Verwendung eines extrazellulären Flux-Analyzers zur Messung von Veränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Maus Sperma-Capacitation

Biochemistry

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Summary

Wir beschreiben die Anwendung eines extrazellulären Flussanalysators zur Überwachung von Echtzeitveränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Mazemazeration der Maus.

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Balbach, M., Buck, J., Levin, L. R. Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation. J. Vis. Exp. (155), e60815, doi:10.3791/60815 (2020).

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Abstract

Säugetier-Spermien erwerben Befruchtungsfähigkeit im weiblichen Fortpflanzungstrakt in einem Prozess, der als Kapitulation bekannt ist. Capacitation-assoziierte Prozesse benötigen Energie. Es bleibt eine laufende Debatte über die Quellen, die die ATP erzeugen, die Spermien progressive Motilität, Kapitulation, Hyperaktivierung, und Akrosomenreaktion antreibt. Hier beschreiben wir die Anwendung eines extrazellulären Flussanalysators als Werkzeug, um Veränderungen im Energiestoffwechsel während der Maus-Sperma-Kapazität zu analysieren. Mit H+- undO2- empfindlichen Fluorophoren ermöglicht diese Methode die Überwachung der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung in Echtzeit in nicht-kapazitierten oder kapazitiven Spermien. Die Verwendung dieses Assays in Gegenwart verschiedener Energiesubstrate und/oder pharmakologischer Aktivatoren und/oder Inhibitoren kann wichtige Einblicke in den Beitrag verschiedener Stoffwechselwege und den Schnittpunkt zwischen Signalkaskaden und Stoffwechsel während der Spermienkapitulation liefern.

Introduction

Die Anwendung der Massenspektrometrie hat die Untersuchung des Stoffwechsels revolutioniert. Gezielte metabolische Profilierung und metatobiomische Tracing ermöglichen eine präzise Überwachung von Veränderungen im Energiestoffwechsel. Die erfolgreiche Durchführung der Metabolomik erfordert jedoch umfangreiche Schulungen, erfahrenes Personal und teure, hochempfindliche Massenspektrometer, die nicht für jedes Labor verfügbar sind. In den letzten Jahren ist die Verwendung eines extrazellulären Flussanalysators, wie z. B. des Seahorse XFe96, als Ersatzmethode zur Messung von Veränderungen im Energiestoffwechsel in verschiedenen Zelltypen1,2,3,4,5populär geworden.

Spermien sind hochspezialisierte motile Zellen; deren Aufgabe es ist, das väterliche Genom an die Oozyte zu liefern. Sperma verlassen den männlichen Fortpflanzungstrakt nach der Ejakulation sind noch funktionell unreif und können die Eizelle nicht befruchten, weil sie nicht in der Lage sind, die Gewänder der Eizellen zu durchdringen. Spermien erwerben Befruchtungskompetenz, wenn sie durch den weiblichen Fortpflanzungstrakt in einem Reifungsprozess, bekannt als Capacitation6,7,transportiert werden. Frisch ejakulierte Spermien oder Spermien, die aus der Cauda epididymis seziert werden, können in vitro durch Inkubation in definierten Kapazitationsmedien, die Ca2+, Bicarbonat (HCO3-) oder einen zelldurchlässigen cAMP analog (z. B. Dibutyryl-cAMP), ein Cholesterin-Akzeptor (z. B. Rinderserumalbumin, BSA) und eine Energiequelle (z. B. Glukose). Während der Kapitulation modifizieren Spermien ihr Motilitätsmuster in einen asymmetrischen Flagellar-Beat, der einen Schwimmmodus namens Hyperaktivierung8,9darstellt, und sie werden kompetent, um die Akrosomenreaktion7zu durchlaufen, wo proteolytische Enzyme freigesetzt werden, die die Gewänder der Eizellen verdauen. Diese Prozesse erfordern Energie, und ähnlich wie somatische Zellen, Spermien erzeugen ATP und andere hochenergetische Verbindungen über Glykolyse sowie mitochondrialen TCA-Zyklus und oxidative Phosphorylierung (Oxphos)10. Während mehrere Studien zeigen, dass Glykolyse notwendig und ausreichend ist, um die Spermien-Kapazität11,12,13,14zu unterstützen, ist der Beitrag von Oxphos weniger klar. Im Gegensatz zu anderen Zelltypen, bei denen die Glykolyse physikalisch an den TCA-Zyklus gekoppelt ist, sind Spermien stark kompartimisiert und sollen diese Prozesse in separaten Flagellarkomden aufrechterhalten: Das Mittelstück konzentriert die mitochondriale Maschinerie, während die Schlüsselenzyme der Glykolyse auf das Hauptstück15,16beschränkt zu sein scheinen. Diese Abschottung führt zu einer anhaltenden Debatte darüber, ob Pyruvat, das im Hauptstück durch Glykolyse produziert wird, mitochondriale Oxphos im Mittelstück unterstützen kann und ob ATP, die von Oxophs im Mittelstück produziert wird, in der Lage wäre, ausreichend schnell entlang der Länge des Flagellums zu diffundieren, um den Energiebedarf in distalen Teilen des Hauptteils17,18,19zu unterstützen. Es gibt auch Unterstützung einer Rolle für Oxphos in Spermien-Capacitation. Oxphos ist nicht nur energetisch günstiger als Glykolyse, erzeugt 16-mal mehr ATP als Glykolyse, sondern Mittelstückvolumen und mitochondrialer Gehalt sind direkt mit der Reproduktivfitness bei Säugetierarten korreliert, die einen größeren Grad des Wettbewerbs zwischen Männchen fürKumpels zeigen 20. Um diese Fragen zu beantworten, sind Methoden zur Untersuchung der relativen Beiträge von Glykolyse und Oxphos während der Spermien-Kapazität erforderlich.

Tourmente et al. wandten einen 24-Well extrazellulären Flussanalysator an, um den Energiestoffwechsel eng verwandter Mausarten mit signifikant unterschiedlichen Spermienleistungsparametern zu vergleichen21. Anstatt die basalen ECAR- und OCR-Werte von nicht kapazitierten Spermien zu melden, passen wir hier ihre Methode mit einem 96-Well extrazellulären Flussanalysator an, um Veränderungen des Energiestoffwechsels während der Flüchtigkeit der Maus in Echtzeit zu überwachen. Wir haben eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, Glykolyse und Oxphos in Echtzeit in Spermien mit schlagenden Flagella in bis zu zwölf verschiedenen Versuchsbedingungen zu überwachen, indem der Fluss von Sauerstoff(O2) und Protonen (H+) gemessen wird (Abbildung 1A). Durch den Abbau von Pyruvat zu Laktat während der Glykolyse und die Produktion vonCO2 über den TCA-Zyklus extrudieren nicht-kapazitierte und kapazitierte Spermien H+ in die Assaymedien, die vom extrazellulären Flussanalysator über H+-empfindliche Fluorophore zur Sondenspitze einer Sensorpatrone immobilisiert werden. Parallel dazu wird derO2-Verbrauch durch oxidative Phosphorylierung überO2-empfindlicheFluorophore immobilisiert, die zur gleichen Sondenspitze immobilisiert sind (Abbildung 1B). Der effektive Nachweis des freigesetzten H+ und verbrauchten O2 erfordert einen modifizierten Spermienpuffer mit geringer Pufferkapazität ohne Bicarbonat oder Phenolrot. Um also in Abwesenheit von Bicarbonat eine Kapacitation zu induzieren, haben wir die Verwendung eines zelldurchlässigen cAMP-Analogos übernommen, das zusammen mit dem Breitbereichs-PDE-Hemmer IBMX22injiziert wurde. Drei zusätzliche unabhängige Injektionsöffnungen ermöglichen die Injektion von pharmakologischen Aktivatoren und/oder Inhibitoren, was die Echtzeitdetektion von Veränderungen der zellulären Atmung und Glykolyserate aufgrund experimenteller Manipulation enciert.

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Protocol

Spermien werden von 8-16 Wochen alten CD-1 männlichen Mäusen gesammelt. Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Weill Cornell Medicine genehmigt.

1. Tag vor dem Assay

  1. Vorbereitung von Sensorpatrone und extrazellulärem Flussanalysator-Kalibrant
    1. Um die Sensorpatrone zu hydratisieren, entfernen Sie die Sensorpatrone aus dem XFe96 Extracellular Flux Assay Kit und stellen Sie die Sensorpatrone kopfüber neben die Versorgungsplatte.
    2. Füllen Sie ein Lösungsreservoir mit 25 ml doppeldestilliertemH2O mit einer Mehrkanalpipette, fügen Sie jedem Brunnen der Versorgungsplatte 200 lH2O hinzu. Legen Sie die Sensorpatrone wieder in die Nutzplatte und inkubieren Sie sie über Nacht in einem 37 °C Nicht-CO2-Inkubator.
      HINWEIS: Die Kartusche muss mindestens 4 h hydratisiert werden.
    3. Aliquot 25 ml des extrazellulären Flussanalysators kalibrieren in ein 50 ml konisches Rohr und inkubieren es über Nacht in einem 37 °C Nicht-CO2-Inkubator.
  2. Herstellung von ConA-beschichteten Mikroplatten
    1. 2,5 mg ConA in 5 ml doppeldestilliertemH2O auflösen, um einen 0,5 mg/ml (w/v) Vorrat zu erstellen.
    2. Füllen Sie mit einer Mehrkanalpipette jeden Brunnen einer extrazellulären Flussanalysator 96-Well-Platte mit 50 l der 0,5 mg/ml Con A-Lösung. Lassen Sie den Deckel offen und lassen Sie die Platte über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.
      HINWEIS: Mehrere Platten können auf einmal beschichtet und bis zu vier Wochen bei 4 °C gelagert werden, bis sie einsatzbereit sind.
  3. Vorbereitung des Spermienpuffers
    1. Bereiten Sie 250 ml extrazellulären Flussanalysator TYH Puffer mit niedrigen HEPES mit 138 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,7 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 5,6 mM Glukose und 1 mM HEPES. Den Puffer auf 37 °C erhitzen und den pH-Wert auf 7,4 einstellen.

2. Tag des Assays

  1. Vorbereitung für die Kartuschenkalibrierung
    1. Ersetzen Sie die H2O in der Nutzplatte durch 200 l XF-Kalibrant pro Bohrkörper und inkubieren Sie mindestens 1 h in einem Nicht-CO2 37 °C-Inkubator.
      HINWEIS: Anstelle von kalibrierenden, sterilgefilterten PBS kann pH 7.4 verwendet werden.
    2. 50 ml TYH-Puffer bei 37 °C erhitzen.
  2. Generieren einer Wellenvorlage für den extrazellulären Flussanalysator
    1. Schalten Sie den extrazellulären Flussanalysator ein und lassen Sie die Temperatur auf 37 °C stabilisieren.
    2. Öffnen Sie die Wellensoftware und entwerfen Sie eine neue Vorlage, indem Sie eine leere Vorlage öffnen (siehe Ergänzungsdatei 1, Wellenvorlage).
    3. Öffnen Sie die Registerkarte Gruppendefinitionen. Definieren Sie Assay-Medien als TYH; pH 7.4 und Zelltyp als Maussperma, lassen Injektionsstrategien und Vorbehandlungen leer. Erstellen Sie verschiedene Gruppen für jede Assaybedingung; In diesem Beispiel gibt es 6 verschiedene Gruppen (TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot + db-cAMP/IBMX); Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) und 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) zur Induzieren von Kapatizien, 2-Deoxyglucose (2-DG) als Glykolysehemmer, Antimycin A (AntA) und Roton (Rot) als Inhibitor des komplexen III und des komplexen I der Elektronentransportkette.
      HINWEIS: Um die Variabilität zwischen den Brunnen zu berücksichtigen, sollten mindestens 7-8 Brunnen pro Zustand parallel gemessen werden.
    4. Öffnen Sie die Registerkarte "Platte" und definieren Sie die Plattenkarte, indem Sie Gruppen bestimmten Brunnen zuweisen.
      HINWEIS: Die vier Eckbrunnen (A1, A12, H1, H12) werden mit TYH-Puffer (kein Sperma) gefüllt und später für die Hintergrundsubtraktion verwendet.
    5. Öffnen Sie die Registerkarte Protokoll, fügen Sie 4 verschiedene Messzyklen hinzu, wählen Sie den jeweiligen Port aus und bearbeiten Sie die Messdetails (Abbildung 2, Tabelle 1). Markieren Sie die Maßnahme nach der Injektion und markieren Sie nicht das Gleichgewicht.
    6. Speichern Sie die Testvorlage, füllen Sie die Projektzusammenfassung aus, und definieren Sie den Speicherort für die Ergebnisdatei.
  3. Herstellung von Verbindungen zum Laden in die Sensorpatrone
    1. Bereiten Sie 2 ml 50 mM db-cAMP vor, indem Sie 9,8 mg Verbindung im TYH-Puffer auflösen und IBMX zu einer Endkonzentration von 5 mM hinzufügen.
      HINWEIS: IBMX neigt dazu, nach verdünnter TYH-Puffer zu ausfallen. Ausscheidungen können durch Wirbeln und Inkubieren der TYH/db-cAMP/IBMX-Lösung in einem 37 °C-Wärmeblock für 5 min gelöst werden.
    2. Bereiten Sie 1 ml 500 mM 2-DG vor, indem Sie 82,1 mg Verbindung im TYH-Puffer auflösen.
    3. Bereiten Sie 1 ml von 5 m AntA/Rot vor, indem Sie beide Medikamente im TYH-Puffer verdünnen.
      HINWEIS: Verbindungen werden 10-fach durch Injektion in die extrazelluläre Flussanalysatorpatrone verdünnt; Achten Sie daher darauf, dass Injektionslösungen 10x konzentrierter sind.
  4. Isolierung von Maussperma
    1. Anästhetisieren Sie 3 männliche Mäuse zwischen 8 und 16 Wochen durch Isofluran und opfern Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation, nachdem keine Reaktion auf Zehenkneifen nachgewiesen wurde. Entfernen Sie die Cauda epididymide und vasa deferentia.
    2. Legen Sie jede Cauda in 500 l vorgewärmten TYH-Puffer in 24-Well-Platte gut, immobilisieren Sie die Cauda an der Unterseite der Platte mit einem Paar Zange und öffnen Sie das Gewebe durch 5-7 kleine Schnitte mit Federschere.
    3. Die Platte sofort in einen Nicht-CO2 37 °C-Inkubator geben und das Sperma 15 min verteilen lassen.
  5. Beladung der Sensorpatrone
    1. Zwei Port-Ladeführungen für Port A und D sowie Port B und C sind im Extrazellulären Flux-Kit enthalten. Entfernen Sie zum Laden eines bestimmten Ports den Deckel von der Sensorkassette, und richten Sie den Buchstaben der entsprechenden Anschlussladeführung an der oberen linken Ecke der Patrone aus. Verwenden Sie beim Einspritzen die Fingerspitzen der nicht injizierenden Hand, um die Anschlussladeführung an Ort und Stelle zu halten und die Pipettenspitzen vertikal in die Anschlussladeführungslöcher einzulegen.
    2. Anschluss A: Mit einer Mehrkanalpipette in jede Spalte 20 L des TYH-Puffers einspritzen.
    3. Port B: Injizieren Sie 22 L TYH-Puffer in Spalte 1-4, injizieren Sie 22 l 500 mM 2-DG in die Spalte 5-8 und 25 l von 5 'M AntA/Rot in Spalte 9-12.
    4. Port C: Injizieren Sie 25 L TYH-Puffer in jede Spalte mit ungeraden Zahlen, injizieren Sie 25 l von 10 mM db-cAMP/ 500 'M IBMX in jede Spalte mit geraden Zahlen.
    5. Legen Sie die Sensorpatrone mit der Kalibrierplatte in den extrazellulären Flussanalysator und starten Sie den Test. Die Kalibrierung dauert 10 - 15 min.
  6. Vorbereitung von Spermienplatten
    1. 45 mg BSA in 15 ml TYH-Puffer (3 mg/ml w/v) auflösen und drei Aliquots von 3 ml BSA/TYH-Lösung in jeweils 5 ml Zentrifugenrohren vorbereiten.
    2. Kombinieren Sie zwei Spermienbrunnen in einem 1,5 ml Zentrifugenrohr, zählen Sie das Sperma mit einem Hämatozytometer und verdünnen Sie das Sperma auf eine Konzentration von 2 x 107 Spermien/ml.
      HINWEIS: Verwenden Sie geschnittene Pipettenspitzen zum Pipetieren von Spermien, um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden.
    3. Zentrifugieren Sie das Sperma für 3 min bei 700 x g, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml TYH Puffer hinzu. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt, entfernen Sie den Überstand und übertragen Sie jede Spermiensuspension aliquot in ein 5 ml Zentrifugenrohr mit 3 ml BSA/TYH.
    4. Legen Sie 180 L TYH-Puffer in jeden Eckbrunnen (A1, A12, H1, H12) einer ConA-beschichteten Platte. Legen Sie 180 l Spermiensuspension in jeden leeren Brunnen der ConA-beschichteten Platte (1,2 x 106 Spermien/Gut).
    5. Zentrifugieren Sie die Spermienplatte bei 250 x g für 1 min, drehen Sie die Platte um 180°, und Zentrifuge wieder bei 250 x g für 1 min (niedrigste Bremsrate 1).
    6. Entfernen Sie die Kalibrierplatte aus dem extrazellulären Flussanalysator und fügen Sie die Spermienplatte hinzu. Setzen Sie den Test fort.
  7. Datenextraktion und -analyse
    1. Nach Abschluss des Testes entfernen Sie die Kassette, öffnen Sie die Ergebnisdatei, klicken Sie auf die Registerkarte Exportieren und exportieren Sie die abgeschlossene Ausführung als GraphPad Prism-Datei (Ergänzende Datei 2: Primäre Beispieldaten für Abbildung 3).
    2. Duplizieren Sie die ECAR- und OCR-Datei, indem Sie auf die Registerkarte Neu und dann auf die Registerkarte "Doppelte Familie" klicken (Abbildung 3A).
    3. Löschen Sie die ersten 7 Datenzeilen (Abbildung 3B).
    4. Normalisieren Sie sich auf den Datenpunkt vor der cAMP/IBMX-Injektion durch Basissubtrahierung von Zeile 1. Klicken Sie auf die Registerkarte Analysieren, dann auf die Registerkarte Basislinie entfernen und Spaltenmathematik. Hervorheben ausgewählter Zeilen: Erste Zeile, Berechnung: Verhältnis:Wert/Baselineund Unterspalten: Unterspalte ignorieren. Klicken Sie auf OK (Abbildung 3C).

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Representative Results

Diese Methode verwendet einen extrazellulären Flussanalysator, um Echtzeit-Änderungen in der Rate der Glykolyse und Oxphos während der Maus Sperma-Capacitation zu überwachen. Abbildung 4 zeigt ein beispielhaftes Experiment, bei dem Spermien in Gegenwart von Glukose als einzigem Energiesubstrat und 2-DG und Antimycin und Roton als pharmakologische Modulatoren kapazitiert wurden. Das Energiesubstrat im extrazellulären Flussanalysator TYH Puffer und die pharmakologischen Modulatoren können je nach Ziel des Experiments frei ausgewählt werden. Nicht-kapazitierte Maussperma in BSA/TYH wurden über ihren Kopf am Boden einer ConA-beschichteten transienten Mikrokammer befestigt. In diesem Beispiel lagen die Basal-ECAR- und OCR-Werte zwischen allen erkannten Brunnen im Durchschnitt bei 12,76 x 2,75 mpH/min bzw. 23,64 x 2,78 pmol/min.

Nach einer Mock-Injektion mit TYH-Puffer, gefolgt von einer Injektion von 2-DG und Ameise/Rot zur Hemmung der Glykolyse bzw. oxidativen Phosphorylierung, wurde die Spermien-Kapazität durch Injektion von db-cAMP/IBMX induziert.

Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass bei Vorhandensein von Glukose die Kapatitierung mit einer 7-fachen Erhöhung der extrazellulären Versauerungsrate (ECAR) einhergeht, die durch die Blockierung der Glykolyse mit 2-DG gehemmt wird (Abbildung 4A). Kapazitierte Spermien zeigen eine 20-fache Erhöhung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) im Vergleich zu nicht kapazitierten Spermien (Abbildung 4B), was zeigt, dass Maussperma sowohl die Glykolyse als auch die oxidative Phosphorylierung verbessern, um den steigenden Energiebedarf während der Kapitulation zu unterstützen. Der Anstieg von ECAR während der Spermien-Kapazität wird durch den Glykolyse-Inhibitor 2-DG gehemmt, aber nicht durch die oxidativen Phosphorylierungsinhibitoren Antimycin A und Rotone beeinflusst (Abbildung 4C), was darauf hindeutet, dass die Veränderung von ECAR hauptsächlich durch H+ Freisetzung aus der Glykolyse angetrieben wird. Der Anstieg der OCR wird, wie erwartet, durch Antimycin A und Roton blockiert (Abbildung 4D), aber er wird auch durch 2-DG (Abbildung 4B) gehemmt, was zeigt, dass der Anstieg der Oxphos während der Spermienkapitrezitatigung von der glykolytischen Aktivität abhängt.

Figure 1
Abbildung 1: Prinzip des extrazellulären Flussanalysators. (A) Aufgrund des Abbaus von Glukose zu Laktat während der Glykolyse und der Erzeugung vonCO2 über den TCA-Zyklus werden Veränderungen der Glykolyse und Oxphos durch H+ Ausscheidung in die extrazellulären Medien begleitet. Der XFe96 Analyzer erkennt diese Veränderungen in der extrazellulären H+ Konzentration als ECAR. Parallel dazu werden Veränderungen der extrazellulärenO2-Konzentration durchO2-Verbrauch durch oxidative Phosphorylierung als OCR gemessen. Die Blockierung der Glykolyse mit 2-Deoxyglucose (2-DG) oder die Atmung mit den komplexen I- und komplexen III-Inhibitoren Roton und Antimycin A zeigt, welche Stoffwechselwege den steigenden Energiebedarf bei der Spermienkapacitation unterstützen. (B) Maussperma werden über ihre Köpfe an der Unterseite einer ConA-beschichteten Mikrokammer befestigt; ihre Flagella sind frei bewegend. Während Veränderungen der extrazellulären H+ undO2-Konzentration durch H+- undO2-empfindlicheFluorophore, die zu einer Sensorsonde immobilisiert sind, erkannt werden, können bis zu vier verschiedene Verbindungen sequenziell injiziert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung des beispielhaften Experiments. Veränderungen in ECAR (mpH/min) und OCR (pmol O2/min) werden in nicht-kapazitierten und kapazitierenden Spermien mit einem extrazellulären Flussanalysator nachgewiesen. Zyklus 1: Basal ECAR- und OCR-Werte. Zyklen 2-5: Systemstabilisierung nach TYH-Mock-Injektion. Zyklen 6-8: Inkubation von Medikamenten. Zyklen 9-27: Sperma-Kapazität. Pfeile zeigen Injektionen an. 2-DG: Endkonzentration 50 mM, AntA/Rot: Endkonzentration 0,5 m, db-cAMP: Endkonzentration 1 mM, IBMX: Endkonzentration 500 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Datenanalyse. (A) Rohdaten über Veränderungen in ECAR während der Sperma-Kapazität der Maus. (B) Daten nach Entfernung der ersten 7 Datenpunkte. (C) Daten normalisiert sich vor der cAMP/IBMX-Injektion auf den Datenpunkt. Die Daten werden als Mittelwert von 7-8 Brunnen angezeigt. S.E.M. Injektionen werden mit einem Pfeil angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Veränderungen der Glykolyse und oxidative Phosphorylierung während der Mazemazeration der Maus. (A) Normalisiertes ECAR in nicht-kapazitierten und kapazitierenden Maussperma in Gegenwart und Abwesenheit von 50 mM 2-DG. (B) Normalisierte OCR in nicht-kapazitierten und kapazitierenden Maussperma in Gegenwart und Abwesenheit von 50 mM 2-DG. (C) Normalisiertes ECAR in nicht-kapazitierten und kapazitierenden Maussperma in Gegenwart und Abwesenheit von 0,5 M Antimycin A und Roton. (D) Normalisierte OCR in nicht-kapazitierten und kapazitierenden Maussperma in Gegenwart und Abwesenheit von 0,5 M Antimycin A und Roton. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt, der auf den Datenpunkt vor der db-cAMP/IBMX-Injektion normalisiert wurde; n = 6. Injektionen werden mit einem Pfeil angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Hafen Anzahl der Zyklen Mischen (min) Warten (min) Messen (min)
A: Basal ECAR/OCR kein Port 1 2:00 0:00 3:00
B: Mock-Injektion 1 4 2:00 0:00 3:00
C: Arzneimittelinjektion 2 3 2:00 0:00 3:00
D: Kapitulation 3 18 2:00 0:00 3:00

Tabelle 1: Messdetails.

Supplemental Figure 1
Ergänzende Abbildung 1: Kapazitation von Maussperma im extrazellulären Flussanalysator TYH Puffer. Phosphorylierung von Tyrosinrückständen von Maussperma, die zu verschiedenen Zeitpunkten während der Kapatitation (0 - 90 min) nach Inkubation in (A) TYH mit 25 mM HCO3-, 3 mg/mL BSA und 20 mM HEPES oder in (B) Extrazellulärem Flussanalysator TYH mit 5 mM db-cAMP, 500 M IBMX und 1 mM HEPES, die mit einem -Phosphotyrosin-Antikörper nachgewiesen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Wave-Assay-Vorlage, um Veränderungen in der Glykolyse und oxidative n.A. -Phosphorylierung während der Maus-Sperma-Kapazität zu erkennen. Die Wave-Desktop-Software kann nach dem Ausfüllen eines Registrierungsformulars(www.agilent.com/en/products/cell-analysis/cell-analysis-software/data-analysis/wave-desktop-2-6) kostenlos heruntergeladen und auf Windows 7, 8 oder 10 installiert werden (Mac OSx 10.11 (oder höher) mit Parallelen 12 (oder höher). Dabei können Wellenvorlagen unabhängig vom extrazellulären Flussanalysator generiert, exportiert und dann in die Wellensoftware eines extrazellulären Flussanalysators importiert werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Ergänzende Datei 2: Graph Pad Prisma Datei aus Wellensoftware mit beispielhafter Datenanalyse exportiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

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Discussion

Der Verlust der Spermienkapazität in Ermangelung bestimmter metabolischer Substrate oder kritischer Stoffwechselenzyme ergab den Energiestoffwechsel als Schlüsselfaktor für eine erfolgreiche Befruchtung. Ein metabolischer Schalter während der Zellaktivierung ist ein etabliertes Konzept in anderen Zelltypen, aber wir beginnen gerade zu verstehen, wie Spermien ihren Stoffwechsel an den steigenden Energiebedarf während der Kapitulation anpassen. Mit einem extrazellulären Flussanalysator haben wir ein leicht anwendbares Werkzeug entwickelt, um Veränderungen der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung in Echtzeit während der Spermienkapitulation zu überwachen. Der Nachweis von Veränderungen in extrazellulären H+ undO2 mit zu einer Sensorsonde immobilisierten Fluorophoren ist minimal invasiv und die vier individuell betriebenen Injektionsöffnungen ermöglichen manipulationsgemäß mit pharmakologischen Inhibitoren oder Aktivatoren zu unterschiedlichen Zeitpunkten vor oder während des Capacitationsprozesses. Dieses Protokoll gibt nur ein Beispiel für ein Mausspermacitation-Experiment. Um die Interpretation der Ergebnisse zu vereinfachen, wählten wir die Show als beispielhaftes Experiment, bei dem Glukose als einzige Energiequelle verwendet wurde. Die Bedingungen sind je nach Ziel des Experiments variabel und können bis zu 12 verschiedene Bedingungen (d.h. verschiedene Energiequellen wie Glukose vs. Glukose und Pyruvat) parallel messen. Darüber hinaus ermöglichen vier unabhängige Injektionsöffnungen die Injektion von pharmakologischen Aktivatoren und/oder Inhibitoren zu jedem gewünschten Zeitpunkt vor oder während der Kapitulation. Dies eröffnet die Möglichkeit, den extrazellulären Flussanalysator als halbdurchsatzhohes Screening-Gerät zu verwenden. Ähnlich wie bei Maussperma, in anderen Arten wie Mensch oder Rind ist es immer noch rätselhaft, wie Spermien ihren Stoffwechsel während der Kapitulation verändern. Das Protokoll kann leicht angepasst werden; Daher empfehlen wir, die Spermienkonzentration jedes Mal zu optimieren, bevor Sie ein echtes Experiment starten.

Die größte Einschränkung des Protokolls besteht darin, dass qualitativ hochwertige Ergebnisse nur ohne Bicarbonat erzielt werden können. Bicarbonat in Samenflüssigkeit ist das physiologische Signal, das die Kapitulation des Spermas signalisiert Kaskade nach der Ejakulation initiiert. Bicarbonat aktiviert die lösliche adenylyl Cyclase (sAC; ADCY10), was die Umwandlung von ATP in cAMP23katalysiert. Die Erhöhung der cAMP treibt dann eine Signalkaskade an, die von Protein Kinase A vermittelt wird, was letztlich zu einer nachgeschalteten Tyrosinphosphorylierung von Zielproteinen (z. B. Ionenkanälen, metabolischen Enzymen und Strukturellen Proteinen24,25) führt. Diese Beschränkung gegen Bicarbonat wird durch Injektion des Produkts bicarbonat-aktivierte sAC, cAMP, überwunden. Wir verwenden 5 mM des zelldurchlässigen cAMP analog en-cAMP parallel zum breitspezifizitätsspezifischen Phosphodiesterase-Inhibitor IBMX, der einen schnellen Abbau von db-cAMP durch Phosphodiesterasen verhindert. Diese Kombination initiiert effektiv den cAMP-regulierten Capacitationssignalweg nach der sAC-Aktivierung mit einer ähnlichen kinetischen wie Bicarbonat (Ergänzende Abbildung 1). Parallel zu Bicarbonat wird ein Cholesterin-Akzeptor (z.B. BSA) verwendet, um frisch ejakulierte Spermien oder Spermien, die aus der Cauda epididymis seziert werden, in vitro zu kapitonieren. Albumin kann nicht injiziert werden, weil es den Injektionsport verstopft und daher dem Spermienpuffer hinzugefügt werden muss, bevor die Zellen plattiert werden. Die Durchführung des Experiments in Gegenwart oder Abwesenheit von BSA ergab, dass die Zunahme von ECAR und OCR während der Spermien-Kapazität unabhängig vom Cholesterin-Akzeptor ist. Das Vorhandensein von BSA im Spermienpuffer verringerte jedoch die Schwankungen der nachgewiesenen ECAR- und OCR-Werte zwischen verschiedenen Brunnen und Experimenten; Daher empfehlen wir, BSA in den Spermienpuffer einzubeziehen, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen.

Die Isolierung von Spermien aus der Cauda epididymis führt zur Kontamination von Spermien mit epididymaler Flüssigkeit. Um künstliche Ergebnisse aufgrund von Samenflüssigkeitskomponenten zu vermeiden, empfehlen wir, Spermien zwei Mal zu waschen, bevor sie für ein Experiment verwendet werden. Die Spermienkonzentration und -beschichtung ist ein weiterer entscheidender Faktor, der den Erfolg des Experiments bestimmt. Für zuverlässige Ergebnisse empfiehlt der Hersteller, dass die anfänglichen ECAR-Werte größer als 10 und die OCR-Werte größer als 20 sind. Die in diesem Protokoll verwendete Spermienkonzentration wurde so optimiert, dass die durchschnittlichen Basal-ECAR- und OCR-Werte der pro Zustand gemessenen 7-8 Brunnen über 10 bzw. 20 liegen. Frei bewegliche Spermien stören die Erkennung von Veränderungen in extrazellulären H+ und O2. Daher ist es wichtig, alle Spermien mit dem Kopf an der Unterseite der Platte zu haften. Wir fanden Erfolg bei der Befestigung von Spermien, indem wir die Platte mit ConA, einem Pflanzenlektin, das speziell mit der äußeren akrosomalen Membran interagiert und häufig für Akrosomen-Assays verwendet wird, und durch sanftes Spinnen der Platte (siehe Schritt 2.7.3) beschichten. Mit dieser Methode werden Spermien auf den Boden des Brunnens nur über ihren Kopf lokalisiert, so dass sie ihre Flagella noch frei bewegen und ihr flagellar Schlagen Muster während der Kapitulation ändern können.

Sperma extrudieren ständig H+ und O2 in beiden, dem nicht kapazitierten und dem kapazitierten Zustand. Um die anfängliche ECAR und OCR so genau wie möglich zu bestimmen, ist es wichtig, das Experiment so schnell wie möglich nach dem letzten Waschschritt zu starten. Dies kann erreicht werden, indem die Sensorpatrone geladen wird, während die Spermien ausschwimmen, und indem die Methode im extrazellulären Flussanalysator vor dem ersten Waschschritt gestartet wird. Das Kalibrieren des Instruments dauert ungefähr so lange wie das Waschen und Beschichten der Zellen und das Spinnen der Platte. Der Hersteller empfiehlt eine Ausgleichsphase, damit sich das System stabilisieren kann, bevor der erste reale Datenpunkt gemessen wird. Da das Protokoll 8 Messzyklen enthält, bevor die Kapitulation eingeleitet wird, wird der Ausgleichsschritt aus diesem Protokoll ausgeschlossen, um Zeit zu sparen.

Die Fähigkeit, Lösungen während des Assays zu injizieren und ihre Auswirkungen auf die Atmung und die Glykolytische Rate in Echtzeit zu beobachten, ist ein Schlüsselmerkmal des extrazellulären Flussanalysators. Das Laden der Sensorpatrone ist einer der entscheidenden Schritte im Protokoll und sollte sorgfältig ausgeführt werden. Um eine ordnungsgemäße Injektion in alle Brunnen zu gewährleisten, muss jede Portserie das gleiche Volumen enthalten, einschließlich der Hintergrundbrunnen. Das Laden der Ports mit einer Mehrkanalpipette erfordert einige Übung, verringert jedoch die Variabilität und Ladezeit erheblich. Es wird dringend empfohlen, die Portladeanleitung zu verwenden, aber nur vier Ports gleichzeitig einzuschleusen. Es ist auch wichtig zu verstehen, dass während der Beladung die Injektionsvolumina schrittweise erhöht werden, um das steigende Volumen im Brunnen auszugleichen. Beim Laden der Sensorpatrone ist es wichtig, die Spitzen nicht vollständig in den Anschluss einzulegen. Dies kann eine Injektionslösung vorzeitig durch die Portöffnung schieben. Bei der Festlegung der Methode fanden wir, dass die Injektion von Flüssigkeit in ein Sperma gut verursacht unerwünschte Injektion Artefakte, wahrscheinlich aufgrund der Verdünnung des Spermas im Brunnen und / oder Verdrängung Spermien aus dem Brunnenboden. Die erste Injektion verursacht das größte Injektionsartefakt, so dass wir zu Beginn des Protokolls eine Mock-Injektion mit Spermapuffer in alle Brunnen aufgenommen haben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren möchten die Unterstützung von Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu am Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center würdigen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich D8375 2-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I7018 IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A1470 BSA
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016 CaCl2
Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) Sigma-Aldrich L7381 ConA
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Hepes Sigma-Aldrich H0887
Isothesia Henry Schein Animal Health 1169567761 Isoflurane
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt Sigma-Aldrich D0627 db-cAMP
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333 KCl
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P5655 KH2PO4
Rotenone Cayman Chemical Company 13995 Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 NaHCO3-
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888 NaCl
Equipment and materials
12 channel pipette 10-100 μL eppendorf ES-12-100
12 channel pipette 50-300 μL vwr 613-5257
37 °C, non-CO2 incubator vwr 1545
5 mL cetrifuge tubes eppendorf 30119380
50 mL conical centrifuge tubes vwr 76211-286
Centrifuge with plate adapter Thermo Scientific IEC FL40R
Dissection kit World Precision Instruments MOUSEKIT
Inverted phase contrast microscope with 40X objective Nikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided Thomas Scientific 1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided Thomas Scientific 1159X95
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.

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References

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