Kvantificering af ethanolniveauer i zebrafiskembryoner ved hjælp af head space gaskromatografi

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dette arbejde beskriver en protokol til kvantificering af ethanolniveauer i et zebrafiskfoster ved hjælp af gaskromatografi til hovedrum fra korrekt eksponeringsmetoder til embryobehandling og ethanolanalyse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lovely, C. B. Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (156), e60766, doi:10.3791/60766 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Føtale alkoholspektrumforstyrrelser (FASD) beskriver et meget varierende kontinuum af ethanol-inducerede udviklingsdefekter, herunder ansigtsdysmorfoster og neurologiske funktionsnedsættelser. Med en kompleks patologi påvirker FASD ca. 1 ud af 100 børn født i USA hvert år. På grund af FASD's meget variable karakter har dyremodeller vist sig at være kritiske i vores nuværende mekanistiske forståelse af ethanolinducerede udviklingsfejl. Et stigende antal laboratorier har fokuseret på at bruge zebrafisk til at undersøge ethanol-inducerede udviklingsfejl. Zebrafisk producerer et stort antal eksternt befrugtede, genetisk tractable, gennemskinnelige embryoner. Dette gør det muligt for forskere præcist at kontrollere timingen og doseringen af ethanoleksponering i flere genetiske sammenhænge og kvantificere virkningen af embryonal ethanoleksponering gennem levende billeddannelsesteknikker. Dette, kombineret med den høje grad af bevarelse af både genetik og udvikling med mennesker, har vist zebrafisk at være en kraftfuld model til at studere det mekanistiske grundlag for ethanol teratogenicity. Ethanoleksponeringsregimer har imidlertid varieret mellem forskellige zebrafiskundersøgelser, hvilket har forvirret fortolkningen af zebrafiskdata på tværs af disse undersøgelser. Her er en protokol til kvantificering af ethanolkoncentrationer i zebrafiskembryoner ved hjælp af hovedrumsgaskromatografi.

Introduction

Føtale alkoholspektrumforstyrrelser (FASD) beskriver en bred vifte af neurologiske funktionsnedsættelser og kraniofacialdysmorphologier forbundet med embryonal ethanol eksponering1. Flere faktorer, herunder timing og dosering af ethanol eksponering og genetisk baggrund, bidrage til variationen af FASD2,3. Hos mennesker, gør det komplekse forhold mellem disse variabler studere og forstå ætiologi FASD udfordrende. Dyremodeller har vist sig afgørende for at udvikle vores forståelse af det mekanistiske grundlag for ethanolteratogenicityitet. En bred vifte af dyremodelsystemer er blevet brugt til at undersøge flere aspekter af FASD, og resultaterne har været bemærkelsesværdigt i overensstemmelse med, hvad der findes i eksponering hos mennesker4. Gnaver modelsystemer bruges til at undersøge mange aspekter af FASD, med mus er den mest almindelige5,6,7. Størstedelen af dette arbejde har fokuseret på udviklingsfejl ved tidlig eksponering af ethanol8, selvom det senere har vist sig at være udsat for ethanol . Desuden har de genetiske evner mus i høj grad hjulpet i vores evne til at sonde den genetiske fundament af FASD10,11. Disse undersøgelser i mus tyder stærkt på, at der er gen-ethanol interaktioner med den soniske pindsvin vej, retinsyre signalering, Superoxid dismutase, nitrogenoxid syntase Jeg, Aldh2 og Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Disse undersøgelser viser, at dyremodeller er afgørende for at fremme vores forståelse af FASD og dets underliggende mekanismer.

Zebrafisken har vist sig som et kraftfuldt modelsystem til at undersøge mange aspekter af ethanol teratorene22,23. På grund af deres eksterne befrugtning, høj frugtbarhed, genetisk tractability, og levende billeddannelse kapaciteter, zebrafisk er velegnet til at studere faktorer såsom timing, dosering, og genetik af ethanol teratogenese. Ethanol kan administreres til præcist iscenesatte embryoner, og embryonerne kan derefter afbildes for at undersøge ethanolens direkte virkning under udviklingsprocesser. Dette arbejde kan relateres direkte til mennesker, fordi de genetiske programmer for udvikling er stærkt bevaret mellem zebrafisk og mennesker og kan derfor hjælpe guide FASD menneskelige undersøgelser24. Mens zebrafisk er blevet brugt til at undersøge ethanol terateseene, en mangel på konsensus i rapportering embryonale ethanol koncentrationer gør sammenligning med mennesker vanskeligt25. I pattedyrsystemer, blod-alkohol niveauer korrelerer direkte til væv ethanol niveauer26. Mange af zebrafiskundersøgelserne behandler embryoner før fuldstændig dannelse af deres kredsløbssystem. Uden nogen moderprøve at undersøge, en proces til vurdering af ethanol koncentrationer er nødvendig for at kvantificere ethanol niveauer i fosteret. Her beskriver vi en proces til kvantificering af ethanolkoncentrationer i et udviklende zebrafiskembryon ved hjælp af hovedrumsgaskromatografi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle zebrafiskembryoner, der anvendes i denne procedure, blev opdrættet og opdrættet efter etablerede IACUC-protokoller27. Disse protokoller blev godkendt af University of Texas i Austin og University of Louisville.

BEMÆRK: Zebrafisklinjen Tg(fli1:EGFP)y1 blev anvendt i denne undersøgelse28. Alt vand, der anvendes i denne procedure er sterilt omvendt osmose vand. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af Graphpad Prism v8.2.1.

1. Fremstilling af embryonmedier

  1. For at lave et 20x lager af embryonmedier opløses 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl2, 0,41 g K2HPO4, 0,142 g NA2HPO4og 4,9 g MgSO4·7H2O i 1 L vand. Ignorer den hvide bundfald, der danner; dette vil ikke påvirke medierne. Den skal steriliseres lageropløsningen, og den opbevares ved 4 °C.
  2. For at skabe den fungerende embryo media løsning, opløses 1,2 g NaHCO3 i 1 L af 20x embryo media lager og tilsæt 19 L vand. Den fungerende embryonmedieopløsning opretholdes ved 28 °C.

2. Måling af embryonale volumen ved hjælp af vand forskydning

BEMÆRK: I denne protokol anvendes 24 h postfertilisering (hpf) embryoner (figur 1). De embryoner, der anvendes i volumenmålingerne, anvendes ikke i ethanolanalysen.

  1. 10 embryoner og ekstraembryonal væske anbringes i 1,5 ml mikrocentrifugerør, der er mærket med et volumen på 250 μL (figur 2A). Tilsæt vand til 250 μL-påfyldningsledningen (se prøven med dyed vand i figur 2B).
  2. Gentag trin 2.1 for at oprette beholdere til embryoner, der har fået fjernet deres chorioner.
    1. For at fjerne chorion, placere embryoner i deres chorions i en 100 mm Petriskål med 2 mg / ml protease cocktail i embryo media ved stuetemperatur (RT) i 10 min. Hvert par minutter, forsigtigt hvirvle embryoner til at bryde chorion.
    2. Når alle embryonerne er fri for deres chorion, skal de dechorionerede embryoner fjernes fra proteasecocktail/embryo-medier og placeres i en ny 100 mm petriskål med friske embryonmedier for at vaske embryonerne. Gentag denne vask trin 1 mere tid (for i alt 2 vask). Fostrene overføres til en frisk 100 mm petriskål.
  3. Brug den mindste spids muligt og uden at beskadige embryonerne, forsigtigt fjerne al væske fra omkring embryonerne ved hjælp af en p200 mikropipettor (figur 2C) og veje vandet med en skala med <0,1 mg præcision. For at bestemme mængden af prøven på 10 embryoner trækkes vandets vægt/volumen fra 250 μL. For at bestemme mængden af et enkelt embryon skal forskellen fordeles mellem 250 μL og vægten af det vand, der fjernes med 10.

Equation 1

Equation 2

3. Behandling af embryoner med ethanol

  1. Saml embryoner fra parringstanke og sted i en standard 100 mm petriskål. Tæl ikke mere end 100 embryoner pr. enkelt petriskål og inkuber ved 28,5 °C.
    BEMÆRK: Hvis chorionen skal fjernes (trin 2.2), skal den fjernes, før der tilsættes ethanol.
  2. Ved 6 hkf tilsættes op til 100 embryoner til en ny standard 100 mm petriskål enten med embryomedia eller embryo media + 1% ethanol (v/v). Dæk, men forsegle ikke petriskålen. Embryoerne anbringes i en lav vikarinkubator, der er indstillet til 28,5 °C i 18 timer, eller indtil embryonerne når udviklingspunktet på 24 hkf.

4. Forberedelse af arbejdsgangen før behandling af embryoner til hovedrumsgaskromatografi

  1. Der skal anvendes en opløsning på 5 M NaCl i vand (450 μL pr. prøverør) for at denaturere alle proteiner og forhindre ethanolmetabolisme. Lav proteasecocktailen(Materialetabellen)i en koncentration på 2 mg/ml i embryonmedier.
  2. Der mærkes et mikrocentrifugerør på 1,5 ml og et 2 ml gaskromaglas for hver prøve. Mærke yderligere 2 ml gaskromatografhætteglas til de ethanolstandarder, der er beskrevet nedenfor, samt luft, vand og 5 M NaCl/protease cocktail emner.
  3. Der sættes tre p200 mikropipettorer op, der er to indstillet til 50 μL, og det tredje sæt til 200 μL. en p1000 mikropipettor indstillet til 450 μL og en p2 mikropipettor indstillet til 2 μL. For de glaspipetter, der anvendes til at overføre embryoner fra petriskålene til 1,5 ml mikrocentrifugerørene, skal du hurtigt passere pipettespidsen gennem en flamme for at glatte kanterne for ikke at beskadige embryonerne, når de trækkes ind i pipetten.

5. Behandling af embryoner til gaskromatografi i hovedet

BEMÆRK: Begge embryoner i deres chorions og dem, der tidligere er fjernet fra deres chorions, behandles på samme måde for konsistens i beregningen af fortyndingsfaktorer.

  1. Brug de to p200 mikropipettorer, der er sat til 50 μL, trækkes 50 μL af proteasecocktailopløsningen i ét og trækkes 50 μL vand ind i den anden.
  2. Brug glaspipetette og mikropipettor, hurtigt placere 10 embryoner (fra trin 3.2) i en 1,5 ml mikrocentrifuge rør og lukke hætten (som beskrevet i figur 2A). Gentag for alle prøver, der skal testes, kontroller og ethanol behandlede embryoner.
  3. Brug p200 micropipettor indstillet til 200 μL, hurtigt åbne hætten og fjerne alle resterende embryo media (som beskrevet i figur 2C). Placer hurtigt pipetten, der indeholder 50 μL vand, i røret, og tilsæt hurtigt, men forsigtigt (for ikke at beskadige embryonerne), og fjern derefter vandet. Tilsæt hurtigt 50 μL af proteasecocktailopløsningen fra den ventende pipettor, og rørdækslet lukkes (figur 2D).
    BEMÆRK: Udfør denne proces ét eksempel ad gangen.
  4. Lad prøven sidde på RT i 10 minutter for at tillade protease cocktail at forringe chorion. Tilsæt derefter hurtigt 450 μL 5 M NaCl, og rørdækslet lukkes (figur 2E). Vortex prøverne i 10 min. For at fremskynde processen skal du konfigurere mixeren til at vortex flere prøver på samme tid.
    BEMÆRK: Tilsættes en lille mængde (~100 μL) af en silicaperleblanding (2 størrelser, 0,5 mm og 1 mm perle) til ethvert rør med embryoner på over 24 hkf. I ældre embryoner forbliver notochordintakt, uanset hvor længe de homogeniseres.
  5. Efter homogenisering i 10 min. fjernes 2 μL homogeniseret embryosupernatant hurtigt og tilsættes et gaskromatografhætteglas. Luk hurtigt hætteglasset med polytetrafluorethylenhætten.

6. Udarbejdelse af standarder for medier og ethanol

  1. For at forberede mediestandarderne skal du fortynde medierne med en faktor på 10 med en 5 M NaCl/protease cocktailløsning. Der tilsættes 2 μL af hver prøve til et gaskromatografhætte og forsegles med en polytetrafluorethylenhætte.
  2. For at forberede ethanol standarder, skabe en seriel fortynding af 100% ethanol i 5 M NaCl / protease cocktail løsning til følgende koncentrationer: 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 og 40 mM. Der tilsættes 2 μL af hver standard til et gaskromatografhætte og forsegles med en polytetrafluorethylenhætte.

7. Forberedelse af hovedet plads gas kromatograf

BEMÆRK: Denne opsætning og protokol skal muligvis ændres afhængigt af den anvendte gaskromatograf. Head space gaskromatografi bruges til at kvantificere ethanol niveauer, ikke til adskillelse.

  1. Indstil varmevarmeren til autosampleren til 58 °C, og tænd. Varmeren må nå op på 58 °C, og luft- og brintgasledningerne føres gaskromatograf (til flammeionisering, der anvendes til at kvantificere ethanolen).
    BEMÆRK: Psi'en skal indstilles til korrekt betjening af kromatografen i overensstemmelse med fabrikantens specifikationer. Sørg for, at heliumlinjen er tændt og indstillet til den rette psi.
  2. For septum, sørg for antallet af injicerede prøver er ikke > 100. For injektionfiberen skal du sørge for, at antallet af injicerede prøver ikke er >500.
    BEMÆRK: Hvis en af dem er over mængden af injektioner, skal de ændres, før prøverne køres.
  3. Tænd for analysesoftwaren, og sørg for, at arbejdsstationen er konfigureret korrekt. Opbevar alle data i henhold til laboratorie-/afdelingsstandarder. Opret en ny eksempelliste for de prøver, der skal køres.
  4. Startmetoden skal startes, og vent på, at flammeioniseringsdetektoren stabiliseres, før prøverne køres. Når stabil, køre software start metode til at rense fiber.

8. Prøvemålinger ved hjælp af gaskromatografi til hovedrum

  1. Når startmetoden er fuldført, skal du oprette 1 ny linje pr. eksempel på eksempellisten. Fra metodemenuen i analysesoftwaren skal du indlæse 436 Nuværende spme ethanol 2013 3min absorbere 2_5min rg run. METH for hver prøve på prøvelisten.
    1. Udfyld prøvelisten, begyndende med luft, vand, 5 M NaCl/ protease cocktail emner. Indtast derefter i standarderne i rækkefølge, fra 0,3125 til 40 mM. Følg standarderne med en anden runde af luft, vand og 5 M NaCl /protease cocktail emner.
    2. Indtast alle homogeniserede embryo supernatant prøver, der skal testes, fra laveste til højeste forudsagt ethanol koncentration. Afslut med at indtaste en tredje og sidste runde af luft, vand og 5 M NaCl / protease cocktail emner.
  2. Tilsæt gaskromatografglas til autosampleren i den rækkefølge, prøverne blev angivet i. Tillad prøver at varme i 10-15 min. Start prøven kører i softwaren.
  3. Når alle eksempler ne og de sidste emner er kørt, skal du aktivere lukningsmetoden i softwaren ved at tilføje et endeligt eksempel på eksempellisten og køre standby. METH. Sikkerhedskopier alle data, der er anskaffet under prøvekørslerne. Sluk for udstyret i følgende rækkefølge: autosamplervarmer, brinttank og først efter kromatograftemperaturen når op på 30 °C lufttanken. Lad heliumtanken være tændt for at bevare vokssøjlen.

9. Analyse af ethanolpeakintegration og analyse af koncentration af prøver

BEMÆRK: Alle værdier fra 9,3 på blev beregnet i en Excel-fil, som alle ligninger udfyldte på forhånd.

  1. Når nedlukningsmetoden er færdig, skal du klikke på Åbn kromatogramme. Åbn den mappe, der indeholder resultaterne. Prøver er automatisk integreret i dette program.
  2. I resultaterne skal du sørge for, at de korrekte toppe er blevet integreret (ethanoltoppe mellem 2 og 2,5). Når alle prøver er blevet bekræftet, udskrives eller eksporteres resultaterne.
  3. Ethanolstandardernes tophøjde på en graf. Hæld hældningen, Y-opfange- og R2-værdierne for ethanolstandarderne (R2 skal være >0,99).
    BEMÆRK: Disse værdier vil blive anvendt til at bestemme ethanolkoncentrationen fra prøvehøjden.
  4. For hver prøve trækkes prøvens tophøjde fra Y-skæringspunktet for ethanolstandarderne. Opdel denne værdi ved hældningen af ethanolstandarderne for at opnå ethanolværdien for hver prøve i GC-hætteglassene.

Equation 3

  1. For at beregne ethanolkoncentrationen i embryonerne beregnes fortyndingsfaktoren for hver prøve først. Tag volumenmålingen beregnet i trin 2.3 i denne protokol, og del den med volumenmålingen plus 500 μL. Dette repræsenterer den 5 M NaCl/protease cocktail opløsning, der tilsættes hver prøve under embryo behandling (trin 5.3 og 5.4).

Equation 4

  1. Ved hjælp af denne prøvefortyndingsfaktor formeres med prøvens ethanolværdi for hver prøve. Resultaterne vil være i mM koncentration. Mediereferenceprøver beregnes ved at gange medieethanolværdien med fortyndingsfaktoren på 10.

Equation 5

Equation 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Blod ethanol niveauer kan ikke bestemmes i tidlig embryonale zebrafisk, fordi de mangler en fuldt dannet kredsløbssygdomme. For at bestemme koncentrationen af ethanol i zebrafiskembryonerne måles ethanolniveauerne direkte fra homogeniseret embryonalvæv. For at måle embryonale ethanolkoncentrationer skal der tages hensyn til embryonale ethanolkoncentrationer. Embryoet (æggeblomme vedlagt) sidder inde i chorion (æggeskal) omgivet af ekstraembryonal væske (figur 1). Ethvert målevolumen af embryonet skal foretages på embryoner på eksponeringstidspunktet, fordi embryonalvolumen vil ændre sig i udviklingstiden, efterhånden som embryonet stiger i størrelse. Desuden skal der tages hensyn til, hvordan embryonet behandles, samt det embryonale volumen, da begge disse elementer skaber fortyndingsfaktorer, der anvendes til at beregne embryonale ethanolniveauer.

Fordi fosteret ikke er en perfekt kugle, især efter 10 hkf, vand forskydning blev brugt til at vurdere embryonale volumen. Denne undersøgelse anvendte embryoner ved 24 hkf. Mængden af embryoner både i deres chorion og dem, der fjernes fra deres chorion blev målt. Disse mængder var 1,97 (± 0,4 SD) μL for embryonet med ekstraembryonal væske og 1,1 (± 0,22 SD) μL for embryonet alene (tabel 1). Denne forskel mellem embryonet med ekstraembryonal væske og embryonet alene er mængden af den ekstraembryonale væske, som omgiver fosteret inde i chorionen (figur 1). Denne forskel er afgørende for bestemmelse af ethanolkoncentrationen af embryonet alene i prøverne. Af analysen udgjorde embryonet 56% af det samlede volumen af embryonet med ekstraembryonal væske inde i chorionen (tabel 1). Efterhånden som fosteret voksede, steg fostervolumenet over tid, hvilket resulterede i et fald i mængden af den ekstraembryonale væske25. Ved måling af ethanolkoncentrationer fra embryoner, der stadig er i deres kor, skal der tages hensyn til vandindholdet i både embryonet og den ekstraembryonale væske.

Tidligere offentliggjort arbejde har vist , at vandfraktionen i embryonet alene er 73,6 %29. Dette resultat blev opnået ved hjælp af en kombination af volumen mål, elektron spin resonans spektroskopi, og magnetisk resonans mikroskopi. For at bekræfte dette resultat vejede embryoner ne alene før og efter bagning ved 70 °C, som tidligere beskrevet25. Denne proces fjerner alt vand fra fosteret. Ændringen i vægt repræsenterer mængden af vand i fosteret. Fra denne analyse indeholdt et 24 hpf embryo ~72% vand, mens et 48 hkf embryo indeholdt ~76%. Begge disse værdier svarer meget til den embryonale vandmængde på 73,6 % , der tidligere er beregnet29. Dette tyder på, at embryoets vandmængde ikke ændrer sig lidt i den tidlige udvikling.

På grundlag af det offentliggjorte arbejde ved hjælp af flere tilgange til beregning af vandmængden i fosteret blev 73,6 % anvendt som fostervandsindhold for alle de præsenterede analyser. Dette resulterede i vand, der omfattede 0,82 μL af det 1,1 μL embryonale volumen (tabel 1). Herfra blev mængden af den ekstraembryonale væske beregnet som 0,86 μL. Af embryomens samlede vandmængde med ekstrafostervæske er 49 % indeholdt i fosteret, og 51 % er i den ekstraembryonale væske (tabel 1).

Til analyse af gaskromatografi blev der kun anvendt 24 hpf-embryoner, der stadig var i deres chorion (figur 1). I dette ethanolregime blev embryoner behandlet med 1% (171 mM) ethanol mediekoncentration fra 6-24 hpf, selv om forskellige ethanol koncentrationer og eksponeringstid vinduer kan anvendes afhængigt af eksperimentelt design. To grupper på 15 prøver (10 embryoner pr. prøve) og de medier, som de blev behandlet med over 2 forskellige forsøgsdage (tabel 2), blev analyseret. Medieniveauer kan variere fra eksperiment til eksperiment. For at tage højde for dette blev der målt ethanolniveauer for medier 5x pr. forsøgsgruppe. I denne analyse var medieniveauerne 143,6 (± 2,3 SD) mM for gruppe 1 og 133,6 (± 2,7 SD) mM for gruppe 2. Disse værdier er væsentligt forskellige ved hjælp af en ikke-parret t-test (p = 0,0002). Embryonerne med ekstraembryonal væske i gennemsnit 63,5 (± 17,1 SD) mM og 53,1 (± 12,6 SD) mM for henholdsvis gruppe 1 og 2. Koncentrationen var imidlertid ikke væsentligt forskellig mellem de 2 grupper af embryoner med ekstraembryonal væske (uparret t-test, p = 0,07). Ubehandlede kontrolembryoner blev målt ved 0 mM. På grund af variationen i medieniveauerne blev der beregnet et forhold mellem embryonalethanolkoncentration/medieniveauer for ethanol for hver prøve. Gruppe 1 havde 44% af medieethanolniveauet, mens gruppe 2 havde 40% af medieethanolniveauerne(figur 3 og tabel 2).

Figure 1
Figur 1: Et billede af et foster ved 24 h postfertilisering (hpf) inde i chorion. Fosteret og æggeblommen er omgivet af den ekstraembryonale væske, alle placeret inde i chorion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Protokol til måling af embryonal volumen og behandling af embryoner til analyse. (A) Ti 24 hkf embryoner overført til en 1,5 ml mikrocentrifuge rør mærket ved en 250 μL volumen. (B) Mikrocentrifugerøret med embryoner fyldt med vand (vandet er dyed, så det er lettere at se på 250 μL mærket). C) Alt vandet fjernes fra røret og vejes. (D) Ti embryoner overført til et mikrocentrifugerør på 1,5 ml. Vandet blev fjernet som i (C) og erstattet med 50 μL protease cocktail. E) Efter 10 min blev der tilsat 450 μL stk. 5 M NaCl til røret fra (D). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kasse- og piskerisplot af forholdet mellem ethanolkoncentration en af prøver til medier. Ethanolkoncentrationen for hver gruppe blev divideret med gennemsnittet af medieprøverne i den pågældende gruppe. Gruppe 1 indeholdt 44 % af medieniveauet, mens gruppe 2 indeholdt 40 %. I begge grupper, n = 15; 10 embryoner pr. prøve. Grupper blev sammenlignet med en envejs ANOVA med en Tukey's post hoc analyse (**** p < 0,0001). Knurhår repræsenterer minimum til maksimum. Klik her for at se en større version af denne figur.

Embryo og embryo + Ekstraembryovandmængder (μL)
Vanda
Samlet volumenb % af den samlede mængde (V) Embryonale volumen (W) Ekstraembryonal volumen (X) % vand i embryo (Y) % vand i Ekstraembryonale (Z)
Embryo + Ekstraembryonale (EE)c 1,97 ± 0,4
Embryo 24 hpf (E)c 1,11 ± 0,22 56% 0.82 0.86 49% 51%
Beregninger
V Embryo % af det samlede volumen = Samlet mængde E ▲ Samlet mængde eE
W Embryonale vandvolumen = V × 73,6%
X (X) Ekstraembryonale vandvolumen = W – Samlet mængde eE
Y% Vand i embryon = (W + X)/W × 100
Z% Vand i Ekstraembryonale = 100 – Y
a a Embryonale vandvolumen blev beregnet fra Hagedorn et al.29.
b Værdier rapporteres som ± standardafvigelse (SD).
cn = 13 10 embryoner pr. prøve

Tabel 1: Beregning af vandvolumen for embryonerne med ekstraembryonal væske. Volumenet blev beregnet ud fra 13 prøver (10 embryoner pr. prøve) fra 24 hpf-embryoner med ekstra embryonal væske, der stadig er fjernet i chorionen og embryoner, der er fjernet fra deres chorion. Værdier rapporteres som den gennemsnitlige ± SD.

Ethanol Koncentration af embryoner og medier (mM)a
Gruppe 1 Gruppe 2 Kombineret
Medier (M)b 143,6 ± 2,3 133,6 ± 2,7 138,6 ± 5,8
Embryo + Ekstraembryonale (EE)c 63,5 ± 17,1 53,1 ± 12,6 58,3 ± 15,7
Forholdet mellem ethanol - embryo til medier (1) 0,44 ± 0,12 0,40 ± 0,09 0,42 ± 0,11
Beregninger
1. Forholdet mellem ethanol = EE ▲ M
a a Værdier rapporteres som ± SD.
bn = 5
cn = 15 10 embryoner pr. prøve
d. Værdier er gennemsnittet af gruppe 1 og 2.

Tabel 2: Beregninger af ethanolkoncentrationen i embryoner med ekstraembryonal væske og medier (mM). Medieprøver var direkte foranstaltninger fra medierne (n = 5 pr. gruppe). Embryonal ethanolkoncentrationen blev beregnet ud fra 15 prøver (10 embryoner pr. prøve) fra 24 hpf-embryoner med ekstraembryonal væske. Forholdet mellem ethanolkoncentrationerne i embryonerne og ekstraembryonal væske og medier blev beregnet. Værdier rapporteres som den gennemsnitlige ± SD.

Beregning af ethanol i embryoneta,b
Embryo (Y) Forholdet til medier (Z)
32,7 ± 8,8 mM 0,24 ± 0,06
Beregninger
Y (Y) Embryonal ethanol = 58,3 mM (tabel 2) × 56% (tabel 1)
Z Forholdet mellem ethanol = Y ▲ 138,6 mM (tabel 2)
a a Værdier er gennemsnittet af gruppe 1 og 2.
b Værdier rapporteres som ± SD.

Tabel 3: Beregning af ethanol i fosteret. Embryonal ethanolkoncentrationen blev beregnet som 56 % af embryomens samlede ethanolkoncentration med ekstraembryonal væske. Dette blev derefter rapporteret som et forhold mellem embryo og medier. Værdier rapporteres som den gennemsnitlige ± SD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som et udviklingsmodelsystem er zebrafisk velegnet til at undersøge miljøfaktorernes indvirkning på udviklingen. De producerer et stort antal eksternt befrugtede embryoner, som giver mulighed for præcis timing og dosering paradigmer i ethanol undersøgelser. Dette, kombineret med live imaging kapaciteter og den genetiske og udviklingsmæssige bevarelse med mennesker, gør zebrafisk en kraftfuld model system til teratologi undersøgelser. Beskrevet er en protokol til måling af embryonale ethanolkoncentrationer i udviklingen af zebrafiskembryoner ved hjælp af hovedrumsgaskromatografi.

Bestemmelse af embryonal ethanolkoncentration er afgørende for at forstå virkningen af ethanol på det udviklende embryon. I gnavere modeller, blod ethanol koncentrationer korrelerer til væv koncentrationer26. Det er dog ikke muligt at vurdere blodets ethanolniveauer i den tidlige embryonale udvikling hos en zebrafisk. Head space gas kromatografi er blevet brugt til at måle ethanol niveauer i forskellige eksperimentelle paradigmer, herunder zebrafisk25,30,31,32,33,34,35. Denne protokol kan dog anvendes til at måle mange forskellige miljøfaktorer, selv om volatiliteten af disse forskellige faktorer skal være høj nok til at måle kvantitativt, og der skal vælges en gaskromatografkolonne baseret på polariteten af de pågældende forbindelser. Desuden er zebrafisk bedst egnet til at undersøge virkningen af vandopløselige faktorer, fordi eksponering for hydrofobe faktorer er yderst vanskeligt at analysere hos fisk.

Denne protokol vil gøre det muligt for forskere direkte at vurdere ethanolkoncentrationer i zebrafiskembryoner. Der skal dog tages fat på flere faktorer for at sikre nøjagtige målinger af embryonale ethanolkoncentrationer. Da ethanolindholdet i det samlede embryonale væv blev målt, måtte embryonale mængder tages i betragtning. Efter 10 hkf fosteret begynder somitogenese (somit dannelse) og er ikke længere en kugle (Figur 1). For at vurdere embryonalvolumen blev der anvendt vandforskydning på 10 samlede embryoner pr. prøve. Hver prøve bestod af 10 embryoner af to grunde: for det første for at reducere fejl fra små mængder, og for det andet til at gennemsnitlige små udsving i embryovolumener. Ved måling af embryonalvolumen er det vigtigt at overveje præcisionen af pipettering og vejning. Selv anvendelsen af 10 embryoner pr. prøve er ved den nedre præcisionsgrænse for både pipetter og den skala, der anvendes til at veje embryonerne. Med det udstyr, der er til rådighed, ville brugen af færre end 10 embryoner have påvirket analyserne. Dette begrænser ikke forskere fra at bruge færre embryoner pr. prøve, så længe udstyrets præcision overvejes.

Embryonalvolumen er en faktor, der påvirker prøveanalysen. En anden nøglefaktor er embryonal behandlingshastighed, fordi ethanol er flygtig. Desuden kan ethanol hurtigt opviske i flere dyreforsøg25,36,37. Vores vask protokol er designet til hurtigt at fjerne enhver ethanol, der overholder den udvendige overflade af chorion. I denne undersøgelse påvirkede denne vaskeprotokol ikke de embryonale ethanolniveauer, selv om længere eller flere vasker kunne påvirke embryonale ethanolkoncentrationer25,38. Men en tredje faktor at tage hensyn til er fortynding af fostervolumen under forarbejdning. Denne protokol bruger en protease cocktail til at forringe chorion samt 5 M NaCl at denaturere alle proteiner, herunder alkohol forarbejdning enzymer.

Endelig er en række analyser og rapporteringsmetoder blevet beskrevet i en lang række zebrafiskundersøgelser. På grund af variation i forskellige stikprøver af en undersøgelse eller sammenligning af forskellige undersøgelser er korrekt rapportering af ethanolkoncentration kritisk25,38. Metoder ved hjælp af indirekte (normalt enzymatiske foranstaltninger) er afhængige af analyse af en sekundær metabolit. I så fald kan hastigheden af enzymatisk aktivitet variere og hindre præcis analyse af ethanolkoncentrationen. Denne metode måler direkte ethanolniveauer, og ethanolkoncentrationer rapporteres som et forhold mellem embryo og mediekoncentrationer. Vores resultater er i overensstemmelse med en voksende konsensus om et 24 hkf embryo, der indeholder ~ 30% af mediekoncentrationerne (tabel 3)25,38,39,40. Overraskende nok er denne 30% embryonale ethanolkoncentration uafhængig af mediekoncentration, og det er ikke godt forstået, hvad der skaber denne ligevægt25,38. Embryoner over 24 hkf viser fald i ethanolkoncentrationer, idet 48 hpf-embryoner indeholder næsten halvdelen af ethanolindholdet i et 24 hkf embryo25. Vores resultater bestemmer dog ikke ligevægten mellem ethanol og vand. I betragtning af den hastighed, hvormed ethanol ligevægter, samt volatiliteten af ethanol, er det utroligt vanskeligt at vurdere vandvolumen ændringer i selve fosteret på grund af ethanol eksponering. Hvis man forsøger at måle mængden af en ethanolbehandlet embryoprøve ved hjælp af vandforskydning, vil det medføre tab af ethanol fra fosteret under målingen. Ved hjælp af mere præcise mikromikroskopi- og spektroskopimetoder end dem, der er beskrevet ovenfor, kan det være muligt at bestemme ethanol-vandligevægten i et foster ved direkte at måle begge dele på samme tid.

Samlet set er den protokol, der er beskrevet her, et effektivt værktøj til at vurdere embryonale ethanolkoncentrationer i udviklingen af zebrafiskembryoner. Disse oplysninger er afgørende for standardisering af FASD-undersøgelser ved hjælp af zebrafisk. Evnen til præcist at kontrollere ethanolbehandlingsparadigmer og direkte kvantificere embryonale ethanolkoncentrationer styrker zebrafiskmodellens funktionalitet til FASD-undersøgelser hos mennesker. I sidste ende vil dette arbejde i høj grad forbedre vores forståelse af FASD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Den forskning, der præsenteres i denne artikel blev støttet af tidligere tilskud fra National Institutes of Health / National Institute of Dental og Craniofacial Research (NIH / NIDCR) R01DE020884 til JK og National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 til C.B.L. og af det nuværende tilskud fra National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 til C.B.L. Vi takker Rueben Gonzales for at levere og bistå med gas kromatograf analyse. Vi takker Tiahna Ontiveros og Dr. Gina Nobles skrive bistand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air Provided by contract to the university
Analytical Balance VWR 10204-962
AutoSampler, CP-8400 Varian Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride VWR 97062-590
Ethanol Decon Labs 2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL Agilent 8010-0198 Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800 Varian
Helium Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column Agilent 19095N-123I 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL Fisher Scientific 2682002
Micropipette tips 10 μL Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL Fisher Scientific 13611112
Petri dishes 100 mm Fisher Scientific FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap Agilent 5190-7021 Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pronase VWR 97062-916
Silica Beads .5 mm Biospec Products 11079105z
Silica Beads 1.0 mm Biospec Products 11079110z
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane Millipore Sigma 57343-U Replacement fibers
Star Chromatography Workstation Varian Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa Millipore Sigma 23154 Replacement inlet septa

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93, (9), 732-737 (2008).
  2. Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230, (6), 389-393 (2005).
  3. Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136, (5), 1395-1406 (2015).
  4. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
  5. Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96, (2), 131-147 (2018).
  6. Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
  7. Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
  8. Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230, (6), 366-375 (2005).
  9. Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7, (8), 43067 (2012).
  10. Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40, (6), 1154-1165 (2016).
  11. Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55, (4), 501-513 (1996).
  12. Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (16), 10476-10481 (2002).
  13. Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85, (6), 556-567 (2009).
  14. Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8, (10), 1002999 (2012).
  15. Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82, (4), 224-231 (2008).
  16. Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10, (9), 1050-1057 (1996).
  17. Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92, (2), 416-422 (2006).
  18. Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39, (2), 221-231 (2015).
  19. Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
  20. Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138, (1), 45-59 (2002).
  21. Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475, (7354), 53-58 (2011).
  22. Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13, (5), 391-398 (2016).
  23. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96, (2), 88-97 (2018).
  24. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, (15), 3254-3265 (2013).
  25. Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48, (6), 595-602 (2014).
  26. Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol's molecular targets. Science Signaling. 1, (28), (2008).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
  28. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248, (2), 307-318 (2002).
  29. Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278, (6), 356-371 (1997).
  30. Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27, (2), 398-403 (2017).
  31. Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9, (10), 1637-1640 (2017).
  32. Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40, (9), 1825-1831 (2016).
  33. Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40, (8), 653-658 (2016).
  34. Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33, (1), 74-80 (2013).
  35. Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).
  36. Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31, (12), 2683-2691 (2006).
  37. Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168, (3), 262-270 (2003).
  38. Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38, (5), 1255-1265 (2014).
  39. Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26, (6), 769-781 (2004).
  40. Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97, (1), 8-27 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics