Изучение нейроповеденческих воздействий экологических загрязнителей на личинки зебрафиш

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Подробный экспериментальный протокол представлен в этой работе для оценки нейроповеденческой токсичности загрязнителей окружающей среды с использованием модели личинок зебры, включая процесс воздействия и тесты на нейроповеденческие показатели.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

В последние годы все больше и больше загрязнителей окружающей среды оказались нейротоксическими, особенно на ранних стадиях развития организмов. Личинки зебрафиш являются выдающейся моделью для нейроповеденческого исследования загрязнителей окружающей среды. Здесь предусмотрен подробный экспериментальный протокол для оценки нейротоксичности загрязняющих веществ окружающей среды с использованием личинок зебры, включая сбор эмбрионов, процесс воздействия, нейроповеденческие показатели, процесс испытаний и анализа данных. Кроме того, для обеспечения успеха ассссы обсуждаются культурная среда, процесс экспозиции и экспериментальные условия. Протокол был использован в разработке психопатических препаратов, исследования экологических нейротоксических загрязнителей, и может быть оптимизирован, чтобы сделать соответствующие исследования или быть полезным для механистических исследований. Протокол демонстрирует четкий процесс работы для изучения нейроповеденческого воздействия на личинки зебры и может выявить эффекты различных нейротоксических веществ или загрязняющих веществ.

Introduction

В последние годы все больше и больше загрязнителей окружающей среды были доказаны нейротоксические1,2,3,4. Однако оценка нейротоксичности in vivo после воздействия загрязнителей окружающей среды не так проста, как оценка эндокринных нарушений или токсичности развития. Кроме того, раннее воздействие загрязняющих веществ, особенно в экологически значимых дозах, привлекает все большее внимание в исследованиях токсичности5,6,7,8.

Зебрафиш в настоящее время устанавливается в качестве модели животных, пригодных для нейротоксичности исследований во время раннего развития после воздействия экологических загрязнителей. Зебрафиши являются позвоночными, которые развиваются быстрее, чем другие виды после оплодотворения. Личинки не нужно кормить, потому что питательные вещества в хорионе достаточно для поддержания их в течение 7 дней послеоплодизации (dpf)9. Larvae выйти из хора на 2 dpf и развивать поведение, такие как плавание иповорот,который можно наблюдать, отслеживается, количественно, и анализируются автоматически с помощью инструментов поведения10,11,12,13, начиная с 3-4 dpf14,15,16,17,18. Кроме того, высокопроизводительные тесты также могут быть реализованы с помощью поведенческих инструментов. Таким образом, личинки зебры являются выдающейся моделью для нейроповеденческого исследования загрязнителей окружающей среды19. Здесь протокол предлагается с использованием высокой пропускной способностью мониторинга для изучения нейроповеденческой токсичности загрязнителей окружающей среды на личинках зебры под легкими стимулами.

Наша лаборатория изучила нейроповеденческую токсичность 2,2',4,4'-тетрабромодифенил эфир (BDE-47)20,21, 6'-Гидрокси / Метокси-2,2',4,4'-tetra Bromodiiphenyl ether (6-OH/MeO-BDE-47)22, дека-броминированный дифениловый эфир (БДЭ-209), свинец и коммерческие хлорированные парафины23 с использованием представленного протокола. Многие лаборатории также используют протокол для изучения нейроповеденческих эффектов других загрязнителей на личинок или взрослых рыб24,25,26,27. Этот нейроповеденческий протокол был использован, чтобы помочь обеспечить механистической поддержки, показывающие, что низкие дозы воздействия бисфенола А и замены бисфенола S индуцированных преждевременного гипоталамического нейрогенеза в эмбриональных зебрафиш27. Кроме того, некоторые исследователи оптимизировали протокол для проведения соответствующих исследований. Недавнее исследование исключило токсичность бета-амилоида (АЗ) в простой модели зебры с высокой пропускной способностью с использованием наночастиц золота с покрытием казеина (Cas AuNPs). Он показал, что «Cas AuNPs в системном циркуляции трансумтризировался через гематоэнцефалический барьер личинок зебры и поглощенных внутримозговых АЗ42, вызывая токсичность в неспецифической, сопровождающей, как образом, которая была поддержана поведенческой патологией28.

Локомотив, угол пути и социальная активность являются тремя нейроповеденческими индикаторами, используемыми для изучения нейротоксических эффектов личинок зебры после воздействия загрязняющих веществ в представленном протоколе. Локомотив измеряется расстоянием плавания личинок и может быть поврежден после воздействия загрязняющих веществ. Угол пути и социальная активность более тесно связаны с функцией мозга и центральной нервной системы29. Угол наклона относится к углу пути движения животных относительно направления плавания30. В системе установлены восемь угловых классов от 180 -180. Для упрощения сравнения, шесть классов в конечном исходе определяются как обычные повороты (-10 "0", 0 "10", средние повороты (-10 "-90", "10" (90) и отзывчивые повороты (-180 "-90", "90" (180) в соответствии с нашими предыдущими исследованиями21,22. Двухрыбная социальная активность является основополагающей для группового поведения; здесь расстояние злт; 0.5 cm между 2 личинками действительными определено как социальный контакт.

Представленный здесь протокол демонстрирует четкий процесс изучения нейроповеденческого воздействия на личинки зебры и дает возможность выявить нейротоксичность различных веществ или загрязняющих веществ. Протокол принесет пользу исследователям, заинтересованным в изучении нейротоксичности загрязнителей окружающей среды.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол соответствует руководящим принципам, утвержденным Комитетом по этике животных Университета Тонджи.

1. Сбор эмбрионов зебрафиш

  1. Положите две пары здоровых взрослых тюбингена зебрафиш в ящик для нереста в ночь перед воздействием, сохраняя соотношение полов на уровне 1:1.
  2. Удалите взрослую рыбу обратно в систему 30-60 минут после дневного света на следующее утро.
  3. Удалите эмбрионы из ящика для нереста.
  4. Промыть эмбрионы системной водой.
  5. Перенесите эмбрионы в стеклянную чашку Петри (диаметром 9 см) с достаточным количеством системной воды.
  6. Наблюдайте за эмбрионами под микроскопом и выбирайте здоровые эмбрионы для последующего воздействия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здоровые эмбрионы, как правило, прозрачны с светло-золотистым цветом под микроскопом. Нездоровые эмбрионы, как правило, бледные и слипаются вместе, как это наблюдается под микроскопом.

2. Подготовка перед воздействием

  1. Подготовьте решение Хэнкса в соответствии с руководящими принципами книги зебры31.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Решение Хэнкса включает в себя 0,137 M NaCl, 5,4 мМ KCl, 0,25 мМ Na2HPO4, 0,44 мМ KH2PO4, 1,3 мм CaCl2, 1,0 мМ MgSO4, и 4,2 мМ NaHCO3.
  2. Разбавить раствор Хэнкса 10% раствором Хэнкса с помощью стерильной воды.
  3. Добавьте 1 мл DMSO в 999 мл 10% решения Hanks, чтобы сделать решение управления 10% решения Hanks, включая 0,1% DMSO.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги используют BDE-47 в качестве примера решения экспозиции.
  4. Растворите 5 мг аккуратного БДЕ-47 в 1 мл 100% DMSO, чтобы сделать стандартный раствор воздействия 5 мг/мл.
  5. Vortex 5 мг/мл раствор в течение 1 мин, чтобы полностью растворить БДЕ-47 в DMSO.
  6. Перенесите 10 л раствора 5 мг/мл в коричневую стеклянную бутылку 12 мл.
  7. Добавьте стерилизованные воды в конечный объем 10 мл, чтобы сделать концентрацию раствора воздействия БДЕ-47 5 мг/л и Соотношения DMSO на уровне 0,1%, затем вихрь в течение 1 мин.
  8. Перенесите 10 л и 100 л раствора 5 мг/л в две объемные колбы объемом 100 мл соответственно.
  9. Добавьте 10% раствор Хэнкса, включая 0,1% DMSO (подготовлено в шаге 2.3) до 100 мл, чтобы сделать окончательные концентрации решений воздействия БДЕ-47 5 мкг/л и 50 мкг/л, соответственно.
  10. Перенесите растворы в коричневые стеклянные бутылки объемом 100 мл и храните их при 4 градусах Цельсия.

3. Воздействие эмбрионов

  1. Передача 50 эмбрионов в каждую из трех стеклянных посуды Петри (диаметром 6 см) 3-5 часов после оплодотворения (hpf).
  2. Используйте 1 мл пипетки отзыв, чтобы пятно системной воды вокруг эмбрионов.
  3. Используйте пипетку для передачи управления и двух решений воздействия БДЕ-47 (контроль, 5 мкг/л, 50 мкг/л) в три стеклянные блюда Петри, соответственно.
  4. Встряхните стеклянные блюда Петри осторожно один за другим, чтобы эмбрионы разошлись в нижней части пластины.
  5. Положите стеклянные блюда Петри в легкий инкубатор под 28,5 градусов по Цельсию.
  6. Обновляйте половину решений экспозиции каждые 24 ч до 5 dpf.
  7. Проверьте мертвые эмбрионы каждой группы на 1 dpf и 2 dpf и вычислить уровень смертности.
  8. Проверьте инкубированные эмбрионы каждой группы на 2 dpf и 3 dpf и вычислить вылупляемость.
  9. Проверьте деформацию личинок каждый день после того, как они выходят из хора и вычислить скорость деформации каждой группы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Показатели деформации включают перикардиальной кисты, кривизны позвоночника, кривизны хвоста, среди других факторов32.

4. Подготовка к тесту на поведение

  1. Подготовьте микроплиту 48 скважин для испытания на передвижение и угол наклона пути и три 6 скважины для теста на социальную активность утром 5 dpf.
  2. Передача 800 л раствора воздействия в каждую скважину микроплиты скважины 48 скважин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 16 скважин для каждой группы (т.е. контрольный раствор, 5 мкг/л и 50 мкг/л группы).
  3. Используйте 1 мл пипетки отзыв для передачи 200 л раствора экспозиции с одной личинки из стекла чашка Петри в один колодец из 48 хорошо микроплиты.
  4. Передача 4 мл раствора экспозиции в каждую скважину 6 скважины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте один 6 хорошо микроплиты для каждой группы.
  5. Используйте 1 мл пипетки отзыв для передачи 200 л воздействия раствора с двумя личинками в каждый колодец 6 хорошо микроплиты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая группа имеет шесть повторяющихся групп.
  6. Перед тестом температура испытательного зала составляет 28 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поведенческие тесты обычно проводятся во второй половине дня.

5. Поведенческий тест

  1. Испытание наклона и угла наклона пути
    1. Нажмите значок пусковой установки на компьютерном столе, чтобы открыть программное обеспечение (см. Таблица материалов), который контролирует корпус мониторинга высокой пропускной их прокладки для запуска программы.
    2. Выберите модуль"Отслеживание, вращения, Углы пути"для входа в операционный интерфейс.
    3. Передача 48 хорошо микроплиты подготовлены в шаге 4.3 на платформу записи и потяните вниз крышку.
    4. Нажмите кнопку«Файл»Generate Protocol, в свою очередь, в программном обеспечении, чтобы начать генерацию нового протокола.
    5. Ввейд "48" в позиции"Местоположение отсчета"и нажмите кнопку"OK".
    6. Нажмите кнопку"Параметры"Параметры протокола"Время" в свою очередь, в программном обеспечении. Установите продолжительность эксперимента на 1 ч и 10 мин и установите период интеграции до 60 с33.
    7. Нарисуйте обнаруженные области.
      1. Выберите эллиптической формы и нарисуйте первый круг вокруг первого верхнего левого хорошо.
      2. Выберите круг, щелкните «Copy«Top-Right Mark« Вставить «Вставить«Выберитекнопку в свою очередь, и используйте мышь, чтобы перетащить скопированный круг в правый верхний.
      3. Выберите круг, щелкните кнопку«Копия»Нижняя Марка«Вставить» Выберите кнопку «Выберите» в свою очередь, и используйте мышь, чтобы перетащить скопированный круг в правый нижний.
      4. Нажмите кнопку"Построить"Очистить знаки" в свою очередь.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Система будет автоматически рисовать каждый другой колодец пластины. Вновь созданные области должны идеально соответствовать каждому хорошо между фактической рыбы и ее отражение на стороне колодца.
    8. Нажмите кнопку«Шкала рисования»,нарисуйте линию калибровки на экране (диагональный путь или параллель с боковой микроплитой), введите ее длину иустановите «единицу». Затем нажмите кнопку"Применить к группе".
    9. Установите цвет животного на "Черный" в программном обеспечении.
    10. Установите порог обнаружения на 16-18, чтобы позволить обнаружение животных.
    11. Ввод неактивен/маленький и малый/большой скорости на 0.5 cm/s и 2.5 cm/s соответственно.
    12. Установите классы угла наклона. Вход "-90, -30, -10, 0, 10, 30 и 90 ",чтобы сделать угол наклона пути классов от -180 "-180".
    13. Установите условия освещения
      1. Нажмите кнопку«Параметры»Легкое вождение»Использует один из 3 методов запуска ниже«Расширенные стимулы»,чтобы установить условия освещения.
      2. Выберите кнопку"Край",затем установите темный период в 10 минут, а затем три цикла чередующихся 10 мин света и темных периодов.
    14. Сохраните протокол и выключите свет испытательного зала.
    15. Акклиматизировать личинки в системе в течение 10 минут и нажмите кнопку«Эксперимент»Выполнитев свою очередь, затем выберите папку, где сохраняются файлы эксперимента, и введите имя результата.
    16. Нажмите кнопку"Background""Начать"в свою очередь, чтобы начать тест.
    17. Нажмите кнопку"Эксперимент"Остановить", чтобы остановить эксперимент, когда тест заканчивается.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система показывает данные, проверенные при остановке системы. Данные включают гусенивое расстояние на трех классах скорости и угловые числа под восемью угловых классами каждой минуты. Для теста на передвижение в представленном примере рассчитывается общее расстояние в каждом светлом периоде (10 минут) и сравнивается разница между контрольной группой и группами лечения.
    18. Передача 48 скважин микроплиты обратно в свет инкубатор для других экспериментов.
  2. Тест на социальную активность
    1. Нажмите на значок пусковой установки на компьютерном столе, чтобы открыть программное обеспечение, которое управляет корпусом мониторинга высокой пропускной техники для запуска программы.
    2. Выберите модуль"Социальное взаимодействие"для входа в операционный интерфейс.
    3. Перенесите подготовленную 6 скважину (контрольная группа) в шаге 4.4 на платформу звукозаписи и снесите крышку.
    4. Нажмите кнопку«Файл»Generate Protocol, в свою очередь, в программном обеспечении, чтобы начать генерацию нового протокола.
    5. Ввечой "6" в позиции" Местоположение инажмите кнопку "OK".
    6. Нажмите кнопку"Параметры"Параметры протокола"Время" в свою очередь, в программном обеспечении. Установите продолжительность эксперимента на 1 ч и 10 мин и установите период интеграции до 60 с.
    7. Нарисуйте обнаруженные области.
      1. Выберите эллиптической формы и нарисуйте первый круг вокруг первого верхнего левого хорошо.
      2. Выберите круг, щелкните кнопку«Копия»Top-Right Mark«Вставить«Выберите» кнопку в свою очередь, и используйте мышь, чтобы перетащить скопированный круг в верхний правый колодец.
      3. Выберите круг, щелкните кнопку«Копия»Нижняя Марка«Вставить» Выберите кнопку «Выберите» в свою очередь, и используйте мышь, чтобы перетащить скопированный круг в правый нижний.
      4. Нажмите кнопку"Построить"Очистить знаки" в свою очередь.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Вновь созданные области должны соответствовать каждому хорошо идеально и между фактическими личинок и его отражение на стороне колодца.
    8. Нажмите кнопку«Шкала рисования»,нарисуйте линию калибровки на экране (диагональный путь или параллель с боковой частью микроплиты), введите ее длину иустановите «единицу». Затем нажмите кнопку"Применить к группе".
    9. Установите порог обнаружения на 16-18, чтобы позволить обнаружение животных.
    10. Нажмите кнопку"Черное животное"в программном обеспечении.
    11. Выберите кнопку«Порог расстояния»и вввод «5» в программном обеспечении.
    12. Установите условия освещения.
      1. Нажмите кнопку«Параметры»Легкое вождение»Использует один из 3 методов запуска ниже«Расширенные стимулы»,чтобы установить условия освещения.
      2. Выберите кнопку"Край",затем установите темный период в 10 минут, а затем три цикла чередующихся 10 мин света и темных периодов.
    13. Сохраните протокол и выключите свет в комнате.
    14. Акклиматизировать личинки в системе в течение 10 минут и нажмите кнопку«Эксперимент»Выполнитев свою очередь, затем выберите папку, где сохраняются файлы эксперимента, и введите имя результата.
    15. Нажмите кнопку"Background""Начать"в свою очередь, чтобы начать тест.
    16. Нажмите кнопку"Эксперимент"Остановить", в свою очередь, чтобы остановить эксперимент в программном обеспечении, когда тест заканчивается.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система показывает данные, проверенные при остановке системы.
    17. Передача 6 скважин микроплиты (контрольная группа) обратно в свет инкубатор для других экспериментов.
    18. Передача 6 скважин микроплит (5 мкг/л и 50 мкг/л групп) в свою очередь, на платформу записи и повторить шаги от 5,2,4 до 5,2,17 на ординаторские.

6. Анализ данных

  1. Откройте файл электронной таблицы в результатах движения и угла наклона.
  2. Выберите три колонки расстояния(неподходящий, smldist, lardist) и сложить их.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные inadist, smldist,и lardist означают различные расстояния, записанные системой в различных классах скорости (неактивных/малых/больших), соответственно.
  3. За каждые 10 минут светового периода суммируетрасстояние каждой скважины, вычисляет среднее расстояние 16 скважин и сравнивает данные трех групп под световыми стимулами.
  4. За каждые 10 минут светового периода суммировать угловое число каждого колодца в каждой продолжительности света от cl01 до cl08 в свою очередь, и сравнить данные трех групп под световыми стимулами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные столбцов от cl01 до cl08 означают разные номера угла пути, записанные системой в разных углах пути, соответственно.
  5. Откройте файл электронной таблицы в результатах социальной деятельности.
  6. Выберите конткт и контдур колонны, и на каждые 10 минут световой период суммирует социальные времена и их продолжительность для каждого колодца.
  7. Рассчитайте среднее социальное время и продолжительность одной группы в каждой продолжительности света и сравните данные трех групп под световыми стимулами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь мы описываем протокол для изучения нейроповеденческих эффектов загрязнителей окружающей среды с использованием личинок зебры под световыми стимулами. Во введении определяются тесты на передвижение, угол наклона и социальную активность. Приведение микроплит в испытаниях на передвижение и угол наклона пути и изображения программного обеспечения показаны ниже. Кроме того, в качестве примеров приводятся результаты наших исследований. Два исследования представляют передвижение и эффекты угла пути после воздействия BDE-47 и 6-OH/MeO-BDE-47. Третье исследование представляет влияние четырех коммерческих хлорированных парафинов на социальное поведение.

Установка микроплиты 48 скважин и движение локуса личинок в передвижении и наклоне ногой.
В протоколе были использованы три группы, в том числе одна контрольная группа и две группы лечения. Поскольку каждая группа может иметь 16 животных, система может быть использована для выполнения высокопроизводительных тестов передвижения и угла наклона в одной микроплите. На рисунке 1 показана одна личинка, обработанная контрольным раствором, 5 мкг/л раствором и 50 мкг/л раствором в каждой скважине первого, среднего и последнего двух рядов, соответственно.

На рисунке 1 также показаны все движения локусов личинок в передвижении и наклоне пути испытаний. Система отслеживала движение личинок и вычисляла расстояние плавания на разных классах скорости. Система вычислила угловые числа личинок в разных классах угла пути. Исследователи могут анализировать данные, записанные системой по-своему.

Figure 1
Рисунок 1: Установка микроплиты 48 скважин и движение локонов личинок в движении и тесте угла наклона. A1-A8, B1-B8 - контрольная группа; C1-C8, D1-D8 - группа 5 мкг/л; E1-E8, F1-F8 - группа 50 мкг/л. Черная линия отслеживания цвета означает бездействие или небольшие движения; зеленая линия отслеживания цвета означает нормальные движения; и красная линия отслеживания цвета означает большие движения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

6 скважин микроплиты в тесте социальной активности.
На рисунке 2 показана 6 скважинная микроплита в процессе тестирования социальной активности. Каждая скважина имела две личинки, и система фиксировала расстояние между двумя личинками в течение всего процесса тестирования. Система зафиксировала номера и продолжительность социальной активности в установленном времени тестирования (1 мин в этом протоколе).

Figure 2
Рисунок 2: 6 скважин микроплиты в тесте социальной активности. В каждом колодце было по две личинки. Желтая линия означает, что расстояние между двумя животными составляет 0,5 см; красная линия означает, что расстояние между двумя животными составляет 0,5 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Воздействие БДЕ-47 повлияло на движение в личинках зебры при 5 дпфах.
Как показано на рисунке 3, самая высокая концентрационная группа БДЕ-47 произвела выраженную гипоактивность в темный период. Однако никаких изменений из-за воздействия БДЕ-47 в световые периоды не наблюдалось.

Figure 3
Рисунок 3: Эффекты воздействия БДЕ-47 на передвижение личинок зебры на 5 dpf. Локодвижение (расстояние, измеренное в см) было зафиксировано в чередующихся периодах тьмы и света в течение общей продолжительности 70 мин. Твердые и открытые прутья внизу указывают на темные и светлые периоды, соответственно. Данные представлены в виде среднего значения - SEM (п.л.; 0,05 по сравнению с контрольной группой). Эта цифра была изменена с Чжао и др.17 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

6-OH/MeO-BDE-47 воздействие повлияло на углы пути личинки зебры на 5 dpf.
Как показано на рисунке 4, высокая концентрационная группа 6-OH-BDE-47 выполняет меньше рутинных поворотов и средних поворотов на 5 dpf. Однако более отзывчивые повороты были вызваны 6-MeO-BDE-47 группами воздействия.

Figure 4
Рисунок 4: Эффекты 6-OH/MeO-BDE-47 на угол пути личинок зебры в темный период. Данные представлены в виде среднего значения SEM(p slt; 0.05 по сравнению с управлением). Эта цифра была изменена с Чжан и др.18 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Воздействие КП повлияло на социальную активность личинок зебры при 5 дпфах.
Как показано на рисунке 5, социальное поведение личинок зебры были под влиянием трех продуктов CP. Социальная активность стимулировалась CP-70 и короткоцепочечной CP-52b. Длинная цепь CP-52a сократила продолжительность на контакт личинок.

Figure 5
Рисунок 5: Влияние КП на среднюю социальную продолжительность на один контакт в различные светлые/темные периоды. (A) CP-42, (B) CP-52a, (C) CP-52b, (D) CP-70. Данные представлены в виде среднего значения SEM(p slt; 0.05 по сравнению с управлением). Эта цифра была изменена с разрешения Ян и др.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта работа обеспечивает подробный экспериментальный протокол для оценки нейротоксичности загрязняющих веществ окружающей среды с использованием личинок зебры. Зебрафиш проходит через этот процесс от эмбрионов до личинок в период экспозиции, что означает, что хороший уход за эмбрионами и личинками имеет важное значение. Все, что влияет на развитие эмбрионов и личинок, может повлиять на конечный результат. Здесь обсуждается культурная среда, процесс экспозиции и экспериментальные условия, чтобы обеспечить успех всего асссе.

Для культурной среды эмбрионы и личинки зебры живут при стабильной температуре в 28 градусов по Цельсию. В этой работе, легкий инкубатор, который может установить условия света автоматически и держать температуру стабильной используется для размещения эмбрионов и личинок. Эмбрионы не выходят из хора на 1 dpf и 2 dpf, поэтому следует позаботиться, чтобы избежать повреждения невылупившихся эмбрионов при возобновлении воздействия решения. Кроме того, соотношение DMSO в растворе должно быть под 0,1%34,35,а свежий раствор экспозиции должен быть на 28 градусов по Цельсию, прежде чем он будет использоваться для обновления.

Процесс отбора эмбрионов до воздействия также является ключевым фактором успеха эксперимента. Выбор здоровых эмбрионов, развивающихся одновременно для каждой группы, гарантирует точность оценки токсичности. Зебрафиш может жить без пищи в течение первых 7 дней после оплодотворения, поэтому лучше не кормить эмбрионы или личинки в течение всего периода воздействия, потому что пища может повлиять на конечный результат. Кроме того, лучше всего подготовить решение экспозиции свежим, когда это необходимо.

Во время теста на поведение, важно предложить личинки достаточно времени, чтобы адаптироваться к окружающей среде высокой пропускной записи мониторинга корпуса. Перед тестом необходимо тщательно проверить каждый этап проверенного протокола, включая состояние света, время тестирования и т.д. В испытательном зале нужно держать полностью тихо и темно, чтобы не беспокоить животных.

Представленный протокол предлагает фундаментальные рамки для изучения нейроповеденческой токсичности загрязнителей окружающей среды. Есть также другие типы поведения, используемые при изучении нейроповеденческих эффектов, таких как цвет предпочтения тесты36, нижней жилище тесты37, свет / темные тесты предпочтения38,39и т.д. Тем не менее, эти тесты в основном используют взрослых зебры, которые не подходят для высокой пропускной форме испытаний. Кроме того, Weichert et al. видеозапись поведения спонтанных движений хвоста, которые могут быть количественно сразу после 24 ч воздействия40. Оценка нейроповеденческой токсичности также включает в себя механизм исследования на функции мозга и центральной нервной системы. Здесь вводятся фундаментальные нейроповеденческие индикаторы, которые могут стать основой для более сложных показателей с использованием других поведенческих инструментов. В конечном счете, разработка новых нейроповеденческих показателей, сопровождаемых этим механизмом исследования, может быть использована в будущих исследованиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарны за финансовую поддержку со стороны Национального фонда естественных наук Китая (21876135 и 21876136), Национального крупного научно-технического проекта Китая (2017-X07502003-03, 2018-X07701001-22), Фонда МЧС-Шанхай Ключевая лаборатория охраны окружающей среды детей (CEH201807-5) и Шведский научно-исследовательский совет (No 639-2013-6913).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35, (12), 2931-2940 (2016).
  2. Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
  3. Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57, (7), 775-793 (2016).
  4. Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
  5. Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. Environmental Organic Chemistry. John Wiley & Sons. (2016).
  6. Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24, (3), 253-273 (2016).
  7. Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90, (9), 2077-2107 (2016).
  8. Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113, (9), 1230-1233 (2005).
  9. Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
  10. Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3, (2), 235-247 (2006).
  11. Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234, (4), 549-558 (2017).
  12. Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
  13. Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
  14. Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4, (3), 567-576 (2008).
  15. Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55, (1), 1-16 (2015).
  16. Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31, (10), 1241-1249 (2016).
  17. Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 65 (2016).
  18. Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
  19. Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10, (1), 46 (2017).
  20. Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
  21. Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
  22. Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
  23. Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
  24. Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
  25. Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
  26. Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos? Environmental Science & Technology. 53, (1), 482-493 (2018).
  27. Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (5), 1475-1480 (2015).
  28. Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10, (1), 1-14 (2019).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210, (2), 266-271 (2012).
  30. Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207, (19), 3265-3279 (2004).
  31. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
  32. Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36, (3), 481-486 (2017).
  33. Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30, (1), 52-58 (2009).
  34. Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
  35. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Drug Safety Evaluation. Springer. 271-279 (2011).
  36. Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13, (4), 330-334 (2016).
  37. Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11, (3), 366-373 (2012).
  38. Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104, (5), 831-837 (2011).
  39. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7, (5), e36931 (2012).
  40. Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics