Berigelse af pattedyrvæv og Xenopus Oocytter med kolesterol

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

To metoder til kolesterol berigelse præsenteres: anvendelse af cyclodextrin mættet med kolesterol til at berige pattedyr væv og celler, og brugen af kolesterol-beriget fosfolipid-baserede dispersioner (liposomer) til at berige Xenopus oocytter. Disse metoder er medvirkende til at bestemme virkningen af forhøjede kolesterolniveauer i molekylære, cellulære, og organfunktion.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kolesterol berigelse af pattedyr væv og celler, herunder Xenopus oocytter anvendes til at studere cellefunktion, kan opnås ved hjælp af en række forskellige metoder. Her beskriver vi to vigtige tilgange, der anvendes til dette formål. Først beskriver vi, hvordan man beriger væv og celler med kolesterol ved hjælp af cyclodextrin mættet med kolesterol ved hjælp af cerebrale arterier (væv) og hippocampale neuroner (celler) som eksempler. Denne fremgangsmåde kan bruges til enhver type væv, celler eller cellelinjer. En alternativ tilgang til kolesterol berigelse indebærer brug af low-density lipoprotein (LDL). Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at det bruger en del af den naturlige kolesterol homøostase maskiner i cellen. Mens cyclodextrin-metoden kan anvendes til at berige enhver celletype af interesse med kolesterol, er LDL-metoden dog begrænset til celler, der udtrykker LDL-receptorer (f.eks. leverceller, knoglemarvsafledte celler såsom blodleukocytter og vævsmakrofager), og graden af berigelse afhænger af koncentrationen og mobiliteten af LDL-receptoren. Endvidere, LDL partikler omfatter andre lipider, så kolesterol levering er uspecifik. For det andet, Vi beskriver, hvordan man berigeR Xenopus oocytter med kolesterol ved hjælp af en fosfolipid-baseret dispersion (dvs. liposomer), der omfatter kolesterol. Xenopus oocytter udgør et populært heterologt udtrykssystem, der anvendes til at studere celle- og proteinfunktion. For både cyclodextrin-baserede kolesterol berigelse tilgang pattedyr væv (cerebral arterier) og for fosfolipid-baserede kolesterol berigelse tilgang af Xenopus oocytter, viser vi, at kolesterolniveauer nå et maksimum efter 5 min inkubation. Dette niveau af kolesterol forbliver konstant i længere perioder med inkubation (f.eks. 60 min). Tilsammen danner disse data grundlag for optimerede tidsmæssige betingelser for kolesterolberigelse af væv, celler og Xenopus oocytter til funktionelle undersøgelser, der har til formål at afhøre virkningen af kolesterolberigelse.

Introduction

Kolesterol, en stor cellulære lipid, spiller mange kritiske funktionelle og strukturelle roller1,2,,3,,4,,5,,6,,7,8,9. Fra regulering af plasmamembranens fysiske egenskaber til sikring af cellernes levedygtighed, vækst, spredning og tjener som et signal- og forløbermolekyle i et væld af biokemiske veje, er kolesterol en nødvendig komponent, der er nødvendig for normal celle- og organfunktion. Som et resultat, kolesterolmangel resulterer i alvorlige fysiske misdannelser og en række lidelser. På den anden side, selv en lille stigning i kolesterol over fysiologiske niveauer (2-3x) er cytotoksisk1,,2,,10 og har været forbundet med udviklingen af lidelser, herunder hjerte-kar-1111,12,13 og neurodegenerative sygdomme14,15,16,17. Således, at afhøre de kritiske funktioner af kolesterol og til at bestemme effekten af ændringer i kolesterolniveauer, forskellige tilgange, der ændrer indholdet af kolesterol i væv, celler, og Xenopus oocytter er blevet udviklet.

Ændring af kolesterolniveauer i pattedyrvæv og -celler
Flere tilgange kan udnyttes til at nedsætte niveauet af kolesterol i væv og celler18. En tilgang indebærer deres eksponering for statiner opløst i lipoprotein-mangelfuld serum til at hæmme HMG-CoA reduktase, som styrer antallet af kolesterol syntese19,20. Men, disse kolesterolsænkende lægemidler hæmmer også dannelsen af ikke-sterol produkter langs mevalonat e pathway. Derfor tilsættes en lille mængde mevalonat for at gøre det muligt at danne disse produkter21 og forbedre specificiteten af denne fremgangsmåde. En anden tilgang til faldende kolesterolniveauer indebærer brug af β-cyclodextrins. Disse glucopyranose monomerer besidder en intern hydrofob hulrum med en diameter, der matcher størrelsen af steroler22, som letter udvinding af kolesterol fra celler, og dermed nedbryder dem fra deres oprindelige kolesterolindhold23. Et eksempel er 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD), et præklinisk lægemiddel, der i øjeblikket testes til behandling af Niemann-Pick type C-sygdommen, en genetisk arvelig dødelig metabolisk lidelse karakteriseret ved lysosomal kolesterolopbevaring24. Niveauet af kolesterol udtynding afhænger af den specifikke afledte anvendes. 25,26,27,28,29HPβCD udtrækker24,f.eks.,30 Især, dog, β-cyclodextrins kan også udtrække andre hydrofobe molekyler ud over kolesterol, som derefter kan resultere i uspecifikke virkninger31. I modsætning til udtynding, celler og væv kan specifikt beriget med kolesterol gennem behandling med β-cyclodextrin, der er blevet præmættet med kolesterol23. Denne fremgangsmåde kan også anvendes som en kontrol for specificiteten af β-cyclodextrin, der anvendes til kolesterol udtynding31. Udtømning af kolesterol fra væv og celler er ligetil og kan opnås ved at udsætte cellerne i 30-60 min til 5 mM MβCD opløst i det medium, der anvendes til opbevaring af cellerne. Denne fremgangsmåde kan resultere i en 50% fald i kolesterolindholdet (f.eks i hippocampal neuroner32, rotte cerebral arterier33). På den anden side, forberedelse af β-cyclodextrin-kolesterol kompleks for kolesterol berigelse af væv og celler er mere kompleks, og vil blive beskrevet i protokollen afsnit.

En alternativ tilgang til berigelse af væv og celler ved hjælp af β-cyclodextrin mættet med kolesterol indebærer brug af LDL, som er afhængig af LDL-receptorer udtrykt i væv / celler18. Mens denne tilgang giver den fordel, at bruge den naturlige kolesterol homøostase maskiner i cellen, det har flere begrænsninger. For det første kan væv og celler, der ikke udtrykker LDL-receptoren, ikke beriges ved hjælp af denne fremgangsmåde. For det andet, LDL partikler indeholder andre lipider ud over kolesterol. Ldl består specifikt af proteinet ApoB100 (25%) og følgende lipider (75%): ~ 6-8% kolesterol, ~ 45-50% cholesteryl ester, ~ 18-24% fosfolipider, og ~ 4-8% triacylglyceroler34. Således levering af kolesterol via LDL partikler er uspecifik. For det tredje, den procentdel af stigningen i kolesterol indhold af LDL i væv og celler, der udtrykker LDL receptor kan være betydeligt lavere end stigningen observeret ved hjælp af cyclodextrin mættet med kolesterol. For eksempel, i en tidligere undersøgelse, berigelse af gnaver cerebral arterier med kolesterol via LDL resulterede i kun en 10-15% stigning i kolesterolniveauer35. I modsætning hertil resulterede berigelse af disse arterier med cyclodextrin mættet med kolesterol som beskrevet i protokolafsnittet i >50% stigning i kolesterolindholdet (se afsnittet Repræsentative resultater, figur 1).

Ændring af kolesterolniveauer i Xenopus oocytter
Xenopus oocytter udgør et heterologt ekspressionssystem, der almindeligvis anvendes til at studere celle- og proteinfunktion. Tidligere undersøgelser har vist, at kolesterol til fosfolipid molære forholdet i Xenopus oocytter er 0,5 ± 0,136. På grund af denne iboende højt niveau af kolesterol, øge indholdet af kolesterol i dette system er udfordrende, men kan opnås ved hjælp af dispersioner fremstillet af membran fosfolipider og kolesterol. De fosfolipider, som vi har valgt til dette formål, svarer til dem, der anvendes til dannelse af kunstige planar lipid bilag og omfatter L-α-phosphatidylethanolamin (POPE) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serin (POPS), som beskrevet i afsnittet protokol. Denne fremgangsmåde kan resultere i >50% stigning i kolesterolindholdet (se afsnittet Repræsentative resultater, figur 2).

En alternativ tilgang til berigelse af Xenopus oocytter med fosfolipid-baserede dispersioner indebærer brug af cyclodextrin mættet med kolesterol, hvilket svarer til den måde væv og celler er beriget. Men vi har fundet denne tilgang til at være af lav reproducerbarhed og effektivitet, med et gennemsnit på ~ 25% stigning i kolesterolindholdet. Dette skyldes muligvis disse to tilganges forskellige lasteevne (se afsnittet repræsentative resultater, figur 3). I modsætning hertil har det vist sig, at ved hjælp af cyclodextrin at nedbryder kolesterol fra Xenopus oocytter kan resultere i en ~ 40% fald i kolesterolindhold36.

Her fokuserer vi på kolesterol berigelse af pattedyr væv og celler gennem anvendelse af cyclodextrin mættet med kolesterol, og af Xenopus oocytter ved hjælp af liposomer. Begge tilgange kan udnyttes til at afgrænse effekten af forhøjede niveauer af kolesterol på protein funktion. Mekanismerne for kolesterolmodulering af proteinfunktion kan omfatte direkte interaktioner8 og/eller indirekte virkninger9. Når kolesterol påvirker protein funktion via direkte interaktioner, effekten af en stigning i kolesterolniveauer på protein aktivitet er sandsynligvis uafhængig af celletype, ekspressionssystem, eller berigelse tilgang. For eksempel, Vi udnyttede disse to tilgange til at bestemme effekten af kolesterol på G-protein gated indadrettekalium (GIRK) kanaler udtrykt i atriemyocytter37, hippocampal neuroner32,38, HEK29339 celler, og Xenopus oocytter32,37. Resultaterne af disse undersøgelser var konsistente: i alle tre typer pattedyrceller og i padderoocytter kolesterol upregulated GIRK kanalfunktion (se repræsentant resultater afsnit, Figur 4, for hippocampal neuroner og de tilsvarende eksperimenter i Xenopus oocytter). Endvidere, observationerne i disse undersøgelser var også i overensstemmelse med resultaterne af undersøgelser udført i atriemyocytter37,40 og hippocampal neuroner32,38 frisk isoleret fra dyr udsat for en høj kolesterol kost40. Især kolesterol berigelse af hippocampal neuroner ved hjælp af MβCD vendt effekten af atorvastatin terapi anvendes til at løse virkningen af højt kolesteroltal kost både på kolesteroltallet og GIRK funktion38. I andre undersøgelser undersøgte vi effekten af mutationer på kolesterolfølsomheden af den indadvendte korrigere kaliumkanal Kir2.1 ved hjælp af både Xenopus oocytter og HEK293 celler41. Igen var mutationernes virkning på kanalens følsomhed ens i de to systemer.

Anvendelserne af begge berigelse metoder til bestemmelse af virkningen af forhøjede kolesterolniveauer på molekylære, cellulære, og organfunktion er talrige. Især er brugen af cyclodextrin-kolesterol komplekser til at berige celler og væv meget almindeligt i vid udstrækning på grund af dens specificitet. Nylige eksempler på denne tilgang omfatter bestemmelse af virkningen af kolesterol på HERG kanal aktivering og underliggende mekanismer42, opdagelsen af, at kolesterol aktiverer G-protein koblet receptor glattet til at fremme Pindsvin signalering43, og identifikation af den rolle, kolesterol i stamceller biomekanik og adipogenesis gennem membran-associerede linker proteiner44. I vores eget arbejde, vi udnyttede pattedyr væv berigelse med MβCD: kolesterol kompleks til at studere effekten af kolesterol berigelse på grundlæggende funktion og farmakologisk profil af calcium- og spænding-gated kanaler af stor ledningsevne (BK, MaxiK) i vaskulære glatte muskel35,45,46. I andre undersøgelser, Vi brugte fosfolipid-baserede dispersion tilgang til at berige Xenopus oocytter med kolesterol til at bestemme rollerne af forskellige regioner i Kir2.1 og GIRK kanaler i kolesterol følsomhed41,47,48,49, samt at bestemme formodede kolesterol bindende steder i disse kanaler32,50,51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer med dyr blev udført på University of Tennessee Health Science Center (UTHSC). Pasning af dyr og forsøgsprotokoller blev gennemgået og godkendt af Animal Care and Use Committee of the UTHSC, som er en institution, der er akkrediteret af Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.

1. Berigelse af væv og celler ved hjælp af methyl-β-cyclodextrin mættet med kolesterol

BEMÆRK: Nedenstående kolesterolberigelsesprotokol er velegnet til væv, celler og cellelinjer. Som et eksempel, beskriver vi de skridt, der udføres for at berige pattedyr cerebral arterier. Der gives repræsentative resultater for både cerebrale arterier (figur 1) og neuroner (figur 4).

  1. Fremstilling af MβCD mættet med kolesterol
    1. 0,064 g MβCD vejes og opløses i en kolbe indeholdende 10 ml fosfatbufferet saltvand (PBS) for at opnå en endelig koncentration på 5 mM MβCD. Opløsningen omrøres med en omrørerstang for at sikre, at MβCD er helt opløst.
    2. Afvejes 0,0024 g kolesterolpulver og tilsæt det til samme kolbe for at opnå en 0,63 mM kolesterolkoncentration. Rør derefter opløsningen kraftigt. Brug en spatel til at bryde op så mange kolesterol stykker som muligt (nogle bidder vil forblive indtil inkubation).
    3. Kolben tildækkes med mindst to lag paraffinfilm, og der rystes langsomt (~30 svingninger/min. ) i et 37 °C vandbad natten over. Dette trin er kritisk.
    4. Efter 8-16 timer afkøles opløsningen til stuetemperatur (RT), og den filtreres derefter gennem et 0,22 μm polyethersulfonsprøjtefilter i en glasflaske.
      BEMÆRK: For at opnå forskellige kolesterolkoncentrationer i opløsning, justere mængden af både kolesterol og MβCD ved simpel proportion. Det er vigtigt at opretholde MβCD:kolesterol molar forholdet på 8:1 for at opnå mætning af methyl-β-cyclodextrin luftfartsselskab med kolesterol. Den kolesterolberigende opløsning kan anvendes straks eller i løbet af flere dage, hvis den opbevares ved 4 °C. Men, kolesterol-berigende evne falder over tid som kolesterol aggregater vises, og løsningen bliver overskyet.
  2. Behandling af cerebrale arterier med MβCD mættet med kolesterol
    1. Euthanize en Sprague Dawley rotte (250-300 g) ved at placere den i et kammer med 2% isofluran. Derefter halshugge den bedøvede rotte ved hjælp af en skarp guillotine eller en stor skarp saks.
      BEMÆRK: Hvis disse procedurer udføres regelmæssigt, er det nyttigt at udvikle en tidsplan for guillotineskarphed. Desuden bør en separat saks være dedikeret til gnaver halshugning. Gnaver halshugning er en terminal procedure; Instrumenterne behøver derfor ikke at være sterile. Rengøring med sæbevand efter hver brug er tilstrækkelig.
    2. Placer rottens hoved vender fremad, væk fra forskeren. Placer den spidse del af en mellemstor saks mellem kraniet og hjernestammen, og skær sideværts på begge sider.
    3. Brug pincet til at lirke det øverste kranium åben ved at trække op på bunden af kraniet, hvor de laterale nedskæringer blev foretaget og forsigtigt fjerne hjernen. Sørg for at skære de optiske nerver, der holder hjernen i kraniet.
    4. Sæt hjernen i et bægerglas med PBS på is efter fjernelse.
      BEMÆRK: Hjernen kan opbevares på is i 4-6 timer ved 4 °C.
    5. I et usterilt miljø overføre rotte hjernen til en voksbehandlet dissektion skål med nok PBS til at nedsænke den. Pin hjernen ned for at holde det fra at bevæge sig.
      BEMÆRK: Trin 1.2.5 kan udføres på RT, hvis det udføres hurtigt. Ellers skal det gøres på is.
    6. Brug skarpe pincet og små kirurgiske saks til at dissekere de cerebrale arterier og deres grene, der danner Circle of Willis i bunden af hjernen under mikroskopet i PBS på RT. Vær blid, når dissekere for at sikre, at arterievævet ikke er strakt eller skåret. Dette trin er kritisk.
    7. Skyl kortvarigt arteriesegmenterne (op til 1 cm lang) i PBS enten i en 96 brøndplade eller i en 35 mm skål for at fjerne rester af blod, og anbring dem derefter i 10 minutter i nok af den kolesterolberigende opløsning (fremstillet i trin 1.1) til at dække hele arteriesegmenterne. Brug en 35 mm skål, hvis der er en rigelig mængde kolesterol-berigende opløsning og en 96 godt plade, hvis arterierne er små, eller hvis der er mangel på kolesterol-berigende opløsning.
      BEMÆRK: Den samme fremgangsmåde kan bruges til at berige andre væv og celler med kolesterol ved hjælp af en 60 min inkubationstid. For eksempel, denne fremgangsmåde har tidligere været brugt til kolesterol berigelse af mus cerebralarterier35,45, hippocampal neuroner32, atriemyocytter37, og HEK 293 celler39. Den minimale inkubationstid skal bestemmes for hver vævs- eller celletype baseret på validering af kolesterolberigelse på forskellige tidspunkter med en kolesterolfølsom analyse (f.eks. den biokemiske bestemmelse af mængden af kolesterol i vævet ved farvning med det kolesterolfølsomme fluorescensfarvefilipin).
  3. Pletten arterievæv med steroid-følsomme fluorescens farvestof filipin at bestemme eventuelle ændringer i kolesteroltallet.
    BEMÆRK: I afsnittet Repræsentative resultater viser vi resultaterne af to metoder til at vurdere ændringer i kolesterolniveauer: en biokemisk analyse udført ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt kolesteroloxidasebaseret kit (se Materialetabel)og farvning med det steroidfølsomme fluorescensfarve stoffarve filipin. Den første fremgangsmåde kan udføres ved at følge producentens anvisninger. Protokollen for sidstnævnte fremgangsmåde findes nedenfor.
    1. Ved hjælp af en frisk flaske filipinpulver fremstilles en 10 mg/ml-stamopløsning i dimethylsulfoxid (DMSO). Dette trin er kritisk.
      BEMÆRK: Den resulterende opløsning er lysfølsom. Hvis den fremstilles korrekt, er den filippinske stamopløsning gullig. Nogle filipin pulver kan holde sig til flasken hætte. Derfor er det vigtigt at skylle flasken og hætten med DMSO opløsningsmiddel for at bevare hele mængden af filipin. Når den er færdiggjort, skal filipin lager anvendes inden for flere dage. Filipin mister fuldstændig titueretsevnen efter 5 dage, selv når den opbevares i mørke ved -20 °C.
    2. Fjern arteriesegmenterne fra den kolesterolberigende opløsning, og vask dem 3x med PBS i 5 min.
    3. Fastgør arteriesegmenterne i 4% paraformaldehyd i 15 minutter på is.
      FORSIGTIG: Paraformaldehyd er lysfølsom. Derfor skal arbejdet udføres i mørke.
    4. Placer arteriesegmenter i 0,5% Triton i PBS på RT i 10 min at permeabilize vævet og lette farvestof penetration.
    5. Vask arteriesegmenterne 3x med PBS i 5 minutter på en shaker. Dette trin er kritisk.
      BEMÆRK: Når Triton er helt vasket ud, må der ikke være bobler på overfladen af PBS-opløsningen.
    6. Filipin-stamopløsningen fortyndes i PBS til en endelig koncentration på 25 μg/ml. Fjern arterierne danner PBS-opløsningen og læg dem i den fortyndede filipinopløsning i 1 time i mørke. Dette trin er kritisk.
    7. Vask filipinen ud ved at skylle arteriesegmenterne 3x med PBS i 5 minutter på en shaker. Dette trin er kritisk.
    8. Skyl arteriesegmenterne kortvarigt med destilleret vand, opsug for meget væske med en papirserviet, og monter arterierne på et dias ved hjælp af kommercielt tilgængelige monteringsmedier(se Materialetabel ).
    9. Dæk arterien med en dæksel undgå rullende eller vridning af arterien og indstille dias til tørre i et mørkt område på RT i 24 timer.
    10. Når monteringsmediet tørrer, forsegles dækstrækkene med klar neglelak, og neglelakken tørres i 10-15 min. Opbevar objektglassene i mørke ved -20 °C.
    11. Ligevægtene til RT, før de afbilledet.
    12. Billede vævet med et fluorescensmikroskop eller en fluorescenslæser med excitationssættet til 340-380 nm og emission ved 385-470 nm.
      FORSIGTIG: Filipin fotoblegere hurtigt; således skal prøverne afbildes omgående.

2. Berigelse af Xenopus oocytter ved hjælp af kolesterolberigede fosfolipid-baserede dispersioner (liposomer)

  1. Udarbejdelse af løsninger
    1. For at forberede en bestand opløsning af kolesterol, opløses 10 mg kolesterol pulver i 1 ml chloroform i en 10 ml glas bæger eller flaske. Opløsningen overføres til en 1,5 ml hætteglasflaske.
      FORSIGTIG: I betragtning af kloroformens toksicitet og hurtige fordampning arbejdes der i emhætten, og reagenserne holdes på is.
    2. Forbered en 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES, pH = 7,4 buffer for kolesterol-beriget fosfolipider. For at gøre dette opløses i en Erlenmeyer kolbe 5,5905 g KCl og 0,6057 g Tris i dobbeltdestilleret vand til i alt 0,5 L volumen. I en anden kolbe opløses 5,5905 g KCl og 1,19155 g HEPES i dobbeltdestilleret vand til i alt 0,5 L volumen. De to opløsninger blandes i en 1 L Erlenmeyer kolbe, og pH'en justeres til 7,4 med HCl.
      BEMÆRK: Den resulterende 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES-opløsning opbevares ved 4 °C.
    3. Til fremstilling af ND96 pre-medium oocyt dyrkning (lav K+, lav Ca2 +) buffer, kombinere 1 ml 2 M KCl, 1 ml 1 M MgCl2,45,5 ml 2 Ml NaCl, og 5 ml 1/1 M NaOH-HEPES i en 1 L Erlenmeyer kolbe. Der tilsættes 900 ml dobbeltdestilleret vand, og pH'en justeres til 7.4 med HCl. Opløsningen overføres til en 1 L cylinder, og volumenet ansættes til 1 L med dobbeltdestilleret vand. Derefter tilsættes 1,8 ml 1 M CaCl2 og filtrer opløsningen.
      BEMÆRK: Små variationer i forholdet mellem de komponenter, der anvendes til at lave en ND96-opløsning, synes ikke at være afgørende for kolesterolberigelse, muligvis fordi ND96-opløsningen ikke anvendes under selve berigelsestrinnet, men til opbevaring. Et eksempel er en 1 L-opløsning, der har en lidt lavere koncentration af natrium- og kloridioner, og som er fremstillet ved at kombinere 2 ml 1 M KCl, 1 ml 1 M MgCl2,82,5 ml 1 M NaCl, 5 ml 1 M HEPES og 1,8 ml på 1 M CaCl2 (Ca.2+ udelades for at opnå en Ca2+ fri opløsning). PH-værdien til 7.4 med NaOH justeres. Den resulterende ND96 oocytdyrkningsopløsning opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
  2. Fremstilling af fosfolipid-baseret dispersion med kolesterol liposomer
    1. I et 12 ml glasrør kombineres 200 μL af hver af følgende 10 mg/ml chloroformopløste lipidopløsninger: L-α-phosphatidylethanolamin, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serin og kolesterol.
    2. Kloroform i hætten til at tørre langsomt under en strøm af kvælstof. Dette trin er kritisk.
    3. Lipiderne suspenderes i 800 μL bufferopløsning bestående af 150 mM KCl og 10 mM Tris-HEPES ved pH = 7,4, og dæk den med paraffinfilm.
    4. Sonikere forsigtigt ved 80 kHz i 10 minutter, indtil der dannes en mælkeagtig blanding. Dette trin er kritisk.
      FORSIGTIG: Ved sonikering skal spredningen i glasrøret vibrere forsigtigt og danne små bølger. Dråber af spredning bør ikke hoppe i røret.
  3. Berigende Xenopus oocytter med kolesterol
    BEMÆRK: Frog oocyt-holdige æggestokke kan fås fra to kilder: For det første, Xenopus laevis kvindelige frøer kan huses med henblik på in-house kirurgi. Denne procedure skal godkendes af Udvalget for Pleje og Anvendelse af InstitutionelT Dyr. For det andet kan hele æggestokke købes hos kommercielle leverandører. Som et alternativ til at købe eller isolere hele æggestokke og derefter fordøje dem som beskrevet i trin 2.3.1-2.3.4, individuelle oocytter er tilgængelige kommercielt til køb. Hvis sidstnævnte anvendes, kan trin 2.3.1-2.3.4 springes over.
    1. De friskfremstillede æggestokke opbevares ved ~14 °C i en ND96-opløsning. Under disse forhold kan æggestokkene opbevares i op til 1 uge.
    2. For at opnå individuelle oocytter, forstyrre æggestokkene sæk flere steder ved hjælp af skarpe pincet. Læg æggestokkene stykker i en 60 mm plade, med 5 ml Ca2 +-fri ND96 suppleret med 0,5 mg / ml kollagen. Ryst på en orbital shaker ved 60 svingninger / min i 15 min på RT.
      BEMÆRK: Dette trin vil sikre fordøjelsen af æggestokkene sæk. For at bevare enzymatisk aktivitet skal du undgå at lagre kollagen, der indeholder ND96, i længere tid (>1 h). Selv kort opbevaring bør udføres ved kølige temperaturer på under 15 °C.
    3. Ved hjælp af en overførselspipette med en bred spids, kraftigt pipette den oocyt-holdige opløsning op og ned ca 5-10x at adskille individuelle oocytter. På dette trin bliver løsningen mørk.
    4. Skyl hurtigt oocytterne med Ca2+-fri ND96, indtil opløsningen bliver gennemsigtig.
    5. Individuelle oocytter overføres til Ca2+-indeholdende ND-96-opløsning suppleret med 2 mg/ml gentamicin ved hjælp af en overførselspipette med en smal spids.
      BEMÆRK: Dette trin er vigtigt, når det er nødvendigt at gemme oocytterne. Individuelle oocytter kan opbevares i en inkubator i flere dage ved 14-17 °C. Døde oocytter, der er hvidlige, skal dog fjernes mindst en gang om dagen for at undgå kontaminering af opløsningen med giftige kemikalier.
    6. 90 μL af den kolesterolberigede fosfolipidbaseret dispersion overføres til en brønd af en 96 brøndplade.
    7. Overfør op til seks oocytter fra ND96-mediet til brønden med så lidt medium som muligt. Dette trin er kritisk.
      FORSIGTIG: Udsæt ikke oocytterne for luften under overførslen for at holde oocytterne intakte.
    8. Placer 96 godt plade på en tre-dimensionel platform rotator at give en lille orbital bevægelse til oocytter i cellen i 5-10 min.
    9. Tilføj en dråbe ND96 i brønden, og overfør de kolesterolberigede oocytter fra 96 brøndpladen til en 35 mm plade med ND96 til øjeblikkelig brug. Dette trin er kritisk.
    10. Brug et kommercielt tilgængeligt kolesteroloxidasebaseret kit (se Materialetabel) til at vurdere ændringer i kolesterolniveauer ved at følge producentens anvisninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Brugen af cyclodextrin mættet med kolesterol som et middel til at berige væv og celler med kolesterol er veletableret. Her viser vi først anvendelsen af denne udbredte tilgang til berigelse af rottecerebrale arterier med kolesterol ved hjælp af MβCD mættet med kolesterol. Figur 1A viser et eksempel på et afbildet cerebralarterieglat muskellag og viser den koncentrationsafhængige stigning i filippineret fluorescens opnået ved vævsberigelse med stigende koncentrationer af kolesterol fra 6,25 μM-6,25 mM for 1 h. Tilsvarende kvantificering af billeddata er afbildet i figur 1B. Især, stigningen i kolesterolniveauer 2 h efter 1 h inkubationstid var ~ 50% af stigningen observeret umiddelbart efter behandlingen med MβCD:kolesterol kompleks. Som det fremgåraf figur1 C for prøven, der er behandlet med 0,625 mM kolesterol i 1 time, skal der gennemføres funktionelle undersøgelser med det behandlede væv så hurtigt som muligt, efter at kolesterolberigelsen er afsluttet. Endvidere, mens en 1 h inkubationstid er almindeligt anvendt til at berige væv og celler med kolesterol ved hjælp af denne fremgangsmåde, 5 min inkubation er normalt tilstrækkelig til at opnå en statistisk signifikant stigning i cerebral arterie kolesterol indhold som bestemt af en kolesterol oxidase-baserede biokemiske assay, som afbildet i figur 1D. Stigningen i kolesterolindholdet forblev på samme niveau, når inkubationstiden blev øget til 60 min (Figur 1D).

Effektiviteten af kolesterolberigede liposomer som et middel til at berige Xenopus oocytter med kolesterol er påvist i figur 2A-C. Mens der ikke blev observeret nogen signifikant ændring i kolesterolindholdet i kontrol fosfolipid-baserede dispersioner mangler kolesterol (Figur 2A),kolesterolniveauer steg betydeligt efter kun 5 min behandling med fosfolipid-baserede dispersioner, der omfattede kolesterol, og forblev på samme niveau, når inkubationstiden blev øget til 60 min (Figur 2B). En lignende effekt blev observeret i to forskellige partier af oocytter, der blev fremstillet af to frøer. Især varierede både de oprindelige niveauer af kolesterol og ændringen i kolesterolindholdet blandt de to partier: i batch 1 var den oprindelige koncentration af kolesterol 64 μg kolesterol pr. mg protein, mens den oprindelige koncentration i batch 2 var 45 μg kolesterol pr. mg protein, hvilket er ~70% af de oprindelige niveauer af kolesterol i batch 1. Efter en 60 minutters behandling var koncentrationen af kolesterol i batch 1 1 124 μg kolesterol pr. mg protein, mens den i batch 2 var 67 μg kolesterol pr. mg protein. Således, mens koncentrationen af kolesterol steg med over ~ 90% i batch 1, det steg med ~ 50% i batch 2. Ikke desto mindre giver den betydelige stigning i kolesterolindholdet i begge partier mulighed for at undersøge virkningen af en stigning i kolesteroltallet på proteinernes funktion udtrykt i dette heterologe ekspressionssystem. Desuden phospholipid-baserede dispersion tilgang til berigelse Xenopus oocytter med kolesterol synes at være mere effektiv end anvendelsen af cyclodextrin mættet med kolesterol som gjort i væv og celler. Som figur 3 viser, anvendelse af cyclodextrin-kolesterol komplekser til at berige oocytter ved hjælp af 5mM cyclodextrin resulterede i et gennemsnit på kun ~ 25% stigning i kolesteroltallet.

Effektiviteten af den cyclodextrin-baserede tilgang til berigelse af celler er også påvist i neuroner frisk isoleret fra CA1-regionen af hippocampus (Figur 4A). Som figur 4B viser, inkubation af neuroner i MβCD mættet med kolesterol i 60 min resulterede i over 2x stigning i kolesteroltallet som bestemt af den filipin-associerede fluorescens. Ved hjælp af denne fremgangsmåde testede vi effekten af stigningen i kolesterol på GIRK-kanaler udtrykt i hippocampale neuroner. Som figur 4C viser, resulterede denne ændring i kolesteroltallet i en betydelig stigning i GIRK-strømme. På samme måde testede vi effekten af kolesterolberigelse på den primære GIRK-underenhed udtrykt i hjernen, GIRK2, ved hjælp af Xenopus oocytter heterologekspressionssystem. Til dette formål overudtrykte vi GIRK2^ (GIRK2_E152D), en poremutant af GIRK2, der øger sin membranekspression og aktivitet52 i Xenopus oocytter, og berigede oocytterne med kolesterol i 60 min ved hjælp af fosfolipid-baseret dispersionsmetode. Som figur 4D-F viser, resulterede stigningen i kolesteroltallet i en betydelig stigning i strømme svarende til effekten af forhøjede kolesterolniveauer i neuroner på GIRK kanalfunktion. Disse data yderligere vise effektiviteten, konsistens, og nytten af de to metoder, der er beskrevet ovenfor for at bestemme virkningen af øget kolesterolniveauer på protein aktivitet og cellulære funktion.

Figure 1
Figur 1: Repræsentativ berigelse af rottehjernearterier med kolesterol ved hjælp af methyl-β-cyclodextrin mættet med kolesterol. (A) Et eksempel på et afbildet cerebralt arterieglat muskellag, der viser den koncentrationsafhængige stigning i filippineret fluorescens opnået ved vævsberigelse med stigende koncentrationer af kolesterol fra 6,25 μM-6,25 mM for 1 h. (B) Kvantificering af billeddannelsesdata i (A). Fluorescensintensitetsmåling af hele billedet blev udført ved hjælp af den indbyggede "Måling" funktion i kommerciel software. Ved hver kolesterolkoncentration blev ≥3 billeder indsamlet fra arterier, der blev høstet fra separate dyredonorer. For hver kolesterolkoncentration præsenteres data som middel ± standardfejl. (C) Kolesterolniveauer i cerebral arterie glat muskel lag segmenter umiddelbart efter en 1 h inkubationstid med 0.625 mM kolesterol, og 3 h efter begyndelsen af behandlingen (dvs. 1 h inkubation efterfulgt af 2 h i PBS). (D) Afhængighed af kolesterolniveauer på inkubationstiden som bestemt af en kolesterol oxidase-baserede biokemiske assay. En signifikant forskel indikeres med en stjerne (*p ≤ 0,05). Paneler (A) (kolesterolkoncentrationer 0 mM-0,625 mM), (B) og (C) er blevet ændret fra nord et al.45. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentativ berigelse af Xenopus oocytter med kolesterol ved hjælp af liposomer. (A) Fold ændring i kolesterolindholdet i kontrol Xenopus oocytter inkuberet i kolesterol-fri liposomer i 5-60 min. (B) Fold ændring i kolesterolindholdet i Xenopus oocytter inkuberet i kolesterol-beriget liposomer i 5-60 min. Den afbildede kontrolbar refererer til inkubation i kolesterolfrie liposomer i 5 min og vises som en sammenligning. (C) Sammenligning af virkningen af kolesterolberigelse af to forskellige batcher af Xenopus oocytter ved hjælp af kolesterolberigede liposomer i 5 og 60 min. En signifikant forskel indikeres med en stjerne (*p ≤ 0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentativ berigelse af Xenopus oocytter med kolesterol ved hjælp af methyl-β-cyclodextrin mættet med kolesterol. (A) Fold ændring i kolesterolindholdet i kontrol Xenopus oocytter inkuberet i kontrol ND96 medier i 5-60 min. (B) Fold ændring i kolesterolindholdet i Xenopus oocytter inkuberet i MβCD mættet med kolesterol i 5-60 min. Den afbildede kontrolbar refererer til inkubation i kontrolmedier i 5 min og vises som en sammenligning. En signifikant forskel indikeres med en stjerne (*p ≤ 0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative eksempler på undersøgelser af kolesterolberigelse på proteinfunktion i celler og Xenopus oocytter: virkningen af kolesterol på G-protein indadtil, der korrigerer kaliumkanaler. (A) Filipin-associeret fluorescens signal af hippocampal CA1 pyramideformet neuron fra rotter på kontrol (venstre) versus kolesterol-beriget (højre). (B) Sammenfattende data for filipin-associerede fluorescens signaler opnået fra kontrol og kolesterol-beriget frisk isoleret hippocampal CA1 pyramideformede neuroner. Kolesterol berigelse blev opnået ved at inkubere neuroner i MβCD mættet med kolesterol i 1 time (n = 12-14). (C) Ionisk strøm (I)-spænding(V) kurve skildrer effekten af kolesterol berigelse som beskrevet i (B) på GIRK strømme i hippocampal neuroner fra CA1 regionen. (D) Repræsentative spor, der viser virkningen af kolesterolberigelse ved hjælp af kolesterolberigede fosfolipidbaserede liposomer på GIRK2^ (GIRK2_E152D) udtrykt i Xenopus oocytter ved -80 mV og +80 mV. (E) Sammenfattende data for (D) ved -80 mV (n = 6-9). En signifikant forskel indikeres med en stjerne (*p ≤ 0,05). Undertal (B-E) er blevet ændret fra Bukiya et al.32. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoder til berigelse af pattedyrvæv og -celler og Xenopus oocytter med kolesterol udgør et effektivt redskab til at undersøge virkningen af forhøjede kolesterolniveauer på individuelle molekylære arter, på komplekse makromolekylære systemer (f.eks. proteiner) og på celle- og organfunktion. I dette dokument har vi beskrevet to komplementære tilgange, der letter sådanne undersøgelser. Først beskrev vi, hvordan man beriger væv og celler med kolesterol ved hjælp af MβCD mættet med kolesterol. Vi viste, at i cerebral arterie segmenter, denne tilgang resulterede i en stigning på ~ 50% i kolesteroltallet. Desuden, i en nylig undersøgelse, vi viste, at den samme tilgang fører til en over 2x stigning i kolesterolindhold i hippocampal neuroner fra CA1 regionen. I modsætning hertil, dog, anvender denne tilgang som et middel til at berige Xenopus oocytter resulterede i kun ~ 25% stigning i kolesterolindholdet i Xenopus oocytter. Således, for at berige Xenopus oocytter, vi har udviklet en fosfolipid-baseret dispersion tilgang, der konsekvent resulterer i mindst ~ 50% stigning i kolesterolniveauer. Det er muligt, at fordelen ved denne tilgang til berigelse af Xenopus oocytter skyldes en forbedret lasteevne sammenlignet med belastningskapaciteten af MβCD:kolesterol-kompleksmetoden. Det er også muligt, at mens MβCD: kolesterol kompleks tilgang er optimeret til berigelse af væv og celler, yderligere optimering af protokollen er nødvendig for at forbedre dens anvendelse til berigende Xenopus oocytter.

Den fosfolipid-baserede dispersion, der anvendes til at berige Xenopus oocytter med kolesterol, omfatter to lipider, der er almindeligt anvendt til at skabe planar lipid bilayers (dvs. L-α-phosphatidylethanolamin og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serin). Men, i en tidligere undersøgelse, Det blev vist, at Xenopus oocytter også kunne beriges ved hjælp af kolesterol fra liposomer, der omfattede phosphatidylcholin og cholat36. Denne metode resulterede i en stigning i kolesterol/fosfolipidmolæreforholdet i plasmamembranen fra 0,5 ± 0,1 til 0,9 ± 0,1 med en gennemsnitlig berigelsesprocent på 71%. Denne gennemsnitlige procentdel af berigelse er meget lig det gennemsnitlige niveau for stigning i kolesterolindhold, som vi observerede (~ 70,5%), hvilket tyder på, at valget af fosfolipider bruges til at danne spredning en ikke er afgørende for at berige Xenopus oocytter med kolesterol ved hjælp af denne fremgangsmåde.

Hver protokol, der beskrives, omfatter flere kritiske trin. Efter klargøring af en MβCD:kolesterol-blanding ved et 8:1 kindtforhold for at sikre mβcd-mβcd-mβcd-mβcd-mβcd-mβcd med kolesterol, er det afgørende at dække kolben med mindst to lag paraffinfilm og sætte den i et langsomt rystende 37 °C vandbad natten over. Når dissekere væv til kolesterol behandling er det vigtigt at være blid for at sikre, at vævet ikke er strakt eller skåret. Efter permeabilizing vævet for at lette farvestof penetration, er det afgørende at grundigt vaske væv segmenter i PBS. Væv farvning i fillipin skal udføres i mørke, og fillipin skal omhyggeligt vaskes ud efter farvning er afsluttet. Ved fremstilling af kolesterolberigede fosfolipidbaserede dispersioner er det afgørende at sikre, at spredningen i glasrøret vibrerer forsigtigt og danner små bølger for at undgå adskillelse af kolesterol fra spredningen. For kolesterol behandling af Xenopus oocytter, er det vigtigt at overføre oocytter fra ND96 medium til brønden med kolesterol-beriget fosfolipid-baserede dispersion med så lidt medium som muligt, mens ikke udsætter oocyttter til luft for at holde oocytter intakt. Det er vigtigt at bemærke, at på grund af den iboende maskiner i væv, celler, og Xenopus oocytter, kolesterolniveauer kan equilibrate, og derefter vende tilbage til deres oprindelige niveauer over tid. Derfor skal funktionelle undersøgelser udføres umiddelbart efter inkubationstiden. Her har vi vist dette begreb i cerebrale arterier beriget med kolesterol, viser, at stigningen i kolesterolniveauer 2 h efter en 1 h inkubationstid var cirka halvdelen af stigningen observeret umiddelbart efter inkubationstiden.

På trods af at følge de kritiske trin, der er beskrevet ovenfor, kan der opstå flere udfordringer. For eksempel, en stigning i kolesterolniveauer kan ikke observeres efter kolesterol-berigende behandling. Hvis dette er tilfældet, kan det være nødvendigt at øge koncentrationen af kolesterol i kolesterol-berigende medier. Det samme gælder for kolesterol berigelse af væv, celler, og Xenopus oocytter. Men ved udarbejdelsen af behandlinger ved hjælp af MβCD:kolesterol kompleks tilgang, mængden af MβCD bør øges med stigningen i kolesterol koncentration for at opretholde en 8:1 molære forhold med kolesterol. Derudover kan det være nødvendigt at forberede en frisk kolesterol-berigende løsning, fordi kolesterol tendens til at udfælde ud af opløsningen, og løsningen mister sin kolesterol-berigende effektivitet. Efter kolesterol berigelse, er det muligt, at en filipin signal ikke vil blive observeret. Hvis dette er tilfældet, kan det være nødvendigt at bruge et frisk filipinpulver til at fremstille en ny bestand og gentage forsøget. Filipin fluorescens falder hurtigt, og stamopløsningen kan ikke opbevares i mere end flere dage. En begrænsning af filipin farvning er, at det ser ud til at genkende steroider andre end kolesterol. For eksempel har vi for nylig vist en stigning i den filipin-associerede fluorescens signal i rotte cerebral arterier efter berigelse med coprostanol45. Således bør filipin farvning resultater fortolkes med forsigtighed, og når du er i tvivl, bør alternative tilgange anvendes til at underbygge resultaterne. En mulighed ville være at udføre en biokemisk analyse gennem anvendelse af en kommercielt tilgængelig kolesterol oxidase-baseret kit.

Sammenfattende er de præsenterede tilgange meget effektive til at opnå kolesterolberigelse på tæt på eller over 50%. Faktisk MβCD:kolesterol kompleks tilgang, der resulterer i ~ 50% i kolesterolniveauer i cerebrale arterier er langt mere effektiv end at bruge LDL til at berige disse væv, hvilket resulterer i en simpel ~ 10% stigning i kolesterol35. Det samme gælder for anvendelsen af kolesterol-beriget fosfolipid-baserede dispersions (liposomer) til at berige Xenopus oocytter. Som beskrevet ovenfor, denne tilgang konsekvent resulterer i mindst en 50% stigning i kolesteroltallet. Det er vigtigt, at disse to metoder til kolesterolberigelse in vitro giver resultater, der kan sammenlignes med den kolesterolstigning , der opnås ved at udsætte dyrene for en kost med højt kolesteroltal32,37,40,53,54. Desuden, i modsætning til uger lange højt kolesteroltal kostvaner, in vitro tilgange kræver blot et par minutters inkubation tid til at nå en statistisk signifikant og stabil tilstand stigning i kolesteroltallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. A. M. Dopico er en særlig, deltid, føderal medarbejder og nuværende medlem af The National Advisory Council on Alcohol Abuse and Alcoholism.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en Scientist Development Grant (11SDG5190025) fra American Heart Association (til A.R.-D.), og af National Institute of Health R01 tilskud AA-023764 (til A.N.B.), og HL-104631 og R37 AA-11560 (til A.M.D).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
  2. Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
  3. Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. Biochemistry. 36, 10959-10974 (1997).
  4. Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
  5. Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
  6. Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
  7. Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
  8. Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Springer Nature. Switzerland. 1135 (2019).
  9. Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Springer Nature. Switzerland. 1115 (2019).
  10. Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
  11. Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
  12. Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
  13. Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
  14. Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration? Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
  15. Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer's disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
  16. Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage? Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
  17. Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
  18. Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
  19. Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
  20. Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
  21. Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
  22. López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020 (2011).
  23. Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
  24. Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
  25. Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054 (2010).
  26. Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
  27. Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
  28. Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
  29. Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
  30. Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
  31. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
  32. Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
  33. Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
  34. Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
  35. Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
  36. Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
  37. Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
  38. Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
  39. Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
  40. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. Kumar, S. A. Intech. 95-119 (2015).
  41. Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
  42. Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
  43. Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304 (2016).
  44. Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. In Press (2019).
  45. North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
  46. Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
  47. Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
  48. Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
  49. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
  50. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
  51. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
  52. Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
  53. Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
  54. Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics