OaAEP1-medierad enzymatisk syntes och immobilisering av polymeriserat protein för enmolekylkraftsspektroskopi

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att konjugera proteinmonomer av enzymer som bildar proteinpolymer med en kontrollerad sekvens och immobilisera den på ytan för enmolekylkraft spektroskopi studier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kemiska och biokonjugationstekniker har utvecklats snabbt under de senaste åren och möjliggöra byggande av proteinpolymerer. En kontrollerad proteinpolymeriseringsprocess är dock alltid en utmaning. Här har vi utvecklat en enzymatisk metod för att konstruera polymererat protein steg för steg i en rationellt kontrollerad sekvens. I denna metod är C-ändstationen för en proteinmonomer NGL för proteinkonjugering med OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginylendopeptidaser) 1) medan N-ändstationen var en cleavable TEV (tobak etsvirus) klyvning webbplats plus en L (ENLYFQ/GL) för tillfällig N-terminal skydd. Därför kunde OaAEP1 lägga till endast en proteinmonomer i taget, och sedan TEV proteask klynade N-ändstationen mellan Q och G för att exponera NH2-Gly-Leu. Då är enheten klar för nästa OaAEP1 ligering. Det konstruerade polyproteinet undersöks genom att utveckla enskilda proteindomän med hjälp av atomkraftmikroskopibaserad enmolekylkraftspektroskopi (AFM-SMFS). Därför ger denna studie en användbar strategi för polyprotein teknik och immobilisering.

Introduction

Jämfört med syntetiska polymerer har naturliga multidomänproteiner en enhetlig struktur med ett välkontrollerat antal och typ av underdomäner1. Denna funktion leder vanligtvis till förbättrad biologisk funktion och stabilitet2,3. Många metoder, såsom cysteinbaserad disulfidbindningskoppling och rekombinant DNA-teknik, har utvecklats för att bygga ett sådant polymeriserat protein med flera domäner4,5,6,7. Emellertid resulterar den tidigare metoden alltid i en slumpmässig och okontrollerad sekvens, och den senare leder till andra problem, inklusive svårigheten för överuttryck av giftiga och stora proteiner och rening av komplext protein med kofaktor och andra känsliga enzymer.

För att möta denna utmaning utvecklar vi en enzymatisk metod som konjugerar proteinmonomer tillsammans för polymer/polyprotein på ett stegvis sätt med hjälp av en proteinligase OaAEP1 i kombination med en proteas TEV8,9. OaAEP1 är en strikt och effektiv endopeptidas. Två proteiner kan kopplas samman kovalent som Asn-Gly-Leu-sekvens (NGL) genom två termini av OaAEP1 på mindre än 30 min om N-ändstationen är Gly-Leu-resterna(GL) och den andra som C-ändstationen är NGL-rester10. Emellertid leder användningen av OaAEP1 endast för att länka proteinmonomer till en proteinpolymer med en okontrollerad sekvens som cysteinbaserad kopplingsmetod. Därför designar vi N-ändstationen för proteinenheten med en löstagbar TEV-proteasplats plus en lucinrester som ENLYFQ/G-L-POI. Innan TEV klyvning, N-terminalen skulle inte delta i OaAEP1 ligering. Och sedan GL rester vid N-ändstation, som är förenliga med ytterligare OaAEP1 ligering, utsätts efter TEV klyvning. Således har vi uppnått en sekventiell enzymatisk biosyntesmetod av polyprotein med en relativt välkontrollerad sekvens.

Här kan vår stegvisa enzymatiska syntesmetod användas i polyproteinprovberedning, inklusive sekvensstyrd och okontrollerad, och proteinimmobilisering för enmolekylsstudier också, särskilt för det komplexa systemet som metalloprotein.

Dessutom tillåter AFM-baserade SMFS-experiment oss att bekräfta proteinpolymerkonstruktion och stabilitet på enmolekylsnivå. Enmolekylkraftspektroskopi, inklusive AFM, optisktweezer och magnetisktweezer, är ett allmänt verktyg inom nanoteknik för att manipulera biomolekylen mekaniskt och mäta deras stabilitet11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. AFM med en molekyl har använts i stor utsträckning vid studiet av protein (un)vikning21,22,23,24,25, styrkemätning av receptor-ligand interaktion26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, oorganisk kemisk bindning20,36,37,38,39,40,41,42,43 och metall-ligan och bindning i metalloprotein44,45,46,47,48,49,50 . Här används enmolekylsAFM för att verifiera den syntetiserade polyproteinsekvensen baserat på motsvarande proteinpågående signal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Proteinproduktion

  1. Genklon
    1. Köp gener kodning för protein av intresse (POI): Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, cellulosa-bindande modul (CBM), dockerin-X domän (XDoc) och sammanhållning från Ruminococcus flavefacience, tobak etsvirus (TEV) proteas, elastin-liknande polypeptider (ELPs).
    2. Utför polymeraskedjereaktion och använd tre-begränsning matsmältningsenzym system BamHI-BglII-KpnI för att kombinera genen från olika proteinfragment.
    3. Bekräfta alla gener genom direkt DNA-sekvensering.
  2. Proteinuttryck och produktion
    1. Förvandla E. coli BL21(DE3) med pQE80L-POI eller pET28a-POI plasmid för uttryck.
    2. Välj en enda koloni i 15 ml LB medium med respektive antibiotika (t.ex. 100 μg/ml ampicillin natriumsalt eller 50 μg/ml, kanamycin). Fortsätt skaka kulturerna vid 200 varv/min vid 37 °C i 16-20 h.
    3. Späd över natten kulturer i 800 ml LB medium (1:50 utspädning). För rubredoxin, centrifuge kulturen på 1.800 x g, sedan omavbryta i 15 ml M9 medium (kompletterad med 0,4% glukos, 0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4), och sedan späd den i 800 mL M9 medium.
    4. Inkubera kulturen vid 37 °C medan du skakar vid 200 varv/min, tills kulturen når en optisk densitet vid 600 nm (OD600) 0,6. Spara 100 μL prov av kulturen som förinduktionskontroll för att testa proteinuttryck.
    5. Inducera proteinuttryck genom att tillsätta IPTG till en slutlig koncentration av 1 mM och skaka kulturen vid 37 °C i 4 timmar vid 200 varv/min. Reservera ett 100 μL-prov av kulturen som postinduktionskontroll för testning av proteinuttryck.
    6. Centrifuge kulturen vid 13.000 x g i 25 min vid 4 °C och förvara satt vid -80 °C före rening.
      Protokollet kan pausas här.
  3. Rening av protein av intresse
    1. Omdu återsuspendera cellerna i 25 ml lysbuffert (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 som innehåller DNase, RNase, PMSF) och använd en ultraljudsbehandling (15% amplitud) för att lysa den i 30 min på is.
    2. Förtydliga celllysen vid 19 000 x g i 40 min vid 4 °C.
    3. Förpackning 1 ml (bäddvolym) av Co-NTA- eller Ni-NTA-affinitetskolonnen och tvätta kolonnen med 10 kolonnvolymer (CV) ultraren vatten och sedan 10 CV-apparater med tvättbuffert (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazol, pH 7.4) efter gravitationsflöde.
    4. Passera proteinet supernatant genom kolonnen genom gravitationsflöde i tre gånger.
    5. Häll tvättbuffert på kolonnen med 50 CV:n för att flytta bort föroreningar proteiner.
    6. Elute det bundna proteinet med 3 CV:n iskall elutionbuffert (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 7.4). När det gäller rubredoxinproteiner är ytterligare anjonutbytesrening med anjonutbyteskolonn vid pH 8,5 vid 4 °C nödvändigt.
    7. Analysera exemplet med SDS-PAGE.

2. Funktionalisering av täckglas och cantilever yta

  1. Funktionaliserad täckglasytberedning
    1. Lös 20 g kaliumkromat i 40 ml ultrarent vatten. Tillsätt långsamt 360 ml koncentrerad svavelsyra till kaliumkromatlösningen med glasstångrör försiktigt och för att förbereda kromsyran.
      FÖRSIKTIGHET: Kemikalien som används här och den slutliga kromsyran är starkt frätande och sur. Arbeta med rätt skyddsutrustning. Lösningen frigör värme när den koncentrerade svavelsyran tillsätts, vilket innebär långsam tillsats och korrekt paus för kylning.
    2. Rengör och aktivera ett glastäcken vid 80 °C i 30 min genom kromsyrabehandling. Sänk ned täckslipsen helt i 1% (v/v) APTES toluenlösning i 1 tim vid rumstemperatur samtidigt som de skyddas från ljus.
    3. Tvätta täckglas med toluen och absolut etylalkohol och torka täckslipen med en ström av kväve.
    4. Inkubera täckslipen vid 80 °C i 15 min och kyl sedan ner till rumstemperatur.
    5. Tillsätt 200 μL sulfo-SMCC (1 mg/ml) i dimetylsulfoxidlösning (DMSO) mellan två immobiliserade täckbeskedar och inkubera i 1 h skyddade mot ljus.
    6. Tvätta täckslipen med DMSO först och sedan med absolut etylalkohol för att ta bort restsulfo-SMCC.
    7. Torka täckglasen under en ström av kväve.
    8. Rör 60 μL på 200 μM GL-ELP50nm-Cproteinlösning på ett funktionerat täckglas och inkubera i ca 3 timmar.
    9. Tvätta täckglas med ultrarent vatten för att ta bort den oreagerade GL-ELP50nm-C.
      ANM.: Funktionella täckbelägg kan i cirka två veckor under lagring vid 4 °C.
  2. Funktionaliserad cantilever ytberedning
    1. Rengör cantilevers vid 80 °C i 10 min genom kromsyrabehandling.
    2. Funktionellisera cantilever genom aminosilanisering med 1% (v/v) APTES toluenlösning och grädda sedan cantilever vid 80 °C i 15 min innan konjudra till sulfo-SMCC.
    3. Länka C-ELP50nm-NGL till ytan med maleimidgruppen sulfo-SMCC i 1,5 timmar.
    4. Tvätta bort den oreagerade C-ELP50nm-NGL på täckglas med ultrarent vatten.
    5. Doppa en funktionaliserad cantilever i 200 μl 50 μM GL-CBM-XDoc proteinlösning som innehåller 200 nM OaAEP1 vid 25 °C i 20-30 min. Använd sedan AFM buffert (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) för att tvätta bort oreagerat protein.
      OBS: Ytan kemi cantilevers och täckslip är liknande.

3. Stegvis polyproteinberedning med kontrollerade sekvenser

  1. Länka ligationsenheten Coh-tev-L-POI-NGL till GL-ELP50nm immobiliserad på täckglasytan av OaAEP1 i 30 min.
  2. Använd 15-20 ml AFM-buffert (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) för att tvätta bort eventuella oreagerade proteiner.
  3. Tillsätt 100 μL TEV proteas (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] glycerol, pH 8.0) för att klyva proteinenheten vid TEV-igenkänningsplatsen i 1 h vid 25 °C.
  4. Använd 15-20 ml AFM buffert för att tvätta bort restproteiner.
  5. Länka ligeringsenheten Coh-tev-L-POI-NGL till GL-Ub-NGL-Glass från OaAEP1 i 30 min.
  6. Upprepa steg 3,3 till 3,5 N-1 gånger för att bygga proteinkonstruktion GL-(Ub)n-NGL på glasytan. Utelämna den sista TEV klyvning reaktion att reservera cohesin på protein-polymer som Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glas.

4. AFM Experiment mätning och dataanalys

  1. AFM-mätningar
    1. Tillsätt 1 ml AFM buffert till kammaren med 10 mM CaCl2 och 5 mM askorbinsyra.
    2. Välj D-spetsen för den funktionaliserade AFM-avsökning för experimentet. Använd equipartitionssatsen för att kalibrera cantilevern i AFM-buffert med ett exakt fjäderkonstantvärde(k)före varje experiment.
    3. Fäst cantileverspetsen på provytan så att den bildar cohesin/dockerin-paret.
    4. Dra tillbaka cantilevern med en konstant hastighet på 400 nm·s−1 från ytan. Under tiden registrerar du kraftförlängningskurvan med en samplingsfrekvens på 4000 Hz.
  2. Dataanalys
    1. Använd JPK databehandling välj force-extension spår.
    2. Använd programvara för att analysera spåren. Montera kurvorna med mask-liknande-kedjan (WLC) modell av polymer elasticitet och få pågående kraft och konturlängd ökning för enskilda protein utvecklas topp.
    3. Montera histogrammet av utfällbara krafter med gaussiska modellen för att få de mest sannolika värdena av pågående kraft (u>) och konturlängdsökning (<ΔLc>).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De NGL-rester som införs mellan angränsande proteiner genom OaAEP1 ligering påverkar inte proteinmonomerstabiliteten i polymeren som den pågående kraften (u>) och konturlängdsökningen (<ΔLc>) är jämförbar med den tidigare studien(figur 1). Reningsresultatet av rubredoxinproteinet visas i figur 2. För att bevisa proteinet efter TEV klyvning är kompatibel med följande OaAEP1 ligering att konstruera proteinpolymer med en kontrollsekvens och konstruktionen är högeffektiv, ger figur 3 en SDS-PAGE bild som referens. Stegen i den funktionaliserade cantilevern och täckglasberedningen beskrivs i figur 4. Den stegvisa enzymatiska biosyntesen och immobiliseringen av polyprotein på täckglas visas i figur 5. Använd detta protokoll kan en proteinpolymer med den kontrollerade sekvensen byggas och lämplig för AFM-baserade SMFS-experiment.

Figure 1
Figur 1: AFM-baserade SMFS-mätningar av polyprotein som byggts av OaAEP1. (A) Typiska sågtandliknande kraftförlängningskurvor av Ub (kurva 1 i blått) visades med förväntad ΔLc på ~23 nm. (BSpridningsområdet presenterar förhållandet mellan Ub utfällkraft (202 ± 44 pN, genomsnitt ± s.d., n = 198) och ΔLc (23 ± 2 nm, genomsnitt ± s.d.). Denna siffra har ändrats från Ref.8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: UV-Vis-absorbansspektra av GL-GB1-Fe(III)-Rd-NGL och GL-GB1-(Zn)-Rd-NGL. Fe(III)-formen Rd (Vänster spektrum, färgat i brunt, PDB-kod:1BRF) presenterade typiska UV-Vis absorptiontoppar på 495 nm och 579 nm medan Zn-formen inte (Höger spektrum, färgat i vin, PDB-kod: 1IRN). Denna siffra har ändrats från Ref.8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: SDS-PAGE gel resultat av stegvis matsmältning och ligering med TEV proteas och OaAEP1 för att bygga Ub dimer. Lanes 1–4 visade Coh-tev-L-Ub, resultatet proteinblandning av TEV-klyvning, ren sfGFP-TEV proteas och renad produkt (GL-Ub). Lanes 5–7 visade den klyvna GL-Ub och Coh-tev-L-Ub-NGL ligation blandning med (Lane 5) eller utan (Lane 6) OaAEP1 och ren OaAEP1. Denna siffra har ändrats från Ref.8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Processdiagram som beskriver varje steg för att göra glastäcken och cantilever. Efter rengöring och aktivering av kromsyra, täcksm och cantilever dela liknande funktionaliseringprocess, utom det sista steget där GL-ELP50nm-C par med täcksm medan C-ELP50nm-NGL par med cantilever. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Processdiagram som beskriver varje steg för polyproteinimmobilisering på ytan. Övre vänstra processflödesdiagram visar stegvis uppbyggnad av polyprotein med kontrollerade sekvenser på täckslipen. Övre högra diagrammet visar preparatet av den funktionaliserade cantilever som används i AFM-mätningarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Typiska pågående spår av proteinpolymererna med en rationellt kontrollerad sekvens av AFM-baserad SMFS. (A)Typiska sågtandliknande kraftförlängningskurvor av Ub presenterade ΔLc på ~23 nm som förväntat. (B) Typiska kraftförlängningskurvor för Rd presenterade ΔLc på ~13 nm som förväntat. (C) Typiska kraftförlängningskurvor för (Ub-Rd)n proteinblandning där den blå toppen innebär ubs pågående händelser medan den röda betyder Rd. Denna siffra har ändrats från Ref.8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Kompletterande figur 1: SDS-PAGE gel resultat av proteinligering effektivitet under olika förhållanden mellan två reaktanter. Ligeringseffektiviteten var 20% när förhållandet är 1 till 1 och nådde 75% i förhållande till 10 till 1. Denna siffra har ändrats från Ref.8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrivit ett protokoll för enzymatisk biosyntes och immobilisering av polyprotein och verifierat polyproteindesign av AFM-baserade SMFS. Denna metod ger en ny metod för att bygga protein-polymer i en utformad sekvens, som kompletterar tidigare metoder för polyprotein teknik och immobilisering4,6,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61.

Jämfört med den klassiska rekombinant DNA-metoden för polyproteinkonstruktion7,62,baserar vår metod på ligeringen mellan små proteinmonomerer. Således tillåter det uttryck för stora eller giftiga proteinmolekyler för polyproteinkonstruktion. Dessutom tillåter det rening av proteinmonomeren före konjugering.

Jämfört med den allmänt använda bicysteinmetoden som bildar intermolekylär disulfidbindning för proteinpolymerisering4resulterar vår enzymatiska metod med både OaAEP1 och TEV-proteas i ett polyprotein med en relativt kontrollerad sekvens och definierad anslutningsgeometri. Och det använder inte cystein, vilket är en viktig funktionell rester för många proteiner.

Vår metod liknar oftast sortasbaserad proteinkonjugering59. Det unika inslaget i vår metod är att OaAEP1-baserade proteinligering är mycket effektivare, vilket gör det möjligt att bygga protein pentamer med en rimlig avkastning10,53. Det behöver också färre rester för ligering och resulterar i en kortare tre-rester NGL linker. Som ett resultat visar det ingen "linker effekt" eftersom den nybildade NGL-länkaren inte påverkar stabiliteten hos enskilda proteinmonomer eller inducerar någon onaturlig proteinproteininteraktion. Vi anser dock att alla metoder har sina egna fördelar och nackdelar. Till exempel, den klassiska rekombinant DNA-metoden inte lägga till några rester mellan proteinmonomer och inte kräver användning av något enzym för ligering. Och bicystein metoden är enkel och lätt för proteinpolymerisering. Således kan de alla vara användbara under olika experimentella krav.

För vår stegvis konstruktion av polyprotein är det viktigt att ta bort det oreagerade proteinet helt. Ta tillräckligt med volym av AFM buffert och tillräckligt med tid att rengöra den reagerade ytan noggrant. Annars kommer restproteinet eller proteaset att påverka ytterligare syntesreaktioner.

Effektiviteten i OaAEP1 ligering är en kritisk gräns för vår metod som TEV klyvning effektivitet är nästan klar (96%). Det är viktigt att höja förhållandet mellan de två reaktanter, GL-protein, och protein-NGL, för att förbättra ligering effektivitet. Vår studie visar att när protein-NGL är tiofaldigt till GL-protein ökar effektiviteten från 20% (förhållandet är 1 till 1) till 75%(tilläggsfigur 1). Det är viktigt att konsumera reaktanten, som var immobiliserad på ytan som den fria reaktanten kan flyttas bort genom att tvätta med buffert. Dessutom, om N- eller C- ändstationen utsätts för lösningen är också en avgörande faktor för ligering. Det är en valfri metod för att exponera terminalen genom att lägga till en länkare som innehåller den erkända platsen till respektive terminal.

I slutändan är vårt protokoll ett enzymatisksätt att konjugera proteiner i en utformad sekvens. Det ger också ett alternativt tillvägagångssätt för par och immobilisera proteinprover i enmolekyl studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (Grant No. BK20160639) och Shuangchuang Program i Jiangsu-provinsen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276, (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8, (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1, (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9, (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41, (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10, (1), 2775 (2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10, (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139, (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8, (1), 1881 (2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13, (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137, (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1, (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989 (2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58, (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355, (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11, (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12, (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264, (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197, (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19, (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55, (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58, (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9, (1), 185 (2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11, (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3, (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135, (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58, (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39, (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894 (2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. iJ., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134, (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139, (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9, (1), 10518 (2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569 (2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52, (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. Biochemistry. 30, (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57, (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29, (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O'Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49, (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27, (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5, (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2, (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47, (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116, (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28, (17), 174003 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics