OaAEP1-Medieret enzymatisk syntese og immobilisering af polymeriseret protein til enkeltmolekylet spektroskopi

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her præsenterer vi en protokol til konjugere proteinmonomer af enzymer, der danner proteinpolymer med en kontrolleret sekvens og immobiliserer den på overfladen til enkeltmolekylets gennemspektroskopiundersøgelser.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kemiske og bio-bøjning teknikker er blevet udviklet hurtigt i de seneste år og tillader opførelse af protein polymerer. Men en kontrolleret protein polymerisering proces er altid en udfordring. Her har vi udviklet en enzymatisk metode til konstruktion af polymeriseret protein trin for trin i en rationelt kontrolleret sekvens. I denne metode er C-terminus af et proteinmonomer NGL for proteinbøjning ved hjælp af OaAEP1(Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases)1), mens N-terminus var en cleavable TEV (tobak etch virus) spaltning site plus en L (ENLYFQ / GL) for midlertidig N-terminal beskyttelse. Derfor var OaAEP1 i stand til kun at tilføje ét proteinmonomer ad gangen, og derefter kløvede TEV N-endeinusmellem Q og G for at afsløre NH 2-Gly-Leu. Derefter er enheden klar til næste OaAEP1 ligation. Det manipulerede polyprotein undersøges ved at udfolde individuelle proteindomæne ved hjælp af atomkraftmikroskopibaseret single-molecule force spektroskopi (AFM-SMFS). Derfor, denne undersøgelse giver en nyttig strategi for polyprotein engineering og immobilisering.

Introduction

Sammenlignet med syntetiske polymerer har naturlige multidomæneproteiner en ensartet struktur med et velkontrolleret antal og typen af underdomæner1. Denne funktion fører normalt til forbedret biologisk funktion og stabilitet2,3. Mange tilgange, såsom cystein-baserede disulfid binding kobling og rekombinant DNA-teknologi, er blevet udviklet til at opbygge en sådan polymeriseret protein med flere domæner4,5,6,7. Men den tidligere metode resulterer altid i en tilfældig og ukontrolleret sekvens, og sidstnævnte fører til andre problemer, herunder vanskeligheden for overekspression af giftige og store proteiner og rensning af komplekst protein med cofaktor og andre sarte enzymer.

For at imødekomme denne udfordring udvikler vi en enzymatisk metode, der sammenlægger proteinmonomer sammen for polymer/polyprotein på en trinvis måde ved hjælp af en proteinligase OaAEP1 kombineret med en protease TEV8,9. OaAEP1 er en streng og effektiv endopeptidase. To proteiner kan forbindes kovalent som Asn-Gly-Leu sekvens (NGL) gennem to termini af OaAEP1 på mindre end 30min. Men brugen af OaAEP1 kun at forbinde protein monomer fører til et protein polymer med en ukontrolleret sekvens som cystein-baserede kobling metode. Derfor designer vi N-endepunktet af proteinenheden med et aftageligt TEV protease-sted plus en leucinrester som ENLYFQ/G-L-POI. Før TEV-kavalergangen ville N-terminalen ikke deltage i OaAEP1 ligation. Og så eksponeres GL-resterne ved N-endeinus, som er forenelige med yderligere OaAEP1 ligation, efter TEV-kavalergangen. Således har vi opnået en sekventiel enzymatisk biosyntese metode til polyprotein med en relativt velkontrolleret sekvens.

Her kan vores trinvise enzymatiske syntesemetode anvendes i polyproteinprøvepræparat, herunder sekvenskontrolleret og ukontrolleret, og proteinimmobilisering til enkeltmolekyleundersøgelser, især til det komplekse system som f.eks. metalloprotein.

Desuden giver AFM-baserede SMFS-eksperimenter os mulighed for at bekræfte proteinpolymerkonstruktionen og stabiliteten på enkeltmolekyleniveau. Single-molekyle kraft spektroskopi, herunder AFM, optisk pincet og magnetisk pincet, er et generelt redskab i nanoteknologi til at manipulere biomolekyle mekanisk og måle deres stabilitet11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Single-molecule AFM har været meget udbredt i studiet af protein (un)foldning21,22,23,24,25, styrken måling af receptor-ligand interaktion26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,34, 35, uorganisk kemisk binding20,36,37,38,39,40,41,42,43 og metal-ligand binding i metalloprotein44,45,46,47,48,49,50 . Her anvendes single-molecule AFM til at verificere den syntetiserede polyproteinsekvens baseret på det tilsvarende proteinudfoldersignal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Proteinproduktion

