OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

Biochemistry

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Summary

ここでは、タンパク質ポリマーを制御された配列で形成する酵素によってタンパク質モノマーを結合し、単一分子力分光研究のために表面に固定化するプロトコルを提示する。

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Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).

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Abstract

化学・バイオコンジュゲーション技術は近年急速に開発され、タンパク質ポリマーの構築が可能です。しかし、制御されたタンパク質重合プロセスは常に課題です。ここでは、合理的に対照的な配列で重合タンパク質を段階的に構築するための酵素的方法論を開発しました。この方法では、タンパク質モノマーのC末端は、OaAEP1(オルデンランディア・アフィニアスパラジニアル・エンドペプチダーゼ)1)を用いたタンパク質結合のためのNGLであり、N末端は一時的なN末端保護のための鎖切りTEV(タバコエッチウイルス)切断部位に加えてL(ENLYFQ/GL)であった。その結果、OaAEP1は一度に1つのタンパク質モノマーのみを添加することができ、その後TEVプロテアーゼはQとGの間のN末経を切断してNH 2-Gly-Leuを暴露した。その後、ユニットは次のOaAEP1ライゲーションの準備ができています。この工学的ポリタンパク質は、原子間力顕微鏡ベースの単分子力分光法(AFM-SMFS)を用いて個々のタンパク質ドメインを展開することによって検査される。したがって、本研究は、ポリタンパク質工学と固定化のための有用な戦略を提供する。

Introduction

合成ポリマーと比較して、天然の多ドメインタンパク質は、サブドメイン1の数と種類がよく制御された均一な構造を有する。この機能は、通常、改善された生物学的機能と安定性2、3をもたらす。システイン系ジスルフィド結合結合結合や組換えDNA技術など多くのアプローチが、複数ドメイン4、5、6、7を有する重合タンパク質を構築するために開発されている。しかし、前者の方法は常にランダムで制御されていない配列を生み出し、後者の方法は、有毒で大きなタンパク質の過剰発現の困難さや、補因子やその他の繊細な酵素による複雑なタンパク質の精製など、他の問題につながります。

この課題に対応するため、プロテアーゼTEV8,9と組み合わせたプロテインリガーゼOaAEP1を用いて、ポリマー/ポリタンパク質のタンパク質モノマーを段階的に結合する酵素法を開発しています。OaAEP1 は、厳格かつ効率的な内ペプチダーゼ.2つのタンパク質は、N末限がGly-Leu残基(GL)であり、C末終点がNGL残基である他のタンパク質がNGL残基である場合、30分以内にOaAEP1によって2つのテルミニを介してAsn-Gly-Leu配列(NGL)として共有結合することができる。しかし、OaAEP1を使用してタンパク質モノマーをリンクさせると、システイン系カップリング法のような制御されていない配列を有するタンパク質ポリマーに導く。そこで、取り外し可能なTEVプロテアーゼ部位とロイシン残基をENLYFQ/G-L-POIとして持つタンパク質ユニットのN末限を設計しています。TEV切断の前に、N末端はOaAEP1ライゲーションに関与しなかった。そして、さらにOaAEP1ライゲーションと互換性があるN末経でGL残基がTEV切断後に暴露される。このように、比較的良好な配列を持つポリタンパク質の逐次酵素生合成法を達成した。

ここでは、当社の段階的酵素合成法は、配列制御および制御されていないポリタンパク質サンプル調製法、および単分子研究のためのタンパク質固定化、特に次のような複雑系に使用することができます。金属タンパク質。

さらに、AFMベースのSMFS実験により、タンパク質ポリマーの構造と安定性を単一分子レベルで確認することができます。AFM、光ツイーザー、磁気ツイーザーを含む単分子力分光法は、ナノテクノロジーにおける一般的なツールで、生体分子を機械的に操作し、その安定性を測定する11、12、13、14、15、16、17、18、19、20である。単分子AFMは、タンパク質(un)折りたたみ21、22、23、24、25、受容体リガンド相互作用26、27、28、29、30、31、32、33、34の研究で広く使用されています。 35,無機化学結合20,36,37,38,39,40,41,42,43および金属- リガンド結合 , 金属タンパク質44,45,46,47,48,49,50.ここで、単分子AFMは、対応するタンパク質展開シグナルに基づいて合成されたポリタンパク配列を検証するために使用される。

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Protocol

1. タンパク質の生産

  1. 遺伝子クローン
    1. 目的タンパク質(POI)用にコード化した遺伝子(POI):ユビキチン、ルブレドキシン(RD)51、セルロース結合モジュール(CBM)、ドッカリンXドメイン(XDoc)およびルミノコッカスフラベファシス、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ、エラスチン様ポリペプチド(Elps)からの凝集体。
    2. ポリメラーゼ連鎖反応を行い、異なるタンパク質断片から遺伝子を再結合するための3制限消化酵素システムBamHI-BglII-KpnIを用いる。
    3. 直接DNAシーケンシングによりすべての遺伝子を確認する。
  2. タンパク質の発現と生産
    1. 発現用に pQE80L-POI または pET28a-POI プラスミドを使用して大腸菌BL21(DE3) を変換します。
    2. 各抗生物質(例えば、100 μg/mLアンピシリンナトリウム塩または50 μg/mL、カナマイシン)を用いて、1つの単一コロニーをLB培地の15mLに選びます。16-20時間の37 °Cで200rpmで培養を振り続けます。
    3. 一晩培養液を800mLのLB培地(1:50希釈)に希釈します。rubredoxinの場合は、1,800 x gで培養を遠心分離し、M9培地の15 mL(0.4%のグルコース、0.1 mMのCaCl2、2mM MgSO4を補って)に再懸濁し、M9培地の800mLに希釈した。
    4. 200rpmで振とうながら37°Cで培養液をインキュベートし、培養が0.6の600nm(OD600)で光学密度に達するまで。タンパク質発現を検査するための事前誘導制御として、培養液のサンプル100μLを保存します。
    5. IPTGを1mMの最終濃度に添加してタンパク質発現を誘導し、200rpmで4時間の培養液を37°Cで振る。タンパク質発現を検査するための誘導後制御として、培養液の100μLサンプルを予約してください。
    6. 4°Cで25分間13,000 x gで培養を遠心分離し、精製前に-80°Cで保存します。
      注: ここでプロトコルを一時停止できます。
  3. 目的タンパク質の精製
    1. 25 mLのリシスバッファー(50mMトリス、150 mM NaCl、pH 7.4、DNase、RNase、PMSF)で細胞を再懸濁し、ソナレータ(15%振幅)を使用して氷上で30分間ライセリングします。
    2. 4°Cで40分間19,000 x gで細胞ライセートを明らかにする。
    3. Co-NTAまたはNi-NTAアフィニティカラムのパック1 mL(ベッドボリューム)を、重力流によって10列ボリューム(CV)の超純水と10 CVの洗浄バッファー(50 mMトリス、150 mM NaCl、2 mMイミダゾール、pH 7.4)で洗浄します。
    4. 重力流によってカラムを通ってタンパク質上清を3回通過させます。
    5. 50個のCVでカラムに洗浄バッファを注ぎ、汚染タンパク質を取り除きます。
    6. 氷冷溶出バッファーの 3 CV (20 mM トリス、400 mM NaCl、250 mM イミダゾール、pH 7.4) の結合タンパク質を溶出します。ラベドキシンタンパク質に関しては、4°CでpH8.5でアニオン交換カラムを用いた更なるアニオン交換精製が必要である。
    7. SDS-PAGEでサンプルを分析します。

2. カバースリップとカンチレバー表面の機能化

  1. 機能化されたカバースリップ表面の準備
    1. 40mLの超純水に20gのクロム酸カリウムを溶かします。グラスロッドを使ってクロム酸カリウム溶液に360mLの濃硫酸をゆっくりと加え、クロミック酸を調製します。
      注意:ここで使用される化学物質と最終クロム酸は、強く腐食性と酸性です。適切な保護具で作業します。この溶液は、濃硫酸を加えるときに熱を放出し、冷却のためのゆっくりとした追加と適切な休止を意味する。
    2. クロム酸処理により、ガラスカバースリップを80°Cで30分間洗浄し、活性化します。カバースリップを光から保護しながら、室温で1時間の1%(v/v)APTESトルエン溶液に完全に浸します。
    3. トルエンと絶対エチルアルコールでカバースリップを洗浄し、窒素の流れでカバースリップを乾燥させます。
    4. 80°Cで15分間カバースリップをインキュベートし、室温まで冷却します。
    5. 2つの固定化カバースリップとインキュベートの間に、スルホ-SMCC(1mg/mL)の200 μL(1mg/mL)をジメチルスルホキシド(DMSO)溶液に加え、光から保護された1時間のインキュベートを行います。
    6. 最初にDMSOでカバースリップを洗い、次に絶対エチルアルコールで残留スルホ-SMCCを除去します。
    7. 窒素の流れの下でカバースリップを乾燥させます。
    8. 200 μM GL-ELP50nm-Cタンパク質溶液のピペット60 μLを機能化されたカバースリップに、約3時間インキュベートする。
    9. 超純水でカバースリップを洗浄し、未反応のGL-ELP50nm-Cを除去します。
      注:機能化されたカバースリップは4 °Cで貯蔵の下で約2週間可能である。
  2. 機能化カンチレバー表面調製
    1. クロム酸処理により、80°Cで10分間、カンチレバーを洗浄します。
    2. 1%(v/v)APTESトルエン溶液でアミノシラン化によってカンチレバーを機能化し、80°Cで15分間焼いてからスルホSMCCに結合します。
    3. C-ELP50nm-NGLを1.5時間のスルホ-SMCCのマレイミド基と表面にリンクします。
    4. 超純水により、カバースリップ上の未反応C-ELP50nm-NGLを洗い流します。
    5. 機能化されたカンチレバーを200μM GL-CBM-XDocタンパク質溶液200μMの200μLに浸し、20~30分間25°Cで200nM OaAEP1を含有します。次に、AFMバッファー(100 mMトリス、100 mM NaCl、pH 7.4)を使用して未反応タンパク質を洗い流します。
      注: 片持ち面とカバースリップの表面化学は似ています。

3. 制御された配列を用いて段階的にポリタンパク質を調製する

  1. このライゲーションユニット Coh-tev-L-POI-NGL を OaAEP1 によってカバースリップ面に固定化された GL-ELP50nmに 30 分間リンクします。
  2. AFMバッファー(100 mMトリス、100 mM NaCl、pH 7.4)を15~20 mL使用して、未反応のタンパク質を洗い流します。
  3. TEVプロテアーゼの100 μL(0.5 mM EDTA、75 mM NaCl、25 mMトリス-HCl 10%[v/v]グリセロール、pH 8.0)を加えて、TEV認識部位でタンパク質ユニットを25°Cで1時間切断します。
  4. 残りのタンパク質を洗い流すために15-20 mLのAFMバッファーを使用してください。
  5. OaAEP1によるライゲーションユニットCoh-tev-L-POI-NGLをOaAEP1によって30分間リンクします。
  6. ステップ3.3~3.5 N-1を繰り返して、ガラス表面にGL-(Ub)n-NGLを構築します。最後のTEV切断反応を省略して、タンパク質ポリマーの凝集をCoh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glassとして予備します。

4. AFM実験の測定とデータ解析

  1. AFM測定
    1. 10 mM CaCl2および 5 mM アスコルビン酸でチャンバーに AFM バッファーの 1 mL を追加します。
    2. 実験用の機能化されたAFMプローブのD先端を選択します。等分定理を使用して、各実験の前に正確なばね定数(k)値を持つAFMバッファーのカンチレバーを較正します。
    3. 片持ちチップをサンプル表面に取り付けて、まとまり/ドッカーニンのペアを形成します。
    4. 片持ち面を表面から400 nm·s-1の一定速度で引き込みます。その間、4000 Hzのサンプルレートで力延長曲線を記録します。
  2. データ分析
    1. JPK データ処理選択の強制拡張トレースを使用します。
    2. ソフトウェアを使用してトレースを分析します。ポリマー弾性のワーム様鎖(WLC)モデルで曲線を適合させ、個々のタンパク質展開ピークに対する展開力と輪郭長増分を得ます。
    3. 展開する力のヒストグラムをガウス モデルに合わせて、展開フォースの最も可能性の高い値 (u>) と輪郭長インクリメント (<ΔLc>) を取得します。

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Representative Results

OaAEP1ライゲーションによって隣接するタンパク質間に導入されたNGL残基は、展開力()としてポリマー中のタンパク質モノマー安定性に影響を及ぼさないし、輪郭長増分(<ΔLc>)は前の研究と同等である(図1)。このルブレドキシンタンパク質の精製結果を図2に示す。TEV切断後のタンパク質が、制御配列を有するタンパク質ポリマーを構築する以下のOaAEP1ライゲーションと適合していることを証明するために、図3は、SDS-PAGE画像を基準として提供する。機能化された片持ちおよびカバースリップ調製のステップは、図4に記載されています。カバースリップ上のポリタンパク質の段階的な酵素生合成と固定化を図5に示す。このプロトコルを使用すると、対照配列を有するタンパク質ポリマーを構築し、AFMベースのSMFS実験に適しています。

Figure 1
図1:OaAEP1によって構築されたポリタンパク質のAFMベースのSMFS測定。(A)Ubの典型的なソートゥース様の力延長曲線(曲線1は青)が、予想されるΔLc〜23nmで示された。(B)散布図は、Ub展開力(202±44pN、平均±s.d.、n=198)とΔLc(23±2nm、平均±s.d)との関係を示す。この図は Ref.8 から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: GL-GB1-Fe(III)-Rd-NGL および GL-GB1-(Zn)-Rd-NGL の UV-Vis 吸光度スペクトル。Fe(III)フォームRd(左スペクトル、茶色、PDBコード:1BRF)は、Znフォームがなかったのに対し、495 nmおよび579nmで典型的なUV-Vis吸収ピークを提示した(右スペクトル、ワインで着色、PDBコード:1IRN)。この図は Ref.8 から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:TEVプロテアーゼとOaAEP1を用いた段階的消化およびライゲーションのSDS-PAGEゲルの結果を、Ubダイマーを構築した。レーン1~4は、TEV切断、純sfGFP-TEVプロテアーゼおよび精製産物(GL-Ub)のタンパク質混合物であるCoh-tev-L-Ubを示した。レーン5~7は、(レーン5)または(レーン6)を含まない(レーン6)OaAEP1と純粋なOaAEP1との切断されたGL-UbおよびCoh-tev-L-Ub-NGLライゲーション混合物を示した。この図は Ref.8 から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:ガラスのカバースリップと片持ちを機能化するための各ステップを説明するプロセスチャート。クロム酸による洗浄と活性化の後、カバースリップとカンチレバーは、C-ELP50nm -NGLカップルがカンチレバーと一緒にカバースリップを有するGL-ELP-Cカップルを除いて、同様の官能化プロセスを共有する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:表面上のポリタンパク質固定化の各ステップを説明するプロセスチャート。左上のプロセスフロー図は、カバースリップ上の制御された配列を持つポリタンパク質の段階的な構築を示す。右上図は、AFM測定に用いられる機能化された片持ちの調製を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:AFMベースのSMFSによる合理的に対照された配列を有するタンパク質ポリマーの典型的な展開トレース。(A) Ub の典型的なソートゥース様の力延長曲線は、予想通り〜23 nmのΔLcを提示した。(B) Rdの典型的な力延長曲線は、予想通り〜13nmのΔLcを提示した。(C)青色のピークがUbの展開事象を意味し、赤色がRdを意味する(Ub-Rd)nタンパク質混合物の典型的な力伸張曲線。この図は Ref.8 から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
補足図1:SDS-PAGEゲルは、2つの反応物間の異なる比率下でのタンパク質ライゲーション効率の結果である。ライゲーション効率は、比率が1対1の場合は20%であり、10対1の比率で75%に達した。この図は Ref.8 から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

我々は、ポリタンパク質の酵素性生合成および固定化のためのプロトコルを説明し、AFMベースのSMFSによるポリタンパク質設計を検証した。この方法論は、ポリタンパク質工学と固定化4、6、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61のための以前の方法を補完する、設計された配列でタンパク質ポリマーを構築するための新しいアプローチ提供します。

ポリタンパク質構造7,62の従来の組換えDNA方法論と比較して、小さなタンパク質モノマー間のライゲーションに関する方法ベース。これにより、ポリタンパク質構造のための大型または毒性タンパク質分子の発現が可能となる。さらに、コンジュゲーション前にタンパク質モノマーを精製することができます。

タンパク質重合のための分子間ジスルフィド結合を形成する広く使用されているバイシステイン法と比較して、OaAEP1とTEVプロテアーゼの両方を用いた酵素法は、比較的対照的な配列と定義された接続形状を有するポリタンパク質をもたらす。また、多くのタンパク質に必須の機能性残留物であるシステインを使用しません。

我々の方法は、ソーターゼベースのタンパク質コンジュゲーション59にほとんど似ています。この方法のユニークな特徴は、OaAEP1ベースのタンパク質ライゲーションがはるかに効率的であり、したがって、合理的な収率10、53を有するタンパク質ペンタマーの構築を可能にする。また、ライゲーションに必要な残基が少なく、より短い3残基のNGLリンカーを生み出します。その結果、新たに形成されたNGLリンカーが個々のタンパク質モノマーの安定性に影響を及ぼさないか、または任意の不自然なタンパク質相互作用を誘発しないので、「リンカー効果」を示さない。それにもかかわらず、我々はすべての方法が独自の長所と短所を持っていると信じています。例えば、従来の組換えDNA法は、タンパク質モノマー間の残留物を添加せず、ライゲーションに酵素を使用する必要はありません。バイシステイン法は、タンパク質重合に対して簡単で簡単です。したがって、それらは異なる実験要件の下で有用であり得る。

ポリタンパク質の段階的な構築のためには、未反応のタンパク質を完全に除去することが重要です。十分な量のAFMバッファーと、反応した表面を慎重に洗浄するのに十分な時間を取ります。さもなければ、残りのタンパク質またはプロテアーゼはさらなる合成反応に影響を与える。

OaAEP1ライゲーションの効率は、TEV切断効率がほぼ完了(96%)であるため、当社の方法に対する重要な限界です。ライゲーション効率を向上させるためには、GL-タンパク質とタンパク質-NGLの2つの反応物質の比率を上げることが重要です。我々の研究は、タンパク質-NGLがGL-タンパク質に対して10倍であるとき、効率が20%(比は1〜1)から75%に増加することを示している(補足図1)。自由な反応物は緩衝液で洗浄することによって離れて移動することができるように表面に固定された反応物を、消費することが重要です。さらに、N-またはC-末中が溶液に曝露されるかも、ライゲーションにとって重要な因子である。認識された部位を含むリンカーをそれぞれの端末に追加して端末を公開するオプションのアプローチです。

結局のところ、私たちのプロトコルは、設計された配列でタンパク質を結合する酵素的な方法です。また、単一分子研究でタンパク質サンプルを結合し固定化するための代替アプローチも提供します。

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Disclosures

著者たちは開示するものは何もない。

Acknowledgments

この研究は、中国自然科学財団(グラントNo.21771103、21977047)、江蘇省自然科学財団(グラントNo.)BK20160639)と江蘇省双荘プログラム。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

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References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276, (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8, (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1, (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9, (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41, (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10, (1), 2775 (2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10, (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139, (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8, (1), 1881 (2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13, (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137, (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1, (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989 (2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58, (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355, (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11, (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12, (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264, (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197, (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19, (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55, (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58, (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9, (1), 185 (2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11, (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3, (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135, (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58, (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39, (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894 (2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. iJ., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134, (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139, (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9, (1), 10518 (2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569 (2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52, (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. Biochemistry. 30, (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57, (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29, (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O'Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49, (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27, (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5, (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2, (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47, (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116, (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28, (17), 174003 (2017).

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