Çevresel Kirleticilerin Zebrabalığı Larvaları Üzerindeki Nörodavranışsal Etkilerinin İncelenmi

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu makalede zebrabalığı larvaları modeli kullanılarak çevresel kirleticilerin nörodavranışsal toksisitesinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bir deneysel protokol sunulmuştur, buna maruz kalma süreci ve nörodavranışsal göstergeler için testler de dahildir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Son yıllarda daha fazla çevresel kirleticiler nörotoksik kanıtlanmıştır, organizmaların erken gelişim aşamalarında özellikle. Zebra balığı larvaları çevresel kirleticilerin nörodavranışsal çalışması için önde gelen bir modeldir. Burada, zebra balığı larvaları kullanılarak çevre kirