Demonstrere en lineær sammenhæng mellem vaskulær endotelial vækstfaktor og luteiniserende hormon i nyre cortex ekstrakter

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Præsenteret her er en protokol til at udnytte en kortikale nyre ekstrakt forberedelse og total protein normalisering at demonstrere sammenhængen mellem vaskulær endotelvækstfaktor og luteiniserende hormon i pattedyrs nyre.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Muthusamy, A., Arivalagan, A., Movsas, T. Z. Demonstrating a Linear Relationship Between Vascular Endothelial Growth Factor and Luteinizing Hormone in Kidney Cortex Extracts. J. Vis. Exp. (155), e60785, doi:10.3791/60785 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) hjælper med at kontrollere angiogenese og vaskulær permeabilitet i nyrerne. Nyrelidelser, såsom diabetisk nefropati, er forbundet med VEGF dysregulering i nyrerne. De faktorer, der regulerer VEGF under fysiologisk forhold i nyrerne er ikke godt forstået. Luteiniserende hormon (LH), en Pro-angiogen hormon, hjælper med at regulere fysiologisk VEGF udtryk i reproduktive organer. I betragtning af at LH receptorer findes i nyrerne, vi, på Zietchick Research Institute, hypotese her, at LH også hjælper med at regulere VEGF udtryk i nyrerne samt. For at fremlægge dokumentation, vi har til formål at vise, at LH niveauer er i stand til at forudsige VEGF niveauer i pattedyrs nyre. De fleste VEGF-relaterede undersøgelser, der involverer nyrerne, har brugt lavere orden pattedyr som modeller (dvs. gnavere og kaniner). For at oversætte dette arbejde til den menneskelige krop, blev det besluttet at undersøge forholdet mellem VEGF og LH i højere orden pattedyr (dvs., kvæg og svin modeller). Denne protokol bruger det samlede protein lysat fra nyre cortex. Nøglerne til denne metodes succes omfatter indkøb af nyrer fra slagteri dyrene umiddelbart efter døden samt normalisering af analysand niveauer (i nyre ekstraktet) af total protein. Denne undersøgelse viser med held et signifikant lineært forhold mellem LH og VEGF i både kvæg-og svine nyrerne. Resultaterne er reproducerbare i to forskellige arter. Undersøgelsen giver dokumentation for, at brugen af nyre ekstrakter fra køer og grise er en fremragende, økonomisk og rigelig ressource til studiet af renal fysiologi, især for at undersøge korrelationen mellem VEGF og andre analytter.

Introduction

Vaskulær endotelvækstfaktor A (VEGF-a), hjælper med at regulere angiogenese og vaskulær permeabilitet i nyrerne og andre organer1,2(herefter vil VEGF-a blive omtalt som VEGF). VEGF niveauer i nyrerne er under stram homeostatisk kontrol. Når nyre VEGF niveauer er forhøjet eller deprimeret, kan nyrerne funktionsfejl. For eksempel, inden for 3 uger efter fødslen, mus med podocyte-specifik heterozygosity for VEGF udvikle endotheliosis og blodløse glomeruli (dvs, nyre læsioner set i humant præeklampsi), og slutstadiet nyresvigt forekommer i disse heterozygoter af 3 måneders alderen. Podocyte-specifikke homozygotiske knockouts dør fra hydrops og nyresvigt inden for 1 dag fødsel3,4.

På den anden side, over ekspression af renal VEGF forårsager proteinuri og glomerulær hypertrofi3,4. For eksempel, transgene kaniner, der overekspression af VEGF udviser progressiv proteinuri med øget glomerulær filtrat ions hastigheder i tidlige stadier af nefropati, efterfulgt af nedsat glomerulær filtrat ions hastigheder i senere stadier3. Diabetisk nefropati, en væsentlig årsag til nyresygdom i slutstadiet hos diabetiske voksne, er stærkt forbundet med VEGF dysregulering2,5. En stor del af opmærksomheden er blevet betalt til rollen af hypoksi i inducerende VEGF udtryk under patologiske betingelser5. Men de faktorer, der regulerer VEGF under fysiologisk forhold (både i nyrerne og andre organer) er ikke godt forstået2,6. Identificering af disse faktorer (med undtagelse af ilt), der er involveret i fysiologisk og patologisk VEGF-regulering, er en vigtig virksomhed.

Luteiniserende hormon (LH), en Pro-angiogen hormon, hjælper med at regulere fysiologisk VEGF udtryk i reproduktive organer såsom æggestokkene og testikel7,8. Tidligere undersøgelser har givet dokumentation for, at LH også hjælper med at regulere VEGF i ikke-reproduktive organer, såsom øjnene6,9,10. LH receptorer findes i medulla og cortex af nyrerne11,12. Af note, nyre tubulære epiteliale celler, samt LH receptor, Express VEGF11,12,13,14. Tager disse to observationer sammen, vi hypotese, at LH også hjælper med at regulere VEGF udtryk i nyrerne13,14. At fremlægge dokumentation for dette LH/VEGF forhold, den præsenterede protokol har til formål at vise, at LH niveauer er i stand til at forudsige VEGF niveauer i nyrerne. Mange tidligere VEGF-relaterede undersøgelser, der involverer nyrerne har brugt lavere orden pattedyr modeller (dvs., gnavere og kaniner)2. For at omsætte dette arbejde til det menneskelige legeme, undersøgelsen undersøger forholdet mellem VEGF og LH i højere orden pattedyr (her, kvæg og svin modeller). For at opfylde dette mål blev det totale proteinlysat fremstillet fra cortex-regionen af kvæg-og svinenyrer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Der blev ikke anvendt levende eller forsøgsdyr til denne undersøgelse.

1. håndtering af væv

  1. Straks efter slagtning fra et slagteri fremskaffer hele nyrerne af kvæg og svin. Transport på is til laboratoriet.
  2. Ved ankomsten til laboratoriet skylles nyrerne med 50 mL iskold fosfat bufferet saltvand (PBS). Gentag dette trin 2x for at fjerne blod helt.
  3. Hold nyrerne på is (eller nedkølet) indtil yderligere ekstraktion.

2. dissektion af nyrerne

  1. Brug steril saks, pincet, en kniv og Petri skåle til at dissekere nyrerne og punktafgifts den krævede vævs portion.
  2. Forbered RIPA lysis buffer før nyre dissektion. 5 mM NaCl opløses, 0,5 M EDTA, 1 M tris (pH = 8,0), NP-40 (ID + GEPAL CA-630), 10% natriumdeoxycholat og 10% SDS i dobbeltdestilleret vand og blandes derefter grundigt. RIPA lysis-bufferen skal opbevares i køleskab, når den ikke er i brug.
  3. Skær forsigtigt nyrerne i halve (sagittal plane) og skær et stykke væv (50-70 mm2) fra cortex regionen i midten af nyrerne (vejer 80-100 mg ved våd vægt).
  4. Hakning vævs blokken i små stykker med en kniv til at hjælpe homogenisering proces.
  5. Efter hakning af væv, overføre dem til en microfuge tube med 1 mL iskold 1x RIPA lysis ekstraktions buffer. Anbring rørene i is indtil yderligere ekstraktion.

3. vævshomogenisering

  1. Mærk mikrofuge rørene med specifikke prøve detaljer for vævs supernatanten-samlingen.
  2. Ved hjælp af en håndholdt homogenisator med en steril sonde, homogeniseres vævene til 1-2 min under kolde forhold (prøver på is spand), indtil ingen klumper af væv er synlige.
  3. Vævs ekstrakterne underkastes straks centrifugering i køle centrifugen ved 9.600 x g i 5 minutter ved 4 °c.
  4. Fjern rørene fra centrifugen og Placer dem på isspanden.
  5. Saml supernatanten i et nyt mærket mikrofuge-rør og opbevar på is. Kassér pellet.
  6. Der fremstilles separate aliquoter af Supernatanterne til LH og VEGF-en enzym-forbundet immunosorbent assays (ELISA) og total proteinanalyse for at undgå fryse-tø-cyklusser.

4. ELISA-analyse af kvæg og svin LH

  1. Alle ELISA-analysekomponenter, der er inkluderet i det kommercielt tilgængelige, luteiniserende hormon (LH) ELISA-Kit (Se tabel over materialer) ved 2-8 °c. Dette omfatter antistof, HRP-konjugat, analyse plade (96 brønd), kalibratorer, vaskebuffer (20x koncentrat), substrat A, substrat B og stopopløsning. Forbered alle reagenser som anbefalet i fabrikantens anvisninger.
  2. Før analysen påbegyndes, skal alle reagenser og analyse plader bringes i stuetemperatur (RT). Brug det påkrævede antal brønde til analysen, Forsegl og opbevar de ubrugte brønde ved 4 °C, indtil de anvendes.
  3. Vask bufferen (15 mL 20x koncentrat) fortyndes til 300 mL med dobbeltdestilleret vand.
  4. Indstil de blanke brønde uden nogen løsning.
  5. Tilsæt 50 μL standard eller prøve til hver brønd (n = 2), og tilsæt derefter yderligere 50 μL peberrod peroxidase (HRP)-konjugat til hver brønd. Tilsæt straks yderligere 50 μL antistof opløsning til hver brønd. Forsegl pladen, bland godt, og Inkuber i 1 time ved 37 °C.
  6. Vask brøndene med 1x vaskebuffer (200 μL/brønd) og Gentag 4X.
  7. Tilsæt 50 μL substrat A og 50 μL substrat B til hver brønd, og bland godt ved at tappe forsigtigt pladen på siden. Forsegl pladen og Inkuber i 15 min ved 37 °C i mørke i 15 minutter.
  8. Tilsæt 50 μL stopopløsning til hver brønd, Tap forsigtigt pladen, og Læs pladen ved hjælp af Spektrofotometer indstillet til en 450 nm bølgelængde.
  9. Normalisere niveauet af kvæg og Porcin LH til totalt protein (se punkt 6).

5. kvæg og svin VEGF-en ELISA-analyse

  1. Opbevar alle ELISA-analysekomponenter inkluderet i den kommercielt tilgængelige vaskulære Endotelvækstfaktor-en ELISA-kits (Se tabel over materialer) ved 2-8 °c. Dette omfatter antistof, HRP-konjugat, analyse plade (96 brønd), kalibratorer, vaskebuffer (20x koncentrat), substrat A, substrat B og stopopløsning. Klargør alle reagenserne som anbefalet i fabrikantens anvisninger.
  2. Før analysen påbegyndes, bringes alle reagenser og analyse plader til RT. Brug det påkrævede antal brønde til analysen, Forsegl og opbevar de ubrugte brønde ved 4 °C, indtil de anvendes.
  3. Vask bufferen (15 mL 20x koncentrat) fortyndes til 300 mL med dobbeltdestilleret vand.
  4. Tilsæt 100 μL af standarden eller prøven til hver brønd (n = 2). Forsegl pladen, bland godt, og Inkuber i 2 timer ved 37 °C.
  5. Fjern væsken i hver brønd og tilsæt 100 μL detekterings reagens A til hver brønd, Forsegl pladen, og Inkuber i 1 time ved 37 °C.
  6. Vask brøndene med 1x vaskebuffer (400 μL/brønd) og Gentag 4X.
  7. Tilsæt 100 μL detekterings reagens B til hver brønd, og bland godt ved at tappe forsigtigt pladen på siden. Pladen forseges, og pladen inkubates i 1 time ved 37 °C.
  8. Vask brøndene med 1x vaskebuffer (400 μL/brønd) og Gentag 4X.
  9. Tilsæt 90 μL substratopløsning til hver brønd, tryk forsigtigt på pladen, og Inkuber i 1 time ved 37 °C.
  10. Tilsæt 50 μL stopopløsning til hver brønd, Tap forsigtigt pladen, og Læs pladen ved hjælp af Spektrofotometer indstillet til en 450 nm bølgelængde.
  11. Normalisere kvæg og svin VEGF-A niveauer til total protein (punkt 6).

6. samlet protein overslag

  1. Beregn totalt protein af kvæg-og Porcin nyre ekstrakter ved standard-serumalbumin (BSA) ved hjælp af et kommercielt Kit (Se tabel over materialer) i henhold til fabrikantens anbefalinger.

7. statistisk analyse

  1. Beregn middelværdien, median og standardafvigelsen for hver analysand.
  2. Test divergens af prøve fordeling fra normal udnytte Kolmogorov-Smirnov test til at afgøre, ved brug, mellem parametrisk vs. ikke-parametrisk statistisk prøvning. Hvis data normalt distribueres, skal du udføre statistisk testning via parametriske tests.
  3. Under passende omstændigheder (såsom normal data distribution), anvende regressionsmodeller til at undersøge den lineære forholdet mellem LH og VEGF-A.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Middelværdien og median niveauerne af LH og VEGF efter animalsk type og køn er vist i tabel 1. Efter kontrol af normalitet af data ved Kolmogorov-Smirnov test af normalitet, lineære regressionsmodeller blev udnyttet til at undersøge forholdet mellem LH og VEGF. LH viste sig at være en stærk og signifikant prædiktor for VEGF i både kvæg-og svinenyrer (bovin nyre model: n = 7, R2 = 0,86, p = 0,002; Porcin nyre model: n = 7; R2 = 0,66, p = 0,025).

Det lineære LH/VEGF-forhold illustreres i figur 1 (bovin regressionsmodel) og figur 2 (svine regressionsmodel). Den lineære bovin ligning er som følger: VEGF Level = 2,156 x LH niveau + 68,75. Den svine lineære ligning er som følger: VEGF niveau = 196,7 x LH niveauer + 47,94.

Eksempel type Mænd Kvinder Alle
Bovint nyrer n = 4 n = 3 n = 7
LH (mIU/mg totalt protein) Gennemsnit: 27,47 (SD 13,3) Gennemsnit: 19,5 (SD 2,1) Gennemsnit: 24,06 (SD 10,8)
Median: 25,7 Median: 19,9 Median: 19,9
VEGF (PG/mg totalt protein) Gennemsnit: 126,2 (SD 25,8) Gennemsnit: 106,0 (SD 14,5) Gennemsnit: 120,6 (SD 25,1)
Median: 131,6 Median: 103,5 Median: 110,8
Porcin nyrer n = 4 n = 3 n = 7
LH (mIU/mg totalt protein) Gennemsnit: 13,2 (SD 3,6) Gennemsnit: 12,3 (SD 5,5) Gennemsnit: 12,8 (SD 4,5)
Median: 13,6 Median: 10,3 Median: 11,2
VEGF (PG/mg totalt protein) Gennemsnit: 2987,2 (SD 772,5) Gennemsnit: 2354,1 (SD 932,4) Gennemsnit: 2715,9 (SD 901,0)
Median: 3324,67 Median: 2377,3 Median: 3226,4

Tabel 1: gennemsnitlige og mediane LH-og VEGF-niveauer efter animalsk type og køn.

Figure 1
Figur 1: LH/VEGF-lineær sammenhæng i voksne bovinnyrer (n = 7). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: LH/VEGF-lineær sammenhæng i voksne svinenyrer (n = 7). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

At fremskaffe nyrer fra slagteriet umiddelbart efter dyrenes død er nøglen til succes i denne metode. Dette er den største fordel ved at udnytte organer fra køer og grise i stedet for menneskelige Kadaverer. Der er normalt mindst en 12-24 h forsinkelse fra dødstidspunktet, indtil menneskelige Kadaver organer indkøbes. Fordi den kemiske sammensætning af kropsorganer signifikant ændringer inden for 2 h post mortem15,16, VEGF-undersøgelser i human Kadaver nyrer kan ikke afspejle virkelige omstændigheder. Selv om protokollen i høj grad understreger betydningen af umiddelbar udtagning og placering af animalske organer på is efter ekstraktion, er det ikke kendt, om andre forskere også prioritere dette trin. For eksempel angav afsnittet metodologi i en nylig undersøgelse (ved hjælp af kvæg-og svinenyrer til påvisning af restkoncentrationer af antibiotika) ikke tidsforsinkelsen mellem dyrenes død og udtagning/køling af organerne17.

Denne undersøgelse måler analytterne af interesse (VEGF og LH) med kommercielt tilgængelige, artsspecifikke ELISAs. ELISAs er meget følsom, enkel at udføre assays med, og give robuste resultater18. Et kritisk skridt i protokollen er normaliseringen af (ELISA-målte) analysand niveauer af total protein. Den kortikale nyre ekstrakt er et meget heterogene biologisk stof. I lyset heraf er en korrektionsfaktor afgørende for, at der kan sammenlignes med analysand niveauer mellem dyrene. Således normaliseret af total protein blev udført, da vi og andre har med succes normaliseret andre heterogene biologiske stoffer (dvs., urin, tørrede blod pletter, og glasfri væske) på samme måde9,19,20.

En forudgående undersøgelse viste, at korrelationen mellem LH og VEGF i glasfri væske (fra kvæg og svin) kun manifesterer sig efter normalisering ved total protein6. Det er vigtigt, at dette normaliserings trin ofte udelades i publicerede VEGF-undersøgelser, især i dem, der involverer ELISA-assays. I stedet udtrykkes VEGF-niveauerne ofte i enheder som pikogram pr. milliliter (og ikke som pikogram pr. milligram total protein). For eksempel blev ingen af de glasholdige VEGF-målinger i ni forskellige Elisa-studier (som indgik i en glaslegemet VEGF Review-artikel) normaliseret ved en hvilken som helst korrektionsmetode21,22. Denne mangel på VEGF normalisering i ELISA-undersøgelser kan delvist forklare, hvorfor VEGF endnu ikke er blevet verificeret som en gyldig biomarkør21,22.

På trods af den begrænsede stikprøvestørrelse af de repræsentative data (kvæg, n = 7, svin, n = 7) viser denne protokol et stærkt og signifikant lineært forhold mellem LH og VEGF i både kvæg-og svine nyrerne. Når det er sagt, var der ikke en stor nok stikprøvestørrelse til at udføre multivariat analyser justeret for køn. Vi planlægger at gentage denne undersøgelse med større prøvestørrelser, så sådanne analyser kan udføres. Ikke desto mindre understøtter de præsenterede resultater den potentielle Association mellem LH og VEGF i pattedyrs nyrer.

Det forventes, at dette arbejde vil bidrage til yderligere forståelse af homeostatisk regulering af VEGF i nyrerne. Både kvaliteten af denne metode og resultaternes robusthed illustreres af reproducerbarhed af resultaterne i to forskellige arter. Da dyr bestemt til kødproduktion er sunde, er brugen af nyre ekstrakter fra slagteri dyrene primært til at studere fysiologi; Men, deres organer er mindre nyttige for at studere patologi, som er den vigtigste begrænsning af deres anvendelse. Alt i alt er brugen af renale ekstrakter fra køer og grise en fremragende, økonomisk og rigelig ressource til studiet af normale voksne nyrer. Endelig viser protokollen effektiviteten af at udnytte det samlede protein til normalisering, især når man undersøger korrelationer mellem VEGF og andre analytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Zietchick Research Institute (ZRI) er et privat (for-profit) forskningsinstitut, og Dr. Tammy Movsas (grundlægger og direktør for ZRI) har en verserende patentansøgninger og validerede patenter for brug af gonadotropin antagonister til behandling af okulære sygdomme og diabetes. Andet end at være en medarbejder (biokemiker) på ZRI, Dr. A. Muthusamy har ingen andre finansielle konflikter til at rapportere. A. Arivalagan (sommer praktikant hos ZRI, bachelor studerende ved University of Michigan) har ingen andre finansielle konflikter at rapportere.

Acknowledgments

Forfatterne takker Scholl slagteri (Blissfield, MI) for levering af kvæg-og svine nyrerne. Der blev ikke udnyttet nogen tilskudsfinansiering til denne undersøgelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine LH ELISA Kit MyBiosource, San Diego, CA. MBS700951
Bovine VEGF-A ELISA Kit MyBiosource, San Diego, CA. MBS2887434
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. 23235
Porcine LH ELISA Kit MyBiosource, San Diego, CA. MBS009739
Porcine VEGF-A ELISA Ray Biotech, Norcross, GA. ELP-VEGFA-1
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. 89901

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104, (36), 14448-14453 (2007).
  2. Majumder, S., Advani, A. VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing. Journal of Diabetes and its Complications. 31, (1), 273-279 (2017).
  3. Liu, E., et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions. Journal of the American Society of Nephrology. 18, (7), 2094-2104 (2007).
  4. Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. Journal of Clinical Investigation. 111, (5), 707-716 (2003).
  5. Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocrine Reviews. 25, (4), 581-611 (2004).
  6. Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes. Current Eye Research. 43, (8), 1041-1044 (2018).
  7. Babitha, V., et al. Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells. General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).
  8. Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2. Biology of Reproduction. 92, (1), 15 (2015).
  9. Movsas, T. Z., et al. Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram. Neuroscience. 385, 1-10 (2018).
  10. Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development. Current Eye Research. 43, (10), 1286-1289 (2018).
  11. Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA. Molecular Endocrinology. 6, (12), 2210-2218 (1992).
  12. Lei, Z. M., et al. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Molecular Endocrinology. 15, (1), 184-200 (2001).
  13. Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney International. 65, (6), 2003-2017 (2004).
  14. Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level. Endocrinology. 146, (8), 3224-3232 (2005).
  15. Ondruschka, B., et al. Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response. International Journal of Legal Medicine. 133, (3), 871-881 (2019).
  16. Swain, R., et al. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).
  17. Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor. Talanta. 172, 120-125 (2017).
  18. Konstantinou, G. N. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).
  19. Levesque, B. M., et al. Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity. Neonatology. 104, (1), 56-64 (2013).
  20. Leviton, A., et al. Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns. Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).
  21. Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators of Inflammation. 872978 (2012).
  22. Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF. Neurochemical Research. 36, (4), 655-667 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics