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用骨肉瘤衍生细胞外囊泡处理的美相干细胞中的LINE-1甲基化分析

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Genetics

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Summary

这里描述的是使用甲基化特异性探针扩增方法分析使用骨肉瘤衍生的细胞外囊泡治疗的中位体干细胞中LINE-1元素的甲基化水平。也演示了超中心化,一种从胎儿牛血清中分离细胞外囊泡的常用程序。

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Sinha, S., Mannerström, B., Seppänen-Kaijansinkko, R., Kaur, S. LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (156), e60705, doi:10.3791/60705 (2020).

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Abstract

甲基化特异性探针扩增(MSPA)是一种简单而可靠的技术,可用于检测DNA样本甲基化水平的相对差异。它是足智多谋的,需要少量的DNA,需要大约4~5小时的动手工作。在所提出的技术中,DNA样本首先变性,然后杂交为以甲基化或参考位点的DNA为目标作为对照的探针。杂交DNA被分离成平行反应,一个只进行结扎,另一个进行结扎,随后在未甲基化GCGC序列下HhaI介导消化。由此产生的DNA片段被PCR扩增,并通过毛细血管电泳分离。HhaI 不消化甲基化 GCGC 位点并产生峰值信号,而未甲基化 GCGC 位点被消化,不生成峰值信号。比较每个样本的消化和未消化版本的控制-归一化峰可提供DNA样本的甲基化剂量比。在这里,MSPA用于检测骨肉瘤衍生的细胞外囊泡(EV)对间质干细胞中长穿插核元素1(LINE-1)甲基化状态的影响。LINE-1是重复性DNA元素,通常在癌症中进行低甲基化,以这种能力,可以作为生物标志物。超离心也被用作从生物液体中分离细胞外囊泡的具有成本效益的方法(即,在制备EV耗尽的胎儿牛血清[FBS]和从骨肉瘤调节介质中分离EV[差分离离]时)。对于甲基化分析,定制LINE-1探针设计用于针对LINE-1启动器序列中的三个甲基化位点和七个控制位点。该协议演示了使用MSPA进行LINE-1甲基化分析,并描述了通过超离心制备EV-耗尽FBS。

Introduction

DNA甲基化是发生在人类细胞中的一种主要的表观遗传修饰。脱氧核糖核酸甲基化是指甲基组与CpG二核苷酸中细胞氨酸残留物的联系。这种核苷酸通常存在于基因1的5'区域的簇(CpG岛)中。在正常细胞中,大多数的二核苷酸处于非甲基化状态,这允许DNA转录。顺便说一句,许多癌症都与高甲基化CpG岛和转录组沉默2有关,特别是在肿瘤抑制基因中,这反过来又促成了癌症3的各种特征。

另一方面,长穿插的核元素1(LINE-1s或L1s)是重复的、可转位DNA元素,在CpG岛屿通常具有高水平的甲基化。LINE-1的甲基化可防止易位,有助于维持基因组的完整性。在几种类型的癌症中,LINE-1被甲基化,导致活化和随后逆转介导染色体不稳定4。LINE-1占人类基因组5的近17%,其甲基化状态可作为全球基因组甲基化水平6的指标。全球LINE-1低甲基化被认为是在细胞过渡到肿瘤表型7之前;因此,它有望成为早期癌症发病的潜在标志物。

目前,甲基化分析有几种方法,包括热测序、甲基化特异性PCR、微阵列和染色质免疫沉淀1。下一代测序的使用也使得有可能纳入全基因组的DNA甲基化检测方法。这些方法中有许多依赖于双硫酸盐处理的DNA,其中未甲基化的细胞氨酸转化为尿素,甲基化的细胞氨酸保持不变。然而,使用双硫酸盐处理的DNA有几个陷阱,如未甲基化的细胞氨酸不完全转化为尿素,有偏颇的序列扩增,和测序错误8。

在甲基化特异性探针扩增(MSPA)中,由两个寡核苷酸靶向DNA序列的探针靶向DNA序列,该DNA序列含有甲基化敏感限制性酶HhaI9的限制性位点(GCGC)。探针杂交为DNA后,每个样本被分成两组。第一组中的探针进行结扎,而第二组中的探针进行结扎,随后在未甲基化CGCG位点进行HhaI介导消化。两组样品然后由PCR放大,产品通过毛细血管电泳分离。未甲基化位点的探针由HhaI消化,在PCR期间不放大,因此没有峰值信号。相比之下,甲基化位点的探针受到保护,防止消化,因此在PCR期间被放大,随后产生峰值信号10。

与替代方法不同,MSPA 具有几个优点。首先,它需要少量的DNA(50-100 ng),非常适合分析从正式固定石蜡嵌入样品10的DNA。它不需要双硫酸盐处理的DNA;事实上,它不适合以这种方式修饰的DNA。可以同时分析许多样品,并设计MSPA探针,以便它们同时针对多个基因或序列。此外,探针是特定和敏感的甲基化DNA,因为HhaI限制位点对应于一个典型的CpG岛屿10序列。

本研究调查了骨肉瘤(OS)衍生的细胞外囊泡(EV)对脂肪组织衍生的中质性干细胞(AT-MSCs;图 1.EV 是纳米级、膜结合的囊泡,由大多数细胞类型分泌。它们携带蛋白质、脂质、mRNA、微RNA和来自母细胞11、12的其他分子。EV调解细胞间通信,并在几种病理生理条件下发挥重要作用13,14。最近的一项研究显示,癌症衍生的EV可能将活性LINE-1转移到受体细胞15。此前有报道称,除了其他遗传效应16外,来自HOS-143B细胞系的EV可以改变MSCs中LINE-1的甲基化状态。

当为EV分离而生长细胞时,在生长培养基中使用EV耗尽的胎儿牛血清[FBS]很重要,因为FBS衍生的EV可能会干扰来自其他来源的EV,并妨碍结果17,18。超中心化是消耗 FBS EV 的最常见方法之一。与超滤和商业EV耗尽FBS19等替代品相比,这是一个相对简单和具有成本效益的程序。在这里,该协议还演示了如何通过超离心来制备EV耗尽的FBS。

本文为上述技术提供了详细的协议,从从OS细胞系分离EV到在OSEV处理MSC中的LINE-1甲基化分析(图1)。

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Protocol

这项研究得到了赫尔辛基和乌西马医院区道德委员会的批准(道德批准D.217/13/03/02/2015)。

1. 通过超离心制备EV耗尽FBS

  1. 将 FBS 放入(超)离心管中,并将其放入超离心桶中。为确保超离心平稳、安全地运行,将水桶彼此平衡在 10 mg 以内。
  2. 在摆动转子上装载铲斗(SW28 型,k 因子 246)。将转子置于超离心机中,在 4°C 下以 100,000 x g运行 19 小时。
  3. 小心地收集上清液的浅色上层(约十分之九),并转移到 50 mL 管中。请勿干扰或移液深棕色颗粒,因为它包含来自 FBS 的 EV。
  4. 通过 0.22 μm 过滤器将上清液传递到新的 50 mL 管中。
  5. 在培养用于 EV 隔离的细胞时,将过滤灭菌、EV 耗尽的 FBS 添加到细胞培养基。

2. 骨肉瘤衍生EV的隔离

  1. 带 RPMI 1640 介质的 T-175 烧瓶中的板 OS 细胞(HOS-143B 细胞系),辅以 10% 正常 FBS 和 1% 抗生素(100 U/mL 青霉素,0.1 mg/mL 链霉素)。将烧瓶置于37°C和5%CO2的培养箱中。
  2. 当烧瓶为70%~80%的汇入时,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞,然后在含有10%EV耗尽FBS(以下简称EV耗尽介质)的介质中生长。
    注:T175烧瓶中镀有1 x 106 HOS-143B的电池在大约60小时后达到70%的汇合率。
  3. 在接下来的48小时中,每24小时后从骨肉瘤细胞收集条件介质,并添加新鲜的EV耗尽介质。
  4. 在 2500 x g下在 4°C 下将调节介质离心 20 分钟,以清除细胞和细胞碎片。将上清液转移到新管中,在底部留下约 2 mL 的介质。
    注:如果在此阶段不直接进行 EV 隔离,则上清液可存储在 -80 oC。
  5. 将上清液倒入超离心管中,并像更早一样平衡它们。在 4°C 下在 100,000 x g下将管离心 2 小时。
  6. 小心地丢弃上清液,在底部留下大约 1 mL。将约 20 mL 的 PBS(0.1 μm 过滤)加入管中,轻轻清洗和重新悬浮 EV 颗粒。
  7. 平衡管,并在相同的设置下执行另一轮超离心。
  8. 通过温和的移液小心地去除上清液,并在 200 μL 的 PBS 中重新悬浮 EV 颗粒。将 EV 存放在低装订管中。
    注:电动汽车可以直接使用,也可以储存在-80°C中,直到需要。

3. 操作系统-电动汽车的特征

注:纯化EV的特征可以是西方印迹(WB)、纳米粒子跟踪分析(NTA)和透射电子显微镜(TEM)16。

  1. 按照标准协议16执行WB,使用EV标记CD63、TSG101和Hsp70,用钙化辛作为负对照,以指示EV样品20的纯度。
  2. 对于NTA,首先以0.1μm过滤的Dulbeco的PBS稀释EV样品,以获得(理想情况下)每帧30~100个颗粒。
    1. 将约 500 μL 的样品放入 1 mL 注射器中,并将其加载到 NTA 仪器的进气口中。检查每帧是否有足够的颗粒,以便进行精确测量。
    2. 打开 NTA 软件,在环境温度下使用摄像机级别 13 录制 5 个持续时间为 60 度的视频。在分析过程中,使用检测阈值 = 5 和增益 = 10。
  3. 按前21名的 TEM 分析 EV 样本。

4. AT-MSC文化

注:用于间质干细胞分离的人体脂肪组织作为抽脂吸气提供(芬兰激光蒂尔卡有限公司整形外科)。书面知情同意来自脂吸药捐赠者,他们正在接受选择性抽脂手术。

  1. 使用标准机械和酶分离方法将AT-MSC从抽脂吸吸中分离22。
    注:也可使用来自其他来源(包括商用细胞系)的MSC。
  2. DMEM/F-12培养细胞辅以10%FBS和1%抗生素。

5. 使用 OS-EV 处理 MSC

  1. 24 孔板中每孔板 15,000 个 AT-MSC 板。
  2. 24 小时后,取出旧介质,使用 PBS 清洗细胞,并更改为 EV 耗尽介质。
  3. 在第1天(细胞粘附后24小时)、第3天(第1天后48小时)和第5天(第1天后96小时)使用OS-EV(每细胞的粒子浓度为1 x106 EV)治疗细胞。
    1. 在第 1 天停止时间点 (TP) 0 样本的 OS-EV 处理,在第 3 天停止 TP 3 样本,在第 7 天(第 5 天之后 48 小时)停止 TP 7 样本。
      注:也可以遵循实验计划的其他时间表。
  4. 使用适当的方法从 MSC 中提取 DNA。包括用于数据分析的正负控制样本。

6. LINE-1甲基化测定

  1. 设计定制的LINE-1探针引体,如之前由Pavicic等人23。对于甲基化探针,选择三个序列,在LINE-1的启动器区域内包含HhaI限制位点。对于控制探测器,从 LINE-1 序列的其余部分选择缺少HhaI 限制站点的七个序列。
    注: LINE-1 序列可在 GenBank 数据库24(L1.2,加入编号)上找到。AH005269.2. 使用 MSPA 制造商的说明设计探头25
  2. 在TE缓冲液中稀释70纳克的DNA样本至5μL体积。
  3. 执行表 1中提到的后续热循环和 PCR 步骤。在98°C下加热样品10分钟,然后冷却至25°C。
  4. 在每个样品中加入3μL探针杂交混合物,并运行热循环器,使探针与DNA杂交。
  5. 在室温 (RT) 下,在每个样品中加入 13 μL 的杂交后混合物。将 10 μL 转移到第二管。
  6. 将两组管子放入热循环器中,并在 48°C 孵育至少 1 分钟。
    1. 当样品在48°C时,将10μL的结扎混合物添加到第一组管(未消化系列)和10μL的结扎消化混合物到第二组管(消化系列)。运行下一个热循环器程序。
  7. 旋转管,同时将热循环器设置为 72°C。
  8. 在每个管中加入5μL的聚合酶混合物,并将管放入热循环器中。运行 PCR 程序。
  9. 在 PCR 程序运行时,准备含有 2.5 μL 尺寸标准的 1 mL 形式酰胺溶液。这种溶液的移液器10μL,用于光学96孔板(带条形码)的每个孔。
  10. PCR后,在超纯水中将未消化和消化的样品分别稀释至1:100和1:200。将 2 μL 的稀释 PCR 产物添加到 96 孔板中。将板在 200 x g下离心 15-20 s,以去除气泡。
  11. 通过毛细血管电泳对样品进行片段分析。
    注:板应在黑暗中储存在4°C下,直到分析。

7. 片段数据分析

  1. 打开毛细管电泳会导致电图分析软件。
    1. "面板"列下,对于其中一个示例,从菜单中选择MLPA。单击"面板"标题,然后按Ctrl_DMLPA应用于所有示例。
    2. 同样,将"分析"方法设置为所有样本的Micro 卫星默认值
    3. 选择所有样本,然后单击"绿色播放"按钮,根据所选设置分析样本。
    4. 选择所有样本,然后单击"图形"按钮以可视化探头峰值。
    5. 放大峰值区域,使单个探头峰值的分辨率更高。确保标有与 LINE-1 探头混合中的探头对应的所有 10 个峰值。丢弃额外的峰值(<95 bp 和 >160 bp)。
    6. 基因类型选项卡中,以逗号分隔值 (CSV) 格式导出结果。
  2. 在数据分析软件中打开 CSV 文件,并将数据分类为列。
    1. 根据三个甲基化位点的峰值根据其近似尺寸标记(L1-1m 在 153 bp,L1-2m 在 119 bp,L1-3m 在 133 bp)。其余七个峰值对应于控制探测器。
      注:这里使用L1-2m探针峰的值,其大小为117 bp,因为该区域已用于大多数LINE-1甲基化测定23。
    2. 对于每个样本(未消化和消化),计算所有七个控制峰值的总和峰值面积。将每个 LINE-1 探头的峰值区域除以此总和。
    3. 对于每个 DNA 样本,使用以下等式将消化样本的值除以未消化样本的值,以获得甲基化剂量比 (DM):
      Equation 1
      其中:DM是甲基化剂量比,Ax是峰值x下的区域(例如 L1-2m 峰值),Actrl是所有七个控制探针的总和峰值区域。

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Representative Results

本研究的主要目的是评估OS-EV对MSCs的表观遗传效应。使用标准差分离离法从HOS-143B细胞中分离出OS-EV。典型的EV标记CD63,Hsp70和TSG101的西方印迹的表达证实了OS-EV的存在。(图2A)没有钙毒素信号表明OS-EV隔离物的纯度。使用 TEM 观察到了纯度的其他指示,存在各种尺寸的完整囊泡(图 2B)。OS-EV粒子平均浓度为7.63x1011/mL(2C)。EV 的大小分布范围为 50-500 nm,约 80% 的颗粒在 50-200 nm 范围内(图 2D)。

AT-MSCs使用OS-EV进行处理,DNA在不同的时间点从MSC提取。LINE-1甲基化由MS-MLPA分析,并计算甲基化剂量比。TP 0 的结果用于确定基线甲基化水平(虚线) (图3)。在TP 3(绿色列),在使用OS-EV治疗时,在MSC中观察到平均LINE-1甲基化剂量比下降,低于基线甲基化水平。这种低甲基化现象在TP 7(蓝色柱)更微妙,在未处理和EV处理的MSCs中,平均甲基化剂量比略高于基线。

Figure 1
图1:实验工作流。EV通过差分离离从HOS-143B细胞中分离出来,其特征是西方印迹、TEM和NTA。AT-MSC 在不同时间点(TP 0、3、7)使用 OS-EV 进行处理。从MSCs中提取DNA,通过MSPA分析LINE-1甲基化。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:电动汽车的特征。(A) EV标记CD63、Hsp70和TSG101的存在证实了通过西方印迹存在EV,而未观察到钙化酶带,表明EV分离物的纯度。HOS-143B蛋白莱沙和OS-EV均加载了10μg蛋白质。(B) TEM确认隔离物中存在各种尺寸的完整EV。(C) OS-EV的粒子浓度和(D)尺寸分布由NTA测量确定。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:未经处理或使用OS-EV治疗的MSCLINE-1的甲基化剂量比。虚线灰色线表示基线甲基化值,对应于 TP 0 值。绿色柱表示 TP 3 样品没有和带有 OS-EV 处理的平均甲基化剂量比率,而蓝色列表示 TP 7 样品的平均甲基化剂量比率。TP 3 和 TP 7 样本均显示使用 OS-EV 治疗后甲基化水平下降。然而,在TP3样品中差异较大,在TP3样品中,EV处理后的甲基化水平也低于基线值。请点击此处查看此图的较大版本。

表1:MSPA试剂混合配方和热循环器/PCR程序。上述体积代表一个DNA样本。需要注意的是,聚合酶混合物应制备2倍于先前混合的样品,因为在这个阶段有两组管。后续热循环或 PCR 计划的详细信息见于右侧。

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Discussion

这项研究说明了如何使用MSPA检测和量化特定遗传元素的甲基化状态。LINE-1是这里的焦点,但探测器可以设计为针对一系列基因和序列。此外,可用于不同应用的探头混合物越来越多。MSPA是一种简单而可靠的DNA甲基化分析技术,不需要双硫酸盐转化10。从样品制备到数据分析的完整过程大约需要 2 天,但仅涉及 4~5 小时的实际动手工作。它适用于少量的DNA(低至70 ng),如此处所示。

甲基化分析协议最重要的部分是制备定制探针混合物,如本研究中的LINE-1探针混合。由于其长度不同,LINE-1探针寡核苷酸在4~40 nM范围内合成,因此必须按照制造商的说明25小心执行溶解步骤和随后的稀释。此处使用的 PCR 和协议的几个热循环程序与原始制造商版本中的 PCR 和几个热循环程序不同。

有一些与HhaI酶有关的预防措施。首先,结扎消化混合物中使用的酶的体积取决于制造商,并且耐热灭活化的酶版本不适合 MSPA。使用某些酶时,可能会出现消化不全的情况,从而导致 PCR 产物和异常峰值信号的形成。最后,最终PCR产物在毛细血管电泳中稀释的程度取决于探头。初始运行可能涉及优化,建议对其进行测试一系列稀释。

MSPA有一定的局限性,例如HhaI介导的DNA消化的选择性。哈哈我只在未甲基化GCGC序列处切割DNA,而忽略没有G和C封闭的CpG二核苷酸的其他实例,即使它们位于CpG岛内。因此,无法确定此类二核苷酸(以及位于探针目标序列之外的)的甲基化状态。LINE-1探针混合可以包括更多含有来自启动子区域24的附加GCGC序列的探针,从而代表更多的甲基化位点。

或者,其他甲基化特异性限制性酶,如SacII和MluI,具有不同于HhaI的限制位点,可以在MSPA中另外使用,这可能提供全球甲基化水平26的更广泛表示。其次,正如在TP 7样品中观察到的,甲基化剂量比的差异可能相当微妙。这可能是由于基因组5中LINE-1的拷贝数量高,在正常条件下,这些基因具有高水平的全球甲基化,并且基本上不会受到少数CpG位点的瞬态低甲基化事件的影响。此外,MSC在分化阶段和细胞周期方面是异质的,这会影响基线甲基化值。最后,MSPA只能检测DNA甲基化的相对差异,并因此需要参考样本。在这种情况下,直接检测局部甲基化的方法可能更合适,尽管它们可能需要双硫酸盐转化步骤27。

由于这项研究涉及细胞外囊泡的使用,我们还演示了EV耗尽FBS的制备,这是细胞培养基培养基的EV分离的重要组成部分。超中心化是一个廉价的过程,可以有效地将 EV 与 FBS 的其余部分分开。然而,19小时的离心使得它比替代品更耗时的方法,如超滤和商业版本19。超离心还需要仔细处理样品,例如,在离心前平衡管,然后收集上清液。尽管存在这些挑战,但它是将EV与生物流体分离的常用方法。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作由赫尔辛基大学项目资助(WBS490302,WBS73714112)赫尔辛基大学医院国家资助大学一级健康研究(Y1014SUL05,TYH2016130),芬兰-挪威医学基金会和塞尔玛和马亚-丽莎·塞兰德基金(米内尔瓦基金会)。我们感谢瓦尔特·帕维奇提供经过修改的 MSPA 协议和相关技术支持。我们感谢特穆·马萨林(赫尔辛基大学)帮助我们制作视频。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe Terumo SS+01T1 for NTA
24-well plate Corning 3524 MSC cell culture
3730xl DNA Analyzer Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific 3730XL
50 mL centrifuge tube Corning 430829
Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge Beckman
BlueStar Prestained Protein Marker Nippon Genetics MWP03 WB: protein marker
Calnexin (clone C5C9) Cell Signaling Technology 2679 WB, dilution 1:800
CD63 (clone H5C6) BD Biosciences 556019 WB, dilution 1:1000
Centrifuge 5702 R Eppendorf 5703000010 For conditioned media and cells
Centrifuge 5810 Eppendorf 5810000010 For spinning down 96-well plate
Centrifuge tube (polyallomer, 14x95 mm) Beckman 331374 Ultracentrifugation
DMEM/F-12 + GlutaMAX medium Gibco, Life Technologies 31331-028 For AT-MSC culture
Fetal bovine serum Gibco, Life Technologies 10270-106
GeneScan 500 LIZ size standard Applied Biosystems, Life Technologies 4322682 for capillary electrophoresis
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2-10RXN for MSPA negative control
Hi-Di formamide Applied Biosystems, Life Technologies 4311320 for capillary electrophoresis
HOS-143B cell line ATCC CRL-8303
Hsp70 (clone 5G10) BD Biosciences 554243 WB, dilution 1:1000
IRDye 800CW Goat anti-mouse Li-Cor 926-32210 WB: secondary
IRDye 800CW Goat anti-rabbit Li-Cor 926-32211 WB: secondary
LINE-1 probe-mix primers IDT Sequences in Table 1
MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode Applied Biosystems, Life Technologies 4306737 also requires sealing film
Micro BCA Protein Assay kit ThermoFisher Scientific 23235 measure protein concentration
MiniProtean TGX 10% gels Bio-Rad 456-1034 WB: gel electrophoresis
NanoSight LM14C Malvern Instruments for NTA
Nitrocellulose membrane 0.2 µm Bio-Rad 1620112 WB: protein transfer
NucleoSpin Tissue XS Macherey-Nagel 740901.50 for DNA extraction
Odyssey Blocking Buffer Li-Cor 927-40000 WB: blocking, antibodies
PBS, 1X Corning 21-040-CVR
Penicillin-streptomycin Gibco, Life Technologies DE17-602E Antibiotics for culture media
Protein LoBind tube, 0.5 mL Eppendorf 22431064 For storing Evs
REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit Li-Cor 926-11015 WB: total protein staining
RKO cell line ATCC CRL-2577 for MSPA positive control
RPMI medium 1640 + GlutaMAX Gibco, Life Technologies 61870-010 For HOS-143B cell culture
SALSA MLPA HhaI enzyme MRC-Holland SMR50
SALSA MLPA reagent kit MRC-Holland EK1-FAM
SALSA MLPA P300 probe-mix MRC-Holland P300-100R
Swinging rotor SW-28 Beckman Coulter 342207 Ultracentrifugation
Syringe filter, 0.22 µm Jet Biofil FPE-204-030 sterile filtering FBS
Tecnai 12 FEI Company equipped with Gatan Orius SC
1000B CCD-camera
(Gatan Inc., USA); for TEM
TBS, 1X tablets Medicago 09-7500-100 WB: buffer
Trans-Blot Turbo Bio-Rad WB: transfer
Thermal cycler ThermoFisher Scientific TCA0096
TrypLE Express Gibco 12604-021 for trypsinization of cells
TSG101 (clone 4A10) Sigma SAB2702167 WB, dilution 1:500

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References

  1. Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
  2. Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
  3. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144, (5), 646-674 (2011).
  4. Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
  5. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
  6. Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Cancer Research. 66, 8462 (2006).
  7. Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
  8. Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21, (11), 4067-4068 (2005).
  9. Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).
  10. Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33, (14), 128 (2005).
  11. El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
  12. Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6, (7), 4953-4967 (2015).
  13. Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
  14. Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris". Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
  15. Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).
  16. Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14, (4), 352-364 (2019).
  17. Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).
  18. Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175 (2016).
  19. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).
  20. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30, (1), 1-29 (2006).
  21. Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7, (16), 3824 (2017).
  22. Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66, (11), 1494-1503 (2013).
  23. Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
  24. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2). Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269 (2000).
  25. Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland. Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018).
  26. Takara Bio Inc. Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018).
  27. Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189, (3), 513-520 (2019).

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