जेब्राफिश लार्वा पर पर्यावरण प्रदूषकों के न्यूरोबिहेवियरल प्रभावों का अध्ययन

Environment

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Summary

इस पेपर में जेब्राफिश लार्वा मॉडल का उपयोग करके पर्यावरणीय प्रदूषकों की न्यूरोबिहेवियर विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है, जिसमें न्यूरोबिहेवियरल संकेतकों के लिए एक्सपोजर प्रक्रिया और परीक्षण शामिल हैं।

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Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).

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Abstract

हाल के वर्षों में अधिक से अधिक पर्यावरणप्रदूषक न्यूरोटॉक्सिक साबित हुए हैं, विशेष रूप से जीवों के प्रारंभिक विकास चरणों में। जेब्राफिश लार्वा पर्यावरण प्रदूषकों के न्यूरोबिहेवियरल अध्ययन के लिए एक प्रख्यात मॉडल हैं। यहां, भ्रूण के संग्रह, एक्सपोजर प्रक्रिया, न्यूरोबिहेवियरल संकेतक, परीक्षण प्रक्रिया सहित जेब्राफिश लार्वा का उपयोग करके पर्यावरणीय प्रदूषकों की न्यूरोटॉक्सिकिटी के मूल्यांकन के लिए एक विस्तृत प्रायोगिक प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है, और डेटा विश्लेषण। साथ ही परख की सफलता सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति पर्यावरण, एक्सपोजर प्रक्रिया और प्रायोगिक स्थितियों पर चर्चा की जाती है । प्रोटोकॉल का उपयोग मनोरोगी दवाओं के विकास, पर्यावरणीय न्यूरोटॉक्सिक प्रदूषकों पर शोध में किया गया है, और इसी अध्ययन करने या मशीनी अध्ययनों के लिए सहायक होने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल जेब्राफिश लार्वा पर न्यूरोबिहेवियरल प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक स्पष्ट ऑपरेशन प्रक्रिया को दर्शाता है और विभिन्न न्यूरोटॉक्सिक पदार्थों या प्रदूषकों के प्रभावों को प्रकट कर सकता है।

Introduction

हाल के वर्षों में अधिक से अधिक पर्यावरणीय प्रदूषक न्यूरोटॉक्सिक1,2,3,4साबित हुए हैं . हालांकि, पर्यावरण प्रदूषकों के संपर्क में आने के बाद वीवो में न्यूरोटॉक्सिकिटी का आकलन उतना आसान नहीं है जितना कि एंडोक्राइन व्यवधान या विकासात्मक विषाक्तता का। इसके अलावा, प्रदूषकों के शीघ्र संपर्क, विशेष रूप से पर्यावरण की दृष्टि से प्रासंगिक खुराकों पर, विषाक्तता अध्ययन5,6,7,8में ध्यान बढ़ाने को आकर्षित किया है।

जेब्राफिश पर्यावरण प्रदूषकों के संपर्क में आने के बाद प्रारंभिक विकास के दौरान न्यूरोटॉक्सिकिटी अध्ययन के लिए एक पशु मॉडल फिट के रूप में स्थापित किया जा रहा है। जेब्राफिश कशेरुकी हैं जो निषेचन के बाद अन्य प्रजातियों की तुलना में तेजी से विकसित होते हैं। लार्वा को खिलाने की आवश्यकता नहीं है क्योंकि चोरियन में पोषक तत्व उन्हें 7 दिनों के लिए निषेचन (डीपीएफ)9तक बनाए रखने के लिए पर्याप्त हैं। लार्वा ~ 2 डीपीएफ पर चोरियन से बाहर आते हैं और तैराकी और टर्निंग जैसे व्यवहार विकसित करते हैं जिन्हें देखा जा सकता है, ट्रैक किया जा सकता है, मात्रानिर्धारित किया जा सकता है, और 3-4 डीपीएफ14,15,16,17,18 से शुरू होने वाले व्यवहार उपकरणोंकास्वचालित रूप से विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, उच्च थ्रूपुट परीक्षणों को व्यवहार उपकरणों द्वारा भी महसूस किया जा सकता है। इस प्रकार, जेब्राफिश लार्वा पर्यावरणप्रदूषक19के न्यूरोव्यवहार अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल हैं। यहां, प्रकाश उत्तेजनाओं के तहत जेब्राफिश लार्वा पर पर्यावरणीय प्रदूषकों की न्यूरोबिहेवियरल विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए उच्च-थ्रूपुट निगरानी का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल की पेशकश की जाती है।

हमारी प्रयोगशाला ने 2,2', 4,4'-टेट्राब्रोमोडेफिनाइल ईथर (बीईई-47)20,21,6'-हाइड्रोक्सी/मेथोक्सी-2,2,4,4'-टेट्रा की न्यूरोबिहेवियरल विषाक्तता का अध्ययन किया है ब्रोमोडिफेनाइल ईथर (6-ओह/मेओ-बीडीईई-47)22,डेका-ब्रोमिनेटेड डिफेनाइल ईथर (बीईई-209), लीड और कमर्शियल क्लोरीनेटेड पैराफिन23 प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करके। कई प्रयोगशालाएं लार्वा या वयस्कमछली24,25 ,26,27पर अन्य प्रदूषकों के न्यूरोबिहेवियरल प्रभावों का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल का भी उपयोग करती हैं । इस न्यूरोबिहेवियरल प्रोटोकॉल का उपयोग मशीनी सहायता प्रदान करने में मदद करने के लिए किया गया था जिसमें यह दर्शाया गया था कि बिफिनॉल ए और रिप्लेसमेंट बिस्फेनॉल एस प्रेरित भ्रूणीय जेब्राफिश27में समय से पहले हाइपोथैलेमिक न्यूरोजेनेसिस के लिए कम खुराक का जोखिम। इसके अलावा, कुछ शोधकर्ताओं ने इसी अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया। हाल ही में हुए एक अध्ययन में कैसिन-लेपित सोने के नैनोकणों (एकास ऑएनपीएस) का उपयोग करके एक आसान, उच्च-थ्रूपुट जेब्राफिश मॉडल में एमिलॉयड बीटा (Aο) की विषाक्तता को समाप्त कर दिया गया। इसमें पता चला कि जेब्राफिश लार्वा के रक्त-मस्तिष्क बाधा और तनहा इंट्रेसरब्रल A42 के रक्त-मस्तिष्क बाधा में फैले सिस्टमिक परिसंचरण में एकेएस एएनपीएस, एक गैर-विशिष्ट, चपरोन जैसे तरीके से विषाक्तता प्राप्त करते हैं, जिसे व्यवहार विकृति28द्वारा समर्थित किया गया था।

लोकोमोशन, पथ कोण और सामाजिक गतिविधि प्रस्तुत प्रोटोकॉल में प्रदूषकों के संपर्क में आने के बाद जेब्राफिश लार्वा के न्यूरोटॉक्सिकप्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तीन न्यूरोबिहेवियरल संकेतक हैं। लोकोमोशन को लार्वा की तैराकी दूरी से मापा जाता है और प्रदूषकों के संपर्क में आने के बाद क्षतिग्रस्त किया जा सकता है। पथ कोण और सामाजिक गतिविधि मस्तिष्क और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र29के कार्य से अधिक निकटता से संबंधित हैं । पथ कोण तैराकी दिशा30के सापेक्ष पशु गति के मार्ग के कोण को संदर्भित करता है । सिस्टम में ~-180 डिग्री-~ +180° से आठ कोण कक्षाएं निर्धारित की गई हैं। तुलना को सरल बनाने के लिए, अंतिम परिणाम में छह वर्गों को नियमित मोड़ (-10 ° ~ 0 °, 0 ° ~ +10°), औसत बदल जाता है (-10 ° ~-90 ° , +10 ° ~ + 90 °), और उत्तरदायी बदल जाता है (-180 ° ~-90 ° , +90 ° ~ + 180 ° ) हमारे पिछले अध्ययनों के अनुसार21,22. दो मछली सामाजिक गतिविधि समूह shoaling व्यवहार के मौलिक है; यहां दो लार्वा वैध के बीच और 0.5 सेमी की दूरी को सामाजिक संपर्क के रूप में परिभाषित किया गया है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल जेब्राफिश लार्वा पर न्यूरोबिहेवियरल प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक स्पष्ट प्रक्रिया को दर्शाता है और विभिन्न पदार्थों या प्रदूषकों के न्यूरोटॉक्सिकिटी प्रभावों को प्रकट करने का एक तरीका प्रदान करता है। प्रोटोकॉल से पर्यावरण प्रदूषकों की न्यूरोटॉक्सिकिटी का अध्ययन करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं को फायदा होगा ।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल तोंगजी विश्वविद्यालय की एनिमल एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित दिशा-निर्देशों के अनुसार है।

1. जेब्राफिश भ्रूण संग्रह

  1. एक्सपोजर से पहले रात को स्पॉनिंग बॉक्स में हेल्दी एडल्ट ट्यूबिंगन जेब्राफिश के दो जोड़े रखें, लिंगअनुपात को 1:1 पर रखते हुए ।
  2. अगली सुबह दिन के उजाले के बाद 30-60 मिन के लिए वयस्क मछली वापस निकालें ।
  3. भ्रूण को स्पॉनबॉक्स से बाहर निकाल ें।
  4. सिस्टम पानी के साथ भ्रूण कुल्ला।
  5. भ्रूण को पर्याप्त सिस्टम पानी के साथ एक ग्लास पेट्री डिश (9 सेमी व्यास) में स्थानांतरित करें।
  6. माइक्रोस्कोप के नीचे भ्रूण का निरीक्षण करें और बाद में जोखिम के लिए स्वस्थ भ्रूण का चयन करें।
    नोट: स्वस्थ भ्रूण माइक्रोस्कोप के तहत हल्के सुनहरे रंग के साथ आमतौर पर पारदर्शी होते हैं। अस्वस्थ भ्रूण आमतौर पर हल्के होते हैं और माइक्रोस्कोप के नीचे देखे जाने के अनुसार एक साथ झुरमुट होते हैं।

2. एक्सपोजर से पहले तैयारी

  1. जेब्राफिश बुक31के दिशा-निर्देशों के अनुसार हैंक्स का समाधान तैयार करें ।
    नोट: हैंक्स के समाधान में 0.137 एम एनसीएल, 5.4 एमएम केसीएल, 0.25 एमएम एनए2एचएम4,0.44 एमएम एम एचएएच2पीओ4,1.3 एमएम सीएसीएल2,1.0 एमएम एमजीएसओ4और 4.2 एमएम नाहको3शामिल हैं।
  2. बाँझ पानी का उपयोग करके 10% हैंक्स के समाधान को पतला करें।
  3. 0.1% डीएमएसओ सहित 10% हैंक्स समाधान का नियंत्रण समाधान बनाने के लिए 10% हैंक्स के समाधान के 999 मीटर में डीएमएसओ के 1 एमएल जोड़ें।
    नोट: अगले कदम एक्सपोजर समाधान के उदाहरण के रूप में BDE-47 का उपयोग करते हैं।
  4. 100% डीएमएसओ के 1 एमएल में 5 मिलीग्राम साफ-सुथरे बीडीई-47 को भंग कर 5 मिलीग्राम/एमएल का मानक एक्सपोजर सॉल्यूशन बनाएं।
  5. भंवर डीएमएसओ में बीडीई-47 को पूरी तरह से भंग करने के लिए 1 मिन के लिए 5 एमजी/एमएल समाधान।
  6. 12 मिलीग्राम ब्राउन ग्लास की बोतल में 5 मिलीग्राम/mL समाधान के 10 माइक्रोन स्थानांतरित करें ।
  7. BDE-47 एक्सपोजर समाधान 5 मिलीग्राम/एल और DMSO अनुपात की एकाग्रता 0.1% पर बनाने के लिए 10 मिलीग्राम की अंतिम मात्रा में निष्फल पानी जोड़ें, फिर 1 मिन के लिए भंवर।
  8. 5 एमजी/एल समाधान के 100 माइक्रोन क्रमशः दो 100 मिलीग्राम वॉल्यूम्ट्रिक फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
  9. क्रमशः BDE-47 एक्सपोजर सॉल्यूशंस 5 μg/L और 50 μg/L की अंतिम सांद्रता बनाने के लिए 100% डीएमएसओ (चरण 2.3 में तैयार) सहित 10% हैंक्स समाधान को 100 मीटर में जोड़ें।
  10. समाधान ों को 100 मीटर भूरे रंग के कांच की बोतलों में स्थानांतरित करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. भ्रूण का एक्सपोजर

  1. तीन ग्लास पेट्री व्यंजन (6 सेमी व्यास) 3-5 घंटे निषेचन (एचपीएफ) में से प्रत्येक में ~ 50 भ्रूण स्थानांतरित करें।
  2. भ्रूण के चारों ओर सिस्टम के पानी को दागने के लिए 1 mL पिपेट टिप का उपयोग करें।
  3. नियंत्रण और दो BDE-४७ जोखिम समाधान (नियंत्रण, 5 μg/L, ५० μg/L) क्रमशः तीन ग्लास पेट्री व्यंजन में स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें ।
  4. कांच पेट्री व्यंजन धीरे एक एक करके हिला भ्रूण थाली के नीचे में तितर-बितर करने के लिए ।
  5. ग्लास पेट्री व्यंजन को 28.5 डिग्री सेल्सियस के नीचे हल्के इनक्यूबेटर में रखें।
  6. एक्सपोजर समाधान के आधे हर 24 घंटे तक 5 डीपीएफ तक नवीनीकृत करें।
  7. हर ग्रुप के मृत भ्रूण ों की जांच 1 डीपीएफ और 2 डीपीएफ पर करें और मृत्यु दर की गणना करें।
  8. 2 डीपीएफ और 3 डीपीएफ पर हर समूह के इनक्यूबेटेड भ्रूण की जांच करें और हैचबिलिटी की गणना करें।
  9. चोरासे बाहर आने के बाद हर दिन लार्वा की विकृति की जांच करें और हर समूह की विकृति दर की गणना करें।
    नोट: विकृति संकेतकों में पेरिकार्डियल सिस्ट, स्पाइनल वक्रता, पूंछ वक्रता, अन्य कारकों के अलावा32शामिल हैं।

4. व्यवहार परीक्षण के लिए तैयारी

  1. 5 डीपीएफ की सुबह सोशल एक्टिविटी टेस्ट के लिए लोकोमोशन और पाथ एंगल टेस्ट के लिए 48 वेल माइक्रोप्लेट और तीन 6 वेल माइक्रोप्लेट तैयार करें।
  2. 48 अच्छी तरह माइक्रोप्लेट के हर कुएं में एक्सपोजर समाधान के 800 μL स्थानांतरित करें।
    नोट: हर समूह के लिए 16 कुओं का उपयोग करें (यानी, नियंत्रण समाधान, 5 μg/L, और ५० μg/L समूह) ।
  3. ग्लास पेट्री डिश से एक लार्वा के साथ एक्सपोजर समाधान के 200 माइक्रोन को 48 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में स्थानांतरित करने के लिए 1 मिलील पिपेट टिप का उपयोग करें।
  4. 6 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के हर कुएं में एक्सपोजर समाधान के 4 mL स्थानांतरित करें।
    नोट: हर समूह के लिए एक 6 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट का उपयोग करें।
  5. 6 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं में दो लार्वा के साथ एक्सपोजर समाधान के 200 माइक्रोन स्थानांतरित करने के लिए 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करें।
    नोट: हर समूह में छह दोहरासमूह होते हैं।
  6. सुनिश्चित करें कि परीक्षण कक्ष का तापमान परीक्षण से पहले 28 डिग्री सेल्सियस 2 घंटे है।
    नोट: व्यवहार परीक्षण आमतौर पर दोपहर में किया जाता है।

5. व्यवहार परीक्षण

  1. लोकोमोशन और पाथ एंगल टेस्ट
    1. सॉफ्टवेयर खोलने के लिए कंप्यूटर डेस्क पर लॉन्चर आइकन पर क्लिक करें (सामग्री की तालिकादेखें) जो कार्यक्रम शुरू करने के लिए उच्च-थ्रूपुट निगरानी बाड़े को नियंत्रित करता है।
    2. ऑपरेटिंग इंटरफेस में प्रवेश करने के लिए'ट्रैकिंग, रोटेशन, पाथ एंगल्स'मॉड्यूल चुनें।
    3. चरण 4.3 में तैयार 48 अच्छी तरह माइक्रोप्लेट को रिकॉर्डिंग प्लेटफॉर्म पर स्थानांतरित करें और कवर को नीचे खींचें।
    4. नया प्रोटोकॉल पैदा करना शुरू करने के लिए सॉफ्टवेयर में बदले में'फाइल'जेनरेट करें प्रोटोकॉलबटन पर क्लिक करें।
    5. 'लोकेशनकाउंट'पोजीशन में इनपुट'48'और'ओके'बटन पर क्लिक करें।
    6. सॉफ्टवेयर में बदले में'पैरामीटर'प्रोटोकॉल पैरामीटर'टाइम'बटन पर क्लिक करें। प्रयोग की अवधि 1 घंटे और 10 मिनट के लिए निर्धारित करें और एकीकरण की अवधि को 60 एस33तक सेट करें।
    7. पता लगाया क्षेत्रों ड्रा।
      1. अंडाकार आकार का चयन करें और पहले शीर्ष के चारों ओर पहला सर्कल अच्छी तरह से छोड़ दिया आकर्षित।
      2. सर्कल का चयन करें,"कॉपी"टॉप-राइट मार्क'पेस्ट'बटन बदले में क्लिक करें, और माउस का उपयोग कॉपी किए गए सर्कल को सही अच्छी तरह से शीर्ष पर खींचने के लिए करें।
      3. सर्कल का चयन करें,"कॉपी"बॉटम मार्क 'पेस्ट'बटन बदले में क्लिक करें, और माउस का उपयोग कॉपी किए गए सर्कल को नीचे सही अच्छी तरह से खींचने के लिए करें।
      4. बदले में'बिल्ड'क्लियरमार्क्सबटन पर क्लिक करें।
        नोट: सिस्टम स्वचालित रूप से प्लेट के हर दूसरे कुएं को आकर्षित करेगा। नव निर्मित क्षेत्रों को पूरी तरह से वास्तविक मछली और अच्छी तरह से के पक्ष में अपने प्रतिबिंब के बीच प्रत्येक अच्छी तरह से फिट होना चाहिए ।
    8. 'ड्रास्केल'बटन पर क्लिक करें, स्क्रीन पर एक अंशांकन रेखा (एक विकर्ण पथ या माइक्रोप्लेट के पक्ष के समानांतर) आकर्षित करें, इसकी लंबाई दर्ज करें और"यूनिट"सेट करें। इसके बाद'ग्रुप पर लगाएं'बटन पर क्लिक करें।
    9. सॉफ्टवेयर में'ब्लैक'पर जानवरों का रंग सेट करें।
    10. जानवरों का पता लगाने की अनुमति देने के लिए 16-18 पर पता लगाने की सीमा निर्धारित करें।
    11. इनपुट निष्क्रिय/छोटी और छोटी/बड़ी गति क्रमश05 सेमी/एस और 2.5 सेमी/एस पर।
    12. पथ कोण कक्षाएं निर्धारित करें। इनपुट"-90, -30, -10, 0, 10, 30, और 90"से पथ कोण कक्षाएं बनाने के लिए -180 ° -+180 ° ।
    13. प्रकाश की स्थिति निर्धारित करें
      1. क्लिक करें'पैरामीटर'लाइटड्राइविंग' में से एक का इस्तेमाल नीचे 3ट्रिगरिंग तरीकोंमें से एक को रोशनी की स्थिति तय करने के लिए बदले में'बढ़ी हुई उत्तेजनाएं'बटन से होती है।
      2. 'एज'बटन चुनें, फिर 10 मिन का डार्क पीरियड सेट करें, इसके बाद बारी-बारी से 10 सीन लाइट और डार्क पीरियड के तीन चक्र लगे।
    14. प्रोटोकॉल को सहेजें और परीक्षण कक्ष की रोशनी को बंद करें।
    15. 10 मिन के लिए सिस्टम में लार्वा को एक्सक्लाम करें और बदले में'प्रयोग'निष्पादितबटन पर क्लिक करें, फिर फ़ोल्डर चुनें जहां प्रयोग फ़ाइलों को सहेजा जाता है और परिणाम नाम दर्ज होता है।
    16. टेस्ट शुरू करने के लिए बदले में'बैकग्राउंड'स्टार्टबटन पर क्लिक करें।
    17. परीक्षण समाप्त होने पर प्रयोग को रोकने के लिए बदले में'प्रयोग'बंदकरो बटन पर क्लिक करें।
      नोट: सिस्टम बंद होने पर सिस्टम परीक्षण किए गए डेटा को दिखाता है। आंकड़ों में तीन गति कक्षाओं में ट्रैक की गई दूरी और हर मिनट की आठ कोण कक्षाओं में पथ कोण संख्या शामिल है । प्रस्तुत उदाहरण में लोकोमोशन परीक्षण के लिए, हर प्रकाश अवधि (10 मिन) में कुल दूरी की गणना की जाती है और नियंत्रण समूह और उपचार समूहों के बीच अंतर की तुलना में।
    18. 48 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट को अन्य प्रयोगों के लिए लाइट इनक्यूबेटर में वापस स्थानांतरित करें।
  2. सामाजिक गतिविधि परीक्षण
    1. प्रोग्राम शुरू करने के लिए हाई-थ्रूपुट मॉनिटरिंग बाड़े को नियंत्रित करने वाले सॉफ्टवेयर को खोलने के लिए कंप्यूटर डेस्क पर लॉन्चर आइकन पर क्लिक करें।
    2. ऑपरेटिंग इंटरफेस में प्रवेश करने के लिए'सोशल इंटरैक्शन'मॉड्यूल चुनें।
    3. तैयार 6 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट (नियंत्रण समूह) को चरण 4.4 में रिकॉर्डिंग प्लेटफॉर्म पर स्थानांतरित करें और कवर को नीचे खींचें।
    4. नया प्रोटोकॉल पैदा करना शुरू करने के लिए सॉफ्टवेयर में बदले में'फाइल'जेनरेट करें प्रोटोकॉलबटन पर क्लिक करें।
    5. 'लोकेशनकाउंट'पोजीशन में इनपुट'6'और'ओके'बटन पर क्लिक करें।
    6. सॉफ्टवेयर में बदले में'पैरामीटर'प्रोटोकॉल पैरामीटर'टाइम'बटन पर क्लिक करें। 1 घंटे और 10 मिनट के लिए प्रयोग अवधि निर्धारित करें और एकीकरण की अवधि 60 एस करने के लिए निर्धारित करें।
    7. पता लगाया क्षेत्रों ड्रा।
      1. अंडाकार आकार का चयन करें और पहले शीर्ष के चारों ओर पहला सर्कल अच्छी तरह से छोड़ दिया आकर्षित।
      2. सर्कल का चयन करें,"कॉपी"टॉप-राइट मार्क'पेस्ट'बटन बदले में क्लिक करें, और माउस का उपयोग कॉपी किए गए सर्कल को टॉप-राइट वेल में खींचने के लिए करें।
      3. सर्कल का चयन करें,"कॉपी"बॉटम मार्क 'पेस्ट'बटन बदले में क्लिक करें, और माउस का उपयोग कॉपी किए गए सर्कल को नीचे सही अच्छी तरह से खींचने के लिए करें।
      4. बदले में'बिल्ड'क्लियरमार्क्सबटन पर क्लिक करें।
        नोट: नव निर्मित क्षेत्रों को प्रत्येक अच्छी तरह से पूरी तरह से और वास्तविक लार्वा और कुएं के किनारे इसके प्रतिबिंब के बीच फिट होना चाहिए।
    8. 'ड्रास्केल'बटन पर क्लिक करें, स्क्रीन में एक अंशांकन रेखा (एक विकर्ण पथ या माइक्रोप्लेट के पक्ष के समानांतर) आकर्षित करें, इसकी लंबाई दर्ज करें और"यूनिट"सेट करें। इसके बाद'ग्रुप पर लगाएं'बटन पर क्लिक करें।
    9. जानवरों का पता लगाने की अनुमति देने के लिए 16-18 पर पता लगाने की सीमा निर्धारित करें।
    10. सॉफ्टवेयर में'ब्लैक एनिमल'बटन पर क्लिक करें।
    11. सॉफ्टवेयर में'डिस्टेंस थ्रेसहोल्ड'बटन और इनपुट5चुनें।
    12. प्रकाश की स्थिति निर्धारित करें।
      1. क्लिक करें'पैरामीटर'लाइटड्राइविंग' में से एक का इस्तेमाल नीचे 3ट्रिगरिंग तरीकोंमें से एक को रोशनी की स्थिति तय करने के लिए बदले में'बढ़ी हुई उत्तेजनाएं'बटन से होती है।
      2. 'एज'बटन चुनें, फिर 10 मिन का डार्क पीरियड सेट करें, इसके बाद बारी-बारी से 10 सीन लाइट और डार्क पीरियड के तीन चक्र लगे।
    13. प्रोटोकॉल को बचाएं और कमरे की रोशनी को बंद कर दें।
    14. 10 मिन के लिए सिस्टम में लार्वा को एक्सक्लाम करें और बदले में'प्रयोग'निष्पादितबटन पर क्लिक करें, फिर फ़ोल्डर चुनें जहां प्रयोग फ़ाइलों को सहेजा जाता है और परिणाम नाम दर्ज होता है।
    15. टेस्ट शुरू करने के लिए बदले में'बैकग्राउंड'स्टार्टबटन पर क्लिक करें।
    16. परीक्षण समाप्त होने पर सॉफ्टवेयर में प्रयोग को रोकने के लिए बदले में'प्रयोग'स्टॉपबटन पर क्लिक करें।
      नोट: सिस्टम बंद होने पर सिस्टम परीक्षण किए गए डेटा को दिखाता है।
    17. 6 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट (नियंत्रण समूह) को अन्य प्रयोगों के लिए लाइट इनक्यूबेटर में वापस स्थानांतरित करें।
    18. रिकॉर्डिंग प्लेटफॉर्म पर बारी-बारी से 6 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट (5 μg/L और 50 μg/L समूह) स्थानांतरित करें और 5.2.4 से 5.2.17 तक के चरणों को ऑर्डिनल द्वारा दोहराएं।

6. डेटा विश्लेषण

  1. लोकोमोशन और पाथ एंगल परिणामों में स्प्रेडशीट फ़ाइल खोलें।
  2. तीन दूरी के स्तंभों(इनािस्ट, स्मलेडिस्ट, लार्डिस्ट)का चयन करें और उन्हें जोड़ें।
    नोट: इनािस्ट, स्एमएलिस्टऔर लार्डिस्ट के डेटा का मतलब सिस्टम द्वारा क्रमशः विभिन्न गति वर्गों (निष्क्रिय/छोटे/बड़े) में दर्ज की गई विभिन्न दूरी है ।
  3. हर 10 मिनट की प्रकाश अवधि के लिए हर कुएं की दूरी का योग, 16 कुओं की औसत दूरी की गणना, और प्रकाश उत्तेजनाओं के तहत तीन समूहों के डेटा की तुलना करें ।
  4. हर 10 मिनट की प्रकाश अवधि के लिए cl01 से cl08 के बदले में हर प्रकाश अवधि में हर अच्छी तरह से कोण संख्या का योग है, और प्रकाश उत्तेजनाओं के तहत तीन समूहों के डेटा की तुलना करें ।
    नोट: cl01 से cl08 के लिए कॉलम के डेटा का मतलब अलग-अलग पथ कोणों में सिस्टम द्वारा दर्ज की गई विभिन्न पथ कोण संख्याएं क्रमशः।
  5. सोशल एक्टिविटी के नतीजों में स्प्रेडशीट फाइल खोलें।
  6. contct और contdur कॉलम का चयन करें, और हर 10 मिनट प्रकाश अवधि के लिए सामाजिक समय और हर अच्छी तरह के लिए उनकी अवधि का योग ।
  7. हर प्रकाश अवधि में एक समूह के औसत सामाजिक समय और अवधि की गणना करें और प्रकाश उत्तेजनाओं के तहत तीन समूहों के डेटा की तुलना करें।

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Representative Results

यहां, हम प्रकाश उत्तेजनाओं के तहत जेब्राफिश लार्वा का उपयोग करके पर्यावरणीय प्रदूषकों के न्यूरोबिहेवियरल प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। परिचय में लोकोमोशन, पथ कोण और सामाजिक गतिविधि परीक्षणों को परिभाषित किया गया है। लोकोमोशन और पाथ एंगल टेस्ट में माइक्रोप्लेट्स का सेटअप और सॉफ्टवेयर की इमेज नीचे दिखाई गई है। इसके अलावा, हमारे अपने शोध परिणाम उदाहरण के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । दो अध्ययनों में बीडीई-४७ और 6-ओह/मेओ-बीडीई-४७ के संपर्क में आने के बाद लोकोमोशन और पाथ एंगल इफेक्ट पेश करते हैं । तीसरा अध्ययन सामाजिक व्यवहार पर चार वाणिज्यिक क्लोरीनेटेड पैराफिन के प्रभाव प्रस्तुत करता है ।

48 वेल माइक्रोप्लेट का सेटअप और लोकोमोशन और पाथ एंगल टेस्ट में लार्वा का मूवमेंट लोकस।
प्रोटोकॉल में एक कंट्रोल ग्रुप और दो ट्रीटमेंट ग्रुप समेत तीन ग्रुप्स का इस्तेमाल किया गया । क्योंकि हर समूह में 16 जानवर हो सकते हैं, इस प्रणाली का उपयोग एक माइक्रोप्लेट में लोकोमोशन और पथ कोण के उच्च थ्रूपुट परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। चित्रा 1 नियंत्रण समाधान, 5 μg/L समाधान, और ५० μg/L समाधान के साथ इलाज एक लार्वा से पता चलता है क्रमशः पहले, मध्य, और पिछले दो पंक्तियों के प्रत्येक अच्छी तरह से ।

चित्रा 1 लोकोमोशन और पथ कोण परीक्षणों में लार्वा के सभी आंदोलन लोकी को भी दिखाता है। सिस्टम ने लार्वा के लोकोमोशन को ट्रैक किया और विभिन्न गति वर्गों में तैराकी दूरी की गणना की। सिस्टम ने विभिन्न पथ कोण कक्षाओं में लार्वा के पथ कोण संख्या की गणना की। शोधकर्ता अपने तरीके से सिस्टम द्वारा दर्ज आंकड़ों का विश्लेषण कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: 48 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट का सेटअप और लोकोमोशन और पथ कोण परीक्षण में लार्वा के आंदोलन लोकी। A1-A8, B1-B8 = नियंत्रण समूह; C1-C8, D1-D8 = 5 μg/L समूह; E1-E8, F1-F8 = ५० μg/L समूह । ब्लैक कलर ट्रैकिंग लाइन का मतलब निष्क्रियता या छोटे आंदोलन ों से है; हरे रंग की ट्रैकिंग लाइन का मतलब सामान्य आंदोलन ों से है; और लाल रंग ट्रैकिंग लाइन का मतलब है बड़े आंदोलन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सोशल एक्टिविटी टेस्ट में 6 वेल माइक्रोप्लेट।
चित्रा 2 सामाजिक गतिविधि परीक्षण प्रक्रिया में एक 6 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट दिखाता है। हर कुएं में दो लार्वा होते थे, और सिस्टम ने पूरी परीक्षण प्रक्रिया के दौरान दो लार्वा के बीच की दूरी दर्ज की। सिस्टम ने सेट टेस्टिंग टाइम (इस प्रोटोकॉल में 1 मिनट) में सोशल एक्टिविटी नंबर और अवधि दर्ज की।

Figure 2
चित्रा 2: सामाजिक गतिविधि परीक्षण में 6 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट। हर कुएं में दो लार्वा होते थे। येलो लाइन का मतलब है कि दो जानवरों के बीच की दूरी & ०.५ सेमी; लाल रेखा का मतलब है कि दो जानवरों के बीच की दूरी 0.5 सेमी है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बीडीई-47 एक्सपोजर ने 5 डीपीएफ पर जेब्राफिश लार्वा में लोकोमोशन को प्रभावित किया।
जैसा कि चित्रा 3में दिखाया गया है, बीडीई-47 के उच्चतम एकाग्रता समूह ने अंधेरे काल के दौरान स्पष्ट हाइपोएक्टिविटी का उत्पादन किया। हालांकि, प्रकाश अवधि के दौरान BDE-47 एक्सपोजर के कारण कोई देखा परिवर्तन नहीं किया गया।

Figure 3
चित्रा 3: 5 डीपीएफ पर लार्वा जेब्राफिश के लोकोमोशन पर बीडीई-47 एक्सपोजर का प्रभाव। लोकोमोशन (सेमी में मापी गई दूरी) को 70 मिनट की कुल अवधि के लिए अंधेरे और प्रकाश की बारी-बारी अवधि में दर्ज किया गया था। नीचे ठोस और खुले सलाखों में क्रमशः अंधेरे और प्रकाश अवधि का संकेत मिलता है। डेटा को मतलब ± एसईएम (*पी एंड एलटी; 0.05 नियंत्रण समूह की तुलना में) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इस आंकड़े को अनुमति के साथ झाओ एट अल17 से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

6- ओह/मेव-बीडीई-47 एक्सपोजर से जेब्राफिश लार्वा के पथ कोण 5 डीपीएफ पर प्रभावित हुए।
जैसा कि चित्र4में दिखाया गया है, 6-ओह-BDE-47 के उच्च एकाग्रता समूह ने कम नियमित मोड़ ों का प्रदर्शन किया और औसत 5 डीपीएफ पर बदल जाता है। हालांकि, 6-मेव-बीडीई-47 एक्सपोजर समूहों द्वारा अधिक उत्तरदायी मोड़ों को प्रेरित किया गया था।

Figure 4
चित्रा 4: अंधेरे अवधि के दौरान लार्वा जेब्राफिश के पथ कोण पर 6-ओह/मेओ-बीडीई-47 का प्रभाव। डेटा को मतलब ± एसईएम (*पी एंड एलटी; 0.05 नियंत्रण की तुलना में) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इस आंकड़े को अनुमति के साथ झांग एट अल18 से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सीपीएस एक्सपोजर ने 5 डीपीएफ पर जेब्राफिश लार्वा की सामाजिक गतिविधि को प्रभावित किया।
जैसा कि चित्रा 5में दिखाया गया है, जेब्राफिश लार्वा के सामाजिक व्यवहार तीन सीपी उत्पादों से प्रभावित थे। सामाजिक गतिविधि सीपी-७० और शॉर्ट चेन सीपी-52बी ने प्रेरित किया । लंबी श्रृंखला सीपी-52ए ने लार्वा के संपर्क के प्रति अवधि को छोटा कर दिया।

Figure 5
चित्रा 5: विभिन्न प्रकाश/अंधेरे अवधि में प्रति संपर्क औसत सामाजिक अवधि पर सीपीएस के प्रभाव । (A)सीपी-42,(B)सीपी-52a,(C)सीपी-52b,(D)सीपी-७० । डेटा को नियंत्रण की तुलना में मतलब ± एसईएम (*पी एंड एलटी; 0.05) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इस आंकड़े को अनुमति के साथ यांग एट अल19 से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह काम जेब्राफिश लार्वा का उपयोग करके पर्यावरणीय प्रदूषकों की न्यूरोटॉक्सिकिटी का मूल्यांकन करने के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदान करता है। ज़ेब्राफ़िश एक्सपोजर अवधि के दौरान भ्रूण से लार्वा तक की प्रक्रिया से गुजरते हैं, जिसका अर्थ है कि भ्रूण और लार्वा की अच्छी देखभाल आवश्यक है। भ्रूण और लार्वा के विकास को प्रभावित करने वाली कोई भी चीज अंतिम परिणाम को प्रभावित कर सकती है। यहां संस्कृति पर्यावरण, जोखिम प्रक्रिया, और प्रयोगात्मक शर्तों पर चर्चा की जाती है ताकि पूरे परख की सफलता सुनिश्चित की जा सके ।

संस्कृति पर्यावरण के लिए, जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा ~ 28 डिग्री सेल्सियस के स्थिर तापमान के तहत रहते हैं। इस काम में, एक हल्का इनक्यूबेटर जो प्रकाश की स्थिति को स्वचालित रूप से सेट कर सकता है और तापमान को स्थिर रख सकता है, भ्रूण और लार्वा को घर में रखने के लिए उपयोग किया जाता है। भ्रूण 1 डीपीएफ और 2 डीपीएफ पर चोरियन से बाहर नहीं आते हैं, इसलिए एक्सपोजर सॉल्यूशन को नवीनीकृत करते समय बिना रची भ्रूण को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए। इसके अलावा, समाधान में डीएमएसओ का अनुपात 0.1%34,35के तहत होना चाहिए, और नवीनीकरण के लिए उपयोग किए जाने से पहले ताजा एक्सपोजर समाधान 28 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए।

एक्सपोजर से पहले भ्रूण चुनने की प्रक्रिया भी प्रयोग की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। स्वस्थ भ्रूण हर समूह के लिए समवर्ती विकास का चयन विषाक्तता मूल्यांकन की सटीकता की गारंटी देता है । जेब्राफ़िश निषेचन के बाद पहले 7 दिनों के दौरान भोजन के बिना रह सकता है, इसलिए पूरे एक्सपोजर अवधि के दौरान भ्रूण या लार्वा को खिलाना सबसे अच्छा है क्योंकि भोजन अंतिम परिणाम को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, जरूरत पड़ने पर एक्सपोजर सॉल्यूशन फ्रेश तैयार करना सबसे अच्छा है।

व्यवहार परीक्षण के दौरान, लार्वा को उच्च-थ्रूपुट निगरानी बाड़े के वातावरण में अनुकूलित करने के लिए पर्याप्त समय प्रदान करना आवश्यक है। परीक्षण से पहले, परीक्षण प्रोटोकॉल के हर कदम को ध्यान से जांचना चाहिए, जिसमें प्रकाश की स्थिति, परीक्षण का समय आदि शामिल हैं। जानवरों को परेशान न करने के लिए टेस्टिंग रूम को पूरी तरह शांत और अंधेरा रखना चाहिए।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल पर्यावरण प्रदूषकों की न्यूरोबिहेवियरल विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए एक मौलिक फ्रेम प्रदान करता है। न्यूरोबिहेवियरल इफेक्ट्स का अध्ययन करते समय अन्य प्रकार के व्यवहार भी किए जाते हैं, जैसे रंग-वरीयता परीक्षण36,बॉटम निवास परीक्षण37,प्रकाश/डार्क प्रिफरेंस टेस्ट38,39,आदि। हालांकि, ये परीक्षण मुख्य रूप से वयस्क जेब्राफिश का उपयोग करते हैं, जो उच्च थ्रूपुट परीक्षणों के लिए फिट नहीं हैं। इसके अलावा, Weichert एट अल. सहज पूंछ आंदोलनों के व्यवहार के लिए वीडियो टेप किया गया है जिसे 24 एच एक्सपोजर40के बाद ही निर्धारित किया जा सकता है। न्यूरोबिहेवियरल विषाक्तता के मूल्यांकन में मस्तिष्क और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के कार्य पर तंत्र अध्ययन भी शामिल है। मौलिक न्यूरोबिहेवियरल संकेतक यहां पेश किए गए हैं और अन्य व्यवहार उपकरणों का उपयोग करके अधिक जटिल संकेतकों के लिए आधार बना सकते हैं। अंततः, इस अध्ययन तंत्र के साथ नए न्यूरोबिहेवियरल संकेतकों के विकास का उपयोग भविष्य के अध्ययनों में किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (21876135 और 21876136), चीन के राष्ट्रीय प्रमुख विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना (2017ZX075003-03, 2018ZX07701001-22), MOE-शंघाई की नींव द्वारा वित्तीय सहायता के लिए आभारी हैं बच्चों के पर्यावरण स्वास्थ्य की प्रमुख प्रयोगशाला (CEH201807-5), और स्वीडिश अनुसंधान परिषद (नंबर 639-2013-6913) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software

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References

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