Agrobacterium-Medierad omogen embryoomvandling av motsträviga majs inavlade linjer med morfogenic Genes

Biology
 

Summary

Växtmorfogenic gener kan användas för att förbättra genetisk omvandling av motsträviga genotyper. Beskrivs här är en Agrobacterium-medieradgenetisk omvandling (QuickCorn) protokoll för tre viktiga offentliga majs inavlade linjer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Masters, A., Kang, M., McCaw, M., Zobrist, J. D., Gordon-Kamm, W., Jones, T., Wang, K. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. J. Vis. Exp. (156), e60782, doi:10.3791/60782 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Demonstrerat här är ett detaljerat protokoll för Agrobacterium-medieradgenetisk omvandling av majs inavlade linjer med morfogenic gener Baby boom (Bbm) och Wuschel2 (Wus2). Bbm regleras av majsfosfolipidöverföringsanen(Pltp)promotor, och Wus2 är under kontroll av en majs auxin-inducebar(Axig1)promotor. En Agrobacterium stam som transporterar dessa morfogenic gener på överföring DNA (T-DNA) och extra kopior av Agrobacterium virulens (vir) gener används för att infektera majs omogna embryo utväxter. Somatiska embryon bildas på scutella av infekterade embryon och kan väljas genom herbicid resistens och groddar till växter. Ett värmeaktiverat rekombinationssystem för cre/loxP som är inbyggt i DNA-konstruktionen möjliggör avlägsnande av morfogenic gener från majsgenomet under ett tidigt skede av omvandlingsprocessen. Omvandlingsfrekvenser på cirka 14 %, 4 %respektive 4 % (antalet oberoende transgena händelser per 100 infekterade embryon) kan uppnås för W22, B73 respektive Mo17 med hjälp av detta protokoll.

Introduction

Omvandling är ett grundläggande verktyg för att utvärdera främmande genuttryck i majs och producera genetiskt modifierade majslinjer för både forskning och kommersiella ändamål. Tillgång till omvandling av högt genomströmning kan underlätta det ökade behovet av studier av majsmolekylära och cellulära biologi1. Förmågan att genetiskt omvandla växtarter är avgörande för både offentliga och privata laboratorier. Detta möjliggör både grundläggande förståelse av genregleringsmekanismer samt förbättring av grödor på global nivå för att stödja en ständigt växande befolkning.

Upptäckten att omogna embryon från majs skulle kunna användas för produktion av regenerativ callus kom från 19752. Sedan denna uppenbarelse har de flesta skalbara majstransformationsprotokoll krävt callusbildning och urval före förnyelse3. Under processen för genetisk omvandling, Agrobacterium-infekteradeeller biolistic-bombarderade omogna embryon odlas på media för embryogenic callus induktion. Inducerad calli odlas sedan på selektiva medier (t.ex. innehållande en herbicid) så att endast förvandlade callusbitar kan överleva. Dessa herbicidresistenta förmodade transgena calli bulkas upp och regenereras till växter. Även om denna metod är effektiv, processen är lång och arbetskrävande, och det kan ta uppemot 3 månader att slutföra4. Ännu viktigare är att konventionella majstransformationsprotokoll har en mycket större begränsning, det vill ja att endast ett begränsat antal majsgenotyper kan omvandlas5,6.

Lowe et al.7,8 tidigare rapporterat en "QuickCorn" omvandling metod som inte bara kraftigt minskat varaktigheten av omvandlingsprocessen men också utökat listan över transformerbara genotyper. QuickCorn-metoden använder majsortologgar (Zm-Bbm och Zm-Wus2) av Arabidopsis transkriptionsfaktorer baby boom (BBM)9 och WUSCHEL (WUS)10. När införlivas i omvandlingsvektorsystemet arbetar dessa gener synergistiskt för att stimulera embryogen tillväxt7.

QuickCorn-protokollet som beskrivs i detta arbete baserades på protokollet i Jones et al11, vilket var en ytterligare förbättring av den metod som rapporterats av Lowe et al7,8. I den aktuella studien, en Agrobacterium stam LBA4404 (Thy-) hysa en binär vektor konstruera PHP81430(Figur 1) och tillbehör plasmid PHP7153912 används för omvandling. T-DNA av PHP81430 innehåller följande molekylära komponenter. (1) Den selektiva markörgenen Hra-uttryckskassett. Majshra (Zm-Hra)genen är en modifierad acetolactase syntas (ALS) gen som är tolerant mot ALS-hämmande herbicider såsom sulfonylureas och imidazolinons13,14. Zm-Hra genen regleras av sorghum ALS promotor8 och potatis proteinashämmare II (stiftII) terminator15. T-DNA innehåller också (2) ett uttryck skassett som innehar omvandlingen skärmbar markör gen ZsGreen. Denna gröna fluorescerande proteingen ZsGreen från Zoanthus sp. rev korall16 regleras av en sorghum ubiquitin promotor / intron och ris ubiquitin terminator.

Dessutom innehåller T-DNA (3) den morfogenic genen Bbm uttryckkassett. Bbm är en transkriptionsfaktor i samband med embryoutveckling9,17. Bbm regleras av majsfosfolipidöverföringprotein(Pltp)promotor8 och ris T28 terminator18. Zm-Pltp är en gen med starkt uttryck i embryot scutellar epitel, silke hår och blad dotterbolag celler (flankerande skyddsceller), lågt uttryck i reproduktiva organ, och inget uttryck i rötter8. Den innehåller också (4) den morfogenic genen Wus2 uttryck kassett. Wus2 är en annan transkriptionsfaktor i samband med upprätthållandet av den apikala meristem19. Zm-Wus2 kontrolleras av en majs auxin-inducerad promotor (Zm-Axig1)20 och majs In2-1 terminator21. Slutligen innehåller T-DNA (5) cre-loxP rekombinationssystem. Cre recombinasgen22 är under kontroll av majs värmechockprotein 17,7(Hsp17.7)23 promotor och potatis stiftII terminator. Två loxP platser (i samma riktning)24 flankfyra genuttryck kassetter inklusive ZsGreen, cre, Bbm och Wus2.

Eftersom förekomsten av morfogenic gener inte önskas för växtmognad och efterföljande avkomma, den värmeinduceradcre-loxP rekombinationsystemet byggdes in i T-DNA för att ta bort morfogenic gener från majsgenomet för att möjliggöra normal callus regenerering och växtutveckling. Vid värmebehandling avlägsnar uttrycket av CRE-protein alla transgener utom hra-urvalsgenen. Framgångsrika transformants bör herbicidresistenta men ZsGreen-negativa. För att ytterligare förbättra omvandlingsfrekvensen, Agrobacterium stammen hyser också ytterligare ett tillbehör plasmid (PHP71539) som har extra kopior av Agrobacterium virulens (vir) gener12.

QuickCorn-metoden skiljer sig från konventionella protokoll majsomvandling, eftersom det inte innebär ett callus induktionssteg under omvandlingen. Under den första veckan efter infektion med Agrobacteriumutvecklas somatiska embryon på scutellar epitel av de infekterade omogna embryona. Embryona överförs sedan till ett medium med hormoner som uppmuntrar embryomognad och skjuta bildas. Snabbt överföra de somatiska embryon på mognad / skjuta bildande medium hoppar över den traditionella callus skede som tidigare använts för majs omvandling och tillåter direkt generering av T0 växter8. Jämfört med tidigare publicerade metoder majs omvandling6, QuickCorn metoden är snabbare, effektivare och mindre genotyp-beroende. Med hjälp av denna metod, rotade växter är vanligtvis redo att överföra till jord på bara 5-7 veckor, snarare än de tre eller fler månader som krävs av traditionella protokoll. Syftet med denna artikel är att ge en djupgående beskrivning och demonstration av metoden, vilket möjliggör enklare replikering i ett laboratorium inställning som vanligtvis finns i de flesta akademiska institutioner.

Protocol

1. Utveckling av medieförberedelser

  1. För exakta tillväxtmedium recept för detta protokoll, se tabell 1.
  2. För att förbereda 1 L av media, placera en 2 L bägare på en rörplatta och placera en rörstång inuti.
  3. Fyll bägare med 900 ml destillerat vatten och slå på rörplattan. Rörstången ska snurra i medelhög hastighet.
  4. Väg alla pulveriserade ingredienser och lös upp i en bägare.
  5. Mät ut alla flytande ingredienser, om sådana finns, och tillsätt till bägaren.
  6. Ta den slutliga volymen till 1 L med destillerat vatten.
  7. Mät pH och justera till receptspecifikationer.
  8. Om formulera en flytande tillväxt medium, ingen agar läggs till. Fäst en filtersterilisator på en vakuumpump och häll det flytande tillväxtmedieet genom filtret. Slå på pumpen och vänta tills all vätska dras igenom. Placera ett lock på behållaren och fäst en etikett.
  9. Om du formulerar ett fast tillväxtmedium, efter att pH:et har justerats, tillsätt agar direkt i en flaska eller kolv.
  10. Häll 1 L flytande tillväxtmedium i en 2 L Erlenmeyer kolv, eller dela upp den i två 1 L autoklaverbara flaskor (500 ml vardera). Om två flaskor används, dela agaren och lägg direkt till flaskorna.
  11. Täck kolv med ett ventilerande lock, såsom två lager aluminiumfolie, så att ånga kan fly. Om du använder en flaska, loss locket skruvlocket på toppen.
  12. Autoklav vid 121 °C i 25 min.
  13. Efter autoklavning, ta bort tillväxtmediet från autoklaven och svalna till 55-60 °C (ett vattenbad som är satt till 55 °C kan göra detta lättare). Håll tillväxtmediet i flytande tillstånd i några timmar tills det är bekvämt att hälla plattor.
  14. När svalnat, tillsätt alla post sterilisering tillsatser (se tabell 1)och blanda noggrant.
  15. När alla ingredienser tillsätts, häll den angivna volymen i behållaren val i en laminarflödehuva.
  16. Tillväxtmedium kan hällas i önskade Petri-rätter manuellt eller med hjälp av en vätskedispenseringsapparat. Vid hälla manuellt, rekommenderas att överföra en stor volym autoclaved medium till en mindre steril bägare (500 ml) för enkel hantering.
  17. Låt tillväxtmediet svalna och stelna.
  18. Tillväxtmediet kommer att finnas tillgängligt för användning när det väl har blivit fast och används bäst följande dag efter torkning något över natten i en steril flödeshuva som staplar av liddedplattor. Efter torkning över natten, överför plattorna till plastärmar, vik över den lösa änden och håll detta på plats med en liten bit tejp. Detta förhindrar överdriven torkning. Medium kan förvaras i en sval, mörk och ren miljö (4-16 °C) i upp till 1 månad.

2. Växande givaranläggningar och skörd omogna öron

  1. Odla alla allmänt tillgängliga majsinavlade (dvs. B73, Mo17 eller W22) i ett växthus i 1,5 gallon (5,9 L) krukor som innehåller ett jordlöst substrat. Använd en fotoperiod på 16/8 (dag/natt), med medeltemperaturer på 25,5 °C under dagen och 20 °C på natten.
  2. Växter vattnas efter behov och befruktas med en kontrollerad utsläpp gödselmedel (N-P-K av 15-9-12), som antingen kan införlivas i jordmixen eller läggas till ytan efter plantering.
  3. Det tar vanligtvis ca 70-90 dagar efter utsäde grobarhet för öron att växa fram. När örat skjuter fram, täcka dem med en skjuta väska för att förhindra okontrollerad pollinering inträffar.
  4. Omkring 2-3 dagar efter silke har dykt upp och om pollen kommer att finnas tillgänglig följande dag, skär silken med sax som har steriliserats i 70% etanol. Skär silken och skal ungefär 2,5 cm under änden av skalbladen, där silken dyker upp. Pollinering kan utföras nästa dag. Var noga med att resterilisera saxen mellan varje öra.
  5. När anthers dyka upp från en tofs, täck tofsmed med en tofs påse och halkfria gem vid basen av påsen runt stjälken.
  6. Nästa morgon, försiktigt böja anläggningen över och knacka på påsen för att uppmuntra pollen att släppas.
  7. Ta bort tofspåsen och vik toppen av påsen över för att förhindra pollen från att fly. Det är i allmänhet bäst att väska tofs 1 dag innan den kommer att användas (för att undvika uppbyggnad av döda pollen och skjul anthers). Färska pollen kan samlas in från tofsar i ca 3-5 dagar. När anthers fram ur de inre floretterna vid basen av tofs, att tofs sannolikt inte kommer att producera livskraftiga pollen nästa dag.
  8. Använd pollenfrån samma växt (självbehärdning) eller från en annan anläggning av samma inavlade (sibbing).
  9. Ta bort öronpåsen eller skär änden av påsen för att exponera silken, häll sedan snabbt pollen från tofspåsen på siden.
  10. Täck örat med tofspån omedelbart och häfta basen av påsen runt stjälken för att säkra den. Det kan vara bra att fysiskt isolera anläggningen från blommande växter av olika genotyper under pollinering för att förhindra korspollinering. Lämna tofspåsen på örat tills det omogna örat är redo att skörda.
  11. 9-12 dagar efter pollinering, skärmöron för embryostorlek. Skjut pollineringspåsen upp för att exponera örat. Dra försiktigt ned skalen för att exponera kärnor på ungefär en tredjedel till en fjärdedel av örats omkrets och ungefär en tredjedel av avståndet ner för örat. Kärnor nära spetsen kommer inte att vara representativa för den genomsnittliga embryostorleken.
  12. Med hjälp av en skalpell, skiva av locket på en enda kärna som liknar de flesta andra kärnor i storlek och färg.
  13. Använd en spatel (med en linjal) för att ta bort embryot enligt beskrivningen i steg 4.6. Mät embryots längd med hjälp av en inbyggd linjal på spatel eller ett digitalt bromsok. Om embryot är mellan 1,5-2,0 mm, skörda örat. Om det är ~ 1,3 mm, kan örat vara redo att skörda senare på dagen och kan kontrolleras igen i ca 7-8 h.

3. Förbereda Agrobacterium suspension kultur för infektion

OBS: Agrobacterium stam LBA4404 (Thy-) som innehåller PHP81430(figur 1) och PHP7153912 lagras som en glycerol lager på -80 °C. Dessa material kan erhållas från Corteva Agriscience genom ett materialöverföringsavtal. LBA4404(Thy-) är en auxotrofisk stam som behöver tymidin levereras i tillväxtmediet. Den primära nyttan av auxotroph Agro stam är för bioinneslutning ändamål. Det har den ytterligare fördelen av att minska Agro överväxt. Den auxotrofiska Agro stammen växer inte utan extra tymidin. Ändå kan tymidin (förmodligen) levereras genom döende växtvävnad i kulturen. Därför finns det fortfarande ett behov av att tillhandahålla ett antibiotikum i mediet för att helt kontrollera den auxotrofiska Agro. Det kommer dock att bli lättare att kontrollera på grund av äventyrad tillväxt av auxotrofisk stam i avsaknad av tymidin.

  1. Fyra dagar före infektionsdagen, initiera en "mor" platta från glycerol beståndet genom strimmor bakterierna på en YP-platta med 50 mg/L tymidin, 50 mg/L gentamicin, och 50 mg/L spectycin(tabell 1). Inkubera "moder"-plattan i en 20 °C-inkubator i 3 dagar.
  2. En dag före infektionsexperimentet, förbered en "fungerande" platta genom att välja en till fem kolonier från "moder"-plattan och strimmor bakterierna från "moder"-plattan till en ny YP-platta (med tymidin, gentamycin och spectinomycin; Tabell 1).
  3. Streak den dagliga "arbetande" plattan i sekventiella kvadranter och kör slingan 1x genom just-streckade området i den successiva kvadrant, upprepa att bilda kvadranter som har utspädd. Inkubera "fungerande" plattan över natten i en 27 °C-inkubator.
  4. Efter avslutad embryodissekering (steg 4.8), använd en slinga eller liknande verktyg för att samla in Agrobacterium från en region av "fungerande" plattan där bakterietillväxt syns som tunna ränder av kolonier.
    OBS: Undvik områden av plattan med en tät gräsmatta av bakterietillväxt. Tillväxten i Agrobacterium har sannolikt redan börjat minska i täta områden, medan bakterierna i de områden som har synliga kolonier befinner sig i rätt tillväxtfas för infektion.
  5. Häng upp de insamlade bakterierna i ett 50 ml-rör som innehåller 10 ml 700A flytande medium(tabell 1). Vortex att avbryta bakteriekulturen helt.
  6. Mät den optiska densiteten vid en våglängd på 550 nm. Justera volymen tills OD är mellan 0,35-0,45, med 0,4 är det optimala värdet.
    OBS: Om OD är högre än 0,45, tillsätt mer 700A flytande medium. Om OD är lägre än 0,35, vaccinera fler Agro kolonier i suspensionkultur.

4. Embryodissekering, infektion och samodling

  1. Välj lämpliga öron för omvandlingsexperiment; Dessa bör ha en bra utsäde satt och har embryon som varierar i storlek från 1,5-2,0 mm. De skördas vanligtvis mellan 9-12 dagar efter pollinering. Skördade öron kan användas färska eller förvaras i 1-4 dagar vid 4 °C, även om responskvaliteten sannolikt försämras successivt med långvarig lagring efter den första dagen.
  2. Ta bort skal och silke. Sätt in ett handtag i antingen basen eller örats överkant. Handtaget kan vara ett par pincett, skruvmejsel, etc.
  3. Placera öronen i en stor behållare (t.ex. 2 L bägare med handtaget uppåt, fyll behållaren med desinfektionslösning. Desinfektionslösning är 1,8 L av 20% kommersiell blekmedel (1,65% natriumhypoklorit) och ett par droppar ytaktiva Tween 20.
  4. Sterilisera öronen inuti en laminarflödesbänk. Efter 20 min, töm blekmedelslösningen och skölj öronen 3x (5 min vardera) med en generös mängd sterilt destillerat vatten. Ta bort vattnet och låt öronen torka i flera minuter.
    OBS: Det är viktigt att öronen är helt nedsänkta i blekmedelslösningen i 20 min. Flytta öronen försiktigt runt i blekmedelslösningen ibland för att rubba luftbubblor.
  5. Förbered ett 2 ml mikrocentrifugrör fyllt med 700A flytande medium. Detta rör kommer att användas för att samla in omogna embryon.
  6. Ta örat och använd en steril skalpell, ta bort de övre 1-2 mm av kärnan kronor för att exponera frövitan. Använd en mikro spatel för att ta bort det omogna zygotiska embryot (IZE). IZE kommer att placeras i kärnan, på sidan mot örats spets och nära fastsättningen på kolven. Använd spatel, sätt in den i frövitan i pericarp längst bort från embryot, vrid försiktigt uppåt för att lossa frövitan och låt embryot avlägsnas(figur 2).
  7. Använd spatel, överför embryot till röret som innehåller 700A flytande medium. Fortsätt att göra detta tills upp till 100 embryon har samlats in. Flera rör kan fyllas (~ 100 embryon / rör) innan du fortsätter till nästa steg. Vid denna punkt bör Agrobacterium suspension en beredd (se steg 3,5).
  8. Ta bort 700A flytande medium från embryoröret med en 1 ml pipett. Tillsätt färska 700A medium för att tvätta embryon, ta sedan bort det mediet också.
  9. Tillsätt 1 ml av Agrobacterium suspension och virvel på en låg inställning (3/ 10) för 30 s eller invertera rör 12x-15x att blanda. Låt detta rör vila horisontellt på bänken i 5 min.
  10. Efter 5 min, överför hela röret av embryon och Agrobacterium suspension på en tallrik med 562V samodling medium(tabell 1). Detta kan uppnås genom att placera plattan på bänken och snabbt hälla röret svar på plattan. Snurra försiktigt plattan för att fördela embryona och ta bort Agrobacterium suspension med en 1 ml pipett.
  11. Se till att embryona placeras med scutellum (rund) sida uppåt. Använd ett förstoringsglas eller ett dissekerande scope, om det behövs. Placera plattorna i plastlådor (19 cm x 28 cm x 5,1 cm) och inkubera plattorna över natten 16-18 h vid 21 °C i mörkret. Ingen enskild plåtomslag med paraffinfilm eller ventilationstejp är nödvändig.
  12. Efter över natten samodling, flytta infekterade embryon, scutellum sida upp, på vilamedium 605T(tabell 1). Placera cirka 30 embryon per tallrik. Inkubera plattorna vid 26-28 °C i mörkret.
  13. Inkubera i 4-10 dagar (7 dagar är att föredra). Vid denna tid kan utvecklingen av somatiska embryon observeras på ytan av den zygotiska scutellum(figur 3).

5. Urval, värmebehandling och regenerering

  1. Efter viloperioden, värme chock embryona. Placera lådan som innehåller plattorna av embryon i en 45 °C-inkubator med 70% relativ luftfuktighet för 2 h. Ta sedan bort lådan från 45 °C-inkubatorn och placera i den mörka inkubatorn på 26–28 °C för 1-2 h.
    OBS: Om det inte kan uppnå 70% luftfuktighet i en inkubator, tillsätt ett dubbelt lager autoklaverade pappershanddukar till botten av plattan rutan och blöta med autokavat vatten för att upprätthålla luftfuktigheten i lådan. Sätt tillbaka plattorna till lådan ovanpå pappershanddukarna och försegla locket innan du placerar vid 45 °C. Använd en liten digital hygrometer/termometer för att övervaka temperaturen och luftfuktigheten.
  2. Överför de värmebehandlade IZEs från vilomediet till skjutbildningsmediet (13329A) som innehåller 0,05 mg/L imazapyr som selektivt medel (tabell 1). När du överför, ta bort koloptiles, om sådan finns, med hjälp av fina spetspinar eller kirurgisksaxar.
  3. Placera 10-15 embryon per tallrik för att undvika överbeläggning. Förvara embryona i detta medium i 2 veckor i den mörka inkubatorn på 26 °C.
  4. Överför embryona till rotmedel (13158; Tabell 1) 1-2 veckor. Placera runt åtta stycken per tallrik och inkubera i ett ljusrum eller ljuskammare (16 dag/8 natt, 20-150 μmol/m2/s) vid 27 °C.
  5. När plantlets utvecklas, placera starkare plantlets som innehåller både skott och kraftfulla rötter på nya plattor av böka medium, placera en växt per tallrik. Detta kommer att möjliggöra en starkare tillväxt för växtändigen. Placera plattorna i ljusrummet eller ljuskammaren i ytterligare 7-14 dagar.
    OBS: Ta försiktigt bort alla callus bitar i samband med plantlet för att säkerställa att det är i god kontakt med mediet.
  6. När växten blir mer kraftfull, ta bort växten från böka medium och skölj rötterna med kranvatten för att ta bort agar.
  7. Transplantera enskilda växter i 3 i2 (~19 cm2)krukor som innehåller ett förfuktat jordlöst substrat. Placera krukorna i en bricka (27 cm x 54 cm) med dräneringshål och täck den platta med en plastfuktkupol. Detta acklimatiseringssteg kan uppnås antingen i tillväxtkammare eller i växthus med tillväxtförhållanden som beskrivs i avsnitt 2 (steg 2.1) ovan.

6. Transplantation till växthuset och produktion av T1 frön

  1. Kontrollera växterna 2x per dag. Vatten efter behov. Se till att växterna varken torkas ut eller övervattnas. Att upprätthålla ett något torrt substrat uppmuntrar rottillväxt.
    OBS: Fuktkupolen kan tas bort 4-7 dagar efter transplantation. Växter bör odlas i dessa små krukor tills de har synligt återhämtat sig från stress av transplantation till jord. Detta bör ta ca 9-14 dagar.
  2. Transplantera hela jordlösa plugg och plantlet i en 1,5 gal (5,9 L) potten. Håll i växthus och vatten när jorden känns torr vid beröring.
  3. Tillsätt en kontrollerad frisättning gödselmedel med N-P-K av 15-9-12 till potten, som antingen kan införlivas i substratmixen eller appliceras på ytan.
  4. När örat skott börjar dyka upp från anläggningen, använd en skjuta väska för att täcka örat skott. Var noga med att använda en påse som är halvtransparent så att de framväxande silke kan observeras utan avlägsnande av påsen. Skjuta påsen gör det möjligt för kontrollerad pollinering att inträffa. Det är viktigt att alltid väska transgena tofsar.
  5. Efter silkesfram (1-2 dagar), trimma de uppkomna silke till en enhetlig längd. Detta kommer att vara ca 2,5 cm under toppen av skalbladen. Använd en sax som har steriliserats i 70% etanol. Genom att trimma silken utvecklas en enhetlig tofs följande dag för pollinering.
  6. För en majoritet av majsgenotyper är den optimala tiden för pollinering 2-3 dagar efter tofs eller silkesuppkomst.
  7. Samla pollen från antingen samma anläggning (om de är självpollinerade) eller från en vild typ av samma inavlade (om outcrossing eller incrossing).
  8. Samla pollen i en tofs väska och tillämpa den på tofsavi av T0 anläggningen. Om pollen en är från en vild-typ (icke-transgena) anläggning, placera pollen i en vanlig brun tofs väska. Om pollen en transgen växt, placera pollen i en grön randig väska för att indikera att pollen är transgen.
  9. Följ steg 2.5-2.10 för pollineringsdetaljer.
  10. Ca 2 veckor efter pollinering, ta bort tofspåsar från öronen, och låt torka ner för att börja. För att torka ner, sluta vattna anläggningen 21-25 dagar efter pollinering. Du kan också dra tillbaka skalbladen för att exponera fröet. Denna praxis hjälper också till att förhindra mögel.
  11. Cirka 45 dagar efter pollinering, skörda frön och förvaras i kylförvaring vid 4-12 °C.

Representative Results

Demonstrerat här är ett steg-för-steg-protokoll för Agrobacterium-medieradgenetisk omvandling av tre offentliga majsinavlade linjer (B73, Mo17 och W22) som har varit betydande när det gäller majsgenetik. Omvandlingen av de tre inavlade linjerna kunde inte uppnås med hjälp av konventionella majsomvandlingsprotokoll5. Figur 1 och figur 2 visar konstruktions- och utgångsmaterial, som används här. Öron skördas i allmänhet 9-12 dagar efter pollinering. IZEs med längder mellan 1,5-2,0 mm är de bästa utväxter för omvandling för detta protokoll(figur 2).

Åtta dagar efter infektion visualiserades ZsGreen-uttryckersomatiska embryon under GFP-kanalen i ett fluorescerande mikroskop(figur 3). Infekterade IZEs utsattes för värmebehandling 8 dagar efter infektion (steg 5.1 och 5.2). Denna behandling inducerade uttrycket av CRE rekombinas som strukits Bbm, Wus2, cre, och ZsGreen uttryck kassetter flankerad mellan de två loxP platser(figur 1). De värmebehandlade vävnaderna odlades sedan på skjutbildningsmedium som innehåller herbicidimazapyr för urval av förvandlad vävnad efter morfogenic genborttagning.

Sprider vävnader med mognande embryon eller skottknoppar som var resistenta mot imazapyr observerades cirka 3-4 veckor efter infektion (figur 4). Vissa imazapyr-resistenta vävnader var negativa för ZsGreen, vilket tyder på att cre-medierad excision sannolikt inträffade i dessa vävnader(figur 4). Efter vävnaderna flyttades till böka medium och lätt inkubation, skott började utvecklas (Figur 5). Friska och kraftfulla växande skott med välutvecklade rötter skördades (figur 5). Vissa vävnader verkade ha flera skott(Figur 5E,F,G). Denna typ av "gräsbevuxen" genankan bero på klonala växter med identiska transgen integration mönster. Molekylär biologisk analys krävs för att genotyp dessa växter.

Alla tre offentliga inavlade linjer svarade bra med hjälp av detta protokoll samt den konstruktion som används i detta arbete. W22 producerade den högsta frekvensen av imazapyr-resistenta skott, med en frekvens på cirka 14% (ca 14 transgena skott per 100 infekterade omogna embryon). Både B73 och Mo17 producerade cirka 4% transgena skott. Dessa frekvenser indikerar alla transgena skott, inklusive båda växter som bär morfogenic gener och växter med morfogenic genen bort av CRE-medierad excision.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av T-DNA-regionen i den binära plasmid PHP81430. RB = höger T-DNA-gräns; loxP = CRE rekombinas målplats; Axig1pro:Wus2 = majs auxin-inducebar promotor (Zm-Axig1) + Zm-Wus2 + majs In2-1 terminator; Pltppro:Zm-Bbm = majs fosfolipid överföring protein (Zm-Pltp) promotor + Zm-Bbm + ris T28 terminator (Os-T28); Hsppro:cre = majsvärmechockprotein 17,7 promotor (Zm-Hsp17.7) + cre recombinasgen + potatisproteinashämmare II (pinII)terminator; Ubipro:ZsGreen = sorghum ubiquitin promoter/intron (Sb-Ubi) + grönt fluorescerande protein ZsGreen gen + ris ubiquitin terminator (Os-Ubi); Hra kassett = sorghum acetolactase syntas (Sb-Als) promotor + majs Hra (Zm-Hra) gen + pinII terminator; LB = vänster T-DNA-gräns; colE1, replikering ursprung plasmid ColE125; SpecR = spectinomycin resistent gen aadA1 från Tn21 för bakterieval26; Rep A,B,C = replikering särursprung från pRiA4 av Agrobacterium rhizogenes27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: Utgångsmaterial. B73 öron skördas 12 dagar efter pollinering (A). Omogna embryon från B73 (B), Mo17 (C) och W22 (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Vävnadsutveckling på vilamedel 1 vecka efter infektion. Embryon (8 dagar efter infektion) under ett florescence mikroskop (GFP-filter) som visar GFP uttrycker somatiska embryon mo17 (A) och W22(B). Utveckla vävnad (B73) under ljust fält (C) och GFP-filter (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Vävnadsutveckling på mognadsmedium med urval. En W22 mognadsplatta (A). Utveckla vävnad (Mo17, 15 dagar efter infektion) under ljust fält (B) och GFP filter(C). Utveckla vävnad (Mo17, 28 dagar efter infektion) under ljust fält(D)och GFP-filter (E). Pilar pekar på regenererande vävnader som saknar GFP uttryck, vilket tyder på excision av ZsGreen genen mellan loxP platser efter värme-inducerad CRE proteinaktivitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Vävnadsutveckling på böka media. Skott av W22 (A), B73 (B), och Mo17 (C,D). Händelse med flera skott (gräsbevuxna regeneranter) av B73 (E) och W22(F,G). Skott med rötter i B73 (H) och W22 (I). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Mediekompositioner för majsomvandling. Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).

Discussion

Traditionella protokoll för majsomvandling följer paradigmet att isolera omogna zygotiska embryon för att producera transgen callusvävnad, som regenereras till bördiga växter4,6. Även om detta är effektivt, callus-baserade protokoll kan vara tidskrävande, och det tar ofta upp till 3 månader för vävnadskulturprocessen att producera växter. Det som gör den metod som presenteras här betydande är att den är callusfri, effektiv, snabb och möjliggör förnyelse av T0-anläggningar i ungefär hälften av tidsramen. Det verkar också vara mindre genotyp-beroende och kan därmed vara effektiva för de flesta allmänt tillgängliga inavlade8,11.

Även om alla åtgärder bör följas effektivt, är det absolut nödvändigt att förbereda tillväxtmedierna. Tillväxtmediekomponenter måste läggas till i rätt steg, både pre- och postautoklav, för att säkerställa att växtmaterialet får rätt koncentration av kemikalier. Detta kommer att säkerställa att känsliga föreningar som antibiotika inte bryts ner. Det är också viktigt att växtmaterial placeras på rätt tillväxtmedium i varje steg, vilket anges i protokollet. Att inte placera material på rätt tillväxtmedium kan leda till materiell död. Dessutom bör det undvikas att placera för många embryon eller utveckla vävnader på plattor. Medan du placerar dubbelt så många vävnadbitar kan spara kostnaden för kemikalier och Petri rätter (och även inkubator utrymme), tillväxten av vävnad i överfulla plattor kan allvarligt hämmas. När infektionen utförs bör det säkerställas att den optiska densiteten hos Agrobacteriumsuspensionen är lämplig. Om den bakteriella suspensionstätheten är för låg kan det hända att korrekt infektion inte uppstår.

Kvaliteten på startmaterial är avgörande för framgång i omvandlingsprotokoll. Öron som används för embryodissekering måste vara friska, vilket innebär att den växt som producerar dem är frisk. De måste också ha en tillräcklig fröuppsättning och vara skadedjursfria och sjukdomsfria. Dessutom bör gamla Agrobacterium inte användas. "Mor"-plattan bör inte vara mer än 2 veckor gammal. Efter denna punkt, en ny "mor" platta bör strimmas för att börja nya experiment.

Även om den här metoden har visat sig vara mindre genotypsberoende, kan det inte antas att alla rader kommer att lyckas lika. Det kan fortfarande finnas variation mellan linjer samt skillnader i framgång baserat på den konstruktion som används. Öra till öra variabilitet är också oundvikligt när man arbetar med omogna embryon, så helst experiment bör använda flera öron för att ta hänsyn till detta. I detta arbete, inavlade W22 presterade bäst, med över ~ 14% omvandlingsfrekvens, följt av B73 och Mo17 (~ 4% vardera). Lowe et al.8 rapporterade med QuickCorn-protokollet för B73 och Mo17-omvandling. I detta arbete varierade omvandlingsfrekvenserna från 9%-50% för B73 och 15%-35% för Mo17.

En möjlighet för de lägre omställningsfrekvenserna för B73 och Mo17 som observerats i detta arbete kan tillskrivas variationer i säsongsbunden öronkvalitet. En annan skillnad mellan detta arbete och lowe et al.8 är att olika vektorkonstruktioner användes här. I Lowes arbete avlägsnades inte morfogenic gener från de förvandlade växterna utan snarare utvecklingsmässigt tystades i de senare stadierna. I detta arbete togs de morfogenic generna bort 8 dagar efter infektionen. Det är möjligt att B73 och Mo17 kan behöva en längre närvaro av Bbm/Wus2 för utveckling av somatiska embryon.

Med hjälp av denna metod finns det en möjlighet att erhålla icke-transgena flyktväxter, multimeriska infogningar och ostrukit transgener. Dessa växter kommer inte att ha en märkbart annorlunda fenotyp, så detektion av PCR krävs för att avgöra om en anläggning är transgen. För att åstadkomma detta kan pcr primers inom den strukna regionen och primers flankera den strukna regionen användas. Flera oberoende omvandlingar kan också producera växter från samma omogna embryo, vilket gör fastställandet av total oberoende transformatorsoda återvinning sett till svårigheter. Vår standard har varit att beräkna en omvandlingshastighet baserad på provtagning av en växt från varje omogna embryo som producerade växter och dividera detta med antalet smittade embryon. Denna metod underskattar nästan säkert det faktiska antalet oberoende händelser som återvinns som plantlets. Diskriminering mellan oberoende händelser från samma embryo kräver sekvensering av gränsregioner runt transgener, och detta kommer att vara oöverkomligt dyrt och tidskrävande för de flesta tillämpningar. Det kan dock finnas fall där dessa uppgifter är användbara.

Denna metod för vävnadskultur omvandling har visat sig vara mycket effektiv, men problem kan fortfarande uppstå. Om växtmaterial inte svarar är det möjligt att det finns ett problem med den särskilda inavlade linjen, vilket tyder på att variabler som tillväxtmediesammansättning och tidpunkten för subkulering kräver justeringar. En annan variabel är korrekt vektordesign och korrekt vektorkonstruktion, om den ursprungliga vektorn ändras. Det kan också finnas problem med imazapyr känslighet, eftersom vissa linjer är känsligare än andra, och koncentrationen av imazapyr kan behöva justeras för att uppnå framgångsrikt omvandlas växter.

Under de senaste 30 åren har majsvävnadsodling och omvandlingsprotokoll förändrats och utvecklats. Och man tror att detta förkortade protokoll kommer att främja denna utveckling. Denna metod är effektiv för akademiska inställningar eftersom det är mindre tidskrävande än traditionella metoder. Dessutom kräver den inte välutbildade operatörer, vilket gör det mer mottagligt för utbredd distribution jämfört med traditionella metoder. I framtiden kan denna metod kombineras med ny teknik som genomteknik.

Disclosures

Alicia Masters, William Gordon-Kamm och Todd Jones är anställda i Corteva Agriscience som levererade protokollet och majsöron en B73, Mo17 och W22 som används i denna artikel. Författarna Minjeong Kang, Morgan McCaw, Jacob Zobrist och Kan Wang har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Corteva växthus laget för att ge majs omogna öron, Corteva media prep lab för att ge hjälp med att göra media, Ning Wang från Corteva för hjälp med Agrobacterium konstruktion, och Keunsub Lee från Iowa State University för hjälp. Detta projekt stöddes delvis av National Science Foundation Plant Genome Research Program Grant 1725122 och 1917138 till K.W., av Predictive Plant Phenomics Research Traineeship Program (National Science Foundation Grant DGE-1545453) till J.Z., av USDA NIFA Hatch-projektet #IOW04341, av State of Iowa-medel, och av Crop Bioengineering Center of State Iowa University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4-D Millipore Sigma D7299
6-Benzylaminopurine (BAP) Millipore Sigma B3408
Acetosyringone Millipore Sigma D134406
Agar Millipore Sigma A7921
Aluminum foil To cover the flask
Ammonium Sulfate Millipore Sigma A4418
Analytical balance To weigh small quantities of chemicals
Autocalve Primus (Omaha, NE) PSS5-K To autoclave media and tools
Bacterial culture loop (10 µl) Fisher scientific 22-363-597 Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid
Bactoagar BD bioscience 214030
Beakers (1 L, 2 L, 4 L) To mix the chemicals for media
Benomyl Millipore Sigma #45339
Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite) Clorox For seed sterilization
Boric Acid Millipore Sigma B6768
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902
Carbenicillin Millipore Sigma C3416
Casein Hydrolysate Phytotech C184
Cefotaxime Phytotech C380
Conical tube (50 mL) Fisher scientific 06-443-19 Contain liquid medium and Agro suspension
Cuvette (Semi-micro) Fisher scientific 14955127 To hold liquid for measuring OD
Dicamba Phytotech D159
Digital hygrometer Checking temperature and humidity for heat treatment
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate Millipore Sigma 324503
Eppendorf tube (2.0 mL) ThermoFischer Scientific AM12475
Eriksson's Vitamins Phytotech E330 1000x in liquid
Ethanol (70%) Sterilizing tools and surfaces
Ferrous Sulfate Heptahydrate Millipore Sigma F8263
Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12 ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH) A903206 Fertilizer
Flask (2 L) Pyrex 10-090E To autoclave media and tools
Flats (Standard 1020, open w/holes, 11"W x 21.37"L x 2.44"D) Hummert International (Earth City, Mo) 11300000 Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome
Forceps (fine-tipped and large) Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders
Gentamicin Gold Biotechnologies G-400
Glass bottle (1 L) Pyrex 06-414-1D To autoclave medium
Graduated cylinder To adjust volume of media
Imazapyr Millipore Sigma 37877
Incubator, 20 °C Percival Scientific Model I-36NL To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection
Incubator, 27 °C Percival Scientific Model I-36NL To grow co-cultivation plate and maize embryo culture
Incubator, 45 °C Heat shock treatment
Insert TO Standard, pots Hummert International (Earth City, Mo) 11030000 For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome
Laminar flow hood Maintains sterile conditions
L-proline Phytotech P698
Magnesium Sulfate Heptahydrate Millipore Sigma M1880
Maize inbred seed B73 U.S National Plant Germplasm id=47638
Maize inbred seed Mo17 U.S National Plant Germplasm id=15785
Maize inbred seed W22 U.S National Plant Germplasm id=61755
Manganese Sulfate Monohydrate Millipore Sigma M7899
Milli-Q Water purification systems Millipore sigma MILLIQ For tissue culture grade water
MS Basal Medium Millipore Sigma M5519
MS Basal Salt Mixture Millipore Sigma M5524
N6 Basal Salt Mixture Millipore Sigma C1416
Paperclips, non-skid Holding on tassel bags
Peptone BD bioscience 211677
Petri dish (100x15 mm) Fisher scientific FB0875713 For bacteria culture medium
Petri dish (100x25 mm) Fisher scientific FB0875711 For the plant tissue culture medium
pH meter Fisher scientific AB150 To adjust pH of media
Pipette (1 mL) ThermoFischer Scientific 4641100N
Plastic Boxes The Container Store 10048430 For tissue culture storage and incubation
Plastic humidy dome (Humi-Dome) Hummert International (Earth City, Mo) 14385100 Plastic cover for soil flat
Potassium Iodide Millipore Sigma 793582
Potassium Nitrate Millipore Sigma P8291
Potassium Phosphate Monobasic Millipore Sigma P5655
Scale To weigh chemicals for media
Scalpel Blade (No. 11, 4 cm) Thermo Scientific 3120030 remove the top of the kernel crowns for embryo dissection
Scalpel handle Holding scalpel blades
Schenk & Hildebrandt Vitamin (S&H vitamin) Phytotech S826 100x powder
Scissors Cutting ear shoots
Shoot bag (Canvasback- semi-transparent) Seedburo (Des Plaines, IL) S26 Semi-transparent bag to cover ear shoots
Silver Nitrate Millipore Sigma S7276
Sodium Molybdate Dihydrate Millipore Sigma M1651
Soiless substrate LC1 SunGro Horticulture (Agawam, Ma) #521 For growing maize plants
Spatula (Double Ended Micro-Tapered) Fischer Scientific 2140110 Dissecting embryos from kernels
Spatula (with spoon) Fisher scientific 14-375-10 To measure chemicals for media
Spectinomycin Millipore Sigma S4014
Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis) Thermo Scientific 840-300000 Measure OD of Agro suspension
Stirring bar Fisher scientific 14-513-67 To mix media
Stirring hotplates To mix media
Syringe (without needle, 60 mL) Fisher scientific 14-823-43 For filter sterilization
Syringe filter (0.22 µm) Fisher scientific 09-720-004 For filter sterilization
Tassel bag (Canvasback- brown) Seedburo (Des Plaines, IL) T514 Bag to cover tassels of non-transgenic plants
Tassel bag (Canvasback-green stripe) Seedburo (Des Plaines, IL) T514G Bag to cover tassels of transgenic plants
Thiamine HCl Phytotech T390
Thidiazuron Phytotech T888
Thymidine Millipore Sigma T1895
Timentin Phytotech T869
Tween 20 Fisher Scientific Cas #9005-64-5 surfactant
Vortex Genie 2 Scientific Industries SI0236 Homogenizes liquids (Agro suspension)
Water bath (large - Precision model 186) Fisher scientific any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 °C Keeps autoclaved media at optimal temperature
Weigh dish Fisher scientific 08-732-112 To measure chemicals for media
Weighing paper Fisher scientific 09-898-12A To measure chemicals for media
Yeast Extract Fisher Scientific BP14222
Zeatin Millipore Sigma Z0164

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, Z. Y., et al. High throughput genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize. Molecular Breeding. 8, (4), 323-333 (2002).
  2. Green, C. E., Phillips, R. L. Plant regeneration from tissue cultures of maize. Crop Science. 15, (3), 417-421 (1975).
  3. Ji, Q., Xu, X., Wang, K. Genetic transformation of major cereal crops. International Journal of Developmental Biology. 57, 495-508 (2013).
  4. Frame, B., Warnberg, K., Main, M., Wang, K. Maize (Zea mays, L). Agrobacterium Protocols. Wang, K. 3rd edition, Springer, USA. 101-117 (2015).
  5. Frame, B., et al. Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts. Plant Cell Reports. 25, (1), 1024-1034 (2006).
  6. Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Frontiers in Plant Science. 5, (379), (2014).
  7. Lowe, K. S., et al. Morphogenic regulators Baby boom and Wuschel improve monocot transformation. The Plant Cell. 28, (9), 1998-2015 (2016).
  8. Lowe, K. S., et al. Rapid genotypes independent maize transformation via direct somatic embryogenesis. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 54, (3), 240-252 (2018).
  9. Boutilier, K., et al. Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth. The Plant Cell. 14, (8), 1737-1749 (2002).
  10. Zuo, J., Niu, Q. W., Frugis, G., Chua, N. H. The WUSCHEL gene promotes vegetative-to-embryonic transition in Arabidopsis. The Plant Journal. 30, (3), 349-359 (2002).
  11. Jones, T. J., et al. Maize transformation using the morphogenic genes Baby Boom and Wuschel2. Transgenic Plants. Kumar, S., Barone, P., Smith, M. 81-93 (2019).
  12. Anand, A., et al. An improved ternary vector system for Agrobacterium-mediated rapid maize transformation. Plant Molecular Biology. 97, (1-2), 187-200 (2018).
  13. Ray, K., et al. Mutant acetolactate synthase gene is an efficient in vitro selectable marker for the genetic transformation of Brassica juncea (Oilseed Mustard). Journal of Plant Physiology. 161, (9), 1079-1083 (2004).
  14. Green, J. M., Hale, T., Pagano, M. A., Andreassi, J. L. II, Gutteridge, S. A. Response of 98140 corn with gat4621 and hra transgenes to glyphosate and ALS-inhibiting herbicides. Weed Science. 57, (2), 142-148 (2009).
  15. An, G., et al. Functional analysis of the 3' control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene. The Plant Cell. 1, (1), 115-122 (1989).
  16. Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nature Biotechnology. 17, (10), 969-973 (1999).
  17. Passarinho, P., et al. Target Genes Provide Diverse Entry Points into Cell Proliferation and Cell Growth Pathways. Plant Molecular Biology. 68, (3), 225-237 (2008).
  18. Bhyri, P., Khrishnamurthy, N., Narayanan, E., Nott, A., Sarangi, R. R. Novel plant terminator sequences. Patent Number US2014/0130205. (2014).
  19. Laux, T., Mayer, K. F., Berger, J., Jürgens, G. The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis. Development. 122, (1), 87-96 (1996).
  20. Garnaat, C., Lowe, K., Roth, B. Zm-AXIG1-specific polynucleotides and methods of use. Patent Number WO2002006499. (2002).
  21. Hershey, H. P., Stoner, T. D. Isolation and characterization of cDNA clones for RNA species induced by substituted benzenesulfonamides in corn. Plant Molecular Biology. 17, (4), 679-690 (1991).
  22. Abremski, K., Hoess, R. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. Journal of Biological Chemistry. 259, (3), 1509-1514 (1984).
  23. Sun, A. Q., et al. Cloning and Function Analysis of Small Heat Shock Protein Gene ZmHSP17.7 from Maize. ACTA Agronomica Sinica. 41, (3), 414 (2015).
  24. Sauer, B., Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, (14), 5166-5170 (1988).
  25. Hershfield, V., Boyer, H. W., Yanofsky, C., Lovett, M. A., Helinski, D. R. Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71, (9), 3455-3459 (1974).
  26. Liebert, C. A., Hall, R. M., Summers, A. O. Transposon Tn21, flagship of the floating genome. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63, (3), 507-522 (1999).
  27. Nishiguchi, R., Takanami, M., Oka, A. Characterization and sequence determination of the replicator region in the hairy-root-inducing plasmid pRiA 4b. Molecular and General Genetics. 206, (1), 1-8 (1987).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics