Sviluppo di un modello di infezione del pesce zebra Larval per Clostridioides difficile

Developmental Biology

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Summary

Presentato qui è un metodo sicuro ed efficace per infettare le larve di pesce zebra con C. difficile anaerobica etichettato fluorescentmente per microiniezione e microgavage non invasivo.

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Li, J., Ünal, C. M., Namikawa, K., Steinert, M., Köster, R. W. Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (156), e60793, doi:10.3791/60793 (2020).

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Abstract

Clostridioides difficile infezione (CDI) è considerato una delle infezioni gastrointestinali più comuni associate all'assistenza sanitaria negli Stati Uniti. È stata descritta la risposta immunitaria innata contro C. difficile, ma i ruoli esatti dei neutrofili e dei macrofagi nel CDI sono meno compresi. Nello studio attuale, le larve di Danio rerio (pesce zebra) vengono utilizzate per stabilire un modello di infezione da C. difficile per l'imaging del comportamento e della cooperazione di queste cellule immunitarie innate in vivo. Per monitorare C. difficile, è stato stabilito un protocollo di etichettatura utilizzando un tintura fluorescente. Un'infezione localizzata è ottenuta microiniettando etichettato C. difficile, che cresce attivamente nel tratto intestinale del pesce zebra e imita il danno epiteliale intestinale in CDI. Tuttavia, questo protocollo di infezione diretta è invasivo e provoca ferite microscopiche, che possono influenzare i risultati sperimentali. Di conseguenza, un protocollo di microgavazione più non invasivo è descritto qui. Il metodo prevede la consegna di cellule C. difficile direttamente nell'intestino delle larve di pesce zebra per intubazione attraverso la bocca aperta. Questo metodo di infezione imita da vicino il percorso di infezione naturale di C. difficile.

Introduction

C. difficile è un bacillo gram-positivo, spore-forming, anaerobico, e tossina che produce la tossina che è la causa principale di gravi infezioni nel tratto gastrointestinale1. I sintomi tipici della CDI includono diarrea, dolore addominale e colite pseudomembranosa fatale, e a volte può portare alla morte1,2. Le prove hanno dimostrato che le risposte immunitarie dell'ospite svolgono un ruolo fondamentale sia nella progressione che nell'esito di questa malattia3. Oltre alla risposta immunitaria, il microbiota intestinale indigeno è fondamentale per l'insorgenza e la patogenesi del CDI4. Nell'ultimo decennio, sia il numero di casi che il tasso di mortalità di CDI sono aumentati in modo significativo a causa dell'emergere di un ceppo ipervirulento di C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Una migliore comprensione dei meccanismi immunitari sottostanti e del ruolo del microbiota durante il CDI contribuirà a portare a nuovi sviluppi e progressi terapeutici, consentendo un migliore controllo di questa epidemia.

Diversi modelli animali, come il criceto e il topo, sono stati sviluppati per fornire informazioni sulla difesa immunitaria contro C. difficile7,8. Tuttavia, il ruolo delle cellule immunitarie innate è ancora poco compreso, soprattutto perché il comportamento delle cellule immunitarie innate è derivato principalmente dall'analisi istologica o dalle cellule coltivate in vitro. Pertanto, stabilire un modello trasparente di pesce zebra per rivelare la risposta immunitaria innata a C. difficile all'interno di un organismo vertebrato vivente faciliterà tali studi. Le larve di pesce zebra hanno un sistema immunitario innato funzionale, ma non hanno il sistema immunitario adattivo fino alle 4-6 settimane dopo la fecondazione9. Questa caratteristica unica rende le larve di pesce zebra un modello eccellente per studiare la risposta isolata e la funzione delle cellule immunitarie innate in CDI.

Questo rapporto descrive nuovi metodi che utilizzano larve di pesce zebra per studiare le interazioni tra C. difficile e cellule immunitarie innate, come macrofagi e neutrofili. In primo luogo, viene presentato un protocollo di microiniezione localizzato che include C. difficile inoculum e colorazione. Utilizzando l'imaging confocaltime in vivo, si registra la risposta dei neutrofili e dei macrofagi verso il sito di infezione e si osserva la fagocitosi dei batteri da neutrofili e macrofagi. Tuttavia, è stato riferito che l'iniezione stessa provoca danni ai tessuti e porta al reclutamento di leucociti indipendentemente dai batteri10. Pertanto, viene descritto successivamente un protocollo di microgavage non invasivo per fornire C. difficile nell'intestino delle larve di pesce zebra. Studi precedenti hanno dimostrato che il microbiota gastrointestinale indigeno protegge un ospite dalla colonizzazione di C. difficile11. Pertanto, le larve di pesce zebra gnotobiotiche sono utilizzate anche per predisporre il pesce zebra che sono infettati 12. Successivamente, viene eseguita la dissezione intestinale per recuperare C. difficile praticabile e convalidare la durata della loro presenza nei tratti intestinali del pesce zebra.

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Protocol

Tutto il lavoro sugli animali qui descritto è stato svolto in conformità con le normative giuridiche (EU-direttiva 2010/63, licenza A 325.1.53/56.1-TUBS e licenza A 33.9-42502-04-14/1418).

1. Preparazione di agarose a bassa fusione, piastra di gel e aghi microiniezione/Microgavage

  1. Sciogliere 0,08 g di agarose a bassa fusione (Table of Materials, agarose A2576) in 10 mL del 30% medio di Danieau (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 m HEPES (pH - 7,2) e 17,4 mM NaCl, conservati a temperatura ambiente (RT) per ottenere una soluzione dello 0,8%.
    NOTA: È possibile utilizzare concentrazioni superiori o inferiori di agarose. Tuttavia, il tempo necessario per solidificare varia per diverse marche di agarose, anche alla stessa concentrazione.
  2. Preparare gli aghi di microiniezione e microgavage da capillari di vetro (Tabella dei Materiali).
    1. Utilizzare un tiratore a micropipette con le seguenti impostazioni (notare che le unità sono specifiche per l'emittente qui utilizzato; vedi Tabella dei materiali): aghi di microiniezione (pressione dell'aria : 500; calore - 400; tiro : 125; velocità : 75; tempo : 150); e aghi microgavage (pressione dell'aria - 500; calore - 400; tiro : 100; velocità: 75; tempo - 150). Utilizzare una punta di microloader per caricare 3 oltere di H2O senza nuclesino nell'ago tirato.
    2. Introdurre l'ago nell'iniettore e fissarlo correttamente. Regolare l'ago ad un angolo adatto per l'iniezione. Impostare la pressione di iniezione tra 600-900 hPa per l'ago di microiniezione e 200-300 hPa per ago gavage.
    3. Posizionare una goccia di olio minerale sul cerchio nero del vetrino di calibrazione. Utilizzare pinze sottili per tagliare la punta dell'ago. Iniettare una goccia nell'olio minerale per misurare le dimensioni della goccia.
    4. Per la microiniezione, regolare il tempo di iniezione per ottenere una goccia con un diametro di 0,10–0,12 mm, che equivale a un volume di 0,5–1,0 nL. Per il microgavage, ottenere una goccia con un diametro di 0,18–0,20 mm, che equivale a un volume di 3-5 nL.
  3. Preparare una piastra di agarose dell'1,5 % con agarose (Tabella dei materiali, 8050) in un piatto di Petri di 10 cm nel mezzo di 30% Danieau utilizzando uno stampo di plastica come stampo microgavage. Conservare a 4 gradi centigradi per evitare l'idratazione fino a quando necessario. Caldo a RT o 28 gradi centigradi prima dell'esperimento.

2. Preparazione ed etichettatura di C. difficile e Spore con disteso fluorescente

  1. Preparare una soluzione di riserva da 1 mM di un tinrito fluorescente (Tabella dei materiali). Poiché il tinrito è venduto in 50 g di polvere, aggiungere 69 -L di DMSO alla fiala per ottenere una concentrazione di scorte di 1 mM.
  2. Preparare una soluzione di lavoro da 100 M del colorante fluorescente aggiungendo 2 -L di 1 mM di soluzione di riserva a 18 -L di DMSO in un tubo centrifuga, e mescolare bene.
  3. Cultura C. difficile (R20291, un ceppo ribotipo 027) inoculando 10 mL di mezzo liquido BHIS con due o tre colonie da una piastra in cappuccio anaerobico senza scuotere durante la notte. BHIS è BHI integrato con 0.5% (w/v) estratto di lievito e 0.1% (w/v) L-cysteine. Sciogliere 1 g di L-cisteina in 10 mL di ddH2O e sterilizzare per filtrazione, quindi aggiungere al mezzo autoclaved per ottenere una concentrazione finale di 1 g/L. Le piastre vengono preparate aggiungendo 15 g/L agar-agar al mezzo prima dell'autoclaving. La coltura selettiva di C. difficile viene eseguita utilizzando piastre croromidi C. difficile (Tabella dei materiali).
  4. Colorazione C. difficile con il colorante fluorescente
    1. Raccogliere C. difficile a un OD600 di 1.0–1.2 e lavare 1x con 1 mL di 1x PBS (5.000 x g per 3 min a RT). Risospendere in 1 mL di 1 x PBS.
    2. Aggiungere 3 - L di soluzione di lavoro del tintura fluorescente in 1 mL di sospensione batterica. Incubare il campione per 15 min a RT al buio. Lavare la c. difficile macchiata una volta con 1 mL PBS per rimuovere il coloranti residuo e risospendere in 1x PBS a un OD600 di 1.0 (1.0 OD600 equivale approssimativamente a 108 cfu/mL).

3. Iniezione di C. difficile macchiata nelle larve di pesce zebra

  1. Anestesizza 20-30 larve di pesce zebra a 5 giorni dopo la fecondazione (indicati come 5 dpf) con 0,02%–0,04% di tricaina (la polvere di tricaina viene sciolta in acqua a doppia distillazione e regolata a pH - 7 con soluzione Tris-HCL da 1 M) nel 30% medio di Danieau Iniezione. Trasferire le larve anestesizzate in un piatto fresco di Petri di 10 cm e rimuovere qualsiasi eccesso di 30% medio di Danieau.
  2. Mettere una goccia di agarose a bassa fusione dello 0,8% sulle larve di pesce zebra da coprire. Regolare delicatamente le larve in posizione laterale. Mettere il piatto Petri sul ghiaccio per 30-60 s per far solidificare la bassa fusione delle agarose. Aggiungere il 30% del mezzo di Danieau contenente 0,02%–0,04% di tricaina per coprire l'agarose.
  3. Preparare la soluzione di iniezione. Aggiungete 1 L dello 0,5% di fenolo rosso nella soluzione PBS a 9 l di C. difficile inoculum colorante per visualizzare il processo di iniezione.
  4. Caricare un ago di microiniezione calibrato con la soluzione di iniezione utilizzando un microloader. Montare l'ago caricato su un micromanipolatore e posizionarlo sotto uno stereoscopio.
  5. Regolare la pressione di iniezione tra 600-900 hPa. Impostare il tempo di iniezione su 0,1–0,3 s per ottenere 0,5–1,0 nL. Impostare l'ago nel micromanipolatore ad un angolo di 45 gradi che punta verso le larve incorporate.
  6. Posizionare la punta dell'ago sopra il tratto gastrointestinale vicino al poro urogenitale. Pierce attraverso agarose poi il muscolo con la punta dell'ago, quindi inserirlo nel lume intestinale e iniettare 0.5–1.0 nL di C. difficile. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per monitorare le larve iniettate e raccogliere le larve iniettate correttamente per l'imaging confocale.

4. Generazione di larve di pesce zebra gnotobiotiche

  1. Utilizzare il metodo di allevamento naturale ben consolidato per generare embrioni di pesce zebra gnotobiotici, tra cui: fecondazione in vitro, lavaggio con mezzo contenente antibiotici (1 g/mL amphotericinB, 10 g/mL di kanamycin e 20 ampicillina, lavaggio con 0,1% wt/vol polycinyl pyrrolidone-iodina (PVP-I) soluzione e incubazione degli embrioni in una cappa cellulare12.
  2. Mantenere tutte le larve di pesce zebra gnotobiotiche in condizioni gnotobiotiche fino a 5 dpf o poco prima del gavage. Dopo il gavage, le larve di pesce zebra saranno trasferite in un'incubatrice standard, ma con il mezzo sterile 30% Danieau.

5. Gavage di larve di pesce zebra

  1. Calibrare l'ago microgavage come descritto al punto 1.2.
  2. Misurare il diametro della punta dell'ago posizionando l'ago su un vetrino di calibrazione con una goccia di olio minerale. Assicurarsi che la punta sia di 30-40 m di diametro, smussata e liscia. Scartare gli aghi affilati o ruvidi.
    NOTA: I bordi taglienti degli aghi possono essere smussati da fiammeggianti veloci.
  3. Preparare la soluzione gavage come descritto nel passaggio 3.3.
  4. Caricare e montare l'ago su un micromanipolatore come descritto al punto 3.4. Regolare il micromanipolatore per posizionare l'ago con un angolo di 45 gradi.
  5. Anestesizzare le larve di pesce zebra di cui al punto 3.1. Quando le larve smettono di muoversi, trasferirle nella scanalatura di uno stampo microgavage utilizzando una pipetta Pasteur.
  6. Mettere una goccia di agarose a bassa fusione dello 0,8% sulle larve di pesce zebra da coprire. Regolare delicatamente le larve con teste rivolte in posizione verticale ad angoli di 45 gradi nella scanalatura e code contro la parete della scanalatura. Assicurarsi che gli angoli delle teste siano approssimativamente gli stessi in modo che siano allineati con l'angolo degli aghi gavage. Posizionare lo stampo microgavage sul ghiaccio per 30-60 s, permettendo alle agarose di fusione bassa di solidificare al fine di stabilizzare le posizioni delle larve.
  7. Regolare la pressione di iniezione tra 200-300 hPa. Impostare il tempo di iniezione su 0,1–0,3 s per ottenere un volume di iniezione di 3–5 nL di C. difficile.
  8. Operare delicatamente l'ago attraverso l'agarose poi nella bocca delle larve di pesce zebra, attraverso l'esofago. Una volta che la punta dell'ago è all'interno della lampadina intestinale anteriore, premere il pedale di iniezione per rilasciare i batteri. Riempire il lume dell'intestino con il volume consegnato. Non lasciate che trabocca dall'esofago o dalla cloaca. Ritirare delicatamente l'ago dalla bocca del pesce zebra.
  9. Dopo la gavage, salva le larve di pesce zebra infette dall'agarose con una punta flessibile del microloader tagliando prima l'agarose e poi sollevando le larve. Trasferire queste larve in sterile 30% Danieau medio. Sciacquare le larve in mezzo sterile due volte. Trasferire le larve in un piatto Petri fresco di 10 cm. Le larve saranno mantenute fino a 11 dpf.

6. Analisi della microscopia confocale delle larve di pesce zebra iniettate

  1. Anestesizzare le larve di pesce zebra riferito al passaggio 3.1. Fare un foro nella parte inferiore di una parabola Petri 35 mm con un vetrino di vetro collegato al foro, indicato come la camera di imaging. Trasferire gli embrioni sul fondo della camera di imaging con una quantità adeguata del mezzo di Danieau del 30%.
  2. Aggiungere 200-300 agarose di fusione basse dell'1% per coprire le larve apitizzate. Poiché viene utilizzato un microscopio confocale invertito, posizionare il più possibile la regione infetta delle larve contro lo scivolo di vetro.
  3. Lasciamo che l'agarose si solidifichi sul ghiaccio per 30-60 s. Sommergi l'agarose con il 30% danieau contenente 0,02%–0,04% di tricaina.
  4. Immagina le larve con un microscopio a scansione laser confocale (Tabella dei materiali).

7. Dissezione del pesce zebra Larvale Intestine per recuperare C vitale.

  1. Isolare i tratti gastrointestinali dalle larve per analizzare il carico batterico. Inizia con larve di pesce zebra eutanasia con 0,4 % di tricaina.
  2. Sciacquare brevemente il pesce zebra con sterile 1x PBS e trasferirli in una piastra di agarose fresca.
  3. Dissezione del pesce zebra
    1. Inserire un ago nel tronco dorsale delle larve di pesce zebra vicino alla testa per immobilizzare il pesce zebra. Togliere la testa dietro le branchie con una lancetta.
    2. Inserire il secondo ago al centro del tronco dorsale. Inserire il terzo ago nell'addome del pesce zebra e tirare l'intestino dalla cavità del corpo.
      NOTA: è necessaria una cura estrema per isolare l'intestino intatto. Se è difficile farlo, eseguire ulteriori tiri per separare il resto dell'intestino dagli organi interni rimanenti.
    3. Utilizzare un ago per microiniezione per trasferire 10-15 intestini in un tubo da 1,5 mL contenente 200 sterili di 1x PBS.
    4. Omogeneizzare l'intestino con un pestello per interrompere il tessuto e preparare gli omogenei. Assicurarsi che il pestello raggiunga il fondo del tubo per interrompere completamente tutti gli intestini.
  4. Incubare gli omogenati nel mezzo di allevamento C. difficile contenente D-cycloserine e cefoxitina, con o senza taurocholate (TCA, un germinante delle spore di C. difficile) nella camera anaerobica.
  5. Incubare la piastra anaerobicamente per 48 h a 37 gradi centigradi.
  6. Utilizzare la coltura batterica per 16S rRNA-PCR.
    1. Risospendere una colonia a 50 gradi di H2O e farla bollire a 95 gradi centigradi per 15 min. Pellet i detriti lisci per centrifugazione (14.000 rpm per 2 min a RT) e utilizzare 2 L del supernatante come modello in 25 - L di reazione PCR utilizzando primer C. difficile-specifici(Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TACG AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
    2. Quando si utilizzano batteri provenienti da colture liquide, raccogliere 1 mL di coltura e lavare una volta con 1 mL di PBS (14.000 rpm per 2 min a RT). Risospendere il pellet in 100 : L di H2Odd e trattare come fatto sopra. Per caratterizzare ulteriormente le colonie batteriche, striscia su una piastra di BHIS o cromo (Tabella dei materiali).

   

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Representative Results

C. difficile è strettamente anaerobica, ma il cromoforo delle proteine fluorescenti di solito richiede ossigeno per maturare. Per ovviare a questo problema, è stato utilizzato un coloranti fluorescente per macchiare le cellule C. difficile vive che stavano attivamente crescendo (R20291, un ceppo di ribotype 027; Figura 1A). Utilizzando il sistema Gal4/UAS, sono state generate linee di pesce zebra transgenici stabili per l'imaging dal vivo, in cui i promotori di mpeg1.1 o lyz hanno guidato l'espressione della proteina fluorescente EGFP nei macrofagi e nei neutrofili (rispettivamente) in modo dipendente da Gal4.

La macchiatura C. difficile è stata iniettata nel tratto intestinale del pesce zebra a 5 dpf, e i siti infetti sono stati immagine dopo 1 h di incubazione. L'imaging time-lapse ha mostrato che sia i neutrofili che i macrofagi hanno raggiunto i siti di infezione (Figura 1B), e il numero di queste due cellule immunitarie innate è aumentato fino a quando il C. difficile è stato eliminato. La cancellazione avvenuta per fagocitosi e digestione dell'etichetta C. difficile.

Figure 1
Figura 1: colorazione e infezione di C. difficile nel pesce zebra. (A) Fluorescently etichettati batteri C. difficile all'interno di pesci zebra infetti dopo microiniezione. Barra di scala (B) Proiezione confocale a stack che mostra neutrofili fluorescenti verdi in doppio pesce zebra transgenico Tg(ly: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFPm3 accumulati nel sito di infezione c. difficile a 2 h post-infezione (hpi). I neutrofili sono mostrati in verde e C. difficile in rosso. Barra della scala - 50 m. (C) Immagini confocali time-lapse che mostrano macrofagi etichettati gFP che fagocitono il fluorescente rosso macchiato C. difficile. Barra di scala 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Anche se la microiniezione è il metodo più comune per infettare le larve di pesce zebra con agenti patogeni, questo metodo provoca invariabilmente danni ai tessuti, che possono influenzare i risultati sperimentali. Per evitare questo problema, il microgavage è stato utilizzato per fornire C. difficile con fluorescenza nel lume intestinale delle linee di reporter di macrofagi e neutrofi a 5 dpf, che imita il percorso naturale della CDI (Figura 2A). Tuttavia, neutrofili e macrofagi non hanno mostrato un'evidente migrazione al tratto gastrointestinale fino a 12 h dopo il microgavage (Figura 2B). Nel frattempo, la fluorescenza dell'etichetta C. difficile è scomparsa dopo circa 5 h post-microgavage, probabilmente a causa di 1) distruzione enzimatica, 2) livelli di pH inappropriati nell'intestino del pesce zebra, o 3) insorgenza di formazione di spore e che accompagnano i cambiamenti della membrana nei batteri (Figura 2B). Pertanto, è stato istituito un metodo di dissezione intestinale per rilevare C. difficile.

Figure 2
Figura 2: Microgavage di larve di pesce zebra con C. difficile. (A) Immagine rappresentativa delle larve di pesce zebra a 5 dpf svasate con fluorescenza C. difficile. L'immagine è stata registrata intorno alle 3 h dopo la gavage, dimostrando che C. difficile erano presenti nell'intestino posteriore del pesce zebra. Barra della scala - 100 m. (B) Immagini time-lapse confocali che dimostrano la motilità dei macrofaci. Doppie larve di pesce zebra transgenici Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 a 5 dpf sono stati gavaged con fluorescenza etichettato C. difficile. L'imaging confocale time-lapse è stato eseguito per un massimo di 12 h. Barra della scala - 200 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per confermare se C. difficile era in grado di abitare il pesce zebra, l'intestino del pesce zebra è stato separato in vari momenti dopo la gavage. Poi, l'intestino isolato è stato omogeneizzato con pestelli di plastica, e gli omogenei sono stati incubati in C. medio contenente D-cicloserine e cefoxitine, con o senza TCA. Tuttavia, le cellule C. difficile in crescita attivamente sono state rilevate solo fino a 24 h dopo l'infezione sia con che senza TCA (dati non mostrati). Si ipotizza che le comunità microbiche indigene nelle larve convenzionali abbiano impedito l'invasione di C. difficile a causa della loro resistenza alla colonizzazione.

Sono state utilizzate anche larve di pesce zebra gnotobiotiche. Campioni intestinali 24 hpi sono stati sezionati e hanno mostrato una crescita batterica in media con TCA o senza TCA, mentre nessun batterio è cresciuto nel gruppo di controllo (Figura 3A). Tuttavia, in tempi successivi (cioè 48 hpi, 72 hpi e 120 hpi) i campioni incubati crescevano solo nel mezzo contenente TCA, il che suggeriva che il C. difficile nell'intestino si fosse formato spore (Figura 3B). Ciò fornisce una possibile spiegazione per la perdita dell'etichettatura della fluorescenza.

16S rDNA PCR è stato poi utilizzato per identificare i batteri coltivati come C. difficile, che ha prodotto specifici amplificatori PCR di dimensioni prevedibili (800 bp; Figura 3C). Questo risultato è stato ulteriormente verificato dal sequenziamento di questi prodotti PCR. Successivamente, le colture batteriche sono state diffuse su una piastra BHIS. Diverse colonie singole sono state poi trasferite su una piastra cromoide, che ha sostenuto solo la crescita di C. difficile. I batteri sono apparsi come colonie nere tipiche, che hanno ulteriormente indicato che i batteri provenienti dall'intestino del pesce zebra erano C. difficile (Figura 3D).

Figure 3
Figura 3: Rilevamento di C. difficile nell'intestino del pesce zebra dopo l'infezione. Per ciascuno degli esperimenti indipendenti, 15-20 larve di pesce zebra gnotobiotiche a 5 dpf sono state infettate con 3-5 nL di 108 CFU/mL C. difficile o PBS come controllo negativo da microgavage. (A) Gli omogenei dell'intestino sezionato sono stati coltivati. I batteri sono cresciuti nel mezzo contenente TCA 72 h dopo l'infezione delle larve di pesce zebra gnotobiotiche (1, gruppo di controllo non infetto; 2, R20291-infettato pesce zebra; n - 3). (B) L'illustrazione schematica dei risultati complessivi dell'esperimento dopo 24 h, 48 h, 72 h e 120 h dopo l'infezione con C. difficile (n ) (C) I campioni batterici sono stati testati da 16S rDNA PCR a 72 h post-microgavage (1, gruppo di controllo non infetto; 2, R20291-infetti di pesce zebra; n - 3). (D) La crescita di C. difficile su piastra cromoIDa; notare il colore nero di C. difficile, che è una caratteristica di queste piastre (n - 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Movie 1
Filmato supplementare 1. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

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Discussion

I metodi presentati modificano ed estendono un approccio esistente per infettare le larve di pesce zebra eseguendo sia iniezione che microgavage10,14. Dimostra anche un approccio per studiare gli agenti patogeni anaerobici con le larve di pesce zebra22. Inoltre, il protocollo facilita l'analisi delle risposte delle cellule immunitarie innate in vivo su CDI e sulla colonizzazione di C. difficile nel pesce zebra. Il metodo è riproducibile e facile da condurre in un laboratorio di routine o in un ambiente clinico.

Per monitorare la fagocitosi di C. difficile da leucociti, sono state utilizzate due linee di pesci zebra transgenici stabili (ad esempio, Tg[mpeg1.1: KalTA4]bz16) per visualizzare i macrofagi (KalTA4: una variante Gal4 ottimizzata per il pesce zebra) e Tg(lyz: KalTA4)bz17 e visualizzare i neutrofili quando attraversati con lo sfondo transgenico di Tg(4xUAS: EGFP) portah3m. A causa dell'ambiente anaerobico che è necessario per la crescita di C. difficile, gli strumenti genetici per tracciare C. difficile sono limitati. Anche se è stato segnalato un mCherryOpt ottimizzato per il codone per etichettarli, i batteri C. difficile devono essere fissati prima di mostrare fluorescenza prima del suo utilizzo nelle impostazioni di imaging dal vivo13. Pertanto, un coloranti fluorescente è stato utilizzato qui per macchiare C. difficile dal vivo con fluorescenza rossa, che può essere combinato con i numerosi ceppi di pesce zebra transgenici fluorescenti verdi disponibili. Questo metodo può essere facilmente applicato ad altri batteri anaerobici intestinali, come le fragilità di Bacteroides e l'epaticus di Helicobacter. I risultati rappresentativi dimostrano che sia i neutrofili che i macrofagi possono riconoscere e fare la fagocitosi A Difficile nel pesce zebra infetto.

Entrambi i metodi di immersione e microiniezione sono stati regolarmente utilizzati per infettare il pesce zebra20,21,22. L'uso di metodi di immersione è semplice, ma questo approccio rende difficile controllare con precisione il tempo di invasione dei batteri nell'intestino. La microiniezione è il metodo più comune per infettare gli embrioni di pesce zebra con agenti patogeni, ma provoca invariabilmente danni ai tessuti. Quindi, il microgavage è stato utilizzato per imitare il percorso di infezione naturale.

Tuttavia, si è scoperto che la colorante C. difficile è diventata inosservabile circa 5 h dopo il microgavage. Le ragioni di questo sono attualmente poco chiare, ma possono essere correlate all'intolleranza 1) del fluoroforo in condizioni intestinali o 2) l'avvio della formazione di spore di cellule C. difficile. Si è inoltre constatato che C. difficile non era rilevabile nella coltura degli omogenati interi. Pertanto, l'intestino di ogni pesce zebra infetto è stato sezionato poi coltivato per determinare se C. difficile ancora abitava il tessuto intestinale del pesce zebra.

A causa del microbiota indigeno dei topi convenzionali, solo i topi pretrattati con un cocktail antibiotico o topi gnotobiotici sono suscettibili a C. difficile16. Allo stesso modo, si è scoperto che C. difficile è stato rilevato solo nell'intestino del pesce zebra gnotobiotico, ma non nel tradizionale pesce zebra di tipo selvatico 24 h post-infezione. È interessante notare che i campioni intestinali di pesci zebra 48 h, 72 h e 120 h dopo l'infezione sono cresciuti solo nei supporti contenenti TCA. Come descritto sopra, la TCA stimola la germinazione c. difficile delle spore in vitro. Questo risultato suggerisce che le cellule attive di C. difficile hanno già formato spore vegetative nell'intestino del pesce zebra, e colonie derivate da spore sono state rilevate utilizzando l'approccio microgavage.

Intrigantemente, il pesce zebra privo di germi non presentava ancora alcun sintomo di CDI, come l'afflusso di neutrofili intestinali o persino la morte del pesce zebra. Questo dimostra che l'infezione per iniezione può attivare le cellule immunitarie innate ferendo e che solo i macrofagi e i neutrofili attivati sono in grado di rilevare rapidamente C. difficile. Inoltre, una probabile spiegazione per la mancanza di CDI prominente nel pesce zebra si basa sulle differenze strutturali tra il pesce zebra e l'intestino dei mammiferi17. L'intestino del pesce zebra manca di cripte intestinali, dove C. difficile si trovano spesso18. Insieme alla minore temperatura di manutenzione del pesce zebra rispetto a quella dei mammiferi, è stato dedotto che l'insorgenza della CDI nel pesce zebra non si verifica così velocemente come nei modelli di mammiferi. Tuttavia, due batteri anaerobici del microbiota umano, Lactobacillus paracasei e limosum Eubacterium, hanno dimostrato di crescere all'interno del pesce zebra gut19. I progressi tecnici qui presentati incoraggeranno l'applicazione di questo metodo allo studio di C. difficile e di altri batteri o patogeni derivati dall'intestino dei mammiferi nelle larve di pesce zebra molecolarmente trattabili in vivo.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Siamo grati a Timo Fritsch per un'eccellente cura degli animali. Ringraziamo i membri dei laboratori di K'ster e Steinert per il supporto e le discussioni utili. Ringraziamo il dottor Dandan Han per aver letto criticamente il manoscritto. Riconosciamo con gratitudine il finanziamento dello Stato federale della Bassa Sassonia, Nieders-chsisches Vorab (VW-N2889).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A2576 Ultra-low gelling agarose
Agarose low-melting (LM) Pronadisa 8050 It is used in agarose plates
BacLight Red Bacterial Stain Thermo Fisher Scientific B35001 Fluorescent dye
Brain-Heart-Infusion Broth Carl Roth GmbH X916.1
Brass (wild-type) deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines
Calcium nitrate (Ca(NO3)2) Sigma-Aldrich C1396
Capillary Glass Harvard Apparatus 30-0019 Injection needles
Clostridioides difficile R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production
DMSO Carl Roth GmbH A994
FIJI open-source platform Image processing
HEPES Carl Roth GmbH 6763
Horizontal needle puller Sutter instrument Inc P-87
L-cysteine Sigma-Aldrich 168149
Leica Application Suite X (LAS X) Leica Image processing
Magnesium sulfate (MgSO4) Carl Roth GmbH P026
Micro injector eppendorf 5253000017
Microinjection molds Adaptive Science Tools TU1
Leica SP8 confocal microscope Leica
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290
Potassium chloride (KCl) Carl Roth GmbH 5346
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth GmbH 9265
Taurocholate Carl Roth GmbH 8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages
Tricaine Sigma-Aldrich E10521
Yeast extract BD Bacto 212750

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