Demonstrieren einer linearen Beziehung zwischen vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor und Luteinizing Hormone in Nieren-Cortex-Extrakte

Biology

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Summary

Präsentiert hier ist ein Protokoll für die Verwendung einer kortikalen Nierenextrakt Präparat und Gesamtprotein Normalisierung, um die Korrelation zwischen vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor und luteinisierendes Hormon in der Säugetierniere zu demonstrieren.

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Muthusamy, A., Arivalagan, A., Movsas, T. Z. Demonstrating a Linear Relationship Between Vascular Endothelial Growth Factor and Luteinizing Hormone in Kidney Cortex Extracts. J. Vis. Exp. (155), e60785, doi:10.3791/60785 (2020).

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Abstract

Vaskulärer endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) hilft, Angiogenese und vaskuläre Durchlässigkeit in der Niere zu kontrollieren. Nierenerkrankungen, wie diabetische Nephropathie, sind mit VEGF-Dysregulation in der Niere verbunden. Die Faktoren, die VEGF unter physiologischen Bedingungen in der Niere regieren, sind nicht gut verstanden. Luteinizing Hormon (LH), ein pro-angiogenes Hormon, hilft, physiologische VEGF-Expression in Fortpflanzungsorganen zu regulieren. Da LH-Rezeptoren in der Niere gefunden werden, haben wir am Zietchick Research Institute hier vermutet, dass LH auch hilft, die VEGF-Expression in der Niere zu regulieren. Um Beweise zu liefern, wollten wir zeigen, dass LH-Spiegel in der Lage sind, VEGF-Spiegel in der Säugetierniere vorherzusagen. Bei den meisten VEGF-bezogenen Untersuchungen mit der Niere wurden Säugetiere niedrigerer Ordnung als Modelle verwendet (d. h. Nagetiere und Kaninchen). Um diese Arbeit auf den menschlichen Körper zu übersetzen, wurde beschlossen, die Beziehung zwischen VEGF und LH bei Säugetieren höherer Ordnung (d. h. Rinder- und Schweinemodelle) zu untersuchen. Dieses Protokoll verwendet das gesamte Proteinlysat aus dem Nierenkortex. Zu den Schlüsseln zum Erfolg dieser Methode gehören die Beschaffung von Nieren von Schlachthoftieren unmittelbar nach dem Tod sowie die Normalisierung des Analytspiegels (im Nierenextrakt) durch das Gesamtprotein. Diese Studie zeigt erfolgreich eine signifikante lineare Beziehung zwischen LH und VEGF sowohl bei Rinder- als auch in Schweinenieren. Die Ergebnisse sind in zwei verschiedenen Arten reproduzierbar. Die Studie liefert Belege dafür, dass die Verwendung von Nierenextrakten von Kühen und Schweinen eine ausgezeichnete, wirtschaftliche und reichlich vorhandene Ressource für die Untersuchung der Nierenphysiologie ist, insbesondere zur Untersuchung der Korrelation zwischen VEGF und anderen Analyten.

Introduction

Vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor A (VEGF-A), hilft, Angiogenese und vaskuläre Permeabilität in der Niere und anderen Organen1,2 (im Folgenden WIRD VEGF-A als VEGF bezeichnet werden) zu regulieren. VEGF-Spiegel in der Niere sind unter strenger panostatischer Kontrolle. Wenn die VEGF-Spiegel der Nieren erhöht oder depressiv sind, kann die Niere fehlamwerden. Zum Beispiel entwickeln Mäuse mit podozytspezifischer Heterozygosität für VEGF innerhalb von 3 Wochen nach der Geburt Endotheliose und blutlose Glomeruli (d. h. Nierenläsionen, die bei menschlicher Präeklampsie beobachtet werden), und Nierenversagen im Endstadium tritt in diesen Heterozygoten im Alter von 3 Monaten auf. Podozyten-spezifische homozygote Knockouts sterben an Hydrops und Nierenversagen innerhalb von 1 Tag nach der Geburt3,4.

Auf der anderen Seite verursacht überexpression von renalem VEGF Proteinurie und glomeruläre Hypertrophie3,4. Zum Beispiel zeigen transgene Kaninchen, die VEGF überexpressen, progressive Proteinurie mit erhöhten glomerulären Filtrationsraten in frühen Stadien der Nephropathie, gefolgt von verringerten glomerulären Filtrationsraten in späteren Stadien3. Diabetische Nephropathie, eine Hauptursache für Nierenerkrankungen im Endstadium bei diabetischen Erwachsenen, ist stark mit VEGF-Dysregulation2,5verbunden. Der Rolle der Hypoxie bei der Induktion der VEGF-Expression unter pathologischen Bedingungen wurde große Aufmerksamkeit gewidmet5. Die Faktoren, die VEGF unter physiologischen Bedingungen (sowohl in der Niere als auch in anderen Organen) beeinflussen, sind jedoch nicht gut verstanden2,6. Die Identifizierung dieser Faktoren (mit Ausnahme von Sauerstoff), die an der physiologischen und pathologischen VEGF-Regulierung beteiligt sind, ist ein wichtiges Unterfangen.

Luteinisierendes Hormon (LH), ein pro-angiogenes Hormon, hilft, die physiologische VEGF-Expression in Fortpflanzungsorganen wie Eierstock und Hoden7,8zu regulieren. Frühere Studien haben Beweise dafür erbracht, dass LH auch hilft, VEGF in nicht-reproduktiven Organen zu regulieren, wie die Augen6,9,10. LH-Rezeptoren finden sich in der Medulla und Demkorteder der Niere11,12. Bemerkenswert ist, dass nierenröhrenförmige Epithelzellen sowie der LH-Rezeptor VEGF11,12,13,14ausdrücken. Unter Berücksichtigung dieser beiden Beobachtungen haben wir vermutet, dass LH auch hilft, die VEGF-Expression in derNiere zuregulieren 13,14. Um Beweise für diese LH/VEGF-Beziehung zu liefern, soll das vorgestellte Protokoll zeigen, dass LH-Spiegel in der Lage sind, VEGF-Spiegel in der Niere vorherzusagen. Viele frühere VEGF-bezogene Untersuchungen mit der Niere haben Säugetiermodelle niedrigerer Ordnung verwendet (d. h. Nagetiere und Kaninchen)2. Um diese Arbeit auf den menschlichen Körper zu übersetzen, untersucht die Studie die Beziehung zwischen VEGF und LH bei Säugetieren höherer Ordnung (hier Rinder- und Schweinemodelle). Um dieses Ziel zu erreichen, wurde das Gesamteproteinlysat aus der Kortexregion von Rinder- und Schweinenieren hergestellt.

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Protocol

Für diese Studie wurden keine lebenden oder experimentellen Tiere verwendet.

1. Gewebehandhabung

  1. Beschaffen Sie Rinder und Schweine ganze Nieren unmittelbar nach der Schlachtung aus einem Schlachthof. Transport auf Eis zum Labor.
  2. Bei der Ankunft im Labor die Nieren mit 50 ml eiskaltem Phosphat gepufferter Saline (PBS) abspülen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x, um Blut vollständig zu entfernen.
  3. Halten Sie die Nieren bis zur weiteren Extraktion auf Eis (oder gekühlt).

2. Dissektion der Nieren

  1. Verwenden Sie sterile Schere, Zangen, ein Messer und Petrischalen, um die Nieren zu sezieren und die erforderliche Gewebeportion zu verbrauchen.
  2. Bereiten Sie RIPA-Lysepuffer vor der Nierensektion vor. 5 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 M Tris (pH = 8,0), NP-40 (ID + GEPAL CA-630), 10% Natriumdesoxycholat und 10% SDS in doppelt destilliertem Wasser auflösen, dann gründlich mischen. Kühlen Sie den RIPA-Lysepuffer, wenn er nicht verwendet wird.
  3. Schneiden Sie die Niere vorsichtig in die Hälfte (sagittale Ebene) und schneiden Sie ein Stück Gewebe (50-70 mm2) aus dem Kortexbereich in der Mitte der Niere (mit einem Gewicht von 80-100 mg durch Nassgewicht).
  4. Den Gewebeblock mit einem Messer in kleine Stücke zerkleinern, um den Homogenisierungsprozess zu unterstützen.
  5. Nach dem Zerminieren des Gewebes in ein Mikrofugenrohr mit 1 ml eiskaltem 1x RIPA-Lyseextraktionspuffer. Legen Sie die Rohre bis zur weiteren Extraktion in Eis.

3. Gewebehomogenisierung

  1. Beschriften Sie die Mikrofugenröhrchen mit spezifischen Probendetails für die Gewebeüberstandsammlung.
  2. Mit einem Handhomogenisator mit einer sterilen Sonde, dann homogenisieren Sie das Gewebe für 1-2 min bei kalten Bedingungen (Proben auf Eiskübel), bis keine Teile von Geweben sichtbar sind.
  3. Die Gewebeextrakte sofort zur Zentrifugierung in der gekühlten Zentrifuge bei 9.600 x g für 5 min bei 4 °C unterziehen.
  4. Entfernen Sie die Rohre aus der Zentrifuge und legen Sie sie auf den Eiskübel.
  5. Sammeln Sie den Überstand in einem neuen beschrifteten Mikrofugenrohr und lagern Sie auf Eis. Entsorgen Sie das Pellet.
  6. Bereiten Sie separate Aliquots der Überstande für LH- und VEGF-A-Enzym-linked Immunosorbent Assays (ELISA) bzw. die gesamte Proteinanalyse vor, um Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.

4. Rinder und Schweine LH ELISA Assay

  1. Bewahren Sie alle ELISA-Assay-Komponenten im handelsüblichen luteinisierenden Hormon (LH) ELISA-Kit (siehe Materialtabelle) bei 2-8 °C auf. Dazu gehören Antikörper, HRP-Konjugat, Assayplatte (96 gut), Kalibratoren, Waschpuffer (20x Konzentrat), Substrat A, Substrat B und Stop-Lösung. Bereiten Sie alle Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  2. Bevor Sie mit dem Test beginnen, bringen Sie alle Reagenzien und Assayplatten auf Raumtemperatur (RT). Verwenden Sie die erforderliche Anzahl von Brunnen für den Assay, Versiegeln und halten Sie die ungenutzten Brunnen bei 4 °C bis zum Gebrauch.
  3. Den Waschpuffer (15 ml 20x Konzentrat) mit doppelt destilliertem Wasser auf 300 ml verdünnen
  4. Richten Sie die leeren Brunnen ohne Lösung ein.
  5. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l Standard oder Probe hinzu (n = 2), und fügen Sie dann jedem Brunnen weitere 50 l Meerrettichperoxidase (hrp)-Konjugat hinzu. Fügen Sie sofort weitere 50 L Antikörperlösung zu jedem Brunnen hinzu. Die Platte versiegeln, gut mischen und 1 h bei 37 °C bebrüten.
  6. Waschen Sie die Brunnen mit 1x Waschpuffer (200 l/well) und wiederholen Sie 4x.
  7. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l Substrat A und 50 l Substrat B hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie die Platte an der Seite sanft anzapfen. Die Platte versiegeln und 15 min bei 37 °C im Dunkeln 15 min inkubieren.
  8. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l Stop-Lösung hinzu, tippen Sie vorsichtig auf die Platte und lesen Sie die Platte mit dem Spektralphotometer, das auf eine Wellenlänge von 450 nm eingestellt ist.
  9. Normalisieren Sie den LH-Gehalt von Rindern und Schweinen auf das Gesamtprotein (siehe Abschnitt 6).

5. Rinder- und Schweine-VEGF-A ELISA-Test

  1. Bewahren Sie alle ELISA-Assay-Komponenten in den handelsüblichen Vascular Endothelial Growth Factor-A ELISA-Kits (siehe Materialtabelle)bei 2-8 °C auf. Dazu gehören Antikörper, HRP-Konjugat, Assayplatte (96 gut), Kalibratoren, Waschpuffer (20x Konzentrat), Substrat A, Substrat B und Stop-Lösung. Bereiten Sie alle Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  2. Bevor Sie mit dem Test beginnen, bringen Sie alle Reagenzien und Assayplatten auf RT. Verwenden Sie die erforderliche Anzahl von Brunnen für den Assay, versiegeln und halten Sie die ungenutzten Brunnen bei 4 °C bis zum Gebrauch.
  3. Den Waschpuffer (15 ml 20x Konzentrat) mit doppelt destilliertem Wasser auf 300 ml verdünnen
  4. Fügen Sie jedem Bohrwert 100 l des Standards oder der Probe hinzu (n = 2). Die Platte versiegeln, gut mischen und 2 h bei 37 °C bebrüten.
  5. Entfernen Sie die Flüssigkeit in jedem Brunnen und fügen Sie 100 l Detektionsreagenz A zu jedem Brunnen hinzu, versiegeln Sie die Platte und brüten sie 1 h bei 37 °C.
  6. Waschen Sie die Brunnen mit 1x Waschpuffer (400 l/well) und wiederholen Sie 4x.
  7. Fügen Sie jedem Brunnen 100 l Detektionsreagenz B hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie die Platte an der Seite sanft anzapfen. Versiegeln Sie die Platte und bebrüten Sie die Platte für 1 h bei 37 °C.
  8. Waschen Sie die Brunnen mit 1x Waschpuffer (400 l/well) und wiederholen Sie 4x.
  9. Fügen Sie jedem Brunnen 90 L Substratlösung hinzu, tippen Sie vorsichtig auf die Platte und brüten sie 1 h bei 37 °C.
  10. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l Stop-Lösung hinzu, tippen Sie vorsichtig auf die Platte und lesen Sie die Platte mit dem Spektralphotometer, das auf eine Wellenlänge von 450 nm eingestellt ist.
  11. Renormalisieren Sie den VEGF-A-Gehalt von Rindern und Schweinen auf das Gesamtprotein (Abschnitt 6).

6. Proteinschätzung insgesamt

  1. Schätzen Sie das Gesamtprotein der Rinder- und Schweinenierenextrakte anhand des Standard-Serumalbumins (BSA) anhand eines kommerziellen Kits (siehe Materialtabelle) gemäß den Empfehlungen des Herstellers.

7. Statistische Analyse

  1. Berechnen Sie den Mittelwert, den Median und die Standardabweichung jedes Analyten.
  2. Testen Sie die Divergenz der Probenverteilung von der normalen Verwendung Kolmogorov-Smirnov Test zu entscheiden, nach der Verwendung, zwischen parametrischen vs. nicht-parametrischen statistischen Tests. Wenn die Daten normal verteilt sind, führen Sie statistische Tests über parametrische Tests durch.
  3. Unter geeigneten Umständen (z. B. normaler Datenverteilung) sollten Regressionsmodelle die lineare Beziehung zwischen LH und VEGF-A untersucht werden.

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Representative Results

Der Mittelwert und der Median von LH und VEGF nach Tiertyp und Geschlecht sind in Tabelle 1dargestellt. Nach der Überprüfung der Normalität der Daten durch Kolmogorov-Smirnov Prüfung der Normalität, lineare Regressionsmodelle wurden verwendet, um die Beziehung zwischen LH und VEGF zu untersuchen. LH erwies sich als starker und signifikanter Prädiktor von VEGF sowohl bei Rinder- als auch bei Schweinenieren (Rindernierenmodell: n = 7, R2 = 0,86, p = 0,002; Schweinenierenmodell: n = 7; R2 = 0,66, p = 0,025).

Die lineare LH/VEGF-Beziehung ist in Abbildung 1 (Rinderregressionsmodell) und Abbildung 2 (Schweineregressionsmodell) dargestellt. Die lineare Rindergleichung ist wie folgt: VEGF-Niveau = 2,156 x LH-Pegel + 68,75. Die lineare Gleichung für Schweine ist wie folgt: VEGF-Niveau = 196,7 x LH-Spiegel + 47,94.

Beispieltyp Männer Frauen Alle
Rindernieren n = 4 n = 3 n = 7
LH (mIU/mg Gesamtprotein) Mittelwert: 27,47 (SD 13,3) Mittelwert: 19.5 (SD 2.1) Mittelwert: 24.06 (SD 10.8)
Median: 25,7 Median: 19,9 Median: 19,9
VEGF (pg/mg Gesamtprotein) Mittelwert: 126,2 (SD 25,8) Mittelwert: 106.0 (SD 14.5) Mittelwert: 120,6 (SD 25,1)
Median: 131,6 Median: 103,5 Median: 110.8
Porcine Nieren n = 4 n = 3 n = 7
LH (mIU/mg Gesamtprotein) Mittelwert: 13,2 (SD 3.6) Mittelwert: 12.3 (SD 5.5) Mittelwert: 12.8 (SD 4.5)
Median: 13,6 Median: 10,3 Median: 11.2
VEGF (pg/mg Gesamtprotein) Mittelwert: 2987.2 (SD 772.5) Mittelwert: 2354.1 (SD 932.4) Mittelwert: 2715.9 (SD 901.0)
Median: 3324,67 Median: 2377,3 Median: 3226,4

Tabelle 1: Mittlerer und Median der LH- und VEGF-Spiegel nach Tiertyp und Geschlecht.

Figure 1
Abbildung 1: LH/VEGF lineare Beziehung bei erwachsenen Rindernieren (n = 7). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: LH/VEGF lineare Beziehung bei erwachsenen Schweinenieren (n = 7). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die Beschaffung von Nieren aus dem Schlachthof unmittelbar nach dem Tod der Tiere ist der Schlüssel zum Erfolg in dieser Methodik. Dies ist der Hauptvorteil der Verwendung von Organen von Kühen und Schweinen anstelle von menschlichen Leichen. Es gibt in der Regel mindestens eine Verzögerung von 12-24 h vom Zeitpunkt des Todes bis zur Beschaffung menschlicher Kadaverorgane. Da sich die chemische Zusammensetzung der Körperorgane innerhalb von 2 h postmortal15,16signifikant verändert, spiegeln VEGF-Studien an menschlichen Kadavernieren möglicherweise keine realen Umstände wider. Obwohl das Protokoll die Bedeutung der sofortigen Beschaffung und Platzierung von tierischen Organen auf Eis nach der Extraktion stark betont, ist es nicht bekannt, ob auch andere Forscher diesen Schritt priorisieren. So wurde beispielsweise im Methodologieteil einer aktuellen Studie (unter Verwendung von Rinder- und Schweinenieren zum Nachweis von Antibiotikarückständen) die Zeitliche Verzögerung zwischen Tiertod und Beschaffung/Kühlung der Organe nicht angegeben17.

Diese Studie misst die Analyten von Interesse (VEGF und LH) mit kommerziell erhältlichen, artspezifischen ELISAs. ELISAs sind hochsensibel, einfach durchzuführen as-as-tests mit und liefern robuste Ergebnisse18. Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die Normalisierung der (ELISA-gemessenen) Analytspiegel durch das Gesamtprotein. Der kortikale Nierenextrakt ist eine sehr heterogene biologische Substanz. Vor diesem Hintergrund ist ein Korrekturfaktor unerlässlich, damit die Analytgehalte zwischen Tieren verglichen werden können. So wurde die Normalisierung durch das Gesamtprotein durchgeführt, da wir und andere erfolgreich andere heterogene biologische Substanzen (d.h. Urin, getrocknete Blutflecken und Glaskörperflüssigkeit) auf die gleiche Weise normalisiert haben9,19,20.

Eine vorherige Studie zeigte, dass sich die Korrelation zwischen LH und VEGF in Glaskörperflüssigkeit (aus Rinder- und Schweineaugen) erst nach normalisiert durch das Gesamtprotein6manifestiert. Wichtig ist, dass dieser Normalisierungsschritt häufig in veröffentlichten VEGF-Studien weggelassen wird, insbesondere bei ELISA-Assays. Stattdessen werden DIE VEGF-Spiegel oft in Einheiten wie Piktogramm pro Milliliter (und nicht als Piktogramm pro Milligramm Gesamtprotein) ausgedrückt. Zum Beispiel wurden keine der Glaskörper-VEGF-Messungen in neun verschiedenen ELISA-Studien (die in einem Glaskörper-VEGF-Prüfartikel enthalten waren) durch eine Korrekturmethode21,22normalisiert. Dieser Mangel an VEGF-Normalisierung in ELISA-Studien kann teilweise erklären, warum VEGF noch nicht als gültiger Biomarker21,22verifiziert wurde.

Trotz des begrenzten Stichprobenumfangs der repräsentativen Daten (Rinder, n = 7; Schweinefleisch, n = 7) zeigt dieses Protokoll eine starke und signifikante lineare Beziehung zwischen LH und VEGF sowohl bei Rindern als auch in Schweinenieren. Allerdings gab es nicht genügend Stichproben, um geschlechtsspezifische multivariate Analysen durchzuführen. Wir planen, diese Studie mit größeren Stichprobengrößen zu wiederholen, damit solche Analysen durchgeführt werden können. Dennoch unterstützen die vorgestellten Ergebnisse den möglichen Zusammenhang zwischen LH und VEGF in der Säugetierniere.

Es wird erwartet, dass diese Arbeit dazu beitragen wird, das Verständnis der patostatischen Regulation von VEGF in der Niere zu fördern. Sowohl die Qualität dieser Methodik als auch die Robustheit der Ergebnisse werden durch die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse in zwei verschiedenen Arten veranschaulicht. Da Tiere, die für die Fleischproduktion bestimmt sind, gesund sind, dient die Verwendung von Nierenextrakten von Schlachthoftieren in erster Linie dem Studium der Physiologie; jedoch, ihre Organe sind weniger hilfreich für das Studium der Pathologie, die die Hauptbeschränkung ihrer Verwendung ist. Alles in allem ist die Verwendung von Nierenextrakten von Kühen und Schweinen eine ausgezeichnete, wirtschaftliche und reichlichvorhandene Ressource für das Studium normaler erwachsener Nieren. Schließlich zeigt das Protokoll die Wirksamkeit der Verwendung von Gesamtprotein für die Normalisierung, insbesondere bei der Untersuchung von Korrelationen zwischen VEGF und anderen Analyten.

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Disclosures

Zietchick Research Institute (ZRI) ist ein privates (gewinnorientiertes) Forschungsinstitut, und Dr. Tammy Movsas (Gründer und Direktor von ZRI) hat eine anhängige Patentanmeldung und validierte Patente für die Verwendung von Gonadotropin-Antagonisten bei der Behandlung von Augenerkrankungen diabetes. Abgesehen davon, dass Dr. A. Muthusamy Mitarbeiter (Biochemiker) bei ZRI ist, hat er keine anderen finanziellen Konflikte zu melden. A. Arivalagan (Sommerpraktikant an der ZRI, Student an der University of Michigan) hat keine anderen finanziellen Konflikte zu melden.

Acknowledgments

Die Autoren danken Scholl es Slaughterhouse (Blissfield, MI) für die Bereitstellung der Rinder- und Schweinenieren. Für diese Studie wurden keine Fördermittel in Höhe von zuschüssen mitteln verwendet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine LH ELISA Kit MyBiosource, San Diego, CA. MBS700951
Bovine VEGF-A ELISA Kit MyBiosource, San Diego, CA. MBS2887434
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. 23235
Porcine LH ELISA Kit MyBiosource, San Diego, CA. MBS009739
Porcine VEGF-A ELISA Ray Biotech, Norcross, GA. ELP-VEGFA-1
RIPA Lysis and Extraction Buffer ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. 89901

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