מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Inal, M. A., Banzai, K., Kamiyama, D. Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (155), e60716, doi:10.3791/60716 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אנו מתארים טכניקה לנסיגה של הנוירונים מוטוריים בדרוסופילה. אנו משתמשים בדיו מומס שמן ולספק droplet קטן להכנת פילה עובריים על ידי מיקרומזרק. כל תא העצב מנוע שהקרום שלו נוצר על ידי ה-droplet יכול להיות מתויג במהירות. מנוע נוירונים בודדים מתויג ברציפות, המאפשר פרטים מבניים עדינים להיות דמיינו בבירור. בהינתן כי הצבעים ליפופילית מגיעים בצבעים שונים, הטכניקה מספקת גם אמצעי לקבל הנוירונים סמוכים המסומנים בצבע רב. טכניקת העקיבה הזאת שימושית לצורך לימוד מורפולגנזה וקישוריות סינפטית במערכת העצב המוטורית של דרוזוהילה.

Introduction

מערכת העצב המוטורית העובריים של דרוסופילה מציעה מודל ניסיוני רב-עוצמה כדי לנתח את המנגנונים שבבסיס הפיתוח של מערכת העצבים המרכזית (cn)1,2,3. מערכת העצב המוטורית היא קלה לטכניקות ביוכימיות, גנטיות, דימות ואלקטרופיזיולוגיה. באמצעות טכניקות, מניפולציות גנטיות וניתוחים פונקציונליים ניתן לבצע ברמת הנוירונים מנוע יחיד2,4,5,6.

במהלך ההתפתחות המוקדמת של מערכת העצבים, הפער המפורז ויצירת מספר רב של גליה ונוירונים. מערכת היחסים הטמפורלית בין הדלאמנציה לבין ביטוי הגנים פרופיל של neuroblasts נחקרו בעבר בפירוט7,8,9. במקרה של מערכת תא העצב מנוע, היווצרות של הצומת העצבי העובריים (NMJ) נחקרו בהרחבה באמצעות aCC (תא בפינה הקדמית), RP2 (סרטנים גולמיים 2), ו RP5 מוטוריים נוירונים2,10. למשל, כאשר תא העצב המוטורי RP5 מהווה צומת סינפטיות המתהווה, הפרה-סינפטית ופוסט-סינפטית התערבבו בין11,12,13. תקשורת סלולרית ישירה כזו חיונית ליזום את היווצרות NMJ. בניגוד למה שאנחנו יודעים על הענפים העצביים ההיקפית, הידע שלנו איך הדנדריטים מוטוריים ליזום קישוריות סינפטית בתוך ה-CN הוא עדיין פרימיטיבי.

בדו ח זה, אנו מציגים טכניקה המאפשרת התיוג נסיגה של נוירונים מוטוריים העוברים באמצעות מיקרופיפטה-תיווך משלוח של צבעי ליפוליים. טכניקה זו מאפשרת לנו לעקוב אחר 38 הנוירונים מנוע innervating כל אחד 30 שרירי הקיר הגוף בפלח חמי ב 15 h לאחר הנחת ביצה (ח. א.)14. על-ידי שימוש בטכניקה זו, הקבוצה שלנו חקרה ביסודיות מספר רב של כולל של הפונקציה/אובדן של התפקוד הכולל,15,16,17. לאחרונה יש לנו את המנגנונים המולקולריים כי הכונן ייזום של קישוריות מוטורית של דנדריטים והפגינו כי Dscam1-Dock-פאק האינטראקציה מגדירה את האתר של דנדריטים מוצלח בתוך תא מנוע aCC17. באופן כללי, טכניקה זו היא להתאמה לניתוח פנוטיפ של כל הנוירונים מוטוריים מתחלקים בסוג פראי או זנים מוטציה, שיפור היכולת שלנו לספק תובנות חדשות לתוך העיצוב הפונקציונלי של מערכת העצבים Drosophila ילה .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ציוד ואספקה

  1. חומרים לאיסוף עוברים והכשרת מבוגרים להטיל ביצים
    1. הכן את מנגנון הסינון על ידי ניתוק שפופרת 50 mL וחיתוך לפתוח חור כובע כדי להגדיר מסנן רשת שינוי עם נקבוביות של 100 יקרומטר (טבלת חומרים) בין הצינור לבין הכובע.
      הערה: לחלופין, משתמשים בתאים עם נקבוביות של 100 יקרומטר (טבלת חומרים) יכולים לשמש לשלב הסינון של אוסף העובר.
    2. הפוך את הצלחות אגר עם ענבים אגרמראש (לוח חומרים) לפי ההוראות המפורטות. בקצרה, מערבבים בעדינות חבילה אחת של תערובת אבקת לתוך 500 mL של טמפרטורת החדר (RT, 23 ° c) dH2O ו מיקרוגל את התערובת מומס לרתיחה נמרץ. לאחר הצינון עד 70 מעלות צלזיוס, יוצקים את התערובת לתוך מנות פטרי (60 מ"מ). לאחר אגר מתחזק, לאחסן צלחות ב 4 ° c.
    3. הכינו משחה שמרים על ידי ערבוב שמרים יבשים פעילים (לוח חומרים) ומים כדי עקביות הדבקה, ולשמור ב 4 ° c.
    4. השתמש בכלובים לאיסוף ביצים (עבור צלחת פטרי 60 מ"מ, לוח חומרים) המספקים זרימת אוויר מספקת.
  2. הכנת מחטי חיתוך ומיקרופיפטות להזרקת צבע
    1. הכנת מיקרופיפטה הזרקת צבע והמחט לחיתוך מצינור נימי אותו עם קוטר פנימי של 0.6 מ"מ וקוטר חיצוני של 1.2 מ"מ (טבלת חומרים). משוך את אבובים נימי ידי פולר מיקרופיפטה ב 7% מ 170 V התפוקה המקסימלית (טבלת חומרים) כדי ליצור מחט חדה עם להתחדד של ~ 0.4 ס מ אורך.
    2. להזרקת צבע, התאימו את המיקרופיפטה עם מיקרופיפטה בובליר (טבלת חומרים) בטכניקת מסתובב בועה המתוארת במדריך לכלי.
      1. בקיצור, להשרות את המטחנה עם סוכן הרטבה (טבלת חומרים) כדי למנוע את המים מתוך "גרירת" קצה המחט. הניחו את המחט על מהדק המיקרו-פיפטה ב -25 לחצי והורידו את הקצה לשני שלישים מרדיוס היציאה ממרכז המשטח הפנימי. לטחון את המחט בעוד מזרק עם אבובים דוחף אוויר לתוך המחט, כדי להבטיח כי המיקרופיפטה יהיה ברור של שבבי זכוכית.
      2. סמן את המיקרו-פיפטה עם סמן קבוע של עצה קבועה כדי לציין את מיקום הפתיחה בטיפ לאחר שיפוע כפי שהוא מאתגר לאתר את הפתיחה הצר של המיקרופיפטה שנוצר בזווית.

2. הכנה לקולקציית העובר

  1. ודא שהמבוגרים מעופפים (20-40 לאחד מהקנטון או הלבן זבובים), זכרים ונקבות, מתוחזקים בגיל צעיר (< 7 ימים) ותנאים בריאים לאוסף הביצים האידיאלי.
    הערה: כדי לעודד הנחת ביצים, זבובים מאומנים בכלוב אוסף הביציות שלהם כמה ימים לפני איסוף ביצים על צלחות אגר מושחז עם שמרים להדביק לפחות פעם אחת בכל יום.

3. העובר הזמני

  1. לאפשר זבובים להטיל ביצים בלילה (או לפחות 15 h) ב RT כדי לאסוף את העוברים ב 15 h ח, כלומר, שלב 1618, כדי להציג את הדנדטוגנזה של ACC ו RP3 מוטוריים נוירונים. בבוקר, אספו את הצלחת. עם הביצים
    הערה: העוברים ב-15 למטה יהיו בעלי בטן בעלת4 מונים. עבור הדמיה בשלבים שונים בעקבות קריטריונים מורפולוגיים ספציפיים שלהם תנאי ההזדקנות.
  2. כדי לאסוף את העוברים, הביצים הניח על הצלחת עם 50% אקונומיקה עבור 5 דקות.
  3. לאחר הורמונים נוקו, יוצקים את התוכן של הצלחת דרך מכשיר סינון או מסננת תאים כדי לבודד את העוברים. באמצעות בקבוק מים לסחוט, לדלל את האקונומיקה שמאל על הצלחת ולאסוף כמו עוברים רבים ככל האפשר על ידי בקבוקי את התערובת לתוך המסנן.
  4. שטפו את העוברים על הפילטר 3-4x עם מים נוספים או עד שהריח האקונומיקה מתמוסס. הסירו את הפילטר מהמנגנון ושטפו את העוברים על צלחת נקייה אחרת עם מים. הללו את המים מהצלחת הלוח החדש שהעוברים מעליהם.
  5. הכינו שקופית זכוכית על-ידי כיסוי הנייר עם שתי שכבות של קלטת ויניל במרכז, ויצרו מלבן. חותכים בריכה מלבנית מתוך הקלטת באמצעות להב תער. הניחו רצועה דקה של קלטת דו צדדית לכיוון הקצה העליון של הבריכה, שם ימוקמו העוברים כמוצג באיור 1.
  6. בעזרת מלקחיים עדינים, בוחרים באופן אינדיבידואלי 5-10 עוברים ב -15 ומניחים אותם על הקלטת הדו כאשר הצד השני פונה כלפי מעלה. מוסיפים את מתמיסת המלח של החרק19 לבריכת החיתוך כדי להגן על העוברים מפני ייבוש (איור 1).

4. חיתוך וצביעת

  1. שימוש במחט זכוכית מתחת למיקרוסקופ מבתר (שולחן חומרים), חותכים דרך קו האמצע של עובר אחד על פני השטח שלו מאחורי שלו לקצה הקדמי. ואז לגרור את העובר החוצה קרום vitelline מן הקלטת על הזכוכית (בקופסה באיור 1). לדאוג לא לפגוע ברקמות הפנים של העובר.
  2. הפוך את רקמות האפיתל מהמרכז ולצרף את הקצה באפידרמיס על פני השטח של שקופית זכוכית (איור 1, שיבוץ).
  3. באמצעות המחט מחובר צינור עם הפתיחה טיפ של ~ 300 יקרומטר (מוכן על ידי שבירת קצה דק של מחט לנתיחה), מחית או לנשוף אוויר כדי לנתק ולהסיר את הצינור האורך האורכי של הקנה האחרון, כמו גם כל המעיים שנותרו.
  4. השתמש ב-4% פאראפורמלדהיד (למעלה) בתמיסת מלח (PBS) כדי לתקן את העוברים עבור 5 דקות ב-RT. שטוף את העוברים 3x עם PBS.
  5. כתם את העוברים עם 1 μL של אנטי מחזרת נוגדן peroxidase מצועם עם cyanine 3 צבע (anti-HRP Cy3) (טבלת חומרים) ב 200 μl של pbs עבור 1 h. לשטוף את העוברים עם PBS 3x לאחר כתמי.
    הערה: הצבע של anti-HRP ניתן לשנות בהתבסס על הצבעים ליפופילית של בחירה להזרקה.

5. מילוי הזרקת מיקרו-פיפטה

  1. צבע ליפופילית חום (5 מ"ג/mL של דיו או עשה, טבלת חומרים) עד 60 ° c בתערובת 1:10 של אתנול: שמן צמחי לפני השימוש.
  2. הכינו שקופית צבע מומס שמן עבור מיקרופיפטה ההזרקה. הניחו את המיקרופיפטה לתוך מחזיק הקפילר (איור 2, #1). באמצעות המיקרומניפולציה (טבלת חומרים), כוונן את המיקרו-פיפטה כדי להיות מעבר לשקופית הצבע. לאחר מכן, התאימו את השלב למיקום המיקרו-פיפטה על הצבע (איור 2, #2).
  3. כדי למלא את המיקרופיפטה, השתמשו במיקרו-מזרק (שולחן החומרים) (איור 2, #3). לאסוף את הצבע במיקרופיפטה על ידי הגדרת Pi (הזרקת הלחץ) בין 200 ל-500 hpa (ההקטו), Ti (זמן הזרקה) בין 0.1 לערך 0.5 ו-Pc (הלחץ פיצוי) כדי 0 Hpa עבור 5 דקות (איור 2, #4).
  4. לאחר הצבע נאסף, להסיר את שקופית הצבע ולמקם את המדגם על במת המיקרוסקופ. לאחר מכן, הגדילו את ה-Pc לטווח של 20 עד 60 hpa לפני הנמכת המיקרופיפטה למדגם, כדי למנוע זיהום של PBS בפעולה קפילר.

6. הזרקת צבע לנוירונים

  1. אתר את העובר במרכז באמצעות המיקרוסקופ עם עדשת המטרה 10x (טבלת חומרים) וליישר את המיקרופיפטה עם העובר.
    הערה: ניתן לכוונן את גודל ה-droplet של הצבע על-ידישינוי ה-P i או גודל הפתיחה של העצה המיקרופיפטה. ה-droplet צריך להיות 10-20 μm, שהוא בערך ברוחב של שריר אחד.
  2. לשנות את העדשה האובייקטיבית לעדשה 40x טבילה המים (טבלה של חומרים) ולהטביע את העדשה לתוך PBS כדי לראות את העובר.
    1. השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לבדוק את המבנה העצבי מסומן על ידי anti-HRP Cy3 ולקבוע את אתר ההזרקה.
    2. במהלך ההזרקה, השתמשו במיקרוסקופיה ברייטפילד כדי לראות את droplet הצבע. כאשר העובר הוא בפוקוס, לשנות את המיקום של המיקרופיפטה כדי ליצור קשר עדין עם קצה האקסון של עניין (למשל, aCC, RP3).
    3. הנח את הצבע בבטן הימנית (A2-A6) המי-קטע בצומת העצבי של aCC או RP3 (איור 3) עם או או דיו, באמצעות הנוירונים המסומנים על ידי ANTI-Hrp Cy3. שימוש בבקרת היד (עכבר; איור 2, 5) לשחרר את הצבע ולהסיר את המיקרופיפטה לאחר שחרור הצבע עם המיקרומניפולציה ולעבור אל אתר ההזרקה הבא.
      הערה: שלא כמו צבעים אחרים (למשל, לוציפר צהוב, calcein) אשר התפשט לתוך התאים הסמוכים באמצעות צמתים הפער, צבע ליפופילית שותף ממברנות תאים לא להעביר לשכנים. בגלל הגודל הגדול יחסית של droplet לצבוע, עם זאת, טכניקה זו גם גורמת לתיוג של שרירי השותפות (איור 3א).
  3. מודטה את המדגם ב RT עבור 1 h לאחר לצבוע טיפה לפני הדמיה.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן לפני ההרכבה, וניתן לשמור את המדגם ב-4 ° c בלילה. צבעי ליפוהיפילית יכול גם להיות מועברת באמצעות iontophoresis אם בשילוב ישיר (DC) מגבר זמין בקלות20.

7. הדמיה עם מיקרוסקופ קונמוקד

  1. הסר את הקלטת דו צדדית וקלטת ויניל מתוך שקופית זכוכית בעזרת מלקחיים.
  2. הכן שובר כיסוי (22 x 22 מ"מ2 מס ' 1 זכוכית מכסה) עם כמות קטנה של שומן ואקום (טבלת חומרים) בארבע פינות ובמקום בזהירות על המדגם, הימנעות בועות אוויר. הסר את כל הPBS העודפת באמצעות מנקי משימות.
  3. דחוף את המכסה למטה כדי לכוונן את מרחק העבודה בין העדשה האובייקטיבית לבין המדגם. אטום לחלוטין את קצות שובר הכיסוי עם לק.
  4. תמונה בהגדלה של 10x ו-100x בעזרת מיקרוסקופ קונמוקד.
  5. השתמש בתוכנת ImageJ לעיבוד תמונות גולמיים מהמיקרוסקופ (טבלת חומרים).
    הערה: ההשגחה חייבת להתחיל בתוך 10 דקות לאחר ההרכבה על התמונות הטובות ביותר. אחרת, ב-RT, הצבע יתפשט לאתרים הסמוכים לאתר ההזרקה ויוצרים רקע לא רצוי לדימות. כדי להאט את הפצת הצבע, ניתן לאחסן את המדגם ב-4 ° c למשך מספר שעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דמות מייצגת של הנוירונים aCC ו RP3 מוטוריים מוצג באיור 3C כדי להדגים את התיוג ריבוי צבעים של נוירונים מוטוריים ב 15 h. מורפולוגיות דנדריטים שלהם הם קבוע במידה רבה בין העוברים. דפוס הצביעת המתקבל עם נוגדן anti-HRP מוצג באפור. Droplet קטן של DiO או עשה הופקד על NMJ של שריר 1 או 6/7, בהתאמה. איור 4 מדגים את היכולת למדוד את הפנוטיפ של הריבית. ספרנו את המספר הכולל של תיאורי הדנדריטים בסוג פראי, לעומת מוטציה (למשל, dscam1-/-).

Figure 1
איור 1: הכיוונון של בריכת החיתוך. חדר כחול ראה על שקופית זכוכית נוצרת עם קלטת ויניל לשמור את המאגרים בתוך. הקלטת הדו מחזיקה את העוברים המיושרים כראוי. מוצג גם בפינה השמאלית התחתונה הוא דוגמה של העובר גזור ב תמיסת מלח. הקצה הקדמי נמצא בחלק העליון של כל האיורים הבאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ציוד הזרקת צבע. מתייג הזכוכית באיור ממחיש את אתר ההתקנה של פיפטה זכוכית (1). מיקרוסקופ אפינפרין-פלורסנט מצויד במקור אור LED וסדרה של ערכות סינון. התקני המיקרומניפולציה (2) והמכשירים המיקרוהזרקה (3) מסומנים מימין למיקרוסקופ. הכניסה היא תקריב של התצוגה של מכשיר מיקרו הזרקה (4) עם ערכים מתאימים של Pi,T, ו-pc). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: בלייפופילית ההכנות לצבע של נוירונים מוטוריים מתויג. (A) מנוע מסומןנוירונים מוטוריים והשרירים היעד שלהם. תא העצב aCC מנוע innervating שריר 1 (DiO: עירור/פליטה, 484 nm/501 nm); RP3 מנוע העצב innervating השרירים 6/7 (עשה: עירור/פליטה, 644 nm/665 nm). שים לב כי השרירים 6/7 גם לקבל אינבציה מתוך תא מנוע אחר (MNISNb/d-Is) בשלבי זחל; עם זאת, MNISNb/d-הוא אין מקבילה עובריים3. עיגולים מציינים אתרים של יישומי צבע. (ב) תרשים סכמטי של שרירי קיר הגוף וענפי העצב ההיקפית ב -15 ש ח. חוט העצב הגחוני (VNC) מורכב הנוירומנטלית והבקיעים סימטרית מבחינה עצבית לגבי קו האמצע הגחוני (קו מנוקד). הגוף שרירי הקיר של כל קטע של חמי מinnervated על ידי מנוע נוירונים 38. הנוירונים מוטוריים פרויקט אקסונים שלהם דרך שישה ענפים העצבים העיקריים (ISN [הSNa העצב הפנימי], (העצב מנטלית), snb, snb, SNd, ו-TN [העצב הרוחבי]). (ג) הענפים הדנדריטים מן ACC ו RP3 מוטוריים נוירונים להראות חפיפה נרחבת. שני הנוירונים הם נוירונים דו קוטבית, כלומר הנוירונים להקים שתי אוכלוסיות שונות של דנדטים. ועוד אחד לתוך הנוירופיל הצלעות. ראשי חץ מצביעים על טיפים דנדריטים. תמונות פלואורסצנטית נרכשו עם מטרה 10x או המטרה טבילה 100x שמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: aCC דנדריטים togenesis כפי שנחשף עם תיוג נסיגה בשעה 15 עוברים. (א) בסוג פראי, aCC מרחיב את הדנדריטים שלה לתוך השני והצלעות והצלעות. למען הפשטות, אנו מציגים רק את הדנדריטים הצלעות הפסיטים מ-aCC בדמות זו. aCC מתויג עם דיו, המוצגת בירוק. (ב) ב dscam1 מוטציות (dscam121/21 מ ד ר. Tzumin לי, בקמפוס המחקר janelia), aCC יש מעט מאוד התסילטים הדנדריטים ברוב המקרים שנצפו17. ראשי חץ מראים טיפים דנדריטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השימוש בתיוג צבע ללימוד מורפולוגיה עצבית יש מספר יתרונות על טכניקות גנטיות של תיוג תאים. הטכניקה תיוג צבע יכול למזער את כמות הזמן הדרוש לתיוג והדמיה של מורפולוגיות של נוירונים מוטוריים. תהליך תיוג הצבע הוא מהיר למדי כפי שלוקח פחות מ 2 h ומאפשר לנו להגדיר את המתאר של התחזיות הנוירואליות. כחלופה, ניתן לדמיין את העצב המנוע aCC על ידי בחירת קו GAL4 המבטא GAL4 שמרים שעתוק פקטור aCC, וחציית אותו עם חלבון פלורסנט ירוק (GFP) כתב נשלט על ידי רצף ההפעלה במעלה (UAS)21. טכניקה התיוג GFP ככזה דורש צלב גנטי וכך, לוקח כמה ימים נוספים.

יתרון נוסף של תיוג צבע היא לאפשר תיוג של קרום הפלזמה בצפיפות גבוהה מאוד. צפיפות מספקת של צבעי ליפופילית יכול להיות נוכח בכל חלק של הקרום, המאפשר לנו לפתור את הפרטים העדינים של מבנה מתויג. לעומת זאת, הצפיפות של מולקולות GFP תלויה לעתים קרובות בתקופת ההמתנה אחרי UAS-GAL4 מערכת בעיטות. לדוגמה, aCC מתחילה לבטא GFP מ 10 h. על ידי 15 h ח כאשר אנו צופים, צפיפות של מולקולות GFP אינו מספיק כדי לכסות את הקרום כולו. זה גורם לתיוג מספיק של תחזיות נוירואליות משובחות (D.K., נתונים שלא פורסמו).

למרות שטכניקה זו מספקת מספר יתרונות, זה פחות יתרון כאשר ההקרנה השגויה של אקסונים מוטוריים ניכרת. בהיעדר צעד צדדי, למשל, הנוירונים מוטוריים להציג פגמים חמורים בצורה מוקדמת, כגון דוכן מוקדם, מעבר הגבול הסגור, והסתעפות מוגזמת22. כתוצאה מכך, להגיע למסוף אקסון מסוים הופך מסורבל. היעילות של תיוג הוא גם תלוי בגיל, להיות יעיל בעוברים צעירים יותר 20 h. כמו חלבונים מטריצה החילוץ להגדיל עם פיתוח, תיוג של נוירונים מוטוריים נראה מורכב מאוד.

הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת לנו למדוד פרמטרים רבים של מורפולוגיים כגון אורך הכולל neurite ומספר, ותבנית neurite ענף וצורה15,16,17,23,24. בגלל ליפופילית צבעים carbocyanine לבוא בצבעים רבים (כגון דיו, DiA, dii, עשה, ו DiR), תיוג ססגוניות של נוירונים מוטוריים סמוכים הוא גם השגה. כפי שמוצג באיור 4, דנדטים מ-aCC ו-RP3 נוירונים מוטוריים חופפים בהרחבה. כדי לקדם את הבנתנו בפיתוח המעגלים המוטוריים, המנגנונים של האינטראקציה עם הדנדט-דנדט ייחקרו.

כאן, אנו לפרט את הטכניקה המגוונת המספקת שדרה ללמוד קישוריות עצבית במעגל המנוע. למרות ההפגנה הוא מוגבל aCC ו RP3 נוירונים מוטוריים ב 15 h ח, טכניקה זו ניתן להחיל על הנוירונים מוטוריים אחרים בשלבים שונים של התפתחות עובריים. אם מסוף אקסון הוא נגיש עם מיקרופיפטה הזרקה, טכניקה זו יכולה גם להיות מיושם על תיוג של כל תא עצב בשלבים זחל ומבוגרים של זבובים או אפילו באורגניזמים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים לחברי מעבדת קמיאיאמה על הערות על כתב היד. עבודה זו נתמכת על-ידי NIH R01 NS107558 (למ, K.B. ו-D.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x objective lens Nikon Plan
40x water-immersion lens Nikon NIR Apo
Capillary tubing Frederick Haer&Co 27-31-1
Confocal microscope Andor N/A Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass Corning 22x22 mm Square #1
DiD ThermoFisher V22886
DiI ThermoFisher V22888
DiO ThermoFisher V22887
Dissecting microscope Nikon N/A SMZ-U
Double Sided Tape Scotch 665
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Sci. 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Egg collection cage FlyStuff 59-100
FemtoJet 5247 Eppendorf discontinued FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ NIH Image processing software
Micromanipulator Sutter MP-225
Micropipette beveler Sutter BV-10-B
Needle puller Narishige PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets FlyStuff 47-102
Nylon Net Filter Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 15710 Any EM grades
PBS Roche 11666789001 Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200 Kodak 146 4510 Wetting agent
Upright fluorescence microscope Nikon N/A Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape Scotch 6143
VWR Cell Strainers VWR 10199-659
Yeast FlyStuff 62-103 Active dry yeast (RED STAR)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
  2. Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
  3. Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336, (2), 213-221 (2009).
  4. Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2, (4), 1002-1013 (2012).
  5. Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
  6. Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
  7. Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
  8. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, (23), 4297-4310 (2012).
  9. Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26, (7), 739-751 (2004).
  10. Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. Umemori, H., Hortsch, M. Springer. New York. 11-37 (2009).
  11. Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3, (10), 1012-1017 (2000).
  12. Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179, (6), 1289-1300 (2007).
  13. Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136, (7), 1127-1135 (2009).
  14. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17, (24), 9642-9655 (1997).
  15. Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324, (5932), 1338-1340 (2009).
  16. Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134, (21), 3795-3804 (2007).
  17. Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35, (1), 93-106 (2015).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. Springer-Verlag. Berlin, Germany. (1985).
  19. Drosophila Ringer's solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (4), (2007).
  20. Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
  21. Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130, (22), 5385-5400 (2003).
  22. Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105, (1), 57-67 (2001).
  23. Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6, (3), 223-230 (2003).
  24. Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1, (2), 41 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics