קוונפיקציה של רמות האתנול של עוברי דגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכמת רמות האתנול בעובר דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה הראש שטח גז משיטות חשיפה נכונה לעיבוד העובר ניתוח אתנול.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lovely, C. B. Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (156), e60766, doi:10.3791/60766 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) לתאר רצף משתנה מאוד של מומים התפתחותיים המושרה אתנול, כולל מורפולוגיות הפנים וליקויים נוירולוגיים. עם פתולוגיה מורכבת, FASD משפיע על כ 1 ב 100 ילדים שנולדו בארצות הברית בכל שנה. בשל האופי המשתנה מאוד של FASD, מודלים בעלי חיים הוכיחו ביקורתית הבנה המכונה הנוכחי שלנו של פגמים המושרה בפיתוח אתנול. מספר גדל והולך של מעבדות התמקד בשימוש בדגים כדי לבחון פגמים התפתחותיים המושרה אתנול. Zebrafish לייצר מספר גדול של הופרות חיצוני, מעוקב גנטית, עוברים שקופים. זה מאפשר לחוקרים לשלוט בדיוק בעיתוי והמינון של חשיפה אתנול בהקשרים גנטיים מרובים לכמת את ההשפעה של חשיפה האתנול עובריים באמצעות טכניקות הדמיה חיה. זה, בשילוב עם הרמה הגבוהה של שימור של גנטיקה ופיתוח עם בני אדם, הוכיחה הדגים להיות מודל רב עוצמה שבו ללמוד את הבסיס המכונה של הטרוגניות האתנול. עם זאת, חשיפה האתנול משטרי יש מגוון בין מחקרים שונים דג זברה, אשר יש לבולבל את הפרשנות של נתוני דג זברה על פני מחקרים אלה. הנה פרוטוקול כדי כמת ריכוזי האתנול בעוברי דג דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי.

Introduction

הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) מתאר מגוון רחב של ליקויי נוירולוגיות ו הגולגולת דיסקוורפולוגיות הקשורים לחשיפה האתנול העובריים1. גורמים מרובים, כולל עיתוי ומינון של חשיפה אתנול ורקע גנטי, לתרום וריאציה של fasd2,3. בבני אדם, מערכת היחסים המורכבת של משתנים אלה עושה לימוד והבנה של האטיולוגיה של FASD מאתגרת. דגמי בעלי חיים הוכיחו באופן קריטי בפיתוח ההבנה שלנו לגבי הבסיס המכניסטי של האתנול הטרוגניות. מגוון רחב של מערכות מודל בעלי חיים נעשה שימוש כדי ללמוד היבטים מרובים של FASD ותוצאות היו עקביים במידה ניכרת עם מה נמצא בחשיפה בבני אדם4. מערכות דגם מכרסמים משמשים כדי לבחון היבטים רבים של fasd, עם עכברים להיות הנפוצים ביותר5,6,7. רוב העבודה התמקדה פגמים התפתחותיים לחשיפה מוקדמת של אתנול8, למרות מאוחר יותר חשיפה לאתנול הוכח לגרום לחריגות התפתחותיות כמו גם9. יתר על כן, היכולות הגנטיות של עכברים סייעו מאוד היכולת שלנו לחקור את בסיס גנטי של fasd10,11. מחקרים אלה בעכברים מצביעים מאוד על כך יש אינטראקציות ג'ין אתנול עם מסלול קיפוד סוניק, חומצה retinoic איתות, סופראוקסיד dismutase תחמוצת חנקן סטנדרטים I, Aldh2 ו Fancd28,10,11,12,13,14,15,16, 17, 18, 5, 19,19,19, 19,20,21. מחקרים אלה מראים כי מודלים בעלי חיים הם קריטיים כדי לקדם את ההבנה שלנו של FASD ואת המנגנונים הבסיסיים שלה.

דג דג זברה התפתחה כמערכת דגם רב עוצמה כדי לבחון היבטים רבים של אתנול teratogenesis22,23. בשל ההפריה החיצונית שלהם, פוריות גבוהה, מעקב גנטי, ויכולות הדמיה חיה, מתאימים באופן אידיאלי לגורמי לימוד כגון עיתוי, מינון, וגנטיקה של האתנול teratogenesis. האתנול יכול להינתן לעוברים מבויים בדיוק והעוברים יכולים להיות בתמונה כדי לבחון את ההשפעה הישירה של אתנול במהלך תהליכים התפתחותיים. עבודה זו יכולה להיות קשורה ישירות לבני אדם, כי התוכניות הגנטיות של הפיתוח הם שימור מאוד בין דג ובני אדם ולכן יכול לעזור להנחות FASD מחקרים אנושיים24. בעוד דגים שימשו כדי לבחון את האתנול teratogenesis, חוסר הסכמה בדיווח ריכוזי אתנול עובריים עושה השוואה לבני אדם קשה25. במערכות היונקים, רמות אלכוהול בדם מתאם ישירות לרמות האתנול של רקמות26. רבים ממחקרי הדגים מתייחסים לעוברים לפני היווצרות מוחלט של מערכת הדם שלהם. ללא מדגם אימהי לבחון, תהליך להערכת ריכוזי אתנול נדרש כדי לכמת את רמות האתנול בתוך העובר. כאן אנו מתארים תהליך לכמת ריכוזי אתנול בתוך העובר בפיתוח דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה גז שטח הראש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העוברים דגים בשימוש בהליך זה הועלו והתרבו בעקבות הוקמה פרוטוקולים IACUC27. פרוטוקולים אלה אושרו על ידי אוניברסיטת טקסס באוסטין ובאוניברסיטת לואיוויל.

הערה: קו הדגים Tg (fli1: EGFP)y1 שימש במחקר זה28. כל המים המשמשים בהליך זה הוא סטרילי מים אוסמוזה הפוכה. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות ה8.2.1 מנסרה.

1. הפיכת מדיה לעובר

  1. כדי להפוך את מלאי 20x של מדיה העובר, לפזר 17.5 g של הנרוג, 0.75 g של KCl, 2.9 g של CaCl2, 0.41 g של K2hpo4, 0.142 g של NA2Hpo4, ו 4.9 g של mgso4· 7h2O ב 1 ליטר של מים. התעלם מהזרז הלבן בטפסים; פעולה זו לא תשפיע על המדיה. המסנן מעקר את פתרון המניה ומאחסן אותו ב-4 ° c.
  2. כדי ליצור את פתרון המדיה העובר עובד, לפזר 1.2 g של נחקו3 ב 1 L של 20x העובר מניות מדיה ולהוסיף 19 L של מים. שמרו על פתרון המדיה של העובר הפועל ב -28 ° c.

2. מדידת נפח עובריים באמצעות הזחה במים

הערה: בפרוטוקול זה, משמשות 24 שעות הפריה (hpf) עוברים (איור 1). העוברים המשמשים במדידות אמצעי האחסון אינם משמשים בניתוח האתנול.

  1. מקום 10 עוברים ונוזלים מתחלקים ב 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה מסומן בנפח של 250 μL (איור 2א). הוסיפו מים לקו המילוי של 250 μL (ראו דגימת מים צבועים באיור 2ב').
  2. חזור על שלב 2.1 כדי להגדיר את נפחים עבור עוברים שהוסרו מורמונים.
    1. כדי להסיר את chorion, למקם את העוברים בתוך כורכותיהם בצלחת פטרי 100 מ"מ עם 2 מ"ג/mL של קוקטייל פרוטאז במדיה העובר בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10 דקות. כל כמה דקות, מערבולת בעדינות את העוברים כדי לשבור את הצ.
    2. לאחר כל העוברים הם חופשיים chorion שלהם, להסיר את העוברים מתוך מדיה העובר הפרוטאז/קוקטייל מקום חדש 100 מ"מ צלחת פטרי עם מדיית העובר טרי לשטוף את העוברים. חזור על השטיפה הזאת עוד פעם אחת (בסכום של 2 שטיפות). העבירו את העוברים לצלחת פטרי חדשה 100 מ"מ.
  3. בעזרת הטיפ הקטן ביותר האפשרי ומבלי לפגוע בעוברים, הסירו בזהירות את כל הנוזלים מסביב לעוברים באמצעות p200 מיקרופיפיאור (איור 2ג) ושוקלים את המים בקנה מידה עם < 0.1 מ ג בדיוק. כדי לקבוע את נפח המדגם של 10 עוברים, להפחית את המשקל/הנפח של המים (1 mL של מים = 1 גרם של מים.) הוסרו מ 250 μL. כדי לקבוע את הנפח של העובר בודד, לחלק את ההפרש בין 250 μL ואת משקל המים הוסרו על ידי 10.

Equation 1

Equation 2

3. טיפול בעוברים באתנול

  1. אסוף עוברים ממיכלי ההזדווגות ומקום בצלחת פטרי 100 מ"מ סטנדרטית. לספור את לא יותר מ 100 עוברים לכל צלחת פטרי אחת הדגירה ב 28.5 ° c.
    הערה: אם chorion יוסר (שלב 2.2), זה צריך להיות מוסר לפני הוספת אתנול.
  2. ב 6 hpf, להוסיף עד 100 עוברים תקן חדש 100 מ"מ צלחת פטרי או עם העובר מדיה או העובר מדיה + 1% אתנול (v/v). כיסוי, אבל לא לאטום את צלחת פטרי. מניחים את העוברים בחממה הטמפ ' הנמוכה שנקבעה ב-28.5 ° צ' למשך 18 שעות, או עד שהעוברים יגיעו לנקודת הזמן ההתפתחותית של 24 hpf.

4. הכנת זרימת עבודה לפני עיבוד העוברים עבור גז החלל הראשי כרומטוגרפיה

  1. לעשות פתרון של 5 M הנאל במים (450 μL יהיה צורך בכל שפופרת לדוגמה) כדי להפוך את כל החלבונים ולמנוע חילוף החומרים אתנול. הפוך את קוקטייל הפרוטאז (טבלת חומרים) בריכוז של 2 מ"ג/mL במדיה העובר.
  2. תווית a 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה ו 2 mL גז כרומטוגרף בקבוקון עבור כל מדגם. תווית נוספת 2 מ ל כרומטוגרף גז מבחנות עבור תקני האתנול שתוארו להלן, כמו גם אוויר, מים, ו 5 כדורי משקה מדיום/פרוטאז.
  3. כוונן שלושה p200 מיקרופיפטורים שניים מוגדרים ל-50 μL, והקבוצה השלישית ל-200 μL; p1000 מיקרופיפיאו מוגדר ל-450 μL ומיקרופיפיפיפיאור p2 מוגדר ל-2 μL. עבור פיפטות זכוכית המשמש להעברת עוברים מצלחות פטרי לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL, במהירות לעבור את העצה באמצעות הלהבה כדי להחליק את הקצוות כדי לא לפגוע העוברים כאשר למשוך אותם לתוך הפיפטה.

5. עיבוד עוברי גז כרומטוגרפיה בחלל הראש

הערה: שני העוברים בורחוריהם ואלה שהוסרו בעבר מהורמונים שלהם מטופלים באופן זהה לעקביות בחישוב גורמי דילול.

  1. באמצעות שני p200 מיקרופיפטורים להגדיר ל50 μL, לצייר 50 μL של פתרון הקוקטייל פרוטאז לתוך אחד ולצייר 50 μL של מים אל השני.
  2. באמצעות פיפטה זכוכית ומיקרופיפיאור, מניחים במהירות 10 עוברים (משלב 3.2) בצינור המיקרו-מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL וסוגרים את המכסה (כמתואר באיור 2א). חזור על כל הדגימות כדי להיבדק, פקדים, והעוברים שטופלו אתנול.
  3. באמצעות p200 מיקרופיפיאור להגדיר μL, 200 לפתוח במהירות את כובע ולהסיר את כל מדיית העובר שיורית (כפי שמתואר באיור 2ג). מקום במהירות את הפיפטה המכיל 50 μL של מים בצינור במהירות אך בעדינות (לא לפגוע העוברים) להוסיף, ולאחר מכן להסיר את המים. הוסף במהירות 50 μL של פתרון קוקטייל פרוטאז מתוך הפיפטורים הממתינים וסגור את כובע הצינור (איור 2ד).
    הערה: בצע תהליך זה מדגם אחד בכל פעם.
  4. תן את המדגם לשבת ב-RT עבור 10 דקות כדי לאפשר קוקטייל פרוטאז לבזות את chorion. לאחר מכן, להוסיף במהירות 450 μL של 5 M הנאל ולסגור את כובע הצינור (איור 2E). מערבולת הדגימות עבור 10 דקות. כדי להאיץ את התהליך, להגדיר את המיקסר כדי מערבולת דגימות מרובות באותו זמן.
    הערה: הוסף כמות קטנה (~ 100 μL) של תערובת חרוזים סיליקה (2 גדלים, 0.5 מ"מ ו 1 מ"מ חרוז) לכל צינור עם עוברים מבוגרים יותר 24 hpf. בעוברים מבוגרים, מיתר הנוטואקורד יישאר שלם בלי קשר לכמה זמן הם הומוגניים.
  5. לאחר הומוגניזציה עבור 10 דקות, להסיר במהירות 2 μL של העובר הומוגניים מוליך supernatant ולהוסיף בקבוקון כרומטוגרף גז. אטום במהירות את המבחנה. עם כובע הפוליטאואתילן

6. הכנת תקני תקשורת ואתנול

  1. כדי להכין את תקני המדיה, לדלל את המדיה על ידי פקטור של 10 עם פתרון של 5 M/פרוטאז קוקטייל. הוסף 2 μL של כל מדגם לבקבוקון כרומטוגרף גז וחותם עם כובע פוליארברואואתילן.
  2. כדי להכין את תקני אתנול, ליצור דילול סדרתי של 100% אתנול בתוך 5 M התקן/פרוטאז הפתרון לריכוזים הבאים: 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, ו 40 mM. הוסף 2 μL של כל תקן לבקבוקון כרומאטוגרף גז וחותם עם כובע פוליארבאואתילן.

7. הכנת כרומאטוגרף גז החלל הראשי

הערה: ייתכן שיהיה צורך לשנות את ההתקנה והפרוטוקול בהתאם לשימוש בכרומטוגרף הגז. גז כרומטוגרפיה של החלל הראשי משמש לכמת רמות אתנול, לא להפרדה.

  1. הגדר את התנור עבור הדגם האוטומטי עד 58 ° c והפעל. אפשר את החימום כדי להגיע 58 ° c, ולהדליק את האוויר ואת קווי גז מימן האכלה כרומטוגרף גז (להבה יינון המשמש לכמת את האתנול).
    הערה: psi צריך להיות מוגדר כראוי להפעיל את chromatograph על פי מפרטים של היצרן. וודא שקו ההליום מופעל. ומכוון למסילה הנכונה
  2. בשביל המחיצה, ודא שמספר הדגימות שהוזרק אינו > 100. עבור סיבי ההזרקה, ודא שמספר הדגימות שהוזרק אינו > 500.
    הערה: אם מדובר על כמות הזריקות, יהיה עליהם לשנות אותם לפני הפעלת דגימות הבדיקה.
  3. הפעל את תוכנת הניתוח וודא שתחנת העבודה מוגדרת כראוי. אחסן את כל הנתונים לפי תקני מעבדה/מחלקה. צור רשימה מדגם חדשה כדי שהדגימות יופעלו.
  4. הפעל את שיטת ההפעלה והמתן עד שגלאי הלהבה לייצוב יתייצב לפני הפעלת הדגימות. פעם אחת יציבה, הפעל את שיטת ההפעלה של התוכנה כדי לנקות את סיבים.

8. מדידות לדוגמה באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי

  1. לאחר השלמת שיטת האתחול, צור שורה חדשה אחת לכל מדגם ברשימה לדוגמה. מתפריט השיטות בתוכנת הניתוח, טען 436 שליטת האתנול spme 2013 3min לקלוט 2_5min rg לרוץ. מתאמפטמין עבור כל דוגמה ברשימת המדגם.
    1. מלאו את הרשימה לדוגמה, החל מהאוויר, מים, 5 כדורי משקה מדגם "נl/פרוטאז". לאחר מכן הזן את הסטנדרטים לפי סדר, מ 0.3125 עד 40 mM. עקבו אחר הסטנדרטים בסיבוב השני של האוויר, המים, ו-5 כדורי הקוקטייל הנאני/פרוטאז.
    2. הזן את כל דגימות סופר הומוגניים העובר כדי להיבדק, מן הנמוך ביותר לריכוז האתנול החזוי ביותר. מסתיים בכניסה לסיבוב השלישי והאחרון של האוויר, המים, ו-5 כדורי הקוקטייל הנאני/פרוטאז.
  2. הוסף את מבחנות כרומטוגרף הגז לדגם האוטומטי בסדר בו הוזנו הדגימות. אפשר דוגמאות לחימום במשך 10 – 15 דקות. הפעל את הדוגמה המופעלת בתוכנה.
  3. לאחר הפעלת כל הדגימות והרווחים הסופיים, הפעל את שיטת הכיבוי בתוכנה על-ידי הוספת דוגמה סופית ברשימה לדוגמה והפעלה במצב המתנה. לילא. גבה את כל הנתונים שנרכשו במהלך הפעלת המדגם. כבו את הציוד בסדר הבא: מדוד חימום אוטומטי, מיכל מימן, רק לאחר טמפרטורת chromatograph מגיע 30 ° c, מיכל האוויר. תשאיר את מיכל ההליום. כדי לשמר את עמוד השעווה

9. לדוגמא שילוב של מפיק האתנול וניתוח ריכוז לדוגמה

הערה: כל הערכים מ-9.3 ב-, חושבו בקובץ excel שכל המשוואות התמלאו מראש.

  1. לאחר השלמת שיטת הכיבוי, לחץ על כרומאטוגרם הפתוח . פתח את התיקיה המכילה את התוצאות. דגימות משולבות באופן אוטומטי בתוכנית זו.
  2. בתוצאות, ודא שהפסגות הנכונות שולבו (פסגות האתנול בין 2 ל-2.5). לאחר שכל הדגימות אושרו, להדפיס או לייצא את התוצאות.
  3. התווה את גובה השיא של תקני האתנול בגרף. חישוב השיפוע, Y ליירט ו-R2 ערכים עבור תקני אתנול (r2 צריך להיות > 0.99).
    הערה: ערכים אלה ישמשו לקביעת ריכוז האתנול מגובה המדגם.
  4. לכל דוגמה, הפחת את גובה השיא של המדגם מנקודת החיתוך של ה-Y של תקני האתנול. חלק ערך זה על-ידי השיפוע של תקני האתנול כדי להשיג את ערך האתנול עבור כל מדגם בבקבוקונים GC.

Equation 3

  1. כדי לחשב את ריכוז האתנול בעוברים, לחשב תחילה את פקטור הדילול עבור כל דוגמה. לקחת את אמצעי האחסון מחושב בשלב 2.3 של פרוטוקול זה ולחלק אותו על ידי מדידת אמצעי האחסון בתוספת 500 μL. זה מייצג את התמיסה 5 מ ' ליטר/פרוטאז שנוספו לכל מדגם במהלך עיבוד העובר (שלבים 5.3 ו 5.4).

Equation 4

  1. בעזרת פקטור הדילול לדוגמה, הכפל לפי ערך האתנול לדוגמה עבור כל דוגמה. התוצאות יהיו בריכוז mM. חישוב דגימות של הפניית מדיה על-ידי הכפלת ערך האתנול של המדיה בפקטור הדילול של 10.

Equation 5

Equation 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

רמות האתנול בדם לא יכול להיקבע ב zebrafish מוקדם, כי הם חסרי מערכת הדם שנוצר במלואו. כדי לקבוע את רמת הריכוז האתנול בעוברי הדגים דג זברה, רמות האתנול נמדדות ישירות מרקמת הומוגניים מעובריים. כדי למדוד כראוי את ריכוזי האתנול עובריים, נפח עובריים יש לקחת בחשבון. העובר (החלמון מוצמד) יושב בתוך הצ (קליפת ביצה) מוקף בנוזלים מעובריים (איור 1). כל אמצעי האחסון של העובר צריך להתבצע על עוברים בזמן החשיפה, כי נפח עובריים ישתנה על פני זמן התפתחותי כאשר העובר גדל בגודל. בנוסף, איך העובר מעובד יש לקחת בחשבון, כמו גם את נפח עובריים, כי שני המרכיבים הללו ליצור גורמי דילול המשמשים לחישוב רמות האתנול עובריים.

בגלל העובר הוא לא התחום המושלם, במיוחד לאחר 10 hpf, העקירה מים שימש להערכת נפח עובריים. מחקר זה השתמשו בעוברים ב 24 hpf. נפח העוברים הן בצ והן באלה שהוסרו מן הצ שלהם נמדדו. כרכים אלה היו 1.97 (± 0.4 SD) μL עבור העובר עם נוזל מעובריים, ו 1.1 (± 0.22 SD) μL עבור העובר לבד (טבלה 1). הבדל זה בין העובר עם הנוזל העובריים והעובר לבדו הוא נפח הנוזלים העובריים, המקיף את העובר בתוך ה-chorion (איור 1). הבדל זה הוא קריטי בקביעת ריכוז האתנול של העובר לבד בדגימות. מתוך הניתוח, העובר כללה 56% מכלל נפח העובר עם נוזל מעובריים בתוך הצ (שולחן 1). כאשר העובר גדל, נפח עובריים גדל לאורך זמן, והתוצאה היא ירידה בנפח של נוזל מעובריים25. כאשר מדידת ריכוזי האתנול מעוברים עדיין ב-chorion שלהם, תוכן המים הן העובר והן הנוזלים העובריים חייבים להילקח בחשבון.

העבודה שפורסמה בעבר הראה כי שבר המים בעובר לבד הוא 73.6%29. תוצאה זו הושגה באמצעות שילוב של אמצעי האחסון, ספקטרוסקופיית התהודה של מדידת האלקטרונים ומיקרוסקופ תהודה מגנטית. כדי לאשר תוצאה זו, העוברים שקלו לבד לפני ואחרי אפייה ב 70 ° c, כפי שתוארה בעבר25. תהליך זה מסיר את כל המים מהעובר. השינוי במשקל מייצג את כמות המים בעובר. מניתוח זה, העובר 24 hpf הכיל ~ 72% מים בעוד העובר 48 hpf הכיל ~ 76%. שני הערכים הללו דומים מאוד לנפח המים העובריים 73.6% שחושב בעבר29. הדבר מרמז על כך שנפח המים של העובר משתנה מעט במהלך ההתפתחות המוקדמת.

בהתבסס על העבודה שפורסמה באמצעות גישות מרובות כדי לחשב את נפח המים בעובר, 73.6% שימש את תכולת המים העובריים עבור כל הניתוחים המוצגים. זה הביא מים הכוללת 0.82 μL של 1.1 μL של נפח עובריים (שולחן 1). מתוך כך, הנפח של נוזל מיותר מעובריים חושב כ0.86 μL. של נפח המים הכולל של העובר עם נוזל מעובריים, 49% מכיל את העובר ו 51% הוא בנוזל מעובריים (שולחן 1).

עבור הניתוח כרומטוגרפיה גז, רק 24 עוברי hpf עדיין בשימוש שלהם chorion שימשו (איור 1). במשטר אתנול זה, העוברים טופלו עם 1% (171 מ"מ) ריכוז מדיה אתנול מ 6 – 24 hpf, למרות ריכוזי אתנול שונים וחלונות זמן חשיפה ניתן להשתמש בהתאם לעיצוב ניסיוני. שתי קבוצות של 15 דגימות (10 עוברים לכל מדגם) והתקשורת שבה הם טופלו על שני ימים ניסיוניים שונים (שולחן 2) נותחו. רמות המדיה עשויות להשתנות מהתנסות להתנסות. כדי להסביר זאת, רמות האתנול של המדיה נמדדו 5x לכל קבוצה ניסיונית. בניתוח זה, רמות התקשורת היו 143.6 (± 2.3 SD) mM עבור קבוצה 1 ו-133.6 (± 2.7 SD) mM עבור קבוצה 2. ערכים אלה שונים באופן משמעותי באמצעות מבחן שאינו משויך (p = 0.0002). העוברים עם נוזל מתחלקים בממוצע 63.5 (± 17.1 SD) mM ו 53.1 (± 12.6 SD) mM עבור קבוצות 1 ו-2, בהתאמה. עם זאת, הריכוז לא היה שונה באופן משמעותי בין 2 קבוצות העוברים עם נוזל מעובריים ( מבחן בלתי מזווג, p = 0.07). עוברי שליטה לא מטופלות נמדדו ב -0 מ"מ. בשל וריאציה ברמות התקשורת, היחס של האתנול מתחלקים הריכוז/רמות התקשורת של אתנול עבור כל מדגם היה מחושב. קבוצה 1 היה 44% של רמות האתנול במדיה, בעוד קבוצה 2 היה 40% מרמות האתנול במדיה (איור 3 ושולחן 2).

Figure 1
איור 1: דמות של העובר ב 24 שעות הפריה (hpf) בתוך chorion. העובר והחלמון מוקפים בנוזלים העובריים, כולם ממוקמים בתוך הצ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פרוטוקול למדוד נפח עובריים ולעבד את העוברים לניתוח. (A) 10 24 hpf עוברים הועברו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL בנפח 250 μl. (ב) שפופרת מיקרוצנטריפוגה עם עוברים מלאים במים (מים צבועים כך קל יותר לראות בסימון μl 250). (ג) כל המים מוסרים מהצינור ושקלו. (ד) עשרה עוברים שהועברו לשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. המים הוסרו כמו ב (ג) והוחלף עם 50 μl של קוקטייל פרוטאז. (ה) לאחר 10 דקות, 450 μl של 5 M הנאל התווסף לצינור מ (ד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תיבת והקצקר העלילה של היחס של ריכוז האתנול של דגימות לתקשורת. ריכוז אתנול לכל קבוצה התחלק בממוצע דגימות המדיה של אותה קבוצה. קבוצה 1 הכילה 44% מרמות המדיה, בעוד שקבוצה 2 הכילה 40%. בשתי הקבוצות, n = 15; 10 עוברים לכל מדגם. קבוצות הושוו באמצעות ה-ANOVA בכיוון אחד עם הניתוח הפוסט-הוק של Tukey (* * * * p < 0.0001). . השפם מייצג מינימום למקסימום אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

עובר ועובר + אמצעי אחסון של מים מחוץ לעובר (μL)
מיםמ
סה כ אמצעי אחסוןb % מאמצעי האחסון הכולל (V) נפח עובריים (W) נפח חוץ-עובריים (X) % מים בעובר (Y) % מים בחוץ עובריים (Z)
עובר + מעובריים (EE)c 1.97 ± 0.4
העובר 24 hpf (E)c 1.11 ± 0.22 56% 0.82 0.86 49% 51%
חישובים
נ' העובר% של נפח כולל = נפח כולל של E ÷ סה כ נפח של הנדסת חשמל
W נפח מים עובריים = V × 73.6%
איקס נפח מים מעובריים = W – נפח כולל של הנדסת חשמל
Y% מים העובר = (W + X)/w × 100
Z% מים בחוץ עובריים = 100 – Y
מהווה נפח המים העובריים חושב מהגאולה ואח ' 29.
ב ערכים מדווחים כסטיית תקן של ± (SD).
cn = 13; 10 עוברים לכל מדגם

טבלה 1: חישוב נפח מים עבור העוברים עם נוזל מעובריים. אמצעי האחסון חושב מתוך 13 דגימות (10 עוברים לכל מדגם) מ 24 עוברי hpf עם נוזל מעובריים עדיין בתוך chorion והעוברים הוסרו chorion שלהם. ערכים מדווחים כממוצע ± SD.

ריכוז האתנול של עוברים ומדיה (mM)מ
קבוצה 1 קבוצה 2 שילוב
מדיה (ז)b 143.6 ± 2.3 133.6 ± 2.7 138.6 ± 5.8
עובר + מעובריים (EE)c 63.5 ± 17.1 53.1 ± 12.6 58.3 ± 15.7
יחס של העובר אתנול לתקשורת (1) 0.44 ± 0.12 0.40 ± 0.09 0.42 ± 0.11
חישובים
מיכל בן יחס של אתנול = הנדסת חשמל
מהווה ערכים מדווחים כ-± SD.
bn = 5
cn = 15; 10 עוברים לכל מדגם
ד הערכים הם הממוצע של קבוצות 1 ו-2.

שולחן 2: חישובי ריכוז אתנול בעוברים עם נוזל ומדיה עובריים (mM). דגימות המדיה היו צעדים ישירים מהתקשורת (n = 5 לכל קבוצה). ריכוז האתנול עובריים חישב מ 15 דגימות (10 עוברים לכל מדגם) מ 24 עוברי hpf עם נוזל מעובריים. היחס של ריכוזי האתנול של העוברים עם נוזל מעובריים לתקשורת חושבו. ערכים מדווחים כממוצע ± SD.

חישוב של אתנול בעוברa, b
עובר (י) יחס למדיה (ת')
32.7 ± 8.8 mM 0.24 ± 0.06
חישובים
י האתנול עובריים = 58.3 מ"מ (שולחן 2) × 56% (שולחן 1)
ז היחס של אתנול = Y ÷ 138.6 mM (טבלה 2)
מהווה הערכים הם הממוצע של קבוצות 1 ו-2.
ב ערכים מדווחים כ-± SD.

שולחן 3: חישוב של אתנול בעובר. ריכוז האתנול עובריים היה מחושב כ 56% מריכוז האתנול הכולל של העובר עם נוזל מעובריים. זה דווח אז כיחס של עובר לתקשורת. ערכים מדווחים כממוצע ± SD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כמערכת מודל התפתחותית, הדגים מתאימים באופן אידיאלי לחקר ההשפעה של גורמים סביבתיים בפיתוח. הם מייצרים מספר גדול של עוברים מופרות חיצוני, אשר מאפשר תזמון מדויק ומינון בלימודי אתנול. זה, בשילוב עם יכולות הדמיה חיה ושימור גנטי והתפתחותי עם בני אדם, להפוך את הדגים מערכת מודל רבת עוצמה ללימודי התרולוגיה. מתוארים הוא פרוטוקול למדידת ריכוזי אתנול עובריים בפיתוח העוברים ומדגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי.

קביעת ריכוז האתנול העובריים הוא קריטי כדי להבין את ההשפעה של אתנול לעובר המתפתח. במודלים של מכרסמים, ריכוזי אתנול של דם בתיאום לריכוזי רקמות26. עם זאת, לא ניתן להעריך את רמות האתנול בדם בהתפתחות העובריים מוקדם ב-zebrafish. שטח הראש גז כרומטוגרפיה שימש כדי למדוד את רמות האתנול בתבניות ניסיוני שונים, כולל דג זברה25,30,31,32,33,34,35. עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי למדוד גורמים סביבתיים רבים ושונים, למרות התנודתיות של גורמים אלה שונים צריך להיות גבוה מספיק כדי למדוד כימות העמודה כרומטוגרף גז צריך להיבחר על בסיס קוטביות של תרכובות השאלה. בנוסף, דג זברה הם המתאימים ביותר ללמוד את ההשפעה של גורמים מסיסים במים, כי החשיפה לגורמים הידרופובי קשה מאוד לנתח דגים.

פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים ישירות להעריך ריכוזי אתנול בעוברי דג דג זברה. עם זאת, מספר גורמים צריך להיות ממוען כדי להבטיח מדידות מדויקות של ריכוזי אתנול עובריים. בגלל רמות האתנול ברקמות עובריים מוחלטת נמדדו, נפח עובריים היה צריך להיחשב. לאחר 10 hpf העובר מתחיל somitogenesis (היווצרות somite) והוא כבר לא כדור (איור 1). כדי להעריך את נפח עובריים, העקירה המים שימש על 10 עוברים במאגר לכל מדגם. כל מדגם מורכב מ -10 עוברים משתי סיבות: ראשית, כדי להפחית את השגיאה מפני כרכים קטנים, ושנית, לממוצע תנודות קטנות באמצעי העובר. כאשר מדידת נפח עובריים, חשוב לשקול את הדיוק של ליטוף ושקילה. אפילו השימוש של 10 עוברים לכל מדגם הוא בגבול הנמוך ביותר של דיוק עבור הפיפטות והסולם המשמש לשקול את העוברים. עם הציוד הזמין, שימוש פחות מ -10 עוברים היו מושפעים את הניתוחים. זה לא להגביל את החוקרים משימוש פחות עוברים לדוגמה כל עוד דיוק הציוד נחשב.

נפח עובריים הוא גורם אחד להשפיע על ניתוח לדוגמה. גורם מפתח שני הוא מהירות עיבוד עובריים, כי אתנול הוא נדיף. בנוסף, אתנול במהירות מעורפלת במספר רב של בעלי חיים25,36,37. פרוטוקול הכביסה שלנו נועד להסיר במהירות כל אתנול הקפדה על המשטח החיצוני של chorion. במחקר זה הפרוטוקול לשטוף לא השפעה על רמות האתנול עובריים, אם כי יותר או מספר שוטף יכול להשפיע ריכוזי אתנול עובריים25,38. עם זאת, גורם שלישי לקחת בחשבון הוא דילול של נפח עובריים במהלך העיבוד. פרוטוקול זה משתמש בקוקטייל פרוטאז כדי לבזות את chorion, כמו גם 5 M הנאגול להשתמש כל החלבונים, כולל בטיפול באלכוהול אנזימים.

לבסוף, מגוון של ניתוחים ושיטות דיווח תוארו במגוון רחב של מחקרים בתחום הדגים. בשל וריאציה בתוך דגימות שונות של מחקר או השוואת מחקרים שונים, דיווח נכון של ריכוז האתנול הוא קריטי25,38. שיטות המשתמשות באמצעים עקיפים (בדרך כלל אנזימטית) מסתמכות על ניתוח מטבוליזם משני. במקרה כזה, שיעור הפעילות האנזימטית יכול להשתנות ולסכל ניתוח מדויק של ריכוז אתנול. שיטה זו מודדת באופן ישיר את רמות האתנול, ריכוזי אתנול מדווחים כיחס העובר לריכוזי מדיה. התוצאות שלנו הן בקנה אחד עם קונצנזוס הולך וגובר של העובר 24 hpf המכיל ~ 30% של ריכוזי מדיה (שולחן 3)25,38,39,40. למרבה ההפתעה, זה 30% ריכוז האתנול העובריים הוא עצמאי של ריכוז התקשורת, והוא לא הבין היטב מה יוצר זה שיווי משקל25,38. עוברים מבוגרים יותר 24 מראה hpf פוחתת בריכוזי האתנול, עם 48 העוברים hpf המכילים כמעט חצי של תוכן האתנול של העובר 24 hpf25. עם זאת, התוצאות שלנו לא קובעים את האיזון במים אתנול. בהתחשב במהירות שבה אתנול משווה, כמו גם את התנודתיות של אתנול, זה קשה מאוד להעריך שינויים בנפח המים בעובר עצמו בשל חשיפה אתנול. מנסה למדוד את עוצמת הקול של מדגם העובר שטופלו אתנול באמצעות הזחה במים יגרום לאובדן אתנול מן העובר במהלך המדידה. באמצעות מיקרוסקופיה מדויקת יותר ושיטות ספקטרוסקופיה מאשר אלה שתוארו לעיל, ייתכן שניתן יהיה לקבוע את שיווי משקל האתנול-מים בעובר על ידי מדידה ישירה של שניהם באותו זמן.

בסך הכל, הפרוטוקול המתואר כאן הוא כלי רב עוצמה שבו להעריך ריכוזי אתנול עובריים בפיתוח עוברי דג דג זברה. מידע זה הוא קריטי בסטנדרטיזציה מחקרים FASD באמצעות דג zebrafish. היכולת לשלוט בדיוק בתבניות הטיפול באתנול ולכמת ריכוזי אתנול עובריים מחזקת את הפונקציונליות של דגם דג זברה ללימודי fasd אנושיים. בסופו של דבר, עבודה זו תשפר מאוד את הבנתנו את FASD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחקר המוצג במאמר זה היה נתמך על ידי מענקים קודמים מן המכונים הלאומיים לבריאות/המכון הלאומי לרפואת שיניים ומחקר הגולגולת (NIH/נדבך) R01DE020884 ל J.K.E. והמכון הלאומי לבריאות/המכון הלאומי על אלכוהול התעללות ואלכוהוליזם (NIH/NIAAA) F32AA021320 כדי C.B.L. ועל ידי המענק הנוכחי מן המוסדות הלאומיים לבריאות/המכון הלאומי על אלכוהול התעללות (NIH/NIAAA) R00AA023560 כדי C.B.L. אנו מודים לרואבן גונזלס למתן ולסייע בניתוח כרומוטוגרף גז. אנחנו מודים לטיטנה בונטיקוס. וד ר ג'ינה נובלס כותבים עזרה

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air Provided by contract to the university
Analytical Balance VWR 10204-962
AutoSampler, CP-8400 Varian Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride VWR 97062-590
Ethanol Decon Labs 2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL Agilent 8010-0198 Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800 Varian
Helium Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column Agilent 19095N-123I 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL Fisher Scientific 2682002
Micropipette tips 10 μL Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL Fisher Scientific 13611112
Petri dishes 100 mm Fisher Scientific FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap Agilent 5190-7021 Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pronase VWR 97062-916
Silica Beads .5 mm Biospec Products 11079105z
Silica Beads 1.0 mm Biospec Products 11079110z
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane Millipore Sigma 57343-U Replacement fibers
Star Chromatography Workstation Varian Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa Millipore Sigma 23154 Replacement inlet septa

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93, (9), 732-737 (2008).
  2. Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230, (6), 389-393 (2005).
  3. Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136, (5), 1395-1406 (2015).
  4. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
  5. Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96, (2), 131-147 (2018).
  6. Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
  7. Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
  8. Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230, (6), 366-375 (2005).
  9. Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7, (8), 43067 (2012).
  10. Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40, (6), 1154-1165 (2016).
  11. Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55, (4), 501-513 (1996).
  12. Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (16), 10476-10481 (2002).
  13. Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85, (6), 556-567 (2009).
  14. Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8, (10), 1002999 (2012).
  15. Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82, (4), 224-231 (2008).
  16. Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10, (9), 1050-1057 (1996).
  17. Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92, (2), 416-422 (2006).
  18. Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39, (2), 221-231 (2015).
  19. Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
  20. Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138, (1), 45-59 (2002).
  21. Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475, (7354), 53-58 (2011).
  22. Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13, (5), 391-398 (2016).
  23. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96, (2), 88-97 (2018).
  24. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, (15), 3254-3265 (2013).
  25. Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48, (6), 595-602 (2014).
  26. Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol's molecular targets. Science Signaling. 1, (28), (2008).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
  28. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248, (2), 307-318 (2002).
  29. Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278, (6), 356-371 (1997).
  30. Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27, (2), 398-403 (2017).
  31. Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9, (10), 1637-1640 (2017).
  32. Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40, (9), 1825-1831 (2016).
  33. Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40, (8), 653-658 (2016).
  34. Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33, (1), 74-80 (2013).
  35. Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
  36. Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31, (12), 2683-2691 (2006).
  37. Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168, (3), 262-270 (2003).
  38. Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38, (5), 1255-1265 (2014).
  39. Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26, (6), 769-781 (2004).
  40. Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97, (1), 8-27 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics