القياس الكمي لمستويات الإيثانول في أجنة حمار وحشي باستخدام كروماتوغرافيا غاز الرأس الفضائية

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يصف هذا العمل بروتوكولًا لقياس مستويات الإيثانول في جنين حمار وحشي باستخدام كروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأس من طرق التعرض المناسبة لمعالجة الأجنة وتحليل الإيثانول.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lovely, C. B. Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (156), e60766, doi:10.3791/60766 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تصف اضطرابات طيف الكحول الجنينية (FASD) سلسلة متصلة متغيرة للغاية من عيوب النمو الناجمة عن الإيثانول، بما في ذلك خلل في الشكل وإعاقات عصبية. مع علم الأمراض المعقد ، يؤثر FASD على ما يقرب من 1 من كل 100 طفل يولدون في الولايات المتحدة كل عام. نظرًا للطبيعة المتغيرة للغاية لـ FASD ، أثبتت النماذج الحيوانية أهميتها الحاسمة في فهمنا الآلي الحالي لعيوب التنمية الناجمة عن الإيثانول. وقد ركز عدد متزايد من المختبرات على استخدام سمك الحمار الوحشي لفحص العيوب التنموية الناجمة عن الإيثانول. تنتج سمكة الحمار الوحشي أعدادًا كبيرة من الأجنة الملقحة خارجيًا والقابلة للنقل وراثيًا والشفافة. وهذا يسمح للباحثين بالتحكم الدقيق في توقيت وجرعة التعرض للإيثانول في سياقات وراثية متعددة وتحديد تأثير التعرض للإيثانول الجنيني من خلال تقنيات التصوير الحي. وقد ثبت أن هذا ، إلى جانب الدرجة العالية من الحفاظ على كل من علم الوراثة والتنمية مع البشر ، هو نموذج قوي لدراسة الأساس الآلي لمسخالإيثانول. ومع ذلك، فقد تنوعت نظم التعرض للإيثانول بين دراسات مختلفة لسمك الحمار الوحشي، مما أربك تفسير بيانات سمك الحمار الوحشي عبر هذه الدراسات. هنا هو بروتوكول لتحديد تركيزات الإيثانول في أجنة حمار وحشي باستخدام الكروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأس.

Introduction

تصف اضطرابات طيف الكحول الجنينية (FASD) مجموعة واسعة من العاهات العصبية وخلل الشكل القحفي المرتبط بالتعرض للإيثانول الجنيني1. عوامل متعددة، بما في ذلك توقيت وجرعة التعرض للإيثانول والخلفية الوراثية، تسهم في الاختلاف من FASD3. في البشر ، والعلاقة المعقدة من هذه المتغيرات يجعل دراسة وفهم مسببات FASD تحديا. وقد أثبتت النماذج الحيوانية حاسمة في تطوير فهمنا للأساس الآلي لمسخة الإيثانول. وقد استخدمت مجموعة واسعة من أنظمة النماذج الحيوانية لدراسة جوانب متعددة من FASD وكانت النتائج متسقة بشكل ملحوظ مع ما هو موجود في التعرض في البشر4. وتستخدم أنظمة نموذج القوارض لدراسة العديد من جوانب FASD، مع الفئران كونها الأكثر شيوعا5،6،7. وقد ركزت غالبية هذا العمل على عيوب النمو إلى التعرض المبكر للإيثانول8، على الرغم من التعرض في وقت لاحق للإيثانول وقد ثبت أن يسبب الشذوذ التنموي ة وكذلك9. وعلاوة على ذلك، ساعدت القدرات الوراثية للفئران إلى حد كبير في قدرتنا على التحقيق في الأسس الوراثية لFASD10،11. هذه الدراسات في الفئران تشير بقوة إلى أن هناك تفاعلات الجينية الإيثانول مع مسار القنفذ الصوتية، إشارات حمض الريتينويك، ديسموتاز Superoxide، أكسيد النيتريك synthase الأول، Aldh2 وFancd210،11،12،13،14،15،16،18،18، 19،20،21. وتبين هذه الدراسات أن النماذج الحيوانية حاسمة لتعزيز فهمنا لFASD وآلياتها الأساسية.

وقد برز حمار وحشي كنظام نموذج قوي لدراسة العديد من جوانب الايثانول teratogenesis22،23. بسبب الإخصاب الخارجي ، والبراز العالي ، والقدرة الوراثية ، وقدرات التصوير الحي ، فإن سمك الحمار الوحشي مناسب بشكل مثالي لدراسة عوامل مثل التوقيت والجرعة وعلم الوراثة لتولد الإيثانول. يمكن إعطاء الإيثانول للأجنة المحددة بدقة ويمكن بعد ذلك صورة الأجنة لفحص التأثير المباشر للإيثانول أثناء عمليات النمو. هذا العمل يمكن أن تكون مرتبطة مباشرة إلى البشر، وذلك لأن البرامج الوراثية للتنمية يتم الحفاظ عليها بشكل كبير بين حمار وحشي والبشر، وبالتالي يمكن أن تساعد في توجيه الدراسات الإنسانية FASD24. في حين تم استخدام سمك الحمار الوحشي لفحص تولد الإيثانول ، فإن عدم وجود توافق في الآراء في الإبلاغ عن تركيزات الإيثانول الجنينية يجعل المقارنة مع البشر صعبة25. في أنظمة الثدييات ، ترتبط مستويات الكحول في الدم مباشرة بمستويات الإيثانول الأنسجة26. العديد من دراسات حمار وحشي علاج الأجنة قبل تشكيل كامل من نظام الدورة الدموية. ومع عدم وجود عينة أمومية لفحصها، يلزم إجراء عملية لتقييم تركيزات الإيثانول لتحديد مستويات الإيثانول داخل الجنين. هنا نصف عملية لقياس تركيزات الإيثانول في جنين حمار وحشي النامية باستخدام الكروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم رفع جميع أجنة حمار وحشي المستخدمة في هذا الإجراء وتربيتها بعد بروتوكولات IACUC الراسخة27. تمت الموافقة على هذه البروتوكولات من قبل جامعة تكساس في أوستن وجامعة لويزفيل.

ملاحظة: تم استخدام خط حمار وحشي Tg (fli1:EGFP)y1 في هذه الدراسة28. جميع المياه المستخدمة في هذا الإجراء هو الماء التناضح العكسي المعقم. أجريت جميع التحليلات الإحصائية باستخدام Graphpad Prism v8.2.1.

1. جعل وسائل الإعلام الجنين

  1. لجعل مخزون 20x من وسائل الإعلام الجنين، حل 17.5 غرام من NaCl، 0.75 غرام من KCl، 2.9 غرام من CaCl0.41 غرام من K2HPO0.142 غرام من NA2HPOو 4.9 غرام من MgSO4·7H2O في 1 لتر من الماء. تجاهل الراسب الأبيض الذي يتشكل. هذا لن يؤثر على وسائل الإعلام. تصفية تعقيم حل الأسهم وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  2. لإنشاء حل وسائط الجنين العامل، قم بإذابة 1.2 غرام من NaHCO3 في 1 لتر من مخزون وسائط الأجنة 20x وإضافة 19 لتر من الماء. الحفاظ على محلول وسائط الجنين العامل عند 28 درجة مئوية.

2. قياس حجم الجنين باستخدام إزاحة المياه

ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتم استخدام 24 ساعة بعد الإخصاب (hPF) الأجنة(الشكل 1). لا يتم استخدام الأجنة المستخدمة في قياسات الحجم في تحليل الإيثانول.

  1. ضع 10 أجنة وسوائل خارج الأجنة في أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 مل معلّم بحجم 250 ميكرولتر(الشكل 2A). إضافة الماء إلى خط التعبئة 250 ميكرولتر (انظر عينة مع الماء المعلوين في الشكل 2B).
  2. كرر الخطوة 2.1 لإعداد أوعية للأجنة التي تمت إزالة التشورات الخاصة بها.
    1. لإزالة chorion، ضع الأجنة في chorions في طبق بيتري 100 ملم مع 2 ملغ / مل من كوكتيل البروتياز في وسائل الإعلام الجنين في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقيقة. كل بضع دقائق، دوامة بلطف الأجنة لكسر chorion.
    2. مرة واحدة جميع الأجنة خالية من chorion، وإزالة الأجنة dechorionated من كوكتيل البروتياز / وسائل الإعلام الجنين ووضعها في طبق بيتري 100 ملم جديدة مع وسائل الإعلام الأجنة الطازجة لغسل الأجنة. كرر هذه الخطوة غسل 1 مزيد من الوقت (لما مجموعه 2 يغسل). نقل الأجنة إلى طبق بيتري طازج عيار 100 مم.
  3. باستخدام أصغر تلميح ممكن ودون الإضرار بالأجنة، قم بإزالة جميع السوائل بعناية من جميع أنحاء الأجنة باستخدام ميكروبيبتور P200(الشكل 2C)ووزن الماء بمقياس مع دقة 0.1 ملغ. لتحديد حجم العينة من 10 أجنة، طرح وزن / حجم الماء (1 مل من الماء = 1 غرام من الماء.) إزالتها من 250 ميكرولتر. لتحديد حجم جنين واحد، قم بتقسيم الفرق بين 250 ميكرولتر ووزن الماء الذي تتم إزالته بمقدار 10.

Equation 1

Equation 2

3. علاج الأجنة بالإيثانول

  1. جمع الأجنة من الدبابات التزاوج ووضع هافي في طبق 100 مم بيتري القياسية. عد ما لا يزيد عن 100 جنين لكل طبق بيتري واحد واحتضان في 28.5 درجة مئوية.
    ملاحظة: إذا كان يجب إزالة chorion (الخطوة 2.2)، فإنه يحتاج إلى إزالته قبل إضافة الإيثانول.
  2. عند 6 hpf، أضف ما يصل إلى 100 جنين إلى طبق بيتري قياسي جديد مقاس 100 مم إما مع وسائط الأجنة أو وسائط الأجنة + 1٪ إيثانول (v/v). تغطية، ولكن لا ختم طبق بيتري. ضع الأجنة في حاضنة مؤقتة منخفضة عند 28.5 درجة مئوية لمدة 18 ساعة، أو حتى تصل الأجنة إلى نقطة وقت النمو البالغة 24 حب.

4- إعداد سير العمل قبل معالجة الأجنة من أجل الكروماتوغرافيا اللونية لغاز الرأس الفضائي

  1. جعل حل من 5 M NaCl في الماء (450 μL ستكون هناك حاجة لكل أنبوب عينة) لتشوه جميع البروتينات ومنع استقلاب الإيثانول. جعل كوكتيل البروتياز(جدول المواد)بتركيز 2 ملغ / مل في وسائل الإعلام الجنين.
  2. قم بتسمية أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 مل وقارورة كروماتوجراف غازية 2 مل لكل عينة. قم بتسمية قوارير كروماتوجراف غازية إضافية تبلغ 2 مل لمعايير الإيثانول الموضحة أدناه بالإضافة إلى الهواء والماء وفراغات كوكتيل 5 M NaCl/protease.
  3. إعداد ثلاثة p200 micropipetrs اثنين مجموعة إلى 50 ميكرولتر، والمجموعة الثالثة إلى 200 ميكرولتر؛ ضبط p1000 ميكروبيتور إلى 450 ميكرولتر وميكروبيبيتور p2 تعيين إلى 2 ميكرولتر. بالنسبة للماصات الزجاجية المستخدمة لنقل الأجنة من أطباق بيتري إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل ، قم بتمرير طرف الماصة بسرعة من خلال اللهب لتنعيم الحواف لعدم تلف الأجنة عند سحبها إلى الماصة.

5- تجهيز الأجنة لكروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأس

ملاحظة: يتم التعامل مع كل من الأجنة في chorions وتلك التي أزيلت سابقا من chorions بهم نفس الاتساق في حساب عوامل التخفيف.

  1. باستخدام اثنين من micropipetrs p200 تعيين إلى 50 ميكرولتر، رسم 50 ميكرولتر من محلول كوكتيل البروتياز في واحد ورسم 50 ميكرولتر من الماء في الثانية.
  2. باستخدام ماصة الزجاج وmicropipettor، بسرعة وضع 10 أجنة (من الخطوة 3.2) في أنبوب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل وإغلاق الغطاء (كما هو موضح في الشكل 2A). كرر لجميع العينات التي سيتم اختبارها، والضوابط، والأجنة المعالجة بالإيثانول.
  3. باستخدام p200 micropipettor تعيين إلى 200 ميكرولتر، وفتح بسرعة الغطاء وإزالة جميع وسائل الإعلام الجنين المتبقية (كما هو موضح في الشكل 2C). وضع بسرعة ماصة تحتوي على 50 ميكرولتر من الماء في أنبوب وبسرعة ولكن بلطف (لعدم إتلاف الأجنة) إضافة، ثم إزالة الماء. إضافة بسرعة 50 ميكرولتر من محلول كوكتيل البروتياز من pipettor الانتظار وإغلاق غطاء أنبوب(الشكل 2D).
    ملاحظة: تنفيذ هذه العملية عينة واحدة في كل مرة.
  4. اسمحوا عينة الجلوس في RT لمدة 10 دقيقة للسماح للكوكتيل البروتياز لتدهور chorion. ثم، إضافة بسرعة 450 ميكرولتر من 5 M NaCl وإغلاق غطاء أنبوب(الشكل 2E). دوامة العينات لمدة 10 دقيقة. لتسريع العملية، قم بإعداد الخلاط لدوامة عينات متعددة في نفس الوقت.
    ملاحظة: أضف كمية صغيرة (~ 100 ميكرولتر) من خليط من السيليكا (2 أحجام، 0.5 مم و1 مم من البزخ) إلى أي أنبوب مع أجنة أكبر من 24 hpf. في الأجنة القديمة ، سيبقى النوكور سليمًا بغض النظر عن المدة التي يتم فيها تجانسها.
  5. بعد التجانس لمدة 10 دقيقة، وإزالة بسرعة 2 ميكرولتر من supernatant الجنين المتجانس وإضافة إلى قارورة كروماتوجراف الغاز. ختم بسرعة القارورة مع غطاء البولي تترافلوروإيثيلين.

6- إعداد معايير الإعلام والإيثانول

  1. لإعداد معايير وسائل الإعلام، تمييع وسائل الإعلام بعامل 10 مع حل كوكتيل 5 M NaCl/protease. أضف 2 ميكرولتر من كل عينة إلى قارورة كروماتوجراف غاز وختم بغطاء البولي تترافلوروإيثيلين.
  2. لإعداد معايير الإيثانول، قم بإنشاء تخفيف تسلسلي للإيثانول بنسبة 100٪ في محلول كوكتيل 5 M NaCl/protease إلى التركيزات التالية: 0.3125 و 0.625 و 1.25 و 2.5 و 5 و 10 و 20 و 40 م. م. أضف 2 ميكرولتر من كل معيار إلى قارورة كروماتوجراف الغاز وختم مع غطاء البولي تترافلوروإيثيلين.

7. إعداد الكروماتوجراف غاز الفضاء الرأس

ملاحظة: قد يحتاج هذا الإعداد والبروتوكول إلى تغيير اعتماداً على الكروماتوجراف الغاز المستخدمة. ويستخدم اللوناللوني لغاز الفضاء الرأس لقياس مستويات الإيثانول، وليس للفصل.

  1. تعيين سخان لautosampler إلى 58 درجة مئوية وعلى تشغيل. السماح للسخان لتصل إلى 58 درجة مئوية، وعلى خطوط الغاز الهواء والهيدروجين تغذية الكروماتوجراف الغاز (لتئني اللهب المستخدمة لقياس الإيثانول).
    ملاحظة: يجب تعيين psi لتشغيل الكروماتوجراف بشكل صحيح وفقًا لمواصفات الشركة المصنعة. تأكد من خط الهيليوم على وتعيين إلى psi السليم.
  2. بالنسبة للحاجز، تأكد من أن عدد العينات التي تم حقنها ليس أكثر من 100. بالنسبة لألياف الحقن، تأكد من أن عدد العينات التي تم حقنها ليس أكثر من 500.
    ملاحظة: إذا كان أي منهما أكثر من كمية الحقن، فإنها سوف تحتاج إلى تغيير قبل تشغيل عينات الاختبار.
  3. قم بتشغيل برنامج التحليل وتأكد من إعداد محطة العمل بشكل صحيح. تخزين جميع البيانات وفقا لمعايير المختبر / القسم. إنشاء قائمة عينة جديدة للعينات ليتم تشغيلها.
  4. بدء طريقة بدء التشغيل وانتظر كاشف تيونب اللهب لتحقيق الاستقرار قبل تشغيل العينات. مرة واحدة مستقرة، تشغيل طريقة بدء تشغيل البرمجيات لتنظيف الألياف.

8- قياسات العينات باستخدام كروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأس

  1. بمجرد اكتمال أسلوب بدء التشغيل، قم بإنشاء سطر جديد واحد لكل عينة في قائمة العينات. من القائمة أساليب في برنامج التحليل، تحميل 436 الإيثانول SPMe الحالي 2013 3min امتصاص 2_5min المدى rg. METH لكل عينة على قائمة العينة.
    1. ملء قائمة العينة، بدءا من الهواء والماء، 5 M NaCl / الفراغات كوكتيل البروتياز. ثم أدخل في المعايير بالترتيب، من 0.3125 إلى 40 م. م. اتبع المعايير مع جولة ثانية من الهواء والماء، و5 M NaCl/ الفراغات كوكتيل البروتياز.
    2. أدخل جميع عينات الأجنة المتجانسة التي سيتم اختبارها، من أدنى إلى أعلى تركيز متوقع للإيثانول. تنتهي بالدخول في جولة ثالثة وأخيرة من الهواء والماء و5 M NaCl/ الفراغات كوكتيل البروتياز.
  2. إضافة قوارير الكروماتوجراف الغاز إلى العينات التلقائية بالترتيب الذي تم إدخال العينات. السماح للعينات لالحارة لمدة 10-15 دقيقة. بدء تشغيل العينة في البرنامج.
  3. بعد تشغيل كافة العينات والفراغات النهائية، قم بتنشيط طريقة إيقاف التشغيل في البرنامج عن طريق إضافة عينة نهائية في قائمة العينات وتشغيل الاستعداد. METH. نسخ احتياطي لكافة البيانات التي تم الحصول عليها أثناء تشغيل العينة. إيقاف تشغيل المعدات في الترتيب التالي: سخان autosampler، خزان الهيدروجين، وفقط بعد درجة حرارة الكروماتوجراف تصل إلى 30 درجة مئوية، خزان الهواء. ترك خزان الهيليوم على للحفاظ على عمود الشمع.

9- عينة تكامل ذروة الإيثانول وتحليل تركيز العينات

ملاحظة: تم حساب كافة القيم من 9.3 على في ملف excel أن كافة المعادلات مسبقاً.

  1. بمجرد اكتمال طريقة إيقاف التشغيل، انقر على مخطط كروماتوجرام مفتوح. افتح المجلد الذي يحتوي على النتائج. يتم دمج العينات تلقائيا في هذا البرنامج.
  2. في النتائج، تأكد من دمج القمم الصحيحة (قمم الإيثانول بين 2 و 2.5). بمجرد تأكيد جميع العينات، قم بطباعة النتائج أو تصديرها.
  3. رسم ذروة ارتفاع معايير الإيثانول على الرسم البياني. احسب قيم الميل واعتراض Y وR2 لمعايير الإيثانول (يجب أن يكون R2 > 0.99).
    ملاحظة: سيتم استخدام هذه القيم لتحديد تركيز الإيثانول من ارتفاع ذروة العينة.
  4. لكل عينة، طرح ذروة ارتفاع العينة من اعتراض Y من معايير الإيثانول. قسمهذه القيمة على منحدر معايير الإيثانول للحصول على قيمة الإيثانول لكل عينة في قارورة GC.

Equation 3

  1. لحساب تركيز الإيثانول في الأجنة، احسب أولاً عامل التخفيف لكل عينة. خذ مقياس الحجم المحسوب في الخطوة 2.3 من هذا البروتوكول وقسمه على مقياس الحجم بالإضافة إلى 500 ميكرولتر. وهذا يمثل محلول كوكتيل 5 M NaCl/البروتياز الذي تمت إضافته إلى كل عينة أثناء معالجة الأجنة (الخطوتان 5.3 و5.4).

Equation 4

  1. باستخدام هذا عامل تخفيف العينة، ضرب من قبل قيمة الإيثانول عينة لكل عينة. وستكون النتائج في تركيز MM. حساب عينات مرجع الوسائط عن طريق ضرب قيمة الإيثانول الوسائط بعامل التخفيف من 10.

Equation 5

Equation 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لا يمكن تحديد مستويات الإيثانول في الدم في وقت مبكر من سمك الحمار الوحشي الجنيني ، لأنها تفتقر إلى نظام الدورة الدموية بشكل كامل. لتحديد مستوى تركيز الإيثانول في أجنة حمار وحشي ، يتم قياس مستويات الإيثانول مباشرة من الأنسجة الجنينية المتجانسة. ولقياس تركيزات الإيثانول الجنينية بشكل صحيح، يجب أن يؤخذ الحجم الجنيني في الاعتبار. الجنين (صفار المرفقة) يجلس داخل chorion (قشر البيض) محاطة السائل خارج الجنين(الشكل 1). يجب إجراء أي مقياس لحجم الجنين على الأجنة في وقت التعرض ، لأن الحجم الجنيني سيتغير بمرور وقت النمو مع زيادة حجم الجنين. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تؤخذ كيفية معالجة الجنين في الاعتبار وكذلك الحجم الجنيني ، لأن كلا العنصرين يخلقان عوامل تمييع تستخدم لحساب مستويات الإيثانول الجنينية.

لأن الجنين ليس كرة مثالية ، خاصة بعد 10 hpf ، تم استخدام إزاحة المياه لتقييم الحجم الجنيني. استخدمت هذه الدراسة الأجنة في 24 hpf. تم قياس حجم الأجنة في كل من chorion وتلك التي أزيلت من chorion بهم. وكانت هذه الكميات 1.97 (± 0.4 SD) ميكرولتر للجنين مع السائل خارج الجنين، و 1.1 (± 0.22 SD) ميكرولتر للجنين وحده(الجدول 1). هذا الفرق بين الجنين مع السائل خارج الجنين والجنين وحده هو حجم السائل خارج الجنين ، الذي يحيط الجنين داخل chorion(الشكل 1). هذا الاختلاف حاسم في تحديد تركيز الإيثانول للجنين وحده في العينات. من التحليل ، شكل الجنين 56 ٪ من إجمالي حجم الجنين مع السائل خارج الجنين داخل chorion(الجدول 1). مع نمو الجنين ، زاد الحجم الجنيني بمرور الوقت ، مما أدى إلى انخفاض في حجم السائل خارج الجنين25. عند قياس تركيزات الإيثانول من الأجنة التي لا تزال في الكورة ، يجب أن يؤخذ محتوى الماء في كل من الجنين والسائل خارج الجنين في الاعتبار.

وقد أظهرت الأعمال المنشورة سابقا أن جزء الماء في الجنين وحده هو 73.6٪29. تم الحصول على هذه النتيجة باستخدام مزيج من مقاييس الحجم، والتحليل الطيفي لرنين الدوران الإلكتروني، والمجهر بالرنين المغناطيسي. لتأكيد هذه النتيجة ، تم وزن الأجنة وحدها قبل وبعد الخبز عند 70 درجة مئوية ، كما سبق وصفه25. هذه العملية يزيل كل الماء من الجنين. يمثل التغير في الوزن كمية الماء في الجنين. من هذا التحليل، يحتوي جنين 24 hpf على حوالي 72٪ من الماء في حين أن جنين 48 hpf يحتوي على حوالي 76٪. كل من هذه القيم هي مشابهة للغاية لحجم المياه الجنينية 73.6٪ تحسب سابقا29. وهذا يشير إلى أن حجم المياه للجنين يتغير قليلا ً طوال مرحلة النمو المبكر.

واستناداً إلى العمل المنشور باستخدام نُهج متعددة لحساب حجم المياه في الجنين، استُخدم 73.6 في المائة كمحتوى مائي جنيني لجميع التحليلات المقدمة. وأسفر ذلك عن مياه تتألف من 0.82 ميكرولتر من الحجم الجنيني 1.1 ميكرولتر(الجدول 1). من هذا، تم حساب حجم السائل خارج الجنين على أنه 0.86 ميكرولتر. من إجمالي حجم المياه للجنين مع السائل خارج الجنين، 49٪ موجود في الجنين و 51٪ في السائل خارج الجنين(الجدول 1).

لتحليل الكروماتوغرافيا الغاز، تم استخدام 24 فقط من الأجنة hPF لا تزال في chorion بهم(الشكل 1). في نظام الإيثانول هذا، عولجت الأجنة بتركيز وسائط الإيثانول بنسبة 1% (171 مليمتر) من 6-24 حبف، على الرغم من أنه يمكن استخدام تركيزات الإيثانول المختلفة ونوافذ وقت التعرض اعتماداً على التصميم التجريبي. تم تحليل مجموعتين من 15 عينة (10 أجنة لكل عينة) ووسائل الإعلام التي تم علاجها خلال يومين تجريبيين مختلفين(الجدول 2). يمكن أن تختلف مستويات الوسائط من تجربة إلى أخرى. ولحساب ذلك، تم قياس مستويات الإيثانول في الوسائط 5x لكل مجموعة تجريبية. في هذا التحليل، كانت مستويات الوسائط 143.6 (± 2.3 SD) mM للمجموعة 1 و 133.6 (± 2.7 SD) mM للمجموعة 2. تختلف هذه القيم بشكل كبير باستخدام اختبار t غير مقترنة (p = 0.0002). بلغ متوسط الأجنة ذات السائل خارج الجنين 63.5 (± 17.1 SD) mM و 53.1 (± 12.6 SD) mM للمجموعتين 1 و 2، على التوالي. ومع ذلك، لم يكن التركيز مختلفاً بشكل كبير بين مجموعتين من الأجنة ذات السائل خارج الجنين (اختبار t غير مقترن، p = 0.07). تم قياس أجنة المكافحة غير المعالجة عند 0 مم. ونظراً للتباين في مستويات الوسائط، تم حساب نسبة تركيز الإيثانول الجنيني/مستويات الوسائط من الإيثانول لكل عينة. وكانت المجموعة 1 44 في المائة من مستويات الإيثانول في وسائط الإعلام، في حين أن المجموعة 2 كانت لديها 40 في المائة من مستويات الإيثانول الإعلامي(الشكل 3 والجدول 2).

Figure 1
الشكل 1: صورة جنين في 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf) داخل chorion. ويحيط الجنين وصفار السائل خارج الجنين، وتقع جميعها داخل chorion. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: بروتوكول لقياس الحجم الجنيني ومعالجة الأجنة لتحليلها. (أ)عشرة أجنة 24 هبف تم نقلها إلى أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 مل معلّم بحجم 250 ميكرولتر. (ب)أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع الأجنة مليئة بالماء (يتم الغُمية بحيث يكون من الأسهل أن نرى عند علامة 250 ميكرولتر). (ج)يتم إزالة جميع المياه من الأنبوب ووزنها. (د)عشرة أجنة تم نقلها إلى أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 مل. تمت إزالة الماء كما هو الحال في(C)واستبداله بـ 50 ميكرولتر من كوكتيل البروتياز. (E)بعد 10 دقيقة ، تمت إضافة 450 ميكرولتر من 5 M NaCl إلى الأنبوب من (D). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مربع وقطعة من الشعيرات من نسبة تركيز الإيثانول من العينات إلى وسائل الإعلام. وقسم تركيز الإيثانول لكل مجموعة على متوسط عينات الوسائط لتلك المجموعة. وتحتوي المجموعة 1 على 44 في المائة من مستويات وسائط الإعلام، في حين احتوت المجموعة 2 على 40 في المائة. في كلتا المجموعتين، n = 15; 10 أجنة لكل عينة. تمت مقارنة المجموعات باستخدام ANOVA أحادية الاتجاه مع تحليل ما بعد وضع Tukey (****p < 0.0001). تمثل الشعيرات الحد الأدنى إلى الحد الأقصى. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حجم مياه الجنين والأجنة + خارج الجنين (μL)
المياهأ
إجمالي الحجمب النسبة المئوية من إجمالي الحجم (V) حجم الجنين (W) حجم خارج الجنين (X) النسبة المئوية للمياه في الجنين (Y) النسبة المئوية للمياه في الأجنة اللاجنينية (Z)
الجنين + خارج الجنين (EE)ج 1.97 ± 0.4
الجنين 24 hpf (E)ج 1.11 ± 0.22 56% 0.82 0.86 49% 51%
الحسابات
V الجنين % من الحجم الإجمالي = الحجم الإجمالي لـ E ☆ الحجم الإجمالي لـ EE
W حجم المياه الجنينية = V × 73.6٪
X حجم المياه خارج الجنين = W – الحجم الإجمالي لـ EE
Y% الماء في الجنين = (W + X) / W × 100
Z% المياه في خارج الجنين = 100 – Y
أ تم حساب حجم المياه الجنينية من Hagedorn et al.29.
ب يتم الإبلاغ عن القيم كـ ± الانحراف المعياري (SD).
(ج)ن = 13؛ 10 أجنة لكل عينة

الجدول 1: حساب حجم المياه للأجنة ذات السوائل خارج الجنين. تم حساب الحجم من 13 عينة (10 أجنة لكل عينة) من 24 جنينًا من الـ hpf مع سائل خارج الجنين لا يزال في chorion والأجنة التي تم إزالتها من chorion. يتم الإبلاغ عن القيم كمتوسط ± SD.

تركيز الإيثانول للأجنة ووسائل الإعلام (mM)أ
المجموعة الأولى المجموعة الثانية مجتمعه
وسائل الإعلام (M)ب 143.6 ± 2.3 133.6 ± 2.7 138.6 ± 5.8
الجنين + خارج الجنين (EE)ج 63.5 ± 17.1 53.1 ± 12.6 58.3 ± 15.7
نسبة الإيثانول - الجنين إلى الوسائط (1) 0.44 ± 0.12 0.40 ± 0.09 0.42 ± 0.11
الحسابات
1 نسبة الإيثانول = EE ☆ M
أ يتم الإبلاغ عن القيم كـ ± SD.
بن = 5
(ج)ن = 15؛ 10 أجنة لكل عينة
د القيم هي متوسط المجموعات 1 و 2.

الجدول 2: حسابات تركيز الإيثانول في الأجنة ذات السوائل والوسائط خارج الأجنة (mM). وكانت عينات الوسائط تدابير مباشرة من وسائط الإعلام (العدد = 5 لكل مجموعة). تم حساب تركيز الإيثانول الجنيني من 15 عينة (10 أجنة لكل عينة) من 24 جنيناً من الـ hpf مع سائل خارج الجنين. تم حساب نسبة تركيزات الإيثانول للأجنة ذات السوائل خارج الجنين إلى الوسائط. يتم الإبلاغ عن القيم كمتوسط ± SD.

حساب الإيثانول في الجنينأ، ب
جنين (Y) النسبة إلى الوسائط (Z)
32.7 ± 8.8 متر مربع 0.24 ± 0.06
الحسابات
Y الإيثانول الجنيني = 58.3 متر مربع (الجدول 2) × 56% (الجدول 1)
Z نسبة الإيثانول = Y ☆ 138.6 م. م (الجدول 2)
أ القيم هي متوسط المجموعات 1 و 2.
ب يتم الإبلاغ عن القيم كـ ± SD.

الجدول 3: حساب الإيثانول في الجنين. تم حساب تركيز الإيثانول الجنيني على أنه 56٪ من إجمالي تركيز الإيثانول للجنين مع السائل خارج الجنين. ثم تم الإبلاغ عن ذلك كنسبة من الأجنة إلى وسائل الإعلام. يتم الإبلاغ عن القيم كمتوسط ± SD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وكنظام نموذجي تنموي، فإن سمك الحمار الوحشي مناسب بشكل مثالي لدراسة تأثير العوامل البيئية على التنمية. وهي تنتج أعدادا كبيرة من الأجنة المخصبة خارجيا، مما يسمح بمواعيد دقيقة وجرعات نموذجية في دراسات الإيثانول. هذا، جنبا إلى جنب مع قدرات التصوير الحي والحفاظ على الوراثية والتنموية مع البشر، وجعل حمار وحشي نظام نموذج قوي لدراسات علم المسخ. وصف هو بروتوكول لقياس تركيزات الإيثانول الجنينية في تطوير أجنة حمار وحشي باستخدام الكروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأس.

تحديد تركيز الإيثانول الجنيني أمر بالغ الأهمية لفهم تأثير الإيثانول على الجنين النامي. في نماذج القوارض ، ترتبط تركيزات الإيثانول في الدم بتركيزات الأنسجة26. ومع ذلك ، لا يمكن تقييم مستويات الإيثانول في الدم في التطور الجنيني المبكر في سمكة حمار وحشي. وقد استخدمت اللونية غاز الفضاء رئيس لقياس مستويات الإيثانول في مختلف النماذج التجريبية، بما في ذلك سمك الحمار الوحشي25،30،31،32،33،34،35. ومع ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لقياس العديد من العوامل البيئية المختلفة، على الرغم من أن تقلب هذه العوامل المختلفة يجب أن يكون مرتفعًا بما يكفي لقياس كمي، ويجب اختيار عمود كروماتوغراف الغاز استنادًا إلى قطبية المركبات المعنية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن سمك الحمار الوحشي هو الأنسب لدراسة تأثير العوامل القابلة للذوبان في الماء ، لأن التعرض للعوامل الكارهة للماء من الصعب للغاية تحليله في الأسماك.

سيسمح هذا البروتوكول للباحثين بتقييم تركيزات الإيثانول مباشرة في أجنة سمك الحمار الوحشي. ومع ذلك، لا بد من معالجة عدة عوامل لضمان قياسات دقيقة لتركيزات الإيثانول الجنينية. وبما أنه تم قياس مستويات الإيثانول في مجموع الأنسجة الجنينية، كان لا بد من النظر في الحجم الجنيني. بعد 10 hpf الجنين يبدأ somitogenesis (تشكيل somite) ولم يعد مجالا(الشكل 1). ولتقييم الحجم الجنيني، استُخدم إزاحة المياه على 10 أجنة مجمعة لكل عينة. وتألفت كل عينة من 10 أجنة لسببين: الأول، للحد من الخطأ من أحجام صغيرة الأنابيب، والثاني، لمتوسط التقلبات الصغيرة في أحجام الأجنة. عند قياس حجم الجنين، من المهم النظر في دقة الأنابيب والوزن. حتى استخدام 10 أجنة لكل عينة هو في الحد الأدنى من الدقة لكل من الماصة والمقياس المستخدم لوزن الأجنة. ومع توفر المعدات، كان استخدام أقل من 10 أجنة سيؤثر على التحليلات. وهذا لا يحد من استخدام الباحثين لعدد أقل من الأجنة لكل عينة طالما تم النظر في دقة المعدات.

حجم الجنين هو أحد العوامل التي تؤثر على تحليل العينة. العامل الرئيسي الثاني هو سرعة المعالجة الجنينية ، لأن الإيثانول متقلب. وبالإضافة إلى ذلك، الإيثانول بسرعة equilibrates في دراسات الحيوانات متعددة25،36،37. تم تصميم بروتوكول الغسيل لدينا لإزالة أي الإيثانول بسرعة التمسك السطح الخارجي للchorion. في هذه الدراسة لم يؤثر بروتوكول الغسيل هذا على مستويات الإيثانول الجنينية ، على الرغم من أن الغسل الأطول أو المتعدد يمكن أن يؤثر على تركيزات الإيثانول الجنينية25،38. ومع ذلك ، فإن العامل الثالث الذي يجب أخذه في الاعتبار هو تخفيف الحجم الجنيني أثناء المعالجة. يستخدم هذا البروتوكول كوكتيل البروتياز لتدهور chorion وكذلك 5 M NaCl لتشوه جميع البروتينات ، بما في ذلك إنزيمات معالجة الكحول.

وأخيراً، تم وصف مجموعة من التحليلات وأساليب الإبلاغ في مجموعة واسعة من دراسات سمك الحمار الوحشي. بسبب الاختلاف داخل عينات مختلفة من الدراسة أو مقارنة دراسات مختلفة ، والإبلاغ السليم عن تركيز الإيثانول أمر بالغ الأهمية25،38. تعتمد الطرق التي تستخدم الأساليب غير المباشرة (عادة التدابير الأنزيمية) على تحليل المستقلب الثانوي. في هذه الحالة ، يمكن أن يختلف معدل النشاط الأنزيمي ويعوق التحليل الدقيق لتركيز الإيثانول. وتقيس هذه الطريقة مستويات الإيثانول بشكل مباشر، ويتم الإبلاغ عن تركيزات الإيثانول كنسبة من الأجنة إلى تركيزات الوسائط. نتائجنا تتماشى مع توافق متزايد في الآراء من 24 hpf الجنين يحتوي على ~ 30 ٪ من تركيزات وسائل الإعلام(الجدول 3)25،38،39،40. والمثير للدهشة، وهذا تركيز الإيثانول الجنينية 30٪ مستقلة عن تركيز وسائل الإعلام، وليس من المفهوم جيدا ما يخلق هذا التوازن25،38. تظهر الأجنة التي يزيد عمرها عن 24 hpf انخفاضًا في تركيزات الإيثانول ، حيث تحتوي 48 جنينًا من نوع hpf على ما يقرب من نصف محتوى الإيثانول لجنين 24 hpf25. ومع ذلك، فإن نتائجنا لا تحدد توازن الإيثانول والماء. وبالنظر إلى السرعة التي يتم بها توازن الإيثانول، فضلاً عن تقلب الإيثانول، فمن الصعب بشكل لا يصدق تقييم التغيرات في حجم المياه في الجنين نفسه بسبب التعرض للإيثانول. إن محاولة قياس حجم عينة جنين معالجة الإيثانول باستخدام إزاحة المياه ستؤدي إلى فقدان الإيثانول من الجنين أثناء القياس. باستخدام أساليب تنظير دقيقة وطيافأكثر دقة من تلك المذكورة أعلاه، قد يكون من الممكن تحديد توازن الإيثانول والماء في الجنين عن طريق قياس كليهما مباشرة في نفس الوقت.

وعموما، فإن البروتوكول الموصوف هنا هو أداة قوية لتقييم تركيزات الإيثانول الجنينية في تطوير أجنة سمك الحمار الوحشي. هذه المعلومات حاسمة في توحيد دراسات FASD باستخدام سمك الحمار الوحشي. القدرة على التحكم بدقة نماذج العلاج الإيثانول والقياس الكمي مباشرة تركيزات الإيثانول الجنينية يعزز وظائف نموذج حمار وحشي لدراسات FASD الإنسان. وفي نهاية المطاف، سيؤدي هذا العمل إلى تحسين فهمنا للإدارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم دعم البحث المقدم في هذه المقالة من خلال المنح السابقة من المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والوجه القحفي (NIH / NIDCR) R01DE020884 إلى J.K.E. والمعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني لتعاطي الكحول وإدمان الكحول (NIH / NIAAA) F32AA021320 إلى C.B.L. وعن طريق المنحة الحالية من المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني لتعاطي الكحول (NIH / NIAAA) R00AA023560 إلى C.B.L. نشكر روبن غونزاليس على تقديم ومساعدة في تحليل الكروماتوجراف الغاز. نشكر تياهنا أونتيفيروس والدكتورة جينا نوبلز على المساعدة في الكتابة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air Provided by contract to the university
Analytical Balance VWR 10204-962
AutoSampler, CP-8400 Varian Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride VWR 97062-590
Ethanol Decon Labs 2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL Agilent 8010-0198 Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800 Varian
Helium Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column Agilent 19095N-123I 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL Fisher Scientific 2682002
Micropipette tips 10 μL Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL Fisher Scientific 13611112
Petri dishes 100 mm Fisher Scientific FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap Agilent 5190-7021 Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pronase VWR 97062-916
Silica Beads .5 mm Biospec Products 11079105z
Silica Beads 1.0 mm Biospec Products 11079110z
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane Millipore Sigma 57343-U Replacement fibers
Star Chromatography Workstation Varian Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa Millipore Sigma 23154 Replacement inlet septa

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93, (9), 732-737 (2008).
  2. Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230, (6), 389-393 (2005).
  3. Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136, (5), 1395-1406 (2015).
  4. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
  5. Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96, (2), 131-147 (2018).
  6. Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
  7. Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
  8. Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230, (6), 366-375 (2005).
  9. Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7, (8), 43067 (2012).
  10. Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40, (6), 1154-1165 (2016).
  11. Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55, (4), 501-513 (1996).
  12. Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (16), 10476-10481 (2002).
  13. Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85, (6), 556-567 (2009).
  14. Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8, (10), 1002999 (2012).
  15. Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82, (4), 224-231 (2008).
  16. Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10, (9), 1050-1057 (1996).
  17. Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92, (2), 416-422 (2006).
  18. Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39, (2), 221-231 (2015).
  19. Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
  20. Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138, (1), 45-59 (2002).
  21. Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475, (7354), 53-58 (2011).
  22. Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13, (5), 391-398 (2016).
  23. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96, (2), 88-97 (2018).
  24. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, (15), 3254-3265 (2013).
  25. Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48, (6), 595-602 (2014).
  26. Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol's molecular targets. Science Signaling. 1, (28), (2008).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
  28. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248, (2), 307-318 (2002).
  29. Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278, (6), 356-371 (1997).
  30. Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27, (2), 398-403 (2017).
  31. Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9, (10), 1637-1640 (2017).
  32. Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40, (9), 1825-1831 (2016).
  33. Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40, (8), 653-658 (2016).
  34. Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33, (1), 74-80 (2013).
  35. Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
  36. Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31, (12), 2683-2691 (2006).
  37. Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168, (3), 262-270 (2003).
  38. Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38, (5), 1255-1265 (2014).
  39. Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26, (6), 769-781 (2004).
  40. Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97, (1), 8-27 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics