggiata rappresenta il valore di metilazione della linea di base, corrispondente ai valori TP 0. Le colonne verdi rappresentano rapporti medi di dosaggio di metilazione senza e con il trattamento OS-EV per i campioni di TP 3, mentre le colonne blu rappresentano lo stesso per i campioni di TP 7. Entrambi i campioni di TP 3 e TP 7 hanno mostrato una diminuzione dei livelli di metilazione dopo il trattamento con OS-EV. Tuttavia, la differenza era maggiore nei campioni di TP 3, dove anche il livello di metilazione dopo il trattamento EV era inferiore al valore di base. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Ricette di mix di reagenti MSPA e programmi termociclista/PCR. I volumi menzionati rappresentano un campione di DNA. Va notato che la miscela di polimerasi deve essere preparata per 2 volte tanti campioni come le miscele precedenti, poiché ci sono due serie di tubi in questa fase. I dettagli del successivo programma termociclo o PCR sono forniti a destra.

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Discussion

Questo studio illustra come mspA può essere utilizzato per rilevare e quantificare lo stato di metilazione di uno specifico elemento genetico. LINE-1 è stato il focus qui, ma le sonde possono essere progettate per indirizzare una serie di geni e sequenze. Inoltre, c'è un elenco crescente di miscele di sonde disponibili per diverse applicazioni. MSPA è una tecnica semplice e robusta per l'analisi della metilazione del DNA che non richiede la conversione bisulfita10. La procedura completa dalla preparazione del campione all'analisi dei dati richiede circa 2 giorni, ma coinvolge solo 4-5 ore di lavoro pratico effettivo. È applicabile per piccole quantità di DNA (a partire da 70 ng), come dimostrato qui.

La parte più importante del protocollo di analisi della metilazione è la preparazione di sonde-mix personalizzati, come la sonda LINE-1 in questo studio. A causa delle loro diverse lunghezze, gli oligonucleotidi della sonda LINE-1 sono stati sintetizzati nell'intervallo di 4-40 nM, quindi la fase di dissoluzione e le successive diluizioni dovevano essere eseguite con attenzione, secondo le istruzioni del produttore25. Il PCR e diversi programmi termociclici del protocollo come usato qui differiscono da quelli nella versione del produttore originale.

Ci sono alcune precauzioni relative all'enzima HhaI. In primo luogo, il volume dell'enzima utilizzato nella miscela legatura-digestione dipende dal produttore e le versioni dell'enzima resistenti all'inattivazione del calore non sono adatte per MSPA. Con alcuni enzimi, ci possono essere casi di digestione incompleta, che comporterebbe la formazione di prodotti PCR difettosi e segnali di picco aberranti. Infine, la misura in cui i prodotti PCR finali vengono diluiti per l'elettroforesi capillare dipendono dalle sonde. È probabile che le esecuzioni iniziali implichino ottimizzazioni, per le quali si consiglia di testare una serie di diluizioni.

Ci sono alcune limitazioni della MSPA, come la natura selettiva della digestione del DNA mediata da HhaI. Hha Mi fende il DNA solo a sequenze GCGC non metilate e ignora altri casi di dinucleotidi CpG che non sono racchiusi da un G e C, anche se si trovano all'interno delle isole CpG. Di conseguenza, lo stato di metilazione di tali dinucleotidi (e quelli che si trovano al di fuori della sequenza di destinazione delle sonde) non può essere determinato. La sonda-mix LINE-1 può includere più sonde contenenti sequenze GCGC aggiuntive della regionepromotore 24, rappresentando così un maggior numero di siti di metilazione.

In alternativa, altri enzimi di restrizione specifici per la metilazione, come SacII e MluI, che hanno un sito di restrizione diverso da quello di HhaI possono essere inoltre utilizzati in MSPA, che può fornire una rappresentazione più ampia dei livelli di metilazione globali26. In secondo luogo, come osservato con i campioni di TP 7, le differenze nel rapporto di dosaggio di metilazione possono essere abbastanza sottili. Ciò può essere dovuto all'elevato numero di copie di LINE-1 nel genoma5, che hanno alti livelli di metilazione globale in condizioni normali e non saranno in gran parte influenzati da eventi di ipometilazione transitori solo in alcuni siti CpG. Inoltre, le MSC sono eterogenee in termini di stadio di differenziazione e del ciclo cellulare, che può influenzare il valore di metilazione di base. Infine, MSPA è in grado di rilevare solo differenze relative nella metilazione del DNA e richiede campioni di riferimento per questo motivo. In tali casi, i metodi che rilevano direttamente la metilazione locale possono essere più appropriati, anche se possono richiedere il passaggio27di conversione bisulfita.

Poiché questo studio ha coinvolto l'uso di vesciche extracellulari, abbiamo anche dimostrato la preparazione di FBS impoverito da EV, che è una componente essenziale dei mezzi di coltura cellulare per l'isolamento EV. L'ultracentrifugazione è un processo economico che può separare efficacemente i veicoli elettrici dal resto dell'FBS. Tuttavia, il 19 h di centrifugazione lo rende un metodo più dispendioso in termini di tempo rispetto alle alternative, come l'ultrafiltrazione e le versioni commerciali19. L'ultracentrifugazione richiede anche un'attenta manipolazione del campione, ad esempio quando si bilanciano i tubi prima della centrifugazione e si raccoglie il soldante in seguito. Nonostante queste sfide, è un metodo popolare per separare i veicoli elettrici dai fluidi biologici.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dal finanziamento del progetto dell'Università di Helsinki (WBS490302, WBS73714112) Finanziamento dello Stato ospedaliero universitario di Helsinki per la ricerca sanitaria a livello universitario (Y1014SUL05, TYH2016130), Finnish-Norwegian Medical Foundation, e la Selma e Maja-Lisa Selander Fund (Fondazione Minerva). Ringraziamo Walter Pavicic per aver fornito il protocollo MSPA modificato e per il relativo supporto tecnico. Siamo grati a Teemu Masalin (Università di Helsinki) per averci aiutato con la produzione video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe Terumo SS+01T1 for NTA
24-well plate Corning 3524 MSC cell culture
3730xl DNA Analyzer Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific 3730XL
50 mL centrifuge tube Corning 430829
Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge Beckman
BlueStar Prestained Protein Marker Nippon Genetics MWP03 WB: protein marker
Calnexin (clone C5C9) Cell Signaling Technology 2679 WB, dilution 1:800
CD63 (clone H5C6) BD Biosciences 556019 WB, dilution 1:1000
Centrifuge 5702 R Eppendorf 5703000010 For conditioned media and cells
Centrifuge 5810 Eppendorf 5810000010 For spinning down 96-well plate
Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm) Beckman 331374 Ultracentrifugation
DMEM/F-12 + GlutaMAX medium Gibco, Life Technologies 31331-028 For AT-MSC culture
Fetal bovine serum Gibco, Life Technologies 10270-106
GeneScan 500 LIZ size standard Applied Biosystems, Life Technologies 4322682 for capillary electrophoresis
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2-10RXN for MSPA negative control
Hi-Di formamide Applied Biosystems, Life Technologies 4311320 for capillary electrophoresis
HOS-143B cell line ATCC CRL-8303
Hsp70 (clone 5G10) BD Biosciences 554243 WB, dilution 1:1000
IRDye 800CW Goat anti-mouse Li-Cor 926-32210 WB: secondary
IRDye 800CW Goat anti-rabbit Li-Cor 926-32211 WB: secondary
LINE-1 probe-mix primers IDT Sequences in Table 1
MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode Applied Biosystems, Life Technologies 4306737 also requires sealing film
Micro BCA Protein Assay kit ThermoFisher Scientific 23235 measure protein concentration
MiniProtean TGX 10% gels Bio-Rad 456-1034 WB: gel electrophoresis
NanoSight LM14C Malvern Instruments for NTA
Nitrocellulose membrane 0.2 µm Bio-Rad 1620112 WB: protein transfer
NucleoSpin Tissue XS Macherey-Nagel 740901.50 for DNA extraction
Odyssey Blocking Buffer Li-Cor 927-40000 WB: blocking, antibodies
PBS, 1X Corning 21-040-CVR
Penicillin-streptomycin Gibco, Life Technologies DE17-602E Antibiotics for culture media
Protein LoBind tube, 0.5 mL Eppendorf 22431064 For storing Evs
REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit Li-Cor 926-11015 WB: total protein staining
RKO cell line ATCC CRL-2577 for MSPA positive control
RPMI medium 1640 + GlutaMAX Gibco, Life Technologies 61870-010 For HOS-143B cell culture
SALSA MLPA HhaI enzyme MRC-Holland SMR50
SALSA MLPA reagent kit MRC-Holland EK1-FAM
SALSA MLPA P300 probe-mix MRC-Holland P300-100R
Swinging rotor SW-28 Beckman Coulter 342207 Ultracentrifugation
Syringe filter, 0.22 µm Jet Biofil FPE-204-030 sterile filtering FBS
Tecnai 12 FEI Company equipped with Gatan Orius SC
1000B CCD-camera
(Gatan Inc., USA); for TEM
TBS, 1X tablets Medicago 09-7500-100 WB: buffer
Trans-Blot Turbo Bio-Rad WB: transfer
Thermal cycler ThermoFisher Scientific TCA0096
TrypLE Express Gibco 12604-021 for trypsinization of cells
TSG101 (clone 4A10) Sigma SAB2702167 WB, dilution 1:500

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References

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