哺乳類組織の富化とコレステロールを伴うゼノプス卵母細胞

Biochemistry

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Summary

コレステロールを飽和させて哺乳動物の組織や細胞を豊かにするシクロデキストリンの適用と、ゼノプス卵母細胞を豊かにするコレステロールを豊富なリン脂質系分散液(リポソーム)の使用の2つの方法が提示される。これらの方法は、分子、細胞、および器官機能におけるコレステロール値の上昇の影響を決定するのに役立ちます。

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Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).

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Abstract

哺乳類組織および細胞のコレステロール濃縮は、細胞機能の研究に用いられるゼノプス卵母細胞を含め、様々な方法を用いて達成することができる。ここでは、この目的に用いられる2つの重要なアプローチについて説明します。まず、例として、脳動脈(組織)と海馬ニューロン(細胞)を用いてコレステロールを飽和させたシクロデキストリンを用いて、コレステロールを有する組織や細胞を濃縮する方法を説明する。このアプローチは、あらゆるタイプの組織、細胞、または細胞株に使用できます。コレステロールの濃縮のための別のアプローチは、低密度リポタンパク質の使用を含む (LDL).このアプローチの利点は、それが細胞の自然なコレステロール恒常性機械の一部を使用することです.しかし、シクロデキストリンアプローチはコレステロールを有するあらゆる細胞タイプの関心を豊かにするために適用できるのに対し、LDLアプローチはLDL受容体を発現する細胞(例えば、肝臓細胞、血球球および組織マクロファージなどの骨髄由来細胞)に限定され、濃縮のレベルはLDL受容体の濃度および移動度に依存する。さらに、LDL粒子は他の脂質を含むが、コレステロール送達は非特異的である。第2に、コレステロールを含むリン脂質系分散体(すなわちリポソーム)を用いて、ゼノプス卵母細胞をコレステロールで濃縮する方法を説明する。ゼノプス卵母細胞は、細胞およびタンパク質機能の研究に使用される一般的な異種発現系を構成する。哺乳動物組織(大脳動脈)のシクロデキストリン系コレステロール濃縮アプローチとゼノプス卵母細胞のリン脂質ベースのコレステロール濃縮アプローチの両方について、コレステロール値がインキュベーションの最大5分に達することを実証する。このコレステロールのレベルは、インキュベーションの長期期間(例えば、60分)の間に一定のままである。これらのデータは、コレステロール濃縮の影響を調べるための機能研究のために、組織、細胞、ゼノプス卵母細胞のコレステロール濃縮のための最適化された時間的条件の基礎を提供します。

Introduction

コレステロールは、主要な細胞脂質、多数の重要な機能的および構造的役割11、2、3、4、5、6、7、8、92,3,4,5,6,7,89果たしている。原形質膜の物理的性質を調節することから、細胞の生存率を保証すること、増殖、増殖、および生化学的経路の多くのシグナル伝達および前駆体分子としての役割を果たすことまで、コレステロールは正常な細胞および器官機能に必要不可欠な構成要素である。その結果、コレステロール欠乏症は、重度の身体的奇形および様々な障害をもたらす。,一方、生理学的レベル(2-3x)以上のコレステロールのわずかな増加でさえ、細胞傷害性,11、2、102,10であり、心血管11、12、13および神経変性疾患111414、15、16、1715を含む障害の発症と関連している。16,171213このように、コレステロールの重要な機能を問い合わせて、コレステロール値の変化の影響を判断するために、組織、細胞、およびゼノプス卵母細胞中のコレステロールの含有量を変化させる異なるアプローチが開発されている。

哺乳類組織および細胞におけるコレステロール値の変化
いくつかのアプローチは、組織および細胞18におけるコレステロールのレベルを低下させるために利用することができる。1つのアプローチは、コレステロール合成19,20の速度を制御するHMG-CoA還元体を阻害するためにリポタンパク質欠損血清中に溶解したスタチンへのそれらの曝露20含む。しかし、これらのコレステロール低下薬はまた、メバロント経路に沿った非ステロール製品の形成を阻害する。したがって、これらの製品21の形成を可能にし、このアプローチの特異性を高めるために少量のメバロン化物が添加される。コレステロール値を低下させるもう一つのアプローチは、β-シクロデキストリンの使用を含む.これらのグルココピー鼻モノマーは、ステロール22の大きさに一致する直径を有する内部疎水性キャビティを有し、細胞からのコレステロールの抽出を容易にし、それによってそれらの天然コレステロール含有量23からそれらを枯渇させる。その一例は、2−ヒドロキシプロピルβ-シクロデキストリン(HPβCD)であり、ニーマンピック型C型疾患の治療のために現在試験されている前臨床薬物であり、リソソームコレステロール貯蔵24を特徴とする遺伝的に遺伝した致命的な代謝障害である。コレステロールの枯渇のレベルは、使用される特定の誘導体に依存します。例えば、HPβCDはメチル化誘導体よりも低容量のコレステロールを抽出し、メチル-β-シクロデキストリン(MβCD)24、25、26、27、28、29、30。29,3024,25,26,27,28,しかし、特に、β-シクロデキストリンはコレステロールに加えて他の疎水性分子を抽出することもできるが、その後、非特異的な効果を生じ得る31。枯渇とは対照的に、細胞および組織は、コレステロール23で予備飽和されたβ-シクロデキストリンによる処置を通じてコレステロールを特異的に濃縮することができる。このアプローチは、コレステロール枯渇31に用いられるβ-シクロデキストリンの特異性のコントロールとして用いることもできる。組織および細胞からのコレステロールの枯渇は簡単であり、細胞を貯蔵するために使用される培地に溶解した30〜60分間mMMβCDの細胞を曝露することによって達成することができる。このアプローチは、コレステロール含有量の50%の減少をもたらすことができます(例えば、海馬ニューロン32、ラット大脳動脈33)。一方、組織や細胞のコレステロール濃縮のためのβ-シクロデキストリン-コレステロール複合体の調製はより複雑であり、プロトコルセクションに記載される。

コレステロールを飽和させたβ-シクロデキストリンを用いて組織および細胞を濃縮する別のアプローチは、組織/細胞18に発現するLDL受容体に依存するLDLの使用を含む。このアプローチは、細胞の天然コレステロール恒常性機械を使用する利点を提供するが、それはいくつかの制限があります。第一に、LDL受容体を発現しない組織や細胞は、このアプローチでは濃縮できない。第二に、LDL粒子はコレステロールに加えて他の脂質を含む。具体的には、LDLは、タンパク質ApoB100(25%)で構成されています以下の脂質(75%):〜6〜8%コレステロール、〜45〜50%コレステリルエステル、〜18〜24%リン脂質、および〜4〜8%トリアシルグリセロール34。したがって、LDL粒子を介したコレステロールの送達は非特異的である。第三に、LDL受容体を発現する組織および細胞におけるLDLによるコレステロール含有量の増加の割合は、コレステロールを飽和させたシクロデキストリンを用いて観察された増加よりも有意に低い場合がある。例えば、以前の研究では、LDLを介してコレステロールを有するげっ歯類の大脳動脈の濃縮は、コレステロール値の10〜15%の増加をもたらした35.対照的に、プロトコルセクションに記載されているようにコレステロールで飽和したシクロデキストリンを有するこれらの動脈の濃縮は、コレステロール含有量の50%の増加をもたらした(代表結果セクション、図1を参照)。

ゼノプス卵母細胞におけるコレステロール値の変化
ゼノプス卵母細胞は、細胞およびタンパク質機能の研究に一般的に使用される異種発現系を構成する。以前の研究では、ゼノプス卵母細胞におけるコレステロール対リン脂質モル比は0.5±0.136であることを示している。コレステロールのこの本質的な高レベルのため、このシステムでコレステロールの含有量を増加させることは困難であり、まだ膜リン脂質とコレステロールから作られた分散を使用して達成することができます。この目的のために選択したリン脂質は、人工平坦脂質二重層の形成に使用されるものと類似しており、L-α-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)および1-パルミトイル-2-オレノイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-l-セリン(POPS)を含む。この方法では、コレステロールの含有量が 50% 増加する可能性があります (代表的な結果セクションを参照してください(図 2)。

リン脂質ベースの分散液でゼノプス卵母細胞を濃縮する別のアプローチは、組織および細胞が濃縮される方法に似ているコレステロールで飽和シクロデキストリンの使用を含む。しかし、このアプローチは、コレステロール含有量の平均約25%の増加で、再現性と効率が低いことがわかりました。これは、これら 2 つのアプローチの負荷容量が異なる可能性があります (代表的な結果セクション、図 3を参照)。これに対し、ゼノプス卵母細胞からコレステロールを枯渇させるシクロデキストリンを使用すると、コレステロール含量が36%〜40%減少36する可能性があることが示されている。

ここでは、コレステロール飽和シクロデキストリンの適用と、リポソームを用いたゼノプス卵母細胞の適用を通じて、哺乳類組織および細胞のコレステロール濃縮に焦点を当てます。両方のアプローチは、タンパク質機能に対するコレステロールの増加レベルの効果を示すために利用することができます。タンパク質機能のコレステロール調節のメカニズムは、直接的な相互作用を伴うことがあります 8および/または間接的な効果9.コレステロールが直接相互作用を介してタンパク質機能に影響を与える場合、コレステロール値の増加がタンパク質活性に及ぼす影響は、細胞の種類、発現系、または濃縮アプローチとは無関係である可能性が高い。例えば、心房筋細胞37、39海馬ニューロン32、38、HEK2933,38細胞およびゼノプス卵母細胞32,37において発現される内向きに整流されたG-gatedG-gated(GIRK)チャネルに対するコレステロールの影響を決定するために37これら2つのアプローチを利用した。これらの研究で得られた結果は一貫していた:哺乳類細胞のすべての3つのタイプおよび両生類卵母細胞でコレステロールアップレギュレートGIRKチャネル関数(海馬ニューロンおよびゼノプス卵母細胞における対応する実験については、代表的な結果セクション、図4を参照)。さらに、これらの研究で行われた観察はまた、心房筋細胞37、40および海馬ニューロン4032、38,38で行われた研究の結果と一致した高コレステロール食,40を受けた動物から新たに単離した。特に、MβCDを用いた海馬ニューロンのコレステロール濃縮は、コレステロール値及びGIRK機能38に対する高コレステロール食の影響に対処するために用いられるアトルバスタチン療法の効果を逆転させた。他の研究では、ゼノプス卵母細胞およびHEK293細胞41の両方を用いて、内向きに整流カリウムチャネルKir2.1のコレステロール感受性に対する突然変異の影響を調べた。繰り返しますが、チャネルの感受性に対する突然変異の影響は、2つのシステムで同様であった。

コレステロール値上昇が分子、細胞、臓器機能に及ぼす影響を判定するための両方の濃縮方法の応用は数多くある。特に、細胞や組織を豊かにするシクロデキストリン-コレステロール複合体の使用は、その特異性が大きく広がることが多い。このアプローチの最近の例としては、HERGチャネル活性化及び基礎機構42に対するコレステロールの影響の決定、コレステロールがヘッジホッグシグナル伝達43を促進するためにSmoothenedGタンパク質結合受容体Smoothenedを活性化するという発見、および膜関連リンカータンパク質44を介した幹細胞バイオメカニクスおよび有分形成におけるコレステロールの役割の同定を含む。私たち自身の研究では、MβCD:コレステロール複合体を用いた哺乳類組織濃縮を利用して、コレステロールの富化が血管平滑筋35,45,46,の大きな導電度(BK,MaxiK)のカルシウムおよび電圧ゲートチャネルの基本的機能35,および薬理学的プロファイルに及ぼす影響を研究しました。46他の研究では、コレステロールを伴う,ゼノプス卵母細胞を濃縮するためのリン脂質ベースの分散アプローチを用いて、コレステロール感受性41、47、48、49,47,48におけるKir2.1およびGIRKチャネルにおける異なる領域の役割を決定し、ならびに49これらのチャネル32、50、51において32,50,51コレステロール結合部位を決定した。

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Protocol

動物との実験手順はすべてテネシー大学保健科学センター(UTHSC)で行われました。動物のケアおよび実験プロトコルは、試験動動物ケア国際の評価と認定のための協会によって認定された機関であるUTHSCの動物ケアと使用委員会によって見直され、承認されました。

1. コレステロールを飽和させたメチルβ-シクロデキストリンを用いた組織や細胞の濃縮

注: 以下のコレステロール濃縮プロトコルは、組織、細胞、および細胞株に適しています。例として、哺乳類の大脳動脈を豊かにするためのステップについて説明する。大脳動脈(図1)とニューロンの両方に代表結果が提供される(図4)。

  1. コレステロールを飽和するMβCDの調製
    1. MβCDの0.064gを秤量し、10mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液を含むフラスコに溶解し、5mMMβCDの最終濃度を得た。MβCDが完全に溶解していることを確認するために攪拌棒で溶液をかき混ぜます。
    2. 0.0024 gのコレステロール粉末を量り、同じフラスコに加え、0.63 mMのコレステロール濃度を得る。その後、溶液を激しくかき混ぜます。できるだけ多くのコレステロールチャンクを分割するためにスパチュラを使用してください(いくつかのチャンクはインキュベーションまで残ります)。
    3. フラスコを少なくとも2層のパラフィンフィルムで覆い、一晩37°Cの水浴でゆっくりと振ります(〜30振動/分)。この手順は重要です。
    4. 8-16時間後、溶液を室温(RT)まで冷却し、0.22 μmのポリエーテルサルホンフィルターを通してガラス瓶にフィルターします。
      注:溶液中の異なるコレステロール濃度に達するには、コレステロールとMβCDの両方の量を簡単な割合で調整してください。コレステロールを伴うメチル-β-シクロデキストリン担体の飽和を得るためには、MβCD:コレステロールモル比を8:1に維持することが重要です。コレステロール濃縮溶液は、4°Cで保存すれば、すぐに、または数日間にわたって使用することができます。しかし、コレステロール凝集体が現れるにつれてコレステロールを豊かにする能力は時間の経過とともに低下し、溶液は曇りになる。
  2. コレステロールを飽和したMβCDによる大脳動脈の治療
    1. 2%イオブルランのチャンバーに入れることで、スプレイグ・ドーリーラット(250-300g)を安楽死させる。次に、鋭いギロチンまたは大きな鋭利なハサミを使用して麻酔ラットを切断する。
      注:これらの手順を定期的に行う場合は、ギロチン研ぎのスケジュールを作成すると便利です。また、別のはさみはげっ歯類の切断のために捧げるべきです。げっ歯類の切断は、終末の手順です。したがって、器具は無菌である必要はありません。使用後の石鹸水での清掃で十分です。
    2. ラットの頭を前に向けて、研究者から離します。中型のハサミの尖った部分を頭蓋骨と脳幹の間に置き、両側を横切ります。
    3. 鉗子を使用して、横切りが行われた頭蓋骨の付け根を引き上げて上の頭蓋骨をこじ開け、慎重に脳を取り除きます。頭蓋骨の中に脳を保持する光神経を切断することを確認してください。
    4. 除去後に氷の上にPBSとビーカーに脳を入れます。
      注:脳は4°Cで4-6時間氷の上に保存することができます。
    5. 非無菌環境では、ラットの脳をワックス状の解剖ボウルに移し、それを水没させるのに十分なPBSを付けます。動かないように脳を固定します。
      注:ステップ1.2.5は、迅速に実行すればRTで行うことができます。それ以外の場合は、氷の上で行う必要があります。
    6. 鋭い鉗子と小さな外科用はさみを使用して、RTでPBSの顕微鏡下で脳の基部にウィリスの円を形成する大脳動脈とその枝を解剖してください。この手順は重要です。
    7. 96ウェルプレートまたは35mm皿でPBSの動脈セグメント(長さ1cmまで)を簡単に洗い流し、残った血液を取り除き、動脈セグメント全体を覆うのに十分なコレステロール濃縮溶液(ステップ1.1で準備)に10分間置きます。動脈が小さい場合、またはコレステロール濃縮溶液が不足している場合は、十分な量のコレステロール濃縮溶液と96ウェルプレートがある場合は、35 mm皿を使用してください。
      注:同じアプローチは、60分のインキュベーション時間を使用してコレステロールを持つ他の組織や細胞を豊かにするために使用することができます。例えば、このアプローチは、マウス大脳動脈35、45、45馬ニューロン32、心房筋細胞37、およびHEK293細胞39のコレステロール濃縮のために以前に使用されてきた。,最小インキュベーション時間は、コレステロール感受性アッセイを用いた異なる時点でのコレステロール濃縮の検証に基づいて、組織または細胞の種類ごとに決定する必要があります(例えば、コレステロール感受性蛍光色素フィリミンで染色することにより、組織中のコレステロールの量の生化学的決定)。
  3. ステロイド感受性蛍光色素フィリパンで動脈組織を染色し、コレステロール値の変化を決定する。
    注: 代表結果セクションでは、コレステロール値の変化を評価するための2つのアプローチの結果を示しています:市販のコレステロールオキシダーゼベースキット(材料表を参照)の適用を通じて行われる生化学的アッセイとステロイド感受性蛍光染料フィリビンによる染色。最初のアプローチは、製造元の指示に従って実行できます。後者のアプローチのプロトコルは以下に示します。
    1. 新鮮なフィリパン粉末のボトルを使用して、ジメチルスルホキシド(DMSO)で10mg/mLストック溶液を調製します。この手順は重要です。
      注: 結果として得られるソリューションは、光に敏感です。正しく調製すれば、フィリパンのストック溶液は黄色がかった。いくつかのフィリピシン粉末は、ボトルキャップに固執することができます.したがって、ボトルとキャップをDMSO溶媒でリンスし、フィリパンの全量を保持することが重要です。準備後、フィリパン在庫は数日以内に使用する必要があります。フィリピン人は、-20°Cで暗闇の中に保存しても、5日後に完全に蛍光能力を失います。
    2. コレステロールを豊富にする溶液から動脈セグメントを取り除き、5分間PBSで3倍洗浄します。
    3. 4%パラホルムアルデヒドで動脈セグメントを氷上で15分間固定します。
      注意:パラホルムアルデヒドは光に敏感です。したがって、作業は暗闇の中で行われなければなりません。
    4. 組織を透過させ、染料の浸透を促進するために、10分間RTでPBSの0.5%トリトンに動脈セグメントを置きます。
    5. シェーカーで5分間PBSで動脈セグメント3倍を洗浄します。この手順は重要です。
      メモ:トリトンが完全に洗い流された場合、PBS溶液の表面に気泡が存在してはいけません。
    6. PBSのフィリパンストック溶液を25μg/mLの最終濃度に希釈します。PBS溶液を形成する動脈を取り除き、暗い状態で1時間希釈したフィリパン溶液に入れる。この手順は重要です。
    7. シェーカーで5分間PBSで動脈セグメント3xをすすいで、フィリパンを洗い流します。この手順は重要です。
    8. 動脈セグメントを蒸留水で短時間リンスし、紙ナプキンで過剰な液体を吸収し、市販の取り付け媒体を使用してスライドに動脈を取り付けます(材料表を参照)。
    9. 動脈の転がりやねじれを避けるカバースリップで動脈を覆い、スライドをRTの暗い領域で24時間乾燥するように設定します。
    10. 取り付け培地が乾いたら、カバースリップの端を透明なマニキュアで密封し、マニキュアを10〜15分間乾燥させておき、スライドを-20°Cの暗闇の中に保管してください。
    11. イメージングの前に、スライドを RT に平衡化します。
    12. 340-380 nmに設定された励起および385-470 nmの放出を用いて蛍光顕微鏡または蛍光リーダーを使用して組織をイメージする。
      注意:フィリピンのフォトブリーチはすぐに。したがって、サンプルは速やかに画像化する必要があります。

2. コレステロールを豊富に含むリン脂質系分散液(リポソーム)を用いたゼノプス卵母細胞の濃縮

  1. ソリューションの準備
    1. コレステロールのストック溶液を調製するには、10mLガラスビーカーまたはボトルに1mLのクロロホルムにコレステロール粉末10mgを溶解する。溶液を1.5mLのキャップガラスボトルに移します。
      注意:クロロホルムの毒性と急速な蒸発を考慮して、フードで働き、試薬を氷の上に置きます。
    2. コレステロールを豊富に含むリン脂質に対して150 mM KCl、10 mMトリスヘペス、pH=7.4バッファーを調製します。これを行うには、2倍蒸留水で5.5905 gのKClと0.6057 gのトリスを合計0.5 Lの体積に溶解します。別のフラスコでは、KClの5.5905 gと1.19155 gのHEPESを2倍蒸留水に溶解し、合計0.5 L体積にします。2つの溶液を1 Lエルレンマイヤーフラスコに混ぜ合わせ、HClでpHを7.4に調整します。
      注:得られた150 mM KCl、10 mMトリス-HEPES溶液を4°Cに保存してください。
    3. ND96プレミディアム卵卵子培養(低K+、Ca2+)バッファーを調製するには、1 mLの2M KCl、1 M MgCl2の1 mL、2 M NaClの45.5 mL、および1 Lの1/1 M NaOH-HEPESの5 mLを1 Lのエルレンマイヤーフラスコに組み合わせます。2900 mL ダブル蒸留水を加え、HCl で pH を 7.4 に調整し、溶液を 1 L シリンダに移し、2 重蒸留水で体積を 1 L にします。その後、1 M CaCl2の 1.8 mL を追加し、ソリューションをフィルター処理します。
      注:ND96溶液を作るために使用されるコンポーネント間の比率のわずかな変動は、おそらくND96溶液が濃縮ステップ自体ではなく、ストレージのために使用されるため、コレステロール濃縮のために重要ではないようです。例としては、ナトリウムおよび塩化物イオンの濃度がわずかに低い1L溶液であり、1MKClの2mL、1MMg2の1mL、1M NaClの82.5mL、1M HEPESの5mL、および1M CaCl2の1.8mLを組2み合わせて作られる2(Ca2+を省略した2+)。NaOHで溶液のpHを7.4に調整します。得られたND96卵卵細胞培養液を4°Cで最大1ヶ月間保管してください。
  2. コレステロールリポソームを用いたリン脂質系分散液の調製
    1. 12 mLガラスチューブで、L-α-ホスファチジルエタノールアミン、1-パルミトイル-2-オレロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-l-セリン、およびコレステロールの各10 mg/mLクロロホルム溶解脂質溶液のそれぞれ200 μLを組み合わせます。
    2. フード内のクロロホルムを蒸発させて、窒素の流れの下でゆっくりと乾燥させます。この手順は重要です。
    3. pH = 7.4で150 mM KClと10 mM Tris-HEPESからなる緩衝溶液の800 μLで脂質を懸濁し、パラフィンフィルムで覆います。
    4. 乳白色の混合物が形成されるまで、80 kHzで10分間静かに超音波処理します。この手順は重要です。
      注意:超音波処理するとき、ガラス管内の分散は、小さな波を形成し、穏やかに振動する必要があります。分散液の滴は、チューブ内でジャンプしてはいけません。
  3. コレステロールを含むゼノプス卵母細胞の濃縮
    注:カエルの卵母細胞含有卵巣は、2つのソースから得ることができます:まず、ゼノプス・ラエビスの雌カエルは、社内手術の目的で収容することができます。この手続きは、制度的動物管理・使用委員会によって承認されなければならない。第二に、卵巣全体は商業サプライヤーから購入することができます。卵巣全体を購入または単離し、ステップ2.3.1-2.3.4に記載されているように消化する代わりに、個々の卵母細胞は商業的に購入可能である。後者を使用する場合、手順 2.3.1-2.3.4 はスキップできます。
    1. ND96溶液中で、得られた卵巣を〜14°Cに保ちます。これらの条件下では、卵巣は最大1週間保存することができる。
    2. 個々の卵母細胞を得るために、鋭い鉗子を使用して複数の場所で卵巣嚢を破壊する。卵巣の塊を60mmプレートに入れ、Ca2+フリーND96の5 mLに0.5mg/mLコラゲナーゼを補充します。RTで15分間60振動/分で軌道シェーカーを振ります。
      注:このステップは、卵巣嚢の消化を保証します。酵素活性を維持するために、ND96を含むコラゲザーゼを長期間保存しないでください(>1時間)。短い貯蔵は15°C以下の涼しい温度で行われるべきである。
    3. 広い先端を持つ移管ピペットを使用して、卵母細胞含有溶液を約5〜10倍上下に激しくピペットして、個々の卵母細胞を分離する。このステップでは、ソリューションが暗くなります。
    4. 溶液が透明になるまで、Ca2+フリーND96で卵母細胞を素早くすすぐすすみます。
    5. 狭い先端を持つ移管ピペットを使用して、ゲンタマイシンの2 mg/mLを補ったCa2+含有ND-96溶液に個々の卵母細胞を移す。
      注: この手順は、卵母細胞を保存する必要がある場合に不可欠です。個々の卵母細胞は、14〜17°Cで数日間インキュベーターに保存することができる。しかし、毒性化学物質で溶液の汚染を避けるために、白っぽい死んだ卵母細胞は少なくとも1日1回除去しなければならない。
    6. コレステロールを豊富に含むリン脂質系分散液の90μLを96ウェルプレートの1ウェルに移します。
    7. ND96培地からできるだけ少ない媒体で6個までの卵母細胞を井戸に移します。この手順は重要です。
      注意:卵母細胞をそのまま保つために、移動中に卵母細胞を空気にさらさないようにしてください。
    8. 96ウェルプレートを3次元プラットフォーム回転子に置き、5〜10分間細胞内の卵母細胞に小さな軌道運動を提供します。
    9. 井戸にND96の滴を追加し、コレステロールを豊富に含む卵母細胞を96ウェルプレートからND96付きの35mmプレートに移してすぐに使用します。この手順は重要です。
    10. 市販のコレステロールオキシダーゼベースキット (資料表を参照) を使用して、製造元の指示に従ってコレステロール値の変化を評価します。

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Representative Results

コレステロールを有する組織および細胞を豊かにする手段としてコレステロールで飽和シクロデキストリンの使用は十分に確立されている.ここでは、コレステロール飽和MβCDを用いてラット大脳動脈をコレステロールで濃縮するためのこの広く用いられているアプローチの応用をまず実証する。図1Aは、画像化された大脳動脈平滑筋層の一例を示し、1時間の6.25μM-6.25mMのコレステロール濃度の増加に伴う組織濃縮時に得られるフィリピイン関連蛍光の濃度依存性上昇を示す図1BBに示す。特に、1時間培養後2時間のコレステロール値の上昇は、MβCD:コレステロール複合体による治療直後に観察された増加の50%程度であった。図1CCが0.625 mMコレステロールを1時間処理したサンプルについて示すように、治療された組織を用いた機能研究は、コレステロール濃縮が完了した後、できるだけ早く行う必要がある。さらに、このアプローチを用いて1時間のインキュベーション時間がコレステロールを有する組織および細胞を豊かにするのに一般的に使用されるが、インキュベーションの5分は、通常、図1DDに示すように、コレステロールオキシダーゼベースの生化学的アッセイによって決定される大脳動脈コレステロール含有量の統計的に有意な増加を達成するのに十分である。インキュベーション時間を60分に増加させた時のコレステロール含有量の増加は同じレベルのままであった(1D)。

コレステロールを含むゼノプス卵母細胞を濃縮する手段としてのコレステロールを豊富なリポソームの有効性は、図2A-Cに示されている。コレステロールを欠いたリン脂質ベースの分散液のコレステロール値には有意な変化は認められなかったが(2A)、コレステロール値はコレステロールを含むリン脂質系分散液で5分の治療を行った後に有意に増加し、インキュベーション時間が60分に増加した時点で同じレベルにとどまった(2B)。同様の効果は、2つのカエルから得られた卵母細胞の2つの異なるバッチで観察された。しかし、特に、コレステロールの初期値とコレステロール含有量の変化の両方が2つのバッチの間で異なっていた:バッチ1では、コレステロールの初期濃度はタンパク質のmg当たりコレステロールの64μgであったのに対し、バッチ2の初期濃度はタンパク質のmg当たりコレステロールの45μgであり、これはバッチ1のコレステロールの初期レベルの70%である。60分の治療の後、バッチ1のコレステロール濃度はタンパク質のmg当たり124μgのコレステロールであったのに対し、バッチ2ではタンパク質のmg当たり67μgのコレステロールであった。これにより、コレステロール濃度がバッチ1で〜90%以上増加するのに対し、バッチ2では〜50%増加した。それにもかかわらず、両方のバッチにおけるコレステロール値の実質的な増加は、この異種発現系で発現されるタンパク質の機能に対するコレステロール値の増加の効果を調査する手段を提供する。さらに、コレステロールを有するゼノプス卵母細胞を濃縮するためのリン脂質ベースの分散アプローチは、組織および細胞で行われているようにコレステロールを飽和させたシクロデキストリンの適用よりも効果的であると思われる。図3が示すように、5mMシクロデキストリンを用いて卵母細胞を濃縮するためのシクロデキストリン-コレステロール複合体の適用は、コレステロール値の平均〜25%の増加をもたらした。

細胞を濃縮するためのシクロデキストリンベースのアプローチの有効性は、海馬のCA1領域から新たに単離されたニューロンにおいても実証されている(図4A)。図4BBが示すように、60分間コレステロールで飽和したMβCD中のニューロンのインキュベーションは、フィリピビン関連蛍光によって決定されるコレステロール値の2倍以上の増加をもたらした。このアプローチを用いて、海馬ニューロンで発現するGIRKチャネルに対するコレステロールの増加の効果を試験した。図4Cが示すように、このコレステロール値の変化はGIRK電流の有意な増加をもたらした。同様に、ゼノプス卵母細胞異種発現系を用いて、脳で発現する主要なGIRKサブユニットGIRK2に対するコレステロール濃縮の効果を試験した。この目的のために、ゼノプス卵母細胞における膜発現および活性52を増加させるGIRK2の細孔変異体であるGIRK2^(GIRK2_E152D)を過剰発現し、リン脂質ベースの分散アプローチを用いて60分間コレステロールを有する卵母細胞を濃縮した。図4D-Fが示すように、コレステロール値の増加は、GIRKチャネル機能に対するニューロンのコレステロール値の増加の効果と同様の電流の有意な増加をもたらした。これらのデータは、タンパク質活性および細胞機能に対するコレステロール値の上昇の影響を決定するための上記2つのアプローチの有効性、一貫性、および有用性をさらに実証する。

Figure 1
図1:コレステロール飽和メチル-β-シクロデキストリンを用いたコレステロールを有するラット大脳動脈の代表的な濃縮。(A) 6.25 μM~6.25 mMのコレステロール濃度を1時間(B)で定量化した組織濃縮時に得られる、フィリピシン関連蛍光の濃度依存性上昇を示す画像化された大脳動脈平滑筋層の例(A)。画像全体の蛍光強度測定は、市販ソフトウェアにおける組み込みの「測定」機能を使用して行った。各コレステロール濃度では、別々の動物ドナーから採取された動脈から3枚の画像を収集した。各コレステロール濃度について、データは平均±標準誤差として提示される。(C)脳動脈平滑筋層セグメントにおけるコレステロール値は、1時間インキュベーション期間の直後に0.625 mMコレステロールを有し、治療開始後3時間(すなわち、1時間のインキュベーションに続く2時間のPBS)である。(D) コレステロールオキシダーゼ系生化学アッセイにより決定されるインキュベーション時間に対するコレステロール値の依存性有意差は、アスタリスク(*p ≤ 0.05)で示されます。パネル(A)(コレステロール濃度0 mM-0.625 mM)、及び(B)は北45から改変された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:リポソームを用いたコレステロールを有するゼノプス卵母細胞の代表的な濃縮(A)コレステロールを含まないリポソーム中で5〜60分間インキュベートされたゼノプス卵母細胞のコレステロール値の折り目変化(B)コレステロールを豊富なリポソーム中で5〜60分間インキュベートしたゼノプス卵母細胞のコレステロール値の折り畳み変化。描かれたコントロールバーは、コレステロールフリーリポソームのインキュベーションを5分間指し、比較として示されています。(C) コレステロールを豊富に含む脂肪類を用いたゼノプス卵母細胞の2つの異なるバッチのコレステロール濃縮効果の比較 5 分と 60 分有意差は、アスタリスク(*p ≤ 0.05)で示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:コレステロールを飽和させたメチル-β-シクロデキストリンを用いたコレステロールを有するゼノプス卵母細胞の代表的な濃縮。(A) コントロールND96培地で5-60分間インキュベートされたゼノプス卵母細胞のコレステロール値の折り目変化(B)5-60分間コレステロールを飽和したMβCDでインキュベートされたゼノプス卵母細胞のコレステロール値の折り畳み変化。描かれた制御バーは、5分間の制御媒体におけるインキュベーションを指し、比較として示されている。有意差は、アスタリスク(*p ≤ 0.05)で示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:細胞およびゼノプス卵母細胞におけるタンパク質機能に対するコレステロール濃縮の研究の代表的な例:コレステロールがカリウムチャネルを内向きに整流するGタンパク質に及ぼす影響。(A)制御上のラット(左)対コレステロール濃縮(右)からの海馬CA1錐体ニューロンのフィリピイン関連蛍光シグナル。(B)制御およびコレステロールを豊富に含めた新鮮な海馬CA1錐体ニューロンから得られた、フィリピシン関連蛍光シグナルの要約データ。コレステロールの濃縮は、1時間のコレステロールで飽和MβCDのニューロンをインキュベートすることによって達成された(n = 12-14)。(C)CA1領域の海馬ニューロンにおけるGIRK電流に関するコレステロール濃縮の効果を描写したイオン電流(I)電圧(V)曲線。C(D)コレステロールを豊富に含むリン脂質ベースのリポソームを用いたコレステロール濃縮の効果を示す代表的な微痕(GIRK2_E152D)を-80mVおよび+80mVのゼノプス卵母細胞で発現したGIRK2^(GIRK2_E152D)。(E) -80 mV (n = 6-9) での (D) の要約データ有意差は、アスタリスク(*p ≤ 0.05)で示されます。サブ図形 (B-E) は、ブキヤら32から修正されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

哺乳類の組織や細胞、コレステロールを含むゼノプス卵母細胞を豊かにする方法は、個々の分子種、複雑な高分子系(タンパク質など)、細胞および器官機能に対するコレステロール値の上昇の影響を調査するための強力なツールです。本論文では、このような研究を促進する2つの補完的なアプローチについて述べた。まず、コレステロールを飽和したMβCDを用いてコレステロールを有する組織や細胞を濃縮する方法を説明した。我々は、大脳動脈セグメントにおいて、このアプローチがコレステロール値の〜50%の増加をもたらしたことを実証した。さらに、最近の研究では、同じアプローチがCA1領域からの海馬ニューロンのコレステロール含有量の2倍以上の増加につながることを示しました。しかし、これに対して、ゼノプス卵母細胞を豊かにする手段としてこのアプローチを採用すると、ゼノプス卵母細胞のコレステロール含有量が約25%増加した。したがって、ゼノプス卵母細胞を濃縮するために、我々は一貫してコレステロール値の少なくとも〜50%の増加をもたらすリン脂質ベースの分散アプローチを開発しました。ゼノプス卵母細胞を濃縮するためのこのアプローチの利点は、MβCD:コレステロール複合体アプローチの負荷容量と比較して、強化された負荷容量に由来する可能性があります。また、MβCD:コレステロール複合体アプローチは組織や細胞を豊かにするために最適化されているが、Xenopus卵母細胞を豊かにするためのアプリケーションを改善するためにプロトコルのさらなる最適化が必要である可能性もある。

コレステロールを有するゼノプス卵母細胞を濃縮するために使用されるリン脂質ベースの分散液には、平坦な脂質二重層(すなわち、L-α-ホスファチジルエタノールアミンおよび1-パルミトイル-2-オレオイイル-sn-グリセロ-3-ホスホウ酸)を作成するために広く使用されている2つの脂質が含まれる。しかし、以前の研究では、ゼノプス卵母細胞はまた、ホスファチジルコリンおよびコレート36を含むリポソームからのコレステロールを使用して濃縮することができることが示された。この方法により、0.5±0.1から0.9±0.1までの血漿膜中のコレステロール/リン脂質モル比が増加し、濃縮率は71%であった。この富化の平均割合は、我々が観察したコレステロール含有量の平均増加レベル(〜70.5%)と非常によく似ているが、このアプローチを用いてコレステロールを有するゼノプス卵母細胞を濃縮するために使用されるリン脂質の選択が重要ではないことを示唆している。

説明されている各プロトコルには、いくつかの重要な手順が含まれます。MβCD:コレステロール比で8:1モル比で調製した後、パラフィンフィルムの少なくとも2層でフラスコを覆い、ゆっくりと揺れる37°Cの水浴に一晩沈むのが重要です。コレステロール治療のために組織を解剖する際には、組織が伸縮または切断されないように優しくすることが重要です。色素の浸透を容易にするために組織を透過した後、PBSで組織セグメントを徹底的に洗浄することが重要です。フィリパンの組織染色は暗で行う必要があり、染色が完了した後にフィリミンを細心の注意を払って洗浄する必要があります。コレステロールを豊富に含むリン脂質系分散液を調製する場合、ガラス管内の分散液が穏やかに振動し、小さな波を形成し、分散からのコレステロールの分離を避けるために重要です。ゼノプス卵母細胞のコレステロール処理のためには、卵母細胞をそのまま保つために卵母細胞を空気に曝さない間、できるだけ少ない媒体でコレステロールを豊富に含むリン脂質ベースの分散液を有するND96培地から卵母細胞を井戸に移すことを重要である。組織、細胞、ゼノプス卵母細胞の固有の機械のために、コレステロール値が平衡化し、時間の経過とともに元のレベルに戻る可能性があることに注意することが重要です。したがって、機能研究は、インキュベーション時間の直後に行う必要があります。ここでは、コレステロールを豊富に含む大脳動脈においてこの概念を実証し、1時間の潜伏期間後のコレステロール値2時間の増加は、インキュベーション期間直後に観察された増加の約半分であることを示した。

上記の重要な手順に従っているにもかかわらず、いくつかの課題が発生する可能性があります。例えば、コレステロール値の上昇は、コレステロールを豊かにする治療に続いて観察されない。この場合、コレステロール濃縮培地中のコレステロール濃度を高める必要がある場合がある。同じことが、組織、細胞、ゼノプス卵母細胞のコレステロール濃縮にも当てはまります。しかし、MβCD:コレステロール複合体アプローチを用いた治療の調製では、コレステロールとの8:1モル比を維持するためにコレステロール濃度の増加に伴ってMβCDの量を増加させるべきである。さらに、コレステロールが溶液から沈殿する傾向があり、その溶液がコレステロールを豊かにする効率を失うため、新鮮なコレステロールを豊富に含む溶液を調製する必要があるかもしれません。コレステロールの濃縮に続いて、フィリピシンシグナルが見られない可能性があります。この場合、新しいストックを調製し、実験を繰り返すために新鮮なフィリパン粉末を使用する必要がある場合があります。フィリピンの蛍光は急速に低下し、ストック液は数日以上保存できません。フィリピシン染色の1つの制限は、コレステロール以外のステロイドを認識するように見えるということです.例えば、我々は最近、コプロスタノール45との濃縮に続くラット大脳動脈におけるフィリピシン関連蛍光シグナルの増加を実証した。したがって、フィリピシン染色結果は慎重に解釈されるべきであり、疑わしい場合は、結果を裏付ける代替アプローチを採用すべきである。1つの可能性は、市販のコレステロールオキシダーゼベースのキットの適用を通じて生化学的アッセイを行うことであろう。

要約すると、提示されたアプローチは、50%に近いか超えるコレステロール濃縮を達成するのに非常に効果的である。実際、MβCD:脳動脈中のコレステロール値が50%を生じるコレステロール複合体のアプローチは、LDLを用いてこれらの組織を濃縮するよりもはるかに効率的であり、これはコレステロール35の10%の単なる10%の増加をもたらす。同じことが、ゼノプス卵母細胞を濃縮するためのコレステロール濃縮リン脂質系分散体(リポソーム)の適用にも当てはまります。上述したように,このアプローチは一貫してコレステロール値の少なくとも50%の増加をもたらす。,重要なことに、これらの2つのアプローチは、高コレステロール食,32、37、40、53、54に動物を供与することによって得られる32,37,コレステロール増加と同等であるインビトロでのコレステロールの富化結果をもたらす。405354さらに、数週間にわたる高コレステロール食とは対照的に、インビトロアプローチは、コレステロール値の統計的に有意かつ定常状態の増加に達するためにわずか数分のインキュベーション時間を必要とします。

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Disclosures

A.M.ドピコ博士は、アルコール乱用とアルコール依存症に関する国家諮問委員会の特別なパートタイム、連邦職員、現在のメンバーです。

Acknowledgments

この研究は、米国心臓協会(A.R.-D.)の科学者開発助成金(11SDG5190025)と国立衛生研究所R01助成金AA-023764(A.N.B.)、HL-104631およびR37 AA-11560(A.M.D.)によって支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

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