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Entdeckung von CsgD-Regulierungszielen im Salmonellen-Biofilm mit Chromatin-Immunpräzipitation und Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Genetics
 

Summary

Chromatin-Immunpräzipitation in Verbindung mit der Sequenzierung der nächsten Generation (ChIP-seq) ist eine Methode, die verwendet wird, um Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren und den von ihnen kontrollierten genomischen Sequenzen herzustellen. Dieses Protokoll skizziert Techniken zur Durchführung von ChIP-seq mit bakteriellen Biofilmen, wobei Salmonella enterica serovar Typhimurium bakterieller Biofilm als Beispiel verwendet wird.

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Palmer, M. B., Wang, Y., White, A. P. Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq). J. Vis. Exp. (155), e60736, doi:10.3791/60736 (2020).

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Abstract

Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Sequenzierung (ChIP-seq) ist eine Technik, die verwendet werden kann, um die regulatorischen Ziele von Transkriptionsfaktoren, Histonmodifikationen und anderen DNA-assoziierten Proteinen zu entdecken. ChIP-seq-Daten können auch verwendet werden, um differentiale Bindung von Transkriptionsfaktoren in verschiedenen Umgebungsbedingungen oder Zelltypen zu finden. Zunächst wurde ChIP durch Hybridisierung auf einem Mikroarray (ChIP-Chip) durchgeführt; ChIP-seq ist jedoch durch technologische Fortschritte, abnehmende finanzielle Hürden für die Sequenzierung und massive Mengen hochwertiger Datenproduktion zur bevorzugten Methode geworden. Techniken zur Durchführung von ChIP-seq mit bakteriellen Biofilmen, einer Der Hauptquellen persistenter und chronischer Infektionen, werden in diesem Protokoll beschrieben. ChIP-seq wird auf Salmonella enterica serovar Typhimurium Biofilm und planktonischen Zellen durchgeführt, die auf den Master-Biofilm-Regulator CsgD abzielen, um die Differentialbindung in den beiden Zelltypen zu bestimmen. Hier zeigen wir die für die Ernte geeignete Menge an Biofilm, die Normalisierung zu einer planktonischen Kontrollprobe, die Homogenisierung des Biofilms für den Crosslinker-Zugriff und die Durchführung routinemäßiger ChIP-Seq-Schritte, um qualitativ hochwertige Sequenzierungsergebnisse zu erzielen.

Introduction

Bakterielle Biofilme, strukturelle Aggregate von Zellen, die in eine selbst produzierte Matrix eingebettet sind, sind resistent gegen Austrocknung, Antibiotika und Wirtsimmunantworten1. Als solche verursachen sie anhaltende und chronische Infektionen und stellen Forscher aufgrund ihrer Überlebens- und Übertragungslösungen vor einzigartige Herausforderungen. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) wurde gefunden, um phänotypisch heterogene Populationen von Biofilm-Aggregaten zu etablieren, die gegen Austrocknung und Antibiotika resistent sind, und planktonischen Zellen, die Virulenzfaktoren in reine Kultur ausdrücken, wenn sie Umweltstress ausgesetzt sind (28 °C, Begrenzung von Nährstoffen)2. Diese beiden Zelltypen entstehen durch die bistabile Expression des Master-Biofilmregulators CsgD3. Wir haben vermutet, dass dies eine Bet-Hedging-Strategie für Salmonellensein kann, wo die planktonischen Zellen an der kurzfristigen Übertragung teilnehmen und Biofilmzellen in der Lage sind, langfristig in der Umwelt zu bleiben, bis eine Gelegenheit entsteht, einen neuen Wirt zu infizieren2,4. Viele der regulatorischen Elemente, die den csg-Operon-Ausdruck steuern, sind gut charakterisiert5. Abgesehen von adrA und dem csg operon6sind jedoch nur wenige regulatorische Ziele von CsgD bekannt. Die Identifizierung des CsgD-Regulierungsnetzes würde uns helfen, den Salmonellen-Lebenszyklus und die Rolle, die Biofilme bei der Übertragung spielen, besser zu verstehen.

Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) ist eine leistungsstarke In-vivo-Technik zur genomweiten Identifizierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen und liefert Informationen über regulatorische Prozesse mit Transkriptionsfaktoren, Histonmodifikationen oder Nukleosomen7. Neuere Studien haben diese Technik verwendet, um die Differentialproteinbindung zwischen Wachstumsbedingungen und Zelltypen8zu bewerten. Bei Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) werden DNA-Fragmente mit interagierenden Proteinen durch Antikörperauswahl der Zielproteine angereichert. Die Zellen werden geerntet und DNA-bindende Proteine werden durch formaldehyd-Kreuzlinkerbehandlung mit der DNA in vivo vernetzt. Die Zellen werden lysiert, wodurch der Zellinhalt freigesetzt wird, und Chromatin wird in etwa 200–600 bp Fragmente7geschert. DNA-Fragmente, die an das Zielprotein gebunden sind, werden mit Antikörpern immunpräzipiert und durch De-Vernetzung isoliert, gefolgt von der Proteinverdauung9. Diese DNA-Fragmente stellen Proteinbindungsstellen dar, die durch Hybridisierung zu einem Mikroarray (ChIP-Chip) oder durch tiefe Sequenzierung und Kartierung zur Genomsequenz10,11ergänzt werden. Obwohl ChIP-Chip-Experimente ausreichende regulatorische Daten liefern, sind sie aufgrund des Einsatzes teurer Sonden sowie Hybridisierung und Array-Bias12begrenzt. ChIP-seq hat einen größeren Dynamikbereich mit erhöhter Nukleotidauflösung und -abdeckung, verbessertem Signal-Rausch-Verhältnis und weniger Artefakten im Vergleich zu ChIP-Chip7.

ChIP wurde verwendet, um Sfh und OmpR Regulierung in Salmonella serovar Typhimurium13,14, Quorum-Sensing AphA Regulierung in Vibrio alginolyticus15, RpoS Regulierung in Escherichzu analysieren ia coli16, Virulenzregulator EspR-Regulierung bei Mycobacterium tuberculosis17, potentielle Digulylatcyclasen durch AmrZ-Regulierung in Pseudomonas aeruginosa18, sowie VraSR Regulierung in Staphylococcus aureus19. Die beschriebenen bakteriellen ChIP-Seq-Experimente beginnen mit dem Anbau von Zellen in flüssigen Medien und der Ernte in einzelliger Form. Die Analyse von Biofilmen und die entsprechende Genregulation stellen jedoch eine neue Reihe von Herausforderungen dar, um ein erfolgreiches ChIP-seq-Protokoll zu generieren. In diesem Protokoll wird ChIP-seq verwendet, um differenzielle regulatorische Ziele von CsgD, der S, zu finden. Typhimurium-Master-Biofilmregulator in Biofilm- und planktonischen Zelltypen. Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der geeigneten Mengen an Biofilm für ChIP-seq, Ernte Biofilm aus Kolbenkultur, Normalisierung Vonbiose und Einzelzell-Kontrollproben, Homogenisierung von Biofilm und vollständige Immunpräzipitation. Dies wird für die Untersuchung der regulatorischen Ziele in bakteriellen Biofilmen nützlich sein und kann für viele Arten angepasst werden.

Protocol

1. Flaschenkulturzellwachstum

  1. Aus gefrorenen Beständen, Streifen Salmonella serovar Typhimurium Stämme auf LB Agar (20 ml festes Medium in 100 mm Petriplatte) mit dem entsprechenden Antibiotikum und inkubieren bei 37 °C für 16-20 h, um isolierte Kolonien zu erhalten.
  2. 5 ml LB-Brühe mit dem entsprechenden Antibiotikum in einem 25 mm x 150 mm Borosilikat-Kulturrohr mit 1–3 Kolonien aus Streifenplatten ab Schritt 1.1 impfen. Bei 37 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen für 7 h inkubieren.
  3. Messen Sie OD600 der Brühekultur mit einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie ein Aliquot von Kultur 1 in 4 in PBS in einer 2 ml Küvette und messen Sie die Absorption bei 600 nm. Wir haben festgestellt, dass der wichtigste Faktor in diesem Schritt die Zeit des Wachstums ist. Die OD-Werte werden verwendet, um die Kulturen zu normalisieren, um die gewünschte Anzahl von Zellen in Schritt 1.4 zu liefern.
  4. Fügen Sie 1,0 OD600 Volumenäquivalent der Zellkultur (d. h. 109 Zellen) zu einem Erlenmeyerkolben hinzu, der 100 ml 1% Trypton mit dem entsprechenden Antibiotikum enthält. Bei 28 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen für 13 stunden inkubieren.
    Hinweis: Biofilmzellen werden als aggregierte Flocken und einzelne planktonische Zellen in den trüben Medien angezeigt.

2. Sammeln zellfrei konditioniert 1% Trypton

  1. Sammeln Sie Kolbenkultur für zellfrei konditionierte 1% Tryptone. Pipette Kolben Kultur mehrmals zu mischen, bevor sie zu einem Zentrifugenrohr hinzufügen.
  2. Zentrifuge bei 12.000 x g für 10 min bei 10 °C, um alle Zellen zu pellet.
  3. Dekantieren Sie überstand in eine 0,2 m Filtereinheit, Vakuumfilter, und geben Sie in ein neues Rohr.
    Hinweis: Biofilmaggregate sind in konventionellen Lösungen (z.B. PBS) haften und kleben an den Seiten von Rohren und Pipettenspitzen. Da es eine einfachere Manipulation ermöglicht, verwenden wir konditionierte Medien (1% Trypton), um Biofilm zunächst zu bewegen und warme PBS unmittelbar vor der Vernetzung (Schritt 4.5) zu verwenden, um alle Proteinvernetzungssubstrate zu entfernen, die in den Medien vorhanden sein könnten.

3. Trennung von Biofilm und planktonischen Zellen von Kolbenkulturen2

  1. Mit einer sterilen 25 ml Pipette, Aliquot Kolbenkultur in 15 ml Rohre. Zentrifuge bei langsamer Geschwindigkeit (210 x g) für 2 min, um die beiden Zelltypen zu trennen.
    Hinweis: Biofilmzellen sollten ein loses Pellet an der Unterseite des Rohres bilden
  2. Pipette den Überstand, der planktonische Zellen enthält, in zwei 40 ml Zentrifugenröhren für später (Schritt 5). Entfernen Sie die restliche Flüssigkeit, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Zelltypen von allen Medien der Kolbenkultur getrennt wurden.

4. Vorbereitung von Biofilmaggregaten

Hinweis: Biofilm wird durch Nassgewicht geerntet, um 25 g DNA zu liefern, das empfohlene Mindestausgangsmaterial für ChIP. Der Biofilm-Umrechnungsfaktor (BCF) von S. Typhimurium ist 1,73 x 108 KBE/mg2. Forscher, die andere Biofilmtypen vorbereiten, müssen empirisch die Anzahl der Zellen pro Gewichtseinheit des Biofilms definieren, die verwendet wird, um das Gewicht des Biofilms zu ermitteln, das für 25 g DNA-Ausgangsmaterial erforderlich ist, mit dieser Gleichung:
Equation 1

  1. Wiegen Sie eine 2 ml Fangkappe oder ein Schraubverschlussrohr genau.
  2. Das Biofilmpellet in 1 ml konditioniertem Trypton wieder aufsetzen. Bewegen Sie den resuspendierten Biofilm in ein vorgewogenes 2 ml Schnappverschluss- oder Schraubverschlussrohr.
  3. Zentrifuge für 1 min bei 11 000 x g bei 20 °C
  4. Entfernen Sie vorsichtig alle Überstand aus dem Rohr und wiegen Sie das Rohr genau. Subtrahieren Sie das Rohrgewicht vom Gewicht der Röhre mit Biofilm, um das Gewicht des Biofilms zu finden. Es sollte 10 % des Ziel-Biofilmgewichts betragen.
  5. Waschen Sie Zellen, um verbleibende konditionierte Trypton zu entfernen. Fügen Sie 1 ml warme PBS in das Rohr und Wirbel sanft, um das Pellet wieder aufzuhängen. Zentrifuge für 3 min bei 8 000 x g, um Biofilm zu pellet und den Überstand zu entfernen. Fügen Sie 1 ml PBS in das Rohr und Wirbel, um das Pellet wieder aufzuhängen.

5. Vorbereitung planktonischer Zellen

  1. Zeichnen Sie das Volumen und die OD600 des planktonischen Überstandes aus der langsamen Geschwindigkeitszentrifugation (Schritt 3.2) mit einem Spektralphotometer auf
  2. Berechnen Sie das benötigte Volumen für eine endgültige OD600 von 6,0:
    Equation 2
  3. Zentrifuge auf 10 °C und Sedimentplanktonzellen durch Zentrifugation abkühlen (10.000 x g, 10 min bei 10 °C)
  4. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet im endletzten PBS-Volumen, berechnet in Schritt 5.2, wieder auf.
  5. Die OD600 der planktonischen Zellen mit einem Spektralphotometer neu messen und das Volumen von 6,0 OD600 planktonischen Zellen in ein 2 ml Schnappverschluss- oder Schraubverschlussrohr abgeben.
  6. Bringen Sie die Lautstärke mit PBS auf 1 ml.

6. Homogenisierende Zellen

  1. Fügen Sie jedem der Rohre eine sterilisierte 5 mm Edelstahlperle hinzu.
  2. Homogenisieren Sie mit einer Mischermühle für 5 min bei 30 Hz. Beobachten Sie Aggregatrohre, um zu bestätigen, dass Biofilm auseinandergebrochen wurde.
  3. Übertragen Sie die homogenisierten Zellen auf ein neues 1,5 ml Rohr, um die Metallperle zu vermeiden. Bringen Sie die Lautstärke mit PBS auf 1 ml.
    Hinweis: Führen Sie serielle Verdünnungen durch, um Eingabezellen aufzuzählen, und überprüfen Sie, ob die endgültige Zellennummer nahe an der gewünschten oder vorhergesagten Zahl liegt.

7. Vernetzung von Proteinen mit DNA

  1. Frisches Formaldehyd in Probenröhrchen auf eine Endkonzentration von 1% geben. 30 min bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad inkubieren.
    Achtung: Formaldehyd ist ätzend, haut-, augen- und atemsaugend reizend und entzündlich. In einer Dunstabzugshaube dosieren.
  2. Fügen Sie 1 M Glycin zu einer Endkonzentration von 125 mM hinzu, um die Vernetzung zu beenden. 5 min bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad inkubieren.

8. Waschzellen, um überschüssigen Vernetzen zu entfernen

  1. Sedimentieren Sie die Zellen bei 8.000 x g für 3 min und entfernen Sie den Überstand
  2. Setzen Sie das Pellet in 20 l 25-fachen Proteasehemmern und 500 l filtersterilisiertem PBS aus.
  3. Zentrifugenrohr für 3 min bei 8000 x g und entfernen Sie den Überstand.

9. Lysing-Zellen

  1. Setzen Sie das Pellet in einem 600-L-Lysispuffer (siehe Tabelle 1)wieder auf und brüten Sie 10 min auf Eis.
  2. 1,4 ml IP-Verdünnungspuffer (siehe Tabelle 1)zu einem sterilen 15 ml-Rohr hinzufügen und lysierte Zellen in das 15 ml-Rohr verschieben. Halten Sie die Röhre 1,5-2 h auf Eis und wirbeln Sie sanft und gelegentlich.
    Hinweis: Einige widerstandsfähige Zellmaterialien können in Rohren verbleiben. Eine lange Inkubationszeit auf Eis mit gelegentlichem Wirbel wird Material auseinanderbrechen. Der Rest wird durch Beschallung aufgebrochen.

10. Fragmentierung der DNA durch Beschallung

  1. Legen Sie das 15 ml-Rohr in einen Becher Auseis und legen Sie die 3 mm Sonde in das Rohr.
  2. Führen Sie 5 Beschallungsrunden von 30 s bei 20–40% von 400 W mit 2 min Kühlung auf Eis zwischen den Bursts durch.
  3. Sediment ausgefälltes Material durch Zentrifugation (8000 x g, 10 min bei 4 °C). Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre.
  4. Optional die Decrosslinking bei 65 °C für 30–60 min durchführen und RNA und Protein bei 45 °C für 30-60 min verdauen, bevor Sie auf einem 2% Agarose-Gel laufen, um nach Fragmenten der richtigen Größe zu suchen.
    Hinweis: Tauchen Sie die Sonde in das Zelllysat ein. Halten Sie die Lösung auf Eis, während Beschallung und Ruhe. Entfernen Sie das Rohr nicht, während die Beschallungssonde pulsiert. Die Lösung sollte trübe Vorbeschallung und klare Nachbeschallung erscheinen.

11. Immunpräzipitierende DNA-Protein-Antikörper-Komplexe

  1. Vorbereitung
    1. Geben Sie ein 1,35 ml aliquot für Immunpräzipitation und ein 200-L-Aliquot als Eingangskontrolle aus. Bewahren Sie die Eingabesteuerung bei -80 °C auf, bis Entkreuzungs- und Verdauungsschritte durchgeführt werden.
  2. Immunpräzipitation mit primärem Antikörper
    1. Fügen Sie dem 1,35-L-Aliquot 10 g gereinigten proteinspezifischen Primärantikörper hinzu. Über Nacht bei 4 °C auf einem rotierenden Rad inkubieren.
      Hinweis: Der primäre Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper, ein hochwertiges polyklonales Serum oder ein kommerzieller Epitop-Antikörper (d. h. Anti-FLAG) sein.
    2. Fügen Sie den Röhren ab Schritt 11.2.1 50 l Protein G-Magnetperlen hinzu und inkubieren Sie bei 4 °C für 3 h auf einem rotierenden Rad.
    3. Platzieren Sie IP-Waschpuffer 1, IP-Waschpuffer 2 und TE pH 8.0 (siehe Tabelle 1) in einem Eiskübel. Warmer Elutionspuffer auf 65 °C.
      Hinweis: Legen Sie die Lösung, die den Elutionspuffer enthält, nicht auf Eis.
    4. Binden Sie die Protein G Magnetperlen mit einem magnetischen Ständer an die Seite von Röhrchen
    5. Waschen: 2x mit 750 l kalter IP-Waschpuffer 1 waschen, 1x mit 750 l kaltem IP-Waschpuffer 2 waschen und 2x mit 750 l kaltem TE bei pH 8,0 waschen. Halten Sie die Rohre während des Einwass auf dem magnetischen Ständer.
    6. Fügen Sie jedem Rohr 450 l IP-Elutionspuffer (siehe Tabelle 1) hinzu und inkubieren Sie bei 65 °C 30 min mit sanfter Wirbelung alle 5 min.
    7. Binden Sie Perlen an der Seite von Rohren mit einem magnetischen Ständer. Warten Sie mindestens 2 min, bis die Lösung klar ist.
    8. Geben Sie den gereinigten Überstand auf ein neues 1,5 ml Rohr, wobei Sie darauf achten, das magnetische Perlenpellet nicht zu stören.

12. Entvernetzung von DNA-Protein-Komplexen und Verdauung von koreinigender RNA und Protein

  1. Fügen Sie 2 g RNase A und NaCl zu einer Endkonzentration von 0,3 M in jedes Rohr.
  2. Bei 65 °C, für 6 h oder über Nacht inkubieren.
  3. Vollständige Proteinverdauung durch Zugabe von 180 g Proteinase K zu jeder Röhre, dann inkubieren bei 45 °C für 3–5 h.

13. Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung

  1. DNA mit magnetischen Perlen reinigen
    Hinweis: Magnetperlen werden bevorzugt, um die kleinen Mengen an DNA zu isolieren, die normalerweise während ChIP mit Bakterienzellen zurückgewonnen werden.
  2. Bereiten Sie Bibliotheken mithilfe eines Kits vor, das mit der ausgewählten Sequenzierungsplattform kompatibel ist.
  3. Überprüfen Sie die Bibliothekskonzentration mit einem Fluorometer und einem breit gefächerten dsDNA-Kit oder einem qRT-PCR-Bibliotheks-Quantifizierungskit.
    Hinweis: Nach unserer Erfahrung können Fluorometermessungen die DNA-Konzentration überschätzen.
  4. Poolbibliotheken, die eine angemessene Abdeckung für jedes Bibliotheksbeispiel berücksichtigen. Für die Illumina-Sequenzierung mit Salmonellahaben wir 10–12 Bibliotheken gepoolt. Tris-HCl pH 8.0 zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzufügen.
  5. Sequenz nach den Spezifikationen der ausgewählten Plattform.

Representative Results

Die Herstellung von Chromatin-Immunpräzipitationsproben aus bakteriellem Biofilm umfasst mehrere Schritte, wie in Abbildung 1dargestellt. Dazu gehören das Anbauen von Biofilm in der Kolbenkultur, das Sammeln konditionierter Medien, das Sammeln einer ausreichenden Menge an Biofilm und planktonischen Zellen als Kontrolle, das Waschen von Zellen in PBS, die Homogenisierung, die Vernetzung von Proteinen zur DNA, die Fragmentierung von DNA durch Beschallung, das Immunpräzipieren der DNA mit den entsprechenden Antikörpern und Protein-G-Perlen, das Waschen und Eluieren immunozipisierter DNA und die Reinigung der DNA.

S. Typhimuriumzellen, die in flüssiger Kultur unter biofilminduzierenden Bedingungen angebaut werden, durchlaufen einen Phänotypwechsel zu multizellulären Biofilmaggregaten und planktonischen Zellen. Diese Population wird etwa 40% Biofilmaggregate enthalten, die höhere Konzentrationen von Digulylatcyclasen (DGCs) und Biofilmregulatoren ausdrücken, und 60% planktonische Zellen, die höhere Konzentrationen von Virulenz-assoziierten Genen ausdrücken2,4 (Abbildung 2A). In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zum Ernten beider Zelltypen, um Transkriptionsstellen über ChIP-seq zu vergleichen; Dieses Protokoll kann jedoch für andere Arten von Biofilmen angepasst werden, die von anderen Bakterienarten gebildet werden. Biofilmaggregate und planktonische Zellen werden durch langsame Geschwindigkeitszentrifugation getrennt, die Biofilm pellets und planktonische Zellen im Überstand2 (Abbildung 2B) hinterlässt. Die Zelltypen werden dann für nachfolgende Schritte im Protokoll separat behandelt.

Die empfohlene Menge an DNA-Eingang für ChIP-seq beträgt 10-25 g20. In S. Typhimuriumkolbenkultur, 30 mg Biofilm ergibt etwa 25 g DNA. Da Biofilmaggregate eine Fülle von proteinhaltigem extrazellulärem Material haben, gehen wir davon aus, dass dies die Effizienz der Vernetzung beeinträchtigen würde. Wenn wir die verschiedenen Zelltypen einfach nach Zellzahl normalisieren würden, kann die Behandlung von planktonischen Zellen zu einer ungleichen Menge an vernetzten Produkten führen, die für die Immunpräzipitation vorgelegt werden. Ein Proteintest wurde durchgeführt, um die entsprechende Menge an planktonischem Zellmaterial zu bestimmen, die 30 mg Biofilm entspricht (Abbildung 3). 6.0 OD600 planktonische Zellen wurden geerntet, um 30 mg Biofilm zu entsprechen.

Biofilmaggregate müssen zuerst auseinandergebrochen werden, um einen gleichberechtigten Zugang des Verkreuzers zu allen Zellen zu ermöglichen. Wir fanden heraus, dass die gleichmäßigste und hochdurchsatzweiseste Möglichkeit, die Zellen zu homogenisieren, die Verwendung einer Mischermühle und einer 5 mm Edelstahlperle war (Abbildung 4A). Planktonische Zellen werden auf die gleiche Weise behandelt, um Variablen im ChIP-seq-Experiment zu reduzieren (Abbildung 4B).

Sobald die DNA durch Beschallung fragmentiert, vernetzt und mit RNase und Proteinase K behandelt wurde, kann sie auf einem 2% Agarose-Gel visualisiert werden. Beschallte DNA wird in eine Sammlung von Fragmenten zerlegt, die als Abstrich auf dem Agarose-Gel erscheinen. Die durchschnittliche Fragmentgröße nimmt mit einer zunehmenden Anzahl von Beschallungsausbrüchen ab (Abbildung 5). Die Energieübertragung variiert für verschiedene Beschallungseinheiten, daher wird ein Beschallungstest empfohlen, um die Anzahl der Beschallungsbursts zu bestimmen, die erforderlich sind, um DNA auf durchschnittlich weniger als 1 kb zu fragmentieren. Für unser ChIP-seq-Experiment haben wir 5 Bursts ausgewählt.

ENCODE-Richtlinien empfehlen eine Bestätigung der Antikörper-Zielbindungsaktivität mit einem Immunoblot21. In diesem Fall haben wir die Spezifität und Bindungsfestigkeit unseres Antikörpers durch Immunoblot an ganzen zellspezifischen Lysaten gemessen, die für ChIP vorbereitet wurden (Abbildung 6). Wir haben bestätigt, dass der Antikörper an CsgD-3xFLAG bindet; Anti-FLAG- und Anti-CsgD-Signale kolokalisieren sich mit dem erwarteten Molekulargewicht (28 kDa)22.

ChIP-Verfahren führen oft zu geringen DNA-Konzentrationen. Daher wurde ein Reinigungsverfahren gewählt, das Verunreinigungen entfernt und einen hohen Anteil der DNA beibehält. Die magnetische Perlenreinigung wurde über die säulenbasierte Reinigung gewählt, da sie niedrige Konzentrationen der Eingangs-ChIP-DNA besser beibehielt (Abbildung 7) und Verunreinigungen entfernte (Daten nicht dargestellt).

Aufgrund reduzierter Ausgangsmengen an DNA kann die Bibliotheksvorbereitung von ChIP-DNA verdünnte Adapter und PCR-Anreicherung erfordern. Vor der Sequenzierung können Bibliotheken durch Bioanalyzer-Ablaufvisualierung visualisiert werden, um die korrekte Größenverteilung vor und nach der PCR-Anreicherung zu bestätigen (Abbildung 8). Darüber hinaus sollte qPCR verwendet werden, um die Anreicherung von Bindungsregionen zu bestätigen, wenn ein bekanntes regulatorisches Ziel des Transkriptionsfaktors vorhanden ist, indem die Faltenveränderung (Ct) zwischen bekannter Ziel- und Referenzgensequenzhäufigkeit in immunoprezipierter und beschallter Input-DNA verglichen wird.

ChIP-Sequenzierungsdaten sollten analysiert werden, indem Qualitätsbewertungen zugewiesen, Basen niedriger Qualität gestutzt, Vorwärts- und Rückwärtslesevorgänge ausgerichtet werden (in gepaarter Endsequenzierung), zu einem hochwertigen Referenzgenom zusammengemontelt, Spitzen über dem Hintergrund gefunden und nachgelagerte Analysen durchgeführt werden (Abbildung 9A). Die nachgeschaltete Analyse sollte die Visualisierung und Anmerkung von Spitzen, die Konsistenz mit biologischen Replikationsproben und die Motivanalyse umfassen und könnte eine Differenzbindungsanalyse zwischen Bedingungen oder Zelltypen sowie die Datenintegration mit der Genexpression aus bekannten Pfaden umfassen. Bei ChIP-seq-Daten wie unserer sollten Spitzen als deutlich über dem Hintergrund liegend(Abbildung 9B,C, rote Balken) mit einer p-Wertbestimmung identifiziert werden, nicht nur durch Faltenwechsel. Letztendlich werden die zugeordneten Lesevorgänge anhand der Anmerkung des Referenzgenoms visualisiert (Abbildung 9D). Ein schlechtes ChIP-Seq-Ergebnis würde wie Input-Seq ohne signifikante Spitzen über dem Hintergrund erscheinen.

Figure 1
Abbildung 1: Abbildung der Schritte in ChIP-seq mit bakteriellen Biofilmen. Im beschriebenen Verfahren hat S. Typhimurium-Zellen werden in 1% Tryptonkolbenkultur bei 28 °C mit Schütteln (1) angebaut, zellfreie konditionierte Medien werden für den Umgang mit Biofilmzelltypen (2) gesammelt, die verwendet werden, um eine ausreichende Menge an Biofilm und planktonischen Zellen zu sammeln (3). Diese Zellen werden mit PBS gewaschen und homogenisiert, um Biofilm (4) auseinanderzubrechen. Proteine sind mit einem Formaldehyd-Verlinker mit der DNA vernetzt, danach werden die Zellen lysiert, um Zellinhalte freizusetzen (5). Die DNA im Zelllysat wird durch Beschallung fragmentiert (6). Die mit dem Zielprotein vernetzte DNA wird durch Immunpräzipitation mit einem Antikörper ausgewählt, der an das Zielprotein und die Protein G-Magnetperlen bindet (7). Ausgewählte DNA wird aus Protein G-Magnetperlen (8) gewaschen und eluiert und zur Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung gereinigt (9). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: In-vitro-Kolbenmodell zum Studium von S. Typhimurium Biofilm Entwicklung. (A) S. Typhimuratzellen, die in 1% Trypton für 13 h bei 28 °C angebaut werden, durchlaufen phänotypumwechselzu den Biofilmaggregaten und planktonischen Zellen in der flüssigen Phase der Kolbenkultur. (B) Biofilmaggregate und planktonische Zellen aus der Kolbenkultur in (A) wurden 2 min durch Zentrifugation bei 210 x g getrennt. Der Überstand wurde für planktonische Zellpräparate geerntet und das Pellet für Biofilmzellpräparate geerntet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Gesamtproteinkonzentrationen für planktonische Zellen und Biofilmzellproben, die von S geerntet wurden. TyphimuriumKolben Kultur. Es wurden farbmetrische Protein-Assays durchgeführt und Proteinmengen relativ zu einer BSA-Standardkurve bei 750 nm gemessen. Der Proteingehalt von lysierten planktonischen Zellproben bei 4,0, 6,0 und 8,0 OD600 wurde mit 30 mg Biofilmaggregaten verglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Homogenisierung von Zellproben aus S. Typhimurium Biofilmkolbenkulturen. (A) Biofilmaggregate aus der in PBS (links) resuspendierten Kolbenkultur wurden mit einer Mischmühle bei 30 Hz für 5 min (rechts) homogenisiert. (B) Planktonzellen aus kolbenkultur, die in PBS resuspendiert wurden, wurden von der Mischermühle bei 30 Hz für 5 min verarbeitet, um die Konsistenz zwischen Zelltypproben zu gewährleisten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Beschallungstest mit Vor-ChIP-Zelllysaten. Biofilm-Aggregat und planktonische Zellproben wurden getrennt, homogenisiert, vernetzt und lysiert. DNA-Protein-Komplexe wurden bis zu 8 Mal bei 30 s und 2 min auf Eis beschallt, um DNA in kleinere Fragmente zu brechen. Ein Teil des beschallten Lysats wurde auf einem 2% Agarose-Gel abgetrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Zielbindende Spezifität von Anti-FLAG-Antikörpern, die in ChIP-seq verwendet werden. Die Antikörperspezifität wurde durch Immunoblotting gegen ganze Zelllysate beurteilt, die aus Kolbenkulturen des S hergestellt wurden. Typhimurium-Stämme wie gezeigt. Die Proben der DehnungcsgD + p3xFLAG/csgD und der WT-Biofilm stellen Biofilmaggregate dar, die aus Kolben geerntet werden, während Die Stamm-CsgD-p3xFLAG- und WT-Planktonzellen planktonische Zellen planktonische Zellen darstellen. Gereinigte CsgD mit T-Tags wurde als Steuerung geladen. Ganze Zelllysate wurden normalisiert, so dass in jeder Spur 30 g Gesamtprotein analysiert wurden. Zahlen auf der linken Seite beziehen sich auf die Größe (in kDa) der vorgefärbten Molekulargewichtsmarker. Primärer Antikörper für den oberen Fleck war ein polyklonaler Kaninchen-Anti-FLAG-Antikörper (Sigma-Aldrich #F7425), während der untere Fleck zusammen mit einem CsgD-spezifischen monoklonalen Antikörper2mit Kaninchen-Anti-FLAG inkubiert wurde. Goat Anti-Rabbit IgG (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) und Goat Anti-Maus IgG (LiCor IRDye 800CW, 925-32210) wurden als sekundäre Antikörper verwendet. Fluoreszierende Signale wurden mit dem Odyssey CLx Bildgebungssystem und dem Softwarepaket Image Studio 4.0 (Li-Cor Biosciences) visualisiert. Repräsentative Bilder werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Säulen- oder magnetische Perlen-basierte Reinigungsstrategien für kleine Mengen an DNA, die aus ChIP-seq-Experimenten resultieren. Proben bekannter DNA-Mengen wurden mit säulenbasierten Kits oder magnetischen Perlen gereinigt und die Konzentration des Eluats nach der Reinigung gemessen. Magnetische Perlen zeigten eine bessere Erholung bei niedrigen DNA-Spiegeln, ähnlich den geringen MENGEN an DNA, die typischerweise am Ende des ChIP-seq-Protokolls, aber vor der Vorbereitung der NGS-Bibliothek auftreten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: ChIP-DNA-Präparate und nachfolgende Bibliotheken, die von Bioanalyzer visualisiert werden. (A) Die durchschnittliche Fragmentgröße der genomischen DNA nach Zelllyse und Beschallung betrug <1000 bp, wobei die Mehrheit der Fragmente im Bereich von 200–500 bp lag. (B) Das Ausgangsmaterial für die Bibliotheksvorbereitung war unten entdeckt. (C) Adapterligation und PCR-Anreicherung ermöglichen die Verstärkung von Bibliotheksfragmenten. (D) Eine schlechte Bibliotheksvorbereitung hat niedrige DNA-Peaks, ungerade oder hochmolekulare Spitzen oder reichlich Adapterspitzen bei ca. 100 bp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: ChIP-seq-Daten werden mit bioinformatischen Werkzeugen analysiert und in einem Genombrowser visualisiert. Ein. Flussdiagramm zur typischen bioinformatischen Analyse von ChIP-seq-Daten. Rohlesevorgänge für Biofilm(csgD-Stamm + p3xFLAG/csgD) und planktonische Zellen (csgD + p3xFLAG) wurden für minderwertige Lese- und Adapter gereinigt und Szugeordnet. Typhimurium 14028s Genome (NC_016856.1 für das Chromosom und NC_016855.1 für das Plasmid) von Bowtie2 (v2.3.3.1) mit den Standardparametern23. MACS2 (v2.1.2) wurde verwendet, um die Peaks mit Denparametern von '-q 0.01 -- nomodel' aufzurufen und Biofilmreplikationen als Testdatensätze und planktonische als Steuerung24zu verwenden. Das MACS2 bdgcmp Modul wurde weiter verwendet, um Faltanreicherungsspur mit Parametern von '-m FE' zu erzeugen. Die signifikante Peak-Datei mit Falten-Anreicherungsspur wurde mit bedtools/bedClip/bedGraphToBigWig25 in eine Perückendatei umgewandelt und mit DemIntegrative Genomics Viewer v2.5.126auf dem Referenzgenom visualisiert. Repräsentative Spitzen werden angezeigt (rote Balken). (B) Ein großer Bereich von 40 kbp, der mehrere Spitzen enthält, ist ein atypisches Ergebnis, aber immer noch potenziell wertvoll. (C) Dies ist ein typischeres Ergebnis, das zwei signifikante Spitzenregionen zeigt. (D) Zoomen Sie auf den linken Peak in C, zeigt Lesekarten zuordnung zum Bereich des S. Typhimurium 14028s Genom mit divergierenden Promotoren für uspA und uspB. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Zelllysepuffer
Lysis-Puffer
50 mM Tris-HCl pH 8,1
10 mM EDTA
1% SDS
Protease-Inhibitoren
IP-Verdünnungspuffer
20 mM Tris-HCl pH 8,1
2 mM EDTA
150 mM NaCl
1% Triton X-100
0,01% SDS
Immunpräzipitationspuffer
IP-Waschpuffer 1
20 mM Tris-HCl pH 8,1
2 mM EDTA
50 mM NaCl
1% Triton X-100
0,1% SDS
IP-Waschpuffer 2
10 mM Tris-HCl pH 8,1
250 mM LiCl
1 mM EDTA
1% NP-40
1% Desoxycholsäure
TE (T10E1) pH 8,0
10 mM Tris-HCl
1 mM EDTA
Elutionspuffer
1% SDS
100 mM NaHCO3

Tabelle 1. Pufferrezepte.

Discussion

Dieses Protokoll skizziert eine Technik zur Durchführung von ChIP-seq mit Salmonella enterica serovar Typhimurium Biofilm und planktonischen Zellen aus reiner Kultur, um regulatorische Ziele des Master-Biofilmregulators CsgD zu finden. Wir erwarten differenzielle Bindungsinformationen aufgrund der Bi-Stabilität von CsgD in den beiden Zelltypen, mit hohen Konzentrationen in Biofilmaggregaten und niedrigen Konzentrationen in planktonischen Zellen2,3. Diese Technik kann jedoch auch auf andere bakterielle Transkriptionsfaktoren, Zelltypen oder Wachstumsbedingungen angewendet werden. Insbesondere kann diese Technik mit einem experimentell ermittelten Umwandlungsfaktor für Die KBE pro Gewichtseinheit von Biofilmzellen an andere bakterielle Biofilme angepasst werden.

ChIP-seq kann durch Sequenzierung anfällig für die Verstärkung technischer Fehler sein; Eine Bestätigung bei kritischen Schritten kann dies jedoch verhindern27. Primäre Antikörperspezifität ist wichtig für die Auswahl nur des Zieltranskriptionsfaktors und der DNA, die es während der Immunpräzipation kontrolliert7. In diesem Experiment wurde csgD mit einem plasmidcodierten 3xFLAG-Tag am 3'-Ende des Gens verschmolzen, das dem C-Terminus von CsgD22entspricht. Das p3xFLAG-Plasmid ohne csgD wurde als "Kontrolle"(S. Typhimurium 14028 csgD + p3xFLAG). ENCODE-Richtlinien empfehlen die Durchführung von Immunoblots mit primärem Antikörper gegen das Protein von Interesse und Lysaten von ChIP-Stämmen und Deletionsstämmen21. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Wachstumsbedingungen in allen Replikationen konsistent sind, um die Variabilität der Transkriptionsfaktorbindung und der nachgelagerten Sequenzierungsergebnisse zu reduzieren. Wenn man darauf achtet, inokulum Größen und Pre-Inoculum Wachstumsbedingungen konsistent sind, Biofilm Wachstum in Kolbenkultur ist konsistent4. Es ist wichtig zu bestätigen, dass alle Biofilme nach der Homogenisierung auseinandergebrochen sind, um einen gleichberechtigten Zugang von Reagenzien, insbesondere Formaldehyd-Kreuzverlinkern, zu allen Zellen zu gewährleisten.

Mehrere Modifikationen können es Forschern ermöglichen, dieses Protokoll für andere DNA-bindende Proteine, Zelltypen, Stämme, Wachstumsbedingungen oder Laborgeräte zu verwenden. Wenn es für biofilmbildende Arten außer S. verwendet wird. Typhimurium, der Umrechnungsfaktor der koloniebildenden Einheiten pro Einheitsgewicht des Biofilms, muss experimentell bestimmt werden, indem verschiedene Mengen an Biofilm geerntet, der Biofilm gründlich homogenisiert und serielle Verdünnungen und Plattenzählungen ausgeführt werden, um eine Standardkurve zu erstellen, die bei niedrigeren Biofilmgewichten2möglicherweise nicht genau ist. Sonicator Energieübertragung und Zelltypwiderstand können abweichen; Daher wird ein Beschallungstest empfohlen, um die Anzahl der Beschallungsbursts zu ermitteln, die den Fragmentgrößenbereich erzeugen, der für die Nachbereitung und Sequenzierung der Bibliothek erforderlich ist11. Chromatin-Fragmentierung durch Mikrokokken-Nuklease ist eine Alternative zur Beschallung, die eine hohe Auflösung von Belegungsstellen erzeugt; Diese Methode kann jedoch zu Fragmentierungsverzerrungen7,28führen. Der DNA-Größenbereich kann in Abhängigkeit von nachgeschalteten Bibliotheksvorbereitungskits und Sequenzierungsplattformen geändert werden. Anstelle der Mischermühle können andere Homogenisierungsmethoden eingesetzt werden. Zum Beispiel kann ein Glasgewebe Homogenisator ersetzt werden, aber es kann Aerosolisieren oder unvollständig aufbrechen Biofilm. In Bezug auf die Kontrollen kann die vorimmunpräcipitate DNA in der Verarbeitung und Analyse der Nachsequenzierung normalisiert werden. Als Kontrollmittel kann auch eine Mock-IP-Steuerung mit artgerechtem normalem Antikörperserum verwendet werden13.

Forscher müssen die Einschränkungen dieser Methode berücksichtigen, wenn sie ein ChIP-seq-Experiment in Betracht ziehen. Erhebliche Änderungen können erforderlich sein, um sie an andere Biofilmtypen anzupassen. Zum Beispiel führt die sofortige Resuspension von Biofilm in PBS bei Salmonella Typhimurium zu einem messbaren Verlust von Biofilmaggregaten. Immunpräzipitation, die auf regulatorische Ziele von Transkriptionsfaktoren in Bakterien abzielt, kann zu sehr geringen Mengen an DNA führen, was eine Herausforderung für die Reinigung und detektion in späteren Schritten darstellt. Bias kann während des Scherens und der nachgeschalteten Manipulation während der Bibliothekserkennung9eingeführt werden. Darüber hinaus zeigt diese Methode keine In-vivo-Expressionsniveaus als Reaktion auf die Transkriptionsfaktorbindung. Forscher, die wenig Erfahrung in der Bioinformatik haben, können durch die Analysepipeline herausgefordert werden. Diese Methode kann zeitintensiv und teuer sein. Die Kosten für die Sequenzierung sind jedoch oft niedriger als bei einem Mikroarray und gehen im Laufe der Zeit zurück, da die technologischen Verbesserungen weiterhin vorgenommen werden.

Wenige Methoden in der Literatur beschreiben ChIP mit Bakterien, und die meisten bakteriellen Experimente beginnen mit einem einfachen Wachstumszustand13,14,15,17,18. Die ChIP-Probenvorbereitung mit Einzelzellen ist einfach und stellt weniger Herausforderungen dar als die ChIP-Probenvorbereitung mit Biofilmaggregaten. Was ChIP-seq betrifft, so wurden frühere Methoden zur Untersuchung von cis-regulatorischen Schaltkreisen, einschließlich der systematischen Entwicklung von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX), elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests (EMSA), ChIP-Chip, Promoter-Deletion und Reporteranalyse, durch ChIP-seq29ergänzt oder ersetzt. ChIP-seq ersetzt den ChIP-Chip aufgrund der fortschreitenden Technologien und der Verfügbarkeit der Sequenzierung. Die tiefe Sequenzierung bietet Forschern riesige Datenmengen, die Standorte mit geringerer Bindungsaffinität und höherer Basispaarauflösung mit weniger Ausgangsmaterial als ChIP-Chip11,30identifizieren können. Die Analyse von ChIP-Daten von Organismen mit hochwertigen Referenzgenomen ist im Allgemeinen schnell und spezifisch. Darüber hinaus ist ChIP-seq eine gründliche Methode zur Entdeckung in silico vorhergesagten Bindungsstellen, die möglicherweise nicht in allen Zelltypen, Wachstumsphasen oder Umgebungsbedingungen belegt sind31.

In Zukunft kann dieses Protokoll verwendet werden, um das Verständnis der bakteriellen Pathogenese, insbesondere biofilmbildender Organismen, zu erleichtern. Eine breite Anwendung dieser Technik und die Verfügbarkeit neuer Datensätze können zur Datenintegration führen, um Gruppen von Proteinen zu identifizieren, die zur Steuerung zellulärer Prozesse in biofilmbildenden Mikroorganismen mitlokalisieren32. Darüber hinaus können ChIP-seq- und RNA-seq-Daten integriert werden, um regulatorische Systemmodelle zu erstellen33.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde durch ein Stipendium des Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) (#2017-05737) an AW und durch den Jarislowsky Lehrstuhl für Biotechnologie unterstützt. MP wurde durch ein NSERC-CREATE-Stipendium im Rahmen des Integrated Training Program in Infectious Diseases, Food Safety and Public Policy (ITraP) an der Universität Saskatchewan unterstützt.

Die Autoren danken Dani Dale für die Dreharbeiten und Schnitte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose powder FroggaBio A87-500G
Balance (Explorer pro) Ohaus EP214
Benchtop Centrifuge (8510R) Eppendorf 022627023
Bioanalyzer 2100 Agilent G2939BA
BR dsDNA kit ThermoFisher Scientific Q32850
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads Cell Signaling Technology 9006
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich COEDTAF-RO ROCHE
Conical tube 15 mL FroggaBio TB15-500
Conical tube 50 mL FroggaBio TB50-500
DC Protein Assay Kit II BioRad 5000112
Disposable Cuvette, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-127
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) Bio-Rad 1658000
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) Thermo Scientific 728211
Fluorometer (Qubit 3.0) Thermo Fisher Scientific Q33216
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water Biotium 41003
High Sensitivity DNA kit Agilent 5067-4626
Incubator (shaking) VWR 1570-ZZMFG
Incubator (Water bath shaking) New Brunswick G76D
LB media VWR 90000-808
Magnetic stand (DynaMag) Fisher Scientific 12321D
Microcentrifuge (refrigerated) Eppendorf 5415R
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) Illumina MS-102-3001
Mixer mill Retsch MM400
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size Thermo Scientific 73520-980
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7370S
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads Machery-Nagel 744970.5
Normal mouse serum AbCam ab188776
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
Pipette controller FroggaBio MP001
Proteinase K ThermoFisher Scientific AM2542
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody Sigma-Aldrich F7425
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) ThermoFisher Scientific EN0531
Rotating wheel Crystal Technologies & Industries TR 01A
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) Eppendorf 22363344
Serological pipette 25 mL FroggaBio 94024
Spectrophotometer Montreal Biotech Inc. Libra S22
Stainless Steel Beads, 5 mm Qiagen 69989
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe Sonics & Materials, Inc. 630-0418
Tryptone media VWR 90000-286
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) Sonics & Materials, Inc. VC300
Vacuum equipment (Vacufuge plus) Eppendorf 022820001
Water bath 1 (Lab-line aquabath) Thermo Scientific 18000-1
Water bath 2 (Precision) Thermo Scientific 51221044

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References

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