  1. Genkloning
    1. Køb gener kodning for protein af interesse (POI): Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, cellulose-bindende modul (CBM), dockerin-X domæne (XDoc) og samhørighed fra Ruminococcus flavefacience, tobak etch virus (TEV) protease, elastin-lignende polypeptider (ELP' er).
    2. Udfør polymerase kædereaktion og bruge tre-begrænsning fordøjelseenzym system BamHI-BglII-KpnI for rekombinere genet fra forskellige proteinfragmenter.
    3. Bekræft alle gener ved direkte DNA-sekvensering.
  2. Proteiner udtryk og produktion
    1. Transformer E. coli BL21(DE3) med pQE80L-POI eller pET28a-POI plasmid for udtryk.
    2. Vælg en enkelt koloni i 15 ml LB-medium med respektive antibiotika (f.eks. 100 μg/ml ampicillin natriumsalt eller 50 μg/ml, kanamycin). Hold ryste kulturerne på 200 rpm ved 37 °C for 16-20 h.
    3. Fortynd nattenkulturer til 800 ml LB-medium (1:50 fortynding). For rubredoxin centrifugeres kulturen ved 1.800 x gog derefter suspenderes i 15 ml M9-medium (suppleret med 0,4% glukose, 0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4), og derefter fortyndes den til 800 ml M9 medium.
    4. Inkuberkulturen ved 37 °C, mens den rystes ved 200 omdrejninger i minuttet, indtil kulturen når en optisk tæthed ved 600 nm (OD600)på 0,6. Gem 100 μL prøve af kulturen som forinduktionskontrol til test af proteinekspression.
    5. Inducere proteinudtryk ved at tilføje IPTG til en endelig koncentration på 1 mM og ryst kulturen ved 37 °C i 4 timer ved 200 omdrejninger i minuttet. Reserver en 100 μL prøve af kulturen som post-induktionskontrol til test af proteinekspression.
    6. Kulturen centrifugeres ved 13.000 x g i 25 min ved 4 °C og opbevares ved -80 °C før rensning.
      BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
  3. Rensning af protein af interesse
    1. Opslæm cellerne i 25 ml lysisbuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 indeholdende DNase, RNase, PMSF) og brug en sonikeator (15% amplitude) til at lyse det i 30 min på is.
    2. Afklare cellen lysat ved 19.000 x g i 40 min ved 4 °C.
    3. Pakke 1 ml (sengevolumen) af Co-NTA eller Ni-NTA affinitet kolonne og vaske kolonnen med 10 kolonne mængder (CV) af ultrarent vand og derefter 10 CV'er af vask buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazol, pH 7,4) ved tyngdekraftflow.
    4. Passere proteinet supernatant gennem kolonnen ved tyngdekraftflow i tre gange.
    5. Hæld vaske buffer på kolonnen med 50 CV'er til at flytte væk forurenende proteiner.
    6. Elute det bundne protein med 3 CV'er af iskold elueringsbuffer (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 7.4). Når det kommer til rubredoxin proteiner, yderligere anion udveksling rensning ved hjælp af anion udveksling kolonne på pH 8,5 ved 4 °C er nødvendig.
    7. Analysér eksemplet efter SDS-PAGE.

2. Funktionalisering af dæksel og cantilever overflade

  1. Funktionaliseret overfladeforberedelse af dæksel
    1. 20 g kaliumkromat opløses i 40 ml ultrarent vand. Tilsæt langsomt 360 ml koncentreret svovlsyre til kaliumkromatopløsningen med glasstangen rør forsigtigt og til at forberede kromatisk syre.
      FORSIGTIG: Det kemikalie, der anvendes her, og den endelige kromsyre er stærkt ætsende og sure. Arbejd med ordentligt beskyttelsesudstyr. Opløsningen frigiver varme, når der tilsættes koncentreret svovlsyre, hvilket betyder langsom tilsætning og korrekt pause til nedkøling.
    2. Rengør og aktiver en glasdæksel ved 80 °C i 30 min. ved behandling af kromsyre. Helt nedsænke tender dæksedlerne i 1% (v/v) APTES toluenopløsning i 1 time ved stuetemperatur, samtidig med at de beskyttes mod lys.
    3. Dækselsslipvaskes med toluen og absolut ethylalkohol, og dækselsslipet tørres af med en strøm af kvælstof.
    4. Inkuber dæksel ved 80 °C i 15 minutter, og afkøles derefter til stuetemperatur.
    5. Der tilsættes 200 μL sulfo-SMCC (1 mg/ml) i dimethylsulfoxidopløsning (DMSO) mellem to immobiliserede dæksedler og inkubator i 1 time, der er beskyttet mod lys.
    6. Vask dækselmed DMSO først og derefter med absolut ethyl alkohol for at fjerne resterende sulfo-SMCC.
    7. Tør dæksel under en strøm af kvælstof.
    8. Pipet 60 μL 200 μM GL-ELP50nm-C proteinopløsning på en funktionaliseret dæksel og inkubator i ca. 3 timer.
    9. Dækselsslipvaskes med ultrarent vand for at fjerne den ureagerede GL-ELP50nm-C.
      BEMÆRK: Funktionsbetonede dæksedler kan opbevares i ca. to uger ved 4 °C.
  2. Funktionelt cantilever overfladeforberedelse
    1. Rengør kantilevers ved 80 °C i 10 min ved kromsyrebehandling.
    2. Funktionær er cantilever ved amino-silanisation med 1% (v / v) APTES toluen opløsning og derefter bage cantilever ved 80 °C i 15 min før konjugering til sulfo-SMCC.
    3. Knyt C-ELP50nm-NGL til overfladen med maleimide gruppen af sulfo-SMCC for 1,5 timer.
    4. Vask væk den ureagerede C-ELP50nm-NGL på dæksslip med ultrarent vand.
    5. Nedsænk en funktionel tcantilmåde i 200 μL 50 μM GL-CBM-XDoc proteinopløsning indeholdende 200 nM OaAEP1 ved 25 °C i 20-30 min. Brug derefter AFM buffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) til at vaske ureagerede protein væk.
      BEMÆRK: Overfladen skemi af cantilevers og dæksslip er ens.

3. Trinvis tig proteinpræparat med kontrollerede sekvenser

  1. Sammenkæd ligationenheden Coh-tev-L-POI-NGL med GL-ELP50nm immobiliseret på dækseloverfladen af OaAEP1 i 30 min.
  2. Brug 15-20 ml AFM buffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) til at vaske eventuelle ureagerede proteiner væk.
  3. Der tilsættes 100 μL TEV protease (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] glycerol, pH 8.0) for at kløve proteinenheden på TEV genkende stedet for 1 time ved 25 °C.
  4. Brug 15-20 ml AFM buffer til at vaske tilbage resterende proteiner.
  5. Knyt ligationenheden Coh-tev-L-POI-NGL til GL-Ub-NGL-Glass et OaAEP1 i 30 min.
  6. Gentag trin 3,3 til 3,5 N-1 gange for at bygge proteinkonstruktionGL-(Ub)n-NGL på glasoverfladen. Udeude den sidste TEV spaltning reaktion at reservere cohesin på protein-polymer som Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass.

4. AFM Eksperimentmåling og dataanalyse

  1. AFM-målinger
    1. Tilføj 1 ml AFM buffer til kammeret med 10 mM CaCl2 og 5 mM Ascorbic Acid.
    2. Vælg D-spidsen af den funktionaliserede AFM-sonde til eksperimentet. Brug equipartitionsætning orem'en til at kalibrere kantilever i AFM buffer med en nøjagtig fjederkonstant (k) værdi før hvert eksperiment.
    3. Fastgør kantileverspidsen på prøvefladen for at danne Cohesin/Dockerin-parret.
    4. Træk kantileverne tilbage med en konstant hastighed på 400 nm·s−1 fra overfladen. I mellemtiden skal kraftforlængelseskurven registreres med en prøvehastighed på 4000 Hz.
  2. Dataanalyse
    1. Brug JPK-databehandling vælg sporinger af kraftudvidelse.
    2. Brug software til at analysere sporene. Passer kurverne med den ormlignende kæde (WLC) model af polymer elasticitet og opnå udfoldelse kraft og kontur længde trin for individuelle protein udfolder peak.
    3. Sæt histogrammer af udfoldende kræfter med gaussiske model for at opnå de mest sandsynlige værdier af udfoldelse kraft (u>) og kontur længde tilvækst (<ΔLc>).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De NGL-restkoncentrationer, der indføres mellem tilstødende proteiner ved OaAEP1 ligation, vil ikke påvirke proteinmonomerstabiliteten i polymeren som udfoldelseskraft (u>), og konturlængdeforøgelsen (<ΔLc>) kan sammenlignes med den foregående undersøgelse (figur 1). Rensningsresultatet af rubredoxinproteinet er vist i figur 2. For at bevise, at proteinet efter TEV spaltning er kompatibelt med følgende OaAEP1 ligation til at konstruere proteinpolymer med en kontrolsekvens, og konstruktionen er højeffektiv, giver Figur 3 et SDS-PAGE-billede som reference. Trinene i den funktionaliserede kantilever og dæksel forberedelse er beskrevet i figur 4. Den trinvise enzymatiske biosyntese og immobilisering af polyprotein på dæksslip er vist i figur 5. Brug denne protokol, en protein polymer med den kontrollerede sekvens kan bygges og egnet til AFM-baserede SMFS eksperimenter.

Figure 1
Figur 1: AFM-baserede SMFS-målinger af polyprotein bygget af OaAEP1. (A) Typiske savtandlignende kraftforlængelseskurver af Ub (kurve 1 i blåt) blev vist med forventet ΔLc på ~23 nm. (B) Punktområdet viser forholdet mellem Ub-udfoldelseskraften (202 ± 44 pN, gennemsnit ± s.d., n = 198) og ΔLc (23 ± 2 nm, gennemsnitlig ± s.d.). Dette tal er blevet ændret fra ref.8. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: UV-Vis absorbansspektre for GL-GB1-Fe(III)-Rd-NGL og GL-GB1-(Zn)-Rd-NGL. Fe(III)-form Rd (Venstre spektrum, farvet i brun, FBF kode:1BRF) præsenterede typiske UV-Vis absorption toppe på 495 nm og 579 nm, mens Zn-form ikke (Højre spektrum, farvet i vin, FBF kode: 1IRN). Dette tal er blevet ændret fra ref.8. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: SDS-PAGE gel resultater af trinvis fordøjelse og ligation ved hjælp af TEV protease og OaAEP1 at bygge Ub dimer. Lanes 1-4 viste Coh-tev-L-Ub, resultatet protein blanding af TEV spaltning, ren sfGFP-TEV protease og renset produkt (GL-Ub). Lanes 5-7 viste den kløvede GL-Ub og Coh-tev-L-Ub-NGL ligation blanding med (Lane 5) eller uden (Lane 6) OaAEP1 og ren OaAEP1. Dette tal er blevet ændret fra ref.8. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Procesdiagram, der beskriver hvert trin til funktionalisering af glasdækslips og cantilever. Efter rengøring og aktivering af kromsyre, coverslip og cantilever aksjer lignende funktionalisering proces, undtagen det sidste trin, hvor GL-ELP50nm-Cpar med coverslip, mens C-ELP50nm-NGL par med cantilever. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Procesdiagram, der beskriver hvert trin for polyproteinimmobilisering på overfladen. Øverste venstre proces flow diagram viser den trinvise bygning af polyprotein med kontrollerede sekvenser på dæksslip. Øverste højre diagram viser forberedelsen af den funktionaliserede cantilever, der anvendes i AFM målinger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Typiske udfoldelse af spor af proteinpolymererne med en rationelt kontrolleret sekvens af AFM-baserede SMFS. (A) Typiske savtandlignende kraftforlængelseskurver af Ub præsenterede ΔLc på ~23 nm som forventet. (B) Typiske kraftforlængelseskurver for Rd præsenterede ΔLc på ~ 13 nm som forventet. (C)Typiske kraftforlængelseskurver af (Ub-Rd)n proteinblanding, hvor den blå top betyder ubs udfoldelse, mens den røde betyder Rd. Dette tal er blevet ændret fra ref.8. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Supplerende figur 1: SDS-PAGE gelresultater af proteinligationseffektiviteten under forskelligt forhold mellem to reaktanter. Ligationens effektivitet var 20%, når forholdet er 1 til 1 og nåede op på 75% ved forholdet mellem 10 og 1. Dette tal er blevet ændret fra ref.8. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet en protokol for enzymatisk biosyntese og immobilisering af polyprotein og verificeret polyprotein design af AFM-baserede SMFS. Denne metode giver en ny tilgang til opbygning af protein-polymer i en designet sekvens, som supplerer tidligere metoder til polyprotein engineering og immobilisering4,6,52,53,54,55,55,57,58,59,60,61.

Sammenlignet med den klassiske rekombinant DNA metode til polyprotein konstruktion7,62, vores metode baserer på ligation mellem små protein monommere. Således, det giver udtryk for store eller giftige proteinmolekyler til polyprotein konstruktion. Derudover tillader det rensning af proteinmonomerfør bøjning.

Sammenlignet med den udbredte tocysteinmetode, der danner intermolekylær disulfidbinding til proteinpolymerisering4, resulterer vores enzymatiske metode ved hjælp af både OaAEP1 og TEV protease i et polyprotein med en relativt kontrolleret sekvens og defineret forbindelsesgeometri. Og det bruger ikke cystein, som er en væsentlig funktionel rest for mange proteiner.

Vores metode er for det meste svarer til sortase-baserede protein bøjning59. Det unikke ved vores metode er, at OaAEP1-baserede protein ligation er langt mere effektiv, således at opførelsen af protein pentamer med et rimeligt udbytte10,53. Det har også brug for færre rester til ligation og resulterer i en kortere tre-restprodukter NGL linker. Som et resultat, det viser ingen "linker effekt", som den nydannede NGL linker påvirker ikke stabiliteten af individuelle proteinmonomer eller fremkalde nogen unaturlig protein-protein interaktion. Ikke desto mindre mener vi, at alle metoder har deres egne fordele og ulemper. For eksempel tilsætter den klassiske rekombinant DNA-metode ingen rester mellem proteinmonomer og kræver ikke brug af enzym til ligation. Og bi-cystein metode er enkel og nem for protein polymerisering. Således kan de alle være nyttige i henhold til forskellige eksperimentelle krav.

For vores trinvise konstruktion af polyprotein, er det afgørende at fjerne den ureagerede protein helt. Tag nok volumen af AFM buffer og tid nok til at rense den reagerede overflade omhyggeligt. Ellers vil restproteinet eller proteaseen påvirke yderligere syntesereaktioner.

Effektiviteten af OaAEP1 ligation er en kritisk grænse for vores metode, da TEV spaltning effektivitet er næsten komplet (96%). Det er afgørende at øge forholdet mellem de to reaktanter, GL-protein, og protein-NGL, at forbedre ligation effektivitet. Vores undersøgelse viser, at når protein-NGL er tigange til GL-protein, effektiviteten stiger fra 20% (forholdet er 1 til 1) til 75%(Supplerende figur 1). Det er afgørende at forbruge reaktanten, som blev immobiliseret på overfladen, da den frie reaktant kan flyttes væk ved vask med buffer. Derudover er det også en afgørende faktor for ligationen, om N- eller C-endeinusudsættes for løsningen. Det er en valgfri tilgang til at udsætte terminalen ved at tilføje en linker, der indeholder det anerkendte sted, til den respektive terminal.

I sidste ende er vores protokol en enzymatisk måde at konjugere proteiner i en designet sekvens. Det giver også en alternativ tilgang til par og immobilisere protein prøver i single-molekyle undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (Grant No. BK20160639) og Shuangchuang Program i Jiangsu-provinsen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276, (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Yang, Y. J., Holmberg, A. L., Olsen, B. D. Artificially Engineered Protein Polymers. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 8, (1), 549-575 (2017).
  3. Yang, J., et al. Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (36), 8509-8517 (2018).
  4. Dietz, H., et al. Cysteine engineering of polyproteins for single-molecule force spectroscopy. Nature Protocols. 1, (1), 80-84 (2006).
  5. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: A comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (7), 3694-3699 (1999).
  6. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of beta-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS Nano. 9, (9), 8811-8821 (2015).
  7. Hoffmann, T., Dougan, L. Single molecule force spectroscopy using polyproteins. Chemical Society Reviews. 41, (14), 4781-4796 (2012).
  8. Deng, Y., et al. Enzymatic biosynthesis and immobilization of polyprotein verified at the single-molecule level. Nature Communications. 10, (1), 2775 (2019).
  9. Yuan, G., et al. Single-Molecule Force Spectroscopy Reveals that Iron-Ligand Bonds Modulate Proteins in Different Modes. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10, (18), 5428-5433 (2019).
  10. Yang, R., et al. Engineering a Catalytically Efficient Recombinant Protein Ligase. Journal of the American Chemical Society. 139, (15), 5351-5358 (2017).
  11. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing Folding Energy Landscapes by Single-Molecule Force Spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43, 19-39 (2014).
  12. Sen Mojumdar, S., et al. Partially native intermediates mediate misfolding of SOD1 in single-molecule folding trajectories. Nature Communications. 8, (1), 1881 (2017).
  13. Singh, D., Ha, T. Understanding the Molecular Mechanisms of the CRISPR Toolbox Using Single Molecule Approaches. ACS Chemical Biology. 13, (3), 516-526 (2018).
  14. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  15. Suren, T., et al. Single-molecule force spectroscopy reveals folding steps associated with hormone binding and activation of the glucocorticoid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (46), 11688-11693 (2018).
  16. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, (16), 7873-7878 (2019).
  17. Chen, H., et al. Dynamics of Equilibrium Folding and Unfolding Transitions of Titin Immunoglobulin Domain under Constant Forces. Journal of the American Chemical Society. 137, (10), 3540-3546 (2015).
  18. Fu, L., Wang, H., Li, H. Harvesting Mechanical Work From Folding-Based Protein Engines: From Single-Molecule Mechanochemical Cycles to Macroscopic Devices. Chinese Chemical Society. 1, (1), 138-147 (2019).
  19. Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. Journal of Visualized Experiments. (144), e55989 (2019).
  20. Zhang, S., et al. Towards Unveiling the Exact Molecular Structure of Amorphous Red Phosphorus by Single-Molecule Studies. Angewandte Chemie International Edition. 58, (6), 1659-1663 (2019).
  21. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355, (6328), 945-950 (2017).
  22. Thoma, J., Sapra, K. T., Müller, D. J. Single-Molecule Force Spectroscopy of Transmembrane β-Barrel Proteins. Annual Review of Analytical Chemistry. 11, (1), 375-395 (2018).
  23. Chen, Y., Radford, S. E., Brockwell, D. J. Force-induced remodelling of proteins and their complexes. Current Opinion in Structural Biology. 30, 89-99 (2015).
  24. Takahashi, H., Rico, F., Chipot, C., Scheuring, S. alpha-Helix Unwinding as Force Buffer in Spectrins. ACS Nano. 12, (3), 2719-2727 (2018).
  25. Borgia, A., Williams, P. M., Clarke, J. Single-molecule studies of protein folding. Annu. Rev. Biochem. 77, 101-125 (2008).
  26. Florin, E., Moy, V., Gaub, H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264, (5157), 415-417 (1994).
  27. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (12), 690-697 (2012).
  28. Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. Single-molecule force spectroscopy on polyproteins and receptor-ligand complexes: The current toolbox. Journal of Structural Biology. 197, (1), 3-12 (2017).
  29. Stahl, S. W., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin-dockerin complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (50), 20431-20436 (2012).
  30. Oh, Y. J., et al. Ultra-Sensitive and Label-Free Probing of Binding Affinity Using Recognition Imaging. Nano Letters. 19, (1), 612-617 (2019).
  31. Vera Andrés, M., Carrion-Vazquez, M. Direct Identification of Protein-Protein Interactions by Single-Molecule Force Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55, (45), 13970-13973 (2016).
  32. Yu, H., Heenan, P. R., Edwards, D. T., Uyetake, L., Perkins, T. T. Quantifying the Initial Unfolding of Bacteriorhodopsin Reveals Retinal Stabilization. Angewandte Chemie International Edition. 58, (6), 1710-1713 (2019).
  33. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  34. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  35. Nadler, H., et al. Deciphering the Mechanical Properties of Type III Secretion System EspA Protein by Single Molecule Force Spectroscopy. Langmuir. (2018).
  36. Giganti, D., Yan, K., Badilla, C. L., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. Disulfide isomerization reactions in titin immunoglobulin domains enable a mode of protein elasticity. Nature Communications. 9, (1), 185 (2018).
  37. Huang, W., et al. Maleimide-thiol adducts stabilized through stretching. Nature Chemistry. 11, (4), 310-319 (2019).
  38. Li, Y. R., et al. Single-Molecule Mechanics of Catechol-Iron Coordination Bonds. ACS Biomaterials Science, Engineering. 3, (6), 979-989 (2017).
  39. Popa, I., et al. Nanomechanics of HaloTag Tethers. Journal of the American Chemical Society. 135, (34), 12762-12771 (2013).
  40. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  41. Wiita, A. P., Ainavarapu, S. R. K., Huang, H. H., Fernandez, J. M. Force-dependent chemical kinetics of disulfide bond reduction observed with single-molecule techniques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (19), 7222-7227 (2006).
  42. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical Activation Drastically Accelerates Amide Bond Hydrolysis, Matching Enzyme Activity. Angewandte Chemie International Edition. 58, (29), 9787-9790 (2019).
  43. Conti, M., Falini, G., Samori, B. How strong is the coordination bond between a histidine tag and Ni-nitrilotriacetate? An experiment of mechanochemistry on single molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 39, (1), 215-218 (2000).
  44. Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Stirnemann, G., Garcia-Manyes, S. The mechanochemistry of copper reports on the directionality of unfolding in model cupredoxin proteins. Nature Communications. 6, 7894 (2015).
  45. Li, H., Zheng, P. Single molecule force spectroscopy: a new tool for bioinorganic chemistry. Current Opinion in Chemical Biology. 43, 58-67 (2018).
  46. Zheng, P., Takayama, S. iJ., Mauk, A. G., Li, H. Hydrogen bond strength modulates the mechanical strength of ferric-thiolate bonds in rubredoxin. Journal of the American Chemical Society. 134, (9), 4124-4131 (2012).
  47. Lei, H., et al. Reversible Unfolding and Folding of the Metalloprotein Ferredoxin Revealed by Single-Molecule Atomic Force Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 139, (4), 1538-1544 (2017).
  48. Yuan, G., et al. Multistep Protein Unfolding Scenarios from the Rupture of a Complex Metal Cluster Cd3S9. Scientific Reports. 9, (1), 10518 (2019).
  49. Zheng, P., Arantes, G. M., Field, M. J., Li, H. Force-induced chemical reactions on the metal centre in a single metalloprotein molecule. Nature Communications. 6, 7569 (2015).
  50. Arantes, G. M., Bhattacharjee, A., Field, M. J. Homolytic cleavage of Fe-S bonds in rubredoxin under mechanical stress. Angewandte Chemie International Edition. 52, (31), 8144-8146 (2013).
  51. Blake, P. R., et al. Determinants of protein hyperthermostability: purification and amino acid sequence of rubredoxin from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus and secondary structure of the zinc adduct by NMR. Biochemistry. 30, (45), 10885-10895 (1991).
  52. Ott, W., Durner, E., Mediated Gaub, H. E. Enzyme-Mediated, Site-Specific Protein Coupling Strategies for Surface-Based Binding Assays. Angewandte Chemie International Edition. 57, (39), 12666-12669 (2018).
  53. Garg, S., Singaraju, G. S., Yengkhom, S., Rakshit, S. Tailored Polyproteins Using Sequential Staple and Cut. Bioconjugate Chemistry. 29, (5), 1714-1719 (2018).
  54. Veggiani, G., et al. Programmable Polyproteams Built Using Twin Peptide Superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (5), 1202-1207 (2016).
  55. Pelegri-O'Day, E. M., Maynard, H. D. Controlled Radical Polymerization as an Enabling Approach for the Next Generation of Protein-Polymer Conjugates. Accounts of Chemical Research. 49, (9), 1777-1785 (2016).
  56. Zheng, P., Cao, Y., Li, H. Facile method of constructing polyproteins for single-molecule force spectroscopy studies. Langmuir. 27, (10), 5713-5718 (2011).
  57. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nature Protocols. 5, (6), 975-985 (2010).
  58. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  59. Liu, H. P., Ta, D. T., Nash, M. A. Mechanical polyprotein assembly using sfp and sortase-mediated domain oligomerization for single-molecule studies. Small Methods. 2, (6), (2018).
  60. Zhang, Y., Park, K. Y., Suazo, K. F., Distefano, M. D. Recent progress in enzymatic protein labelling techniques and their applications. Chemical Society Reviews. 47, (24), 9106-9136 (2018).
  61. Luo, Q., Hou, C., Bai, Y., Wang, R., Liu, J. Protein Assembly: Versatile Approaches to Construct Highly Ordered Nanostructures. Chemical Reviews. 116, (22), 13571-13632 (2016).
  62. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28, (17), 174003 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics