Estudio de los efectos neuroconductuales de los contaminantes ambientales en las larvas de peces cebra

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Summary

En este documento se presenta un protocolo experimental detallado para la evaluación de la toxicidad neuroconductual de contaminantes ambientales utilizando un modelo de larvas de pez cebra, incluyendo el proceso de exposición y pruebas para indicadores neuroconductuales.

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Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).

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Abstract

En los últimos años se han demostrado que cada vez más contaminantes ambientales son neurotóxicos, especialmente en las primeras etapas de desarrollo de los organismos. Las larvas de pez cebra son un modelo preeminente para el estudio neuroconductual de contaminantes ambientales. Aquí, se proporciona un protocolo experimental detallado para la evaluación de la neurotoxicidad de los contaminantes ambientales utilizando larvas de pez cebra, incluyendo la recolección de los embriones, el proceso de exposición, indicadores neuroconductuales, el proceso de prueba, y análisis de datos. Además, se discuten el entorno de cultivo, el proceso de exposición y las condiciones experimentales para garantizar el éxito del ensayo. El protocolo se ha utilizado en el desarrollo de fármacos psicópatas, investigación sobre contaminantes neurotóxicos ambientales, y puede ser optimizado para hacer estudios correspondientes o ser útil para estudios mecánicos. El protocolo demuestra un proceso de operación claro para estudiar los efectos neuroconductuales en las larvas de peces cebra y puede revelar los efectos de diversas sustancias neurotóxicas o contaminantes.

Introduction

En los últimos años se han demostrado más y más contaminantes ambientales neurotóxicos1,2,3,4. Sin embargo, la evaluación de la neurotoxicidad in vivo después de la exposición a contaminantes ambientales no es tan fácil como la de la alteración endocrina o la toxicidad del desarrollo. Además, la exposición temprana a contaminantes, especialmente en dosis ambientalmente relevantes, ha atraído cada vez más atención en los estudios de toxicidad5,6,7,8.

El pez cebra se está estableciendo como un modelo animal apto para estudios de neurotoxicidad durante el desarrollo temprano después de la exposición a contaminantes ambientales. Los peces cebra son vertebrados que se desarrollan más rápido que otras especies después de la fertilización. Las larvas no necesitan ser alimentadas porque los nutrientes en el coro son suficientes para sostenerlas durante 7 días después de la fertilización (dpf)9. Las larvas salen del coro a 2 dpf y desarrollan comportamientos como natación y torneado que se pueden observar, rastrear, cuantificar y analizar automáticamente utilizando instrumentos de comportamiento10,11,12,13 a partir de 3-4 dpf14,15,16,17,18. Además, las pruebas de alto rendimiento también se pueden realizar mediante instrumentos de comportamiento. Por lo tanto, las larvas de pez cebra son un modelo excepcional para el estudio neuroconductual de contaminantes ambientales19. Aquí, se ofrece un protocolo utilizando monitoreo de alto rendimiento para estudiar la toxicidad neuroconductual de contaminantes ambientales en larvas de peces cebra bajo estímulos ligeros.

Nuestro laboratorio ha estudiado la toxicidad neuroconductual de 2,2',4,4'-tetrabromodifenilo éter (BDE-47)20,21, 6'-Hidroxi/Methoxy-2,2',4,4'-éter de tetrabromodifenilo (6-OH/MeO-BDE-47)22, éter de difenilo deca-brominado (BDE-209), plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo y parafinas cloradas comerciales23 utilizando el protocolo presentado. Muchos laboratorios también utilizan el protocolo para estudiar los efectos neuroconductuales de otros contaminantes en larvas o peces adultos24,25,26,27. Este protocolo neuroconductual se utilizó para ayudar a proporcionar apoyo mecánico que muestra que la exposición a dosis bajas al bisfenol A y al bisfenol S de reemplazo induzcan neurogénesis hipotalámica prematura en el pez cebra embrionario27. Además, algunos investigadores optimizaron el protocolo para realizar los estudios correspondientes. Un estudio reciente eliminó la toxicidad de la beta amiloide (A) en un modelo de pez cebra fácil y de alto rendimiento utilizando nanopartículas de oro recubiertas de caseína (Cas AuNPs). Demostró que las AuNPs de las Cas en circulación sistémica se trasladaron a través de la barrera hematoencefálica de las larvas de peces cebra y secuestraron el A42 intracerebral, provocando toxicidad de una manera inespecífica, similar a la acompañante, que estaba respaldada por la patología conductual28.

La locomoción, el ángulo de trayectoria y la actividad social son tres indicadores neuroconductuales utilizados para estudiar los efectos de la neurotoxicidad de las larvas de peces cebra después de la exposición a contaminantes en el protocolo presentado. La locomoción se mide por la distancia de natación de las larvas y puede dañarse después de la exposición a contaminantes. El ángulo del camino y la actividad social están más estrechamente relacionados con la función del cerebro y el sistema nervioso central29. El ángulo de trayectoria se refiere al ángulo de la trayectoria del movimiento animal en relación con la dirección de natación30. En el sistema se establecen ocho clases de ángulo s/180o-+180o. Para simplificar la comparación, seis clases en el resultado final se definen como giros de rutina (-10o, 0o+ 10o), giros medios (-10o-90o, +10o+90o) y giros responsivos (-180o-90o, +90o+180o) según nuestros estudios anteriores21,22. La actividad social de dos peces es fundamental para el comportamiento de los bancos de grupo; aquí una distancia de < 0,5 cm entre dos larvas válidas se define como contacto social.

El protocolo presentado aquí demuestra un proceso claro para estudiar los efectos neuroconductuales en las larvas de peces cebra y proporciona una manera de revelar los efectos de neurotoxicidad de diversas sustancias o contaminantes. El protocolo beneficiará a los investigadores interesados en estudiar la neurotoxicidad de los contaminantes ambientales.

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Protocol

El protocolo está de acuerdo con las directrices aprobadas por el Comité de ética animal de la Universidad de Tongji.

1. Recogida de embriones zebrafish

  1. Ponga dos pares de peces cebra Tubingen adultos sanos en la caja de desove en la noche antes de la exposición, manteniendo la proporción de sexo en 1:1.
  2. Retire el pez adulto de vuelta al sistema 30-60 minutos después de la luz del día a la mañana siguiente.
  3. Retire los embriones de la caja de desove.
  4. Enjuague los embriones con agua del sistema.
  5. Transfiera los embriones a una placa de vidrio Petri (9 cm de diámetro) con suficiente agua del sistema.
  6. Observe los embriones bajo el microscopio y seleccione embriones sanos para una exposición posterior.
    NOTA: Los embriones sanos suelen ser transparentes con un color dorado claro bajo el microscopio. Los embriones insalubres suelen estar pálidos y agrupados como se observa bajo el microscopio.

2. Preparación antes de la exposición

  1. Preparar la solución de los Hanks de acuerdo con las directrices del libro de peces cebra31.
    NOTA: La solución de Hanks incluye 0.137 M NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na2HPO4, 0.44 mM KH2PO4, 1.3 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4y 4.2 mM NaHCO3.
  2. Diluir la solución de Hanks a 10% de la solución de Hanks utilizando agua estéril.
  3. Añadir 1 ml de DMSO en 999 ml de solución de 10% Hanks para hacer una solución de control de la solución de 10% Hanks incluyendo 0.1% DMSO.
    NOTA: Los siguientes pasos utilizan BDE-47 como ejemplo de una solución de exposición.
  4. Disolver 5 mg del BDE-47 limpio en 1 ml de 100% DMSO para hacer una solución de exposición estándar de 5 mg/ml.
  5. Vortex la solución de 5 mg/ml durante 1 min para disolver completamente el BDE-47 en el DMSO.
  6. Transfiera 10 ml de la solución de 5 mg/ml a una botella de vidrio marrón de 12 ml.
  7. Añadir agua esterilizada a un volumen final de 10 ml para hacer la concentración de la solución de exposición BDE-47 5 mg/L y DMSO relación al 0,1%, luego vórtice durante 1 min.
  8. Transfiera 10 l y 100 l de la solución de 5 mg/L en dos matraces volumétricos de 100 ml respectivamente.
  9. Añadir una solución de 10% Hanks, incluyendo 0,1% DMSO (preparado en el paso 2.3) a 100 ml para realizar las concentraciones finales de las soluciones de exposición BDE-47 5 g/L y 50 g/L, respectivamente.
  10. Transfiera las soluciones a botellas de vidrio marrón de 100 ml y guárdelas a 4 oC.

3. Exposición de embriones

  1. Transfiera 50 embriones en cada uno de los tres platos Petri de vidrio (6 cm de diámetro) 3-5 horas después de la fertilización (hpf).
  2. Utilice una punta de pipeta de 1 ml para borrar el agua del sistema alrededor de los embriones.
  3. Utilice una pipeta para transferir el control y dos soluciones de exposición BDE-47 (control, 5 g/L, 50 g/l) a los tres platos de vidrio Petri, respectivamente.
  4. Agitar los platos de vidrio Petri suavemente uno por uno para hacer que los embriones se dispersen en la parte inferior de la placa.
  5. Poner los platos de vidrio Petri en la incubadora de luz por debajo de 28.5 oC.
  6. Renueve la mitad de las soluciones de exposición cada 24 h hasta 5 dpf.
  7. Compruebe los embriones muertos de cada grupo en 1 dpf y 2 dpf y calcule la tasa de mortalidad.
  8. Compruebe los embriones incubados de cada grupo en 2 dpf y 3 dpf y calcule la incubación.
  9. Compruebe la deformidad de las larvas todos los días después de que salgan del coro y calcule la tasa de deformidad de cada grupo.
    NOTA: Los indicadores de deformidad incluyen quiste pericárdico, curvatura de la columna vertebral, curvatura de la cola, entre otros factores32.

4. Preparación para la prueba de comportamiento

  1. Prepare una microplaca de 48 pozos para la prueba de ángulo de trayectoria y locomoción y tres 6 microplacas de pozo para la prueba de actividad social en la mañana de 5 dpf.
  2. Transfiera 800 l de solución de exposición a cada pocal de la microplaca de 48 pocillos.
    NOTA: Utilice 16 pozos para cada grupo (es decir, la solución de control, 5 g/L y 50 g/L de grupo).
  3. Utilice una punta de pipeta de 1 ml para transferir 200 ml de solución de exposición con una larva de la placa de vidrio Petri en un pozo de la microplaca de 48 pocillos.
  4. Transfiera 4 ml de solución de exposición a cada pocal de la microplaca de 6 pocillos.
    NOTA: Utilice una microplaca de 6 pozos para cada grupo.
  5. Utilice una punta de pipeta de 1 ml para transferir 200 ml de solución de exposición con dos larvas a cada poca de la microplaca de 6 pocillos.
    NOTA: Cada grupo tiene seis grupos repetidos.
  6. Asegúrese de que la temperatura de la sala de ensayo es de 28 oC 2 h antes de la prueba.
    NOTA: Las pruebas de comportamiento generalmente se realizan por la tarde.

5. Prueba de comportamiento

  1. Prueba de ángulo de giro y giro
    1. Haga clic en el icono del lanzador en el escritorio del ordenador para abrir el software (consulte Tabla de materiales)que controla el gabinete de supervisión de alto rendimiento para iniciar el programa.
    2. Elija el módulo"Seguimiento, Rotaciones, Ángulosde ruta" para entrar en la interfaz operativa.
    3. Transfiera la microplaca de 48 pozos preparada en el paso 4.3 a la plataforma de grabación y tire hacia abajo de la cubierta.
    4. Haga clic en elbotón" Archivo " "Generar protocolo"a su vez en el software para comenzar a generar un nuevo protocolo.
    5. Ingrese "48" en la posición "Recuentode ubicación " y haga clic en el botón "OK".
    6. Haga clic en el botón "Parameters" "Protocol Parameters" "Time" a su vez en el software. Establezca la duración del experimento para 1 h y 10 min y establezca el período de integración en 60 s33.
    7. Dibuje las áreas detectadas.
      1. Seleccione la forma elíptica y dibuje el primer círculo alrededor del primer pozo superior izquierdo.
      2. Seleccione el círculo, haga clic en el botón "Copy" "Top-right Mark" "Paste"Select" a su vez, y utilice el ratón para arrastrar el círculo copiado hacia el pozo superior derecho.
      3. Seleccione el círculo, haga clic en el botón"Copiar" "Marca inferior""Pegar" "Seleccionar" a su vez, y utilice el ratón para arrastrar el círculo copiado hacia la parte inferior derecha.
      4. Haga clic en el botón "Build" "Clear marks" a su vez.
        NOTA: El sistema dibujará automáticamente todos los demás pozos de la placa. Las áreas recién creadas deben encajar perfectamente cada pozo entre el pez real y su reflejo en el lado del pozo.
    8. Haga clic en el botón"Dibujar escala",dibuje una línea de calibración en la pantalla (un trazado diagonal o paralelo al lado de la microplaca), introduzca su longitud y ajuste la"Unidad". A continuación, haga clic en el botón"Aplicar al grupo".
    9. Establezca el color del animal en"Negro"en el software.
    10. Establezca el umbral de detección en 16-18 para permitir la detección de los animales.
    11. Entrada inactiva/pequeña y pequeña/grande a 0,5 cm/s y 2,5 cm/s respectivamente.
    12. Establezca las clases de ángulo de ruta. Entrada "-90, -30, -10, 0, 10, 30 y 90"para hacer clases de ángulo de ruta de -180o-+180o.
    13. Establecer las condiciones de luz
      1. Haga clic en el botón "Parameters" "Light driving" " Utiliza uno de los 3 métodos deactivación a continuación" " Enhancedstimuli"a su vez para establecer las condiciones de luz.
      2. Elija el botón"Borde",luego establezca un período oscuro de 10 min, seguido de tres ciclos de períodos de luz y oscuridad alternados de 10 minutos.
    14. Guarde el protocolo y apague la luz de la sala de pruebas.
    15. Aclimate las larvas en el sistema durante 10 minutos y haga clic en el botón "Experiment" "Execute" a su vez, luego elija la carpeta donde se guardan los archivos del experimento e introduzca el nombre del resultado.
    16. Haga clic en el botón "Background" "Start" a su vez para iniciar la prueba.
    17. Haga clic en el botón "Experimento" "Detener"a su vez para detener el experimento cuando finalice la prueba.
      NOTA: El sistema muestra los datos probados cuando el sistema se detiene. Los datos incluyen la distancia rastreada en tres clases de velocidad y números de ángulo de ruta en ocho clases de ángulo de cada minuto. Para la prueba de locomoción en el ejemplo presentado, se calcula la distancia total en cada período de luz (10 min) y se compara la diferencia entre el grupo de control y los grupos de tratamiento.
    18. Transfiera la microplaca de 48 pocillos a la incubadora de luz para otros experimentos.
  2. Prueba de actividad social
    1. Haga clic en el icono del lanzador en el escritorio del ordenador para abrir el software que controla el gabinete de supervisión de alto rendimiento para iniciar el programa.
    2. Elija el módulo"Interacciones sociales"para entrar en la interfaz operativa.
    3. Transfiera la microplaca de 6 pozos preparada (grupo de control) en el paso 4.4 a la plataforma de grabación y tire hacia abajo de la cubierta.
    4. Haga clic en elbotón" Archivo " "Generar protocolo"a su vez en el software para comenzar a generar un nuevo protocolo.
    5. Introduzca "6" en la posición "Recuentode ubicación " y haga clic en el botón "OK".
    6. Haga clic en el botón "Parameters" "Protocol Parameters" "Time" a su vez en el software. Establezca la duración del experimento para 1 h y 10 min y establezca el período de integración en 60 s.
    7. Dibuje las áreas detectadas.
      1. Seleccione la forma elíptica y dibuje el primer círculo alrededor del primer pozo superior izquierdo.
      2. Seleccione el círculo, haga clic en el botón "Copy" "Top-right Mark" "Paste"Select" a su vez, y utilice el ratón para arrastrar el círculo copiado al pozo superior derecho.
      3. Seleccione el círculo, haga clic en el botón"Copiar" "Marca inferior""Pegar" "Seleccionar" a su vez, y utilice el ratón para arrastrar el círculo copiado hacia la parte inferior derecha.
      4. Haga clic en el botón "Build" "Clear marks" a su vez.
        NOTA: Las áreas recién creadas deben encajar cada una perfectamente y entre las larvas reales y su reflejo en el lado del pozo.
    8. Haga clic en el botón"Dibujar escala",dibuje una línea de calibración en la pantalla (un trazado diagonal o paralelo al lado de la microplaca), introduzca su longitud y ajuste la"Unidad". A continuación, haga clic en el botón"Aplicar al grupo".
    9. Establezca el umbral de detección en 16-18 para permitir la detección de los animales.
    10. Haga clic en el botón"Animal negro"en el software.
    11. Elija el botón "Umbral de distancia" y introduzca "5" en el software.
    12. Ajuste las condiciones de luz.
      1. Haga clic en el botón "Parameters" "Light driving" " Utiliza uno de los 3 métodos deactivación a continuación" " Enhancedstimuli"a su vez para establecer las condiciones de luz.
      2. Elija el botón"Borde",luego establezca un período oscuro de 10 min, seguido de tres ciclos de períodos de luz y oscuridad alternados de 10 minutos.
    13. Guarde el protocolo y apague la luz de la habitación.
    14. Aclimate las larvas en el sistema durante 10 minutos y haga clic en el botón "Experiment" "Execute" a su vez, luego elija la carpeta donde se guardan los archivos del experimento e introduzca el nombre del resultado.
    15. Haga clic en el botón "Background" "Start" a su vez para iniciar la prueba.
    16. Haga clic en el botón "Experimento" "Detener"a su vez para detener el experimento en el software cuando finalice la prueba.
      NOTA: El sistema muestra los datos probados cuando el sistema se detiene.
    17. Transfiera la microplaca de 6 pocillos (grupo de control) a la incubadora de luz para otros experimentos.
    18. Transfiera las 6 microplacas de pozo (grupos de 5 g/L y 50 g/L) a su vez a la plataforma de grabación y repita los pasos de 5.2.4 a 5.2.17 por ordinal.

6. Análisis de datos

  1. Abra el archivo de hoja de cálculo en los resultados de locomoción y ángulo de ruta.
  2. Seleccione las tres columnas de distancia(inadista, smldist, lardist)y agréguelas.
    NOTA: Los datos de inadista, smldisty lardist significan diferentes distancias registradas por el sistema en diferentes clases de velocidad (inactivas/pequeñas/grandes), respectivamente.
  3. Por cada período de luz de 10 minutos sumar la distancia de cada pozo, calcular la distancia media de 16 pozos, y comparar los datos de los tres grupos bajo estímulos ligeros.
  4. Por cada período de luz de 10 minutos suman el número de ángulo de cada pocal en cada duración de luz desde cl01 hasta cl08 a su vez, y compare los datos de los tres grupos bajo estímulos ligeros.
    NOTA: Los datos de las columnas de cl01 a cl08 significan diferentes números de ángulo de ruta registrados por el sistema en diferentes ángulos de ruta, respectivamente.
  5. Abra el archivo de hoja de cálculo en los resultados de la actividad social.
  6. Seleccione las columnas contct y contdur, y por cada período de luz de 10 minutos resumen los tiempos sociales y su duración para cada poctura.
  7. Calcular los tiempos sociales promedio y la duración de un grupo en cada duración de la luz y comparar los datos de los tres grupos bajo estímulos ligeros.

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Representative Results

Aquí, describimos un protocolo para estudiar los efectos neuroconductuales de los contaminantes ambientales utilizando larvas de peces cebra bajo estímulos ligeros. Las pruebas de locomoción, ángulo de trayectoria y actividad social se definen en la introducción. La configuración de las microplacas en las pruebas de locomoción y ángulo de trayectoria y las imágenes del software se muestran a continuación. Además, nuestros propios resultados de investigación se presentan como ejemplos. Dos estudios presentan los efectos de locomoción y ángulo de trayectoria después de la exposición a BDE-47 y 6-OH/MeO-BDE-47. El tercer estudio presenta los efectos de cuatro parafinas cloradas comerciales en el comportamiento social.

La configuración de la microplaca de 48 pozos y el locus de movimiento de las larvas en la prueba de ángulo de trayectoria y locomoción.
En el protocolo se utilizaron tres grupos, entre ellos un grupo de control y dos grupos de tratamiento. Debido a que cada grupo puede tener 16 animales, el sistema se puede utilizar para realizar pruebas de alto rendimiento de locomoción y ángulo de trayectoria en una microplaca. La Figura 1 muestra una larva tratada con la solución de control, una solución de 5 g/L y una solución de 50 g/L en cada pocal de la primera, media y últimas dos filas, respectivamente.

La Figura 1 también muestra todos los loci de movimiento de las larvas en las pruebas de locomoción y ángulo de trayectoria. El sistema rastreó la locomoción de las larvas y calculó la distancia de natación en diferentes clases de velocidad. El sistema calculó los números de ángulo de trayectoria de las larvas en diferentes clases de ángulo de trayectoria. Los investigadores pueden analizar los datos registrados por el sistema a su manera.

Figure 1
Figura 1: La configuración de la microplaca de 48 pozos y los loci de movimiento de las larvas en la prueba de ángulo de ruta y locomoción. A1-A8, B1-B8 - el grupo de control; C1-C8, D1-D8 - el grupo de 5 g/L; E1-E8, F1-F8 - el grupo de 50 g/L. La línea de seguimiento de color negro significa inactividad o pequeños movimientos; la línea de seguimiento de color verde significa movimientos normales; y la línea de seguimiento de color rojo significa grandes movimientos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La microplaca de 6 pozos en la prueba de actividad social.
La Figura 2 muestra una microplaca de 6 pozos en el proceso de prueba de actividad social. Cada pozo tenía dos larvas, y el sistema registró la distancia entre las dos larvas durante todo el proceso de prueba. El sistema registró los números de actividad social y la duración en el tiempo de prueba establecido (1 min en este protocolo).

Figure 2
Figura 2: La microplaca de 6 pozos en la prueba de actividad social. Cada pozo tenía dos larvas. La línea amarilla significa que la distancia entre dos animales es < 0,5 cm; la línea roja significa que la distancia entre dos animales es > 0,5 cm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La exposición a BDE-47 afectó a la locomoción en larvas de peces cebra a 5 dpf.
Como se muestra en la Figura 3, el grupo de concentración más alto de BDE-47 produjo hipoactividad pronunciada durante el período oscuro. Sin embargo, no se observaron cambios debido a la exposición a BDE-47 durante los períodos de luz.

Figure 3
Figura 3: Efectos de la exposición a BDE-47 en la locomoción del pez cebra larvaria a 5 dpf. La locomotora (distancia medida en cm) se registró en períodos alternos de oscuridad y luz para una duración total de 70 min. Las barras sólidas y abiertas en la parte inferior indican períodos oscuros y claros, respectivamente. Los datos se presentan como media s SEM (*p < 0,05 en comparación con el grupo de control). Esta figura ha sido modificada de Zhao et al.17 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La exposición 6-OH/MeO-BDE-47 afectó los ángulos de trayectoria de las larvas de peces cebra a 5 dpf.
Como se muestra en la Figura 4,el grupo de alta concentración de 6-OH-BDE-47 realizó menos giros de rutina y giros medios a 5 dpf. Sin embargo, los grupos de exposición 6-MeO-BDE-47 indujeron giros más sensibles.

Figure 4
Figura 4: Efectos de 6-OH/MeO-BDE-47 en el ángulo de trayectoria del pez cebra larval durante el período oscuro. Los datos se presentan como la media de SEM (*p < 0,05 en comparación con el control). Esta cifra ha sido modificada de Zhang et al.18 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La exposición a los PC afectó la actividad social de las larvas de peces cebra a 5 dpf.
Como se muestra en la Figura 5,los comportamientos sociales de las larvas de peces cebra fueron influenciados por tres productos de CP. La actividad social fue estimulada por el CP-70 y el CP-52b de cadena corta. La cadena larga CP-52a acortó la duración por contacto de las larvas.

Figure 5
Figura 5: Efectos de los CP en la duración social media por contacto en diferentes períodos de luz/oscuridad. (A) CP-42, (B) CP-52a, (C) CP-52b, (D) CP-70. Los datos se presentan como la media de SEM (*p < 0,05 en comparación con el control). Esta cifra ha sido modificada de Yang et al.19 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este trabajo proporciona un protocolo experimental detallado para evaluar la neurotoxicidad de los contaminantes ambientales utilizando larvas de peces cebra. El pez cebra pasa por el proceso desde embriones hasta larvas durante el período de exposición, lo que significa que el buen cuidado de los embriones y larvas es esencial. Cualquier cosa que afecte el desarrollo de los embriones y larvas puede influir en el resultado final. Aquí se discuten el entorno de cultivo, el proceso de exposición y las condiciones experimentales para asegurar el éxito de todo el ensayo.

Para el entorno de cultivo, los embriones y larvas de peces cebra viven bajo una temperatura estable de 28 oC. En este trabajo, se utiliza una incubadora ligera que puede establecer las condiciones de luz automáticamente y mantener la temperatura estable para albergar los embriones y larvas. Los embriones no salen del coro a 1 dpf y 2 dpf, por lo que se debe tener cuidado de evitar dañar los embriones sin rayar al renovar la solución de exposición. Además, la proporción de DMSO en la solución debe ser inferior al 0,1%34,35, y la solución de exposición fresca debe estar a 28 oC antes de que se utilice para la renovación.

El proceso de selección de embriones antes de la exposición es también un factor clave para el éxito del experimento. La elección de embriones sanos que se desarrollan simultáneamente para cada grupo garantiza la precisión de la evaluación de la toxicidad. El pez cebra puede vivir sin alimentos durante los primeros 7 días después de la fertilización, por lo que es mejor no alimentar a los embriones o larvas durante todo el período de exposición porque los alimentos podrían influir en el resultado final. Además, es mejor preparar la solución de exposición fresca cuando sea necesario.

Durante la prueba de comportamiento, es esencial ofrecer a las larvas tiempo suficiente para adaptarse al entorno del gabinete de monitoreo de alto rendimiento. Antes de la prueba, cada paso del protocolo probado debe comprobarse cuidadosamente, incluyendo la condición de la luz, el tiempo de prueba, etc. La sala de pruebas debe mantenerse completamente tranquila y oscura para no molestar a los animales.

El protocolo presentado ofrece un marco fundamental para estudiar la toxicidad neuroconductual de los contaminantes ambientales. También hay otros tipos de comportamientos utilizados al estudiar efectos neuroconductuales, tales como pruebas de preferencia de color36, pruebas de vivienda inferior37, pruebas de preferencia de luz / oscuridad38,39,etc. Sin embargo, estas pruebas utilizan principalmente peces cebra adultos, que no son aptos para pruebas de alto rendimiento. Además, Weichert y otros videograbados al comportamiento de los movimientos espontáneos de la cola que podrían cuantificarse justo después de 24 h de exposición40. La evaluación de la toxicidad neuroconductual también incluye estudios de mecanismo sobre la función del cerebro y el sistema nervioso central. Los indicadores neuroconductuales fundamentales se introducen aquí y pueden formar la base para indicadores más complejos utilizando otros instrumentos de comportamiento. En última instancia, el desarrollo de nuevos indicadores neuroconductuales acompañados de este mecanismo de estudio se puede utilizar en estudios futuros.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen el apoyo financiero de la National Natural Science Foundation of China (21876135 y 21876136), el National Major Science and Technology Project of China (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), la Fundación del MOE-Shanghai Laboratorio Clave de Salud Ambiental Infantil (CEH201807-5), y Consejo Sueco de Investigación (Núm. 639-2013-6913).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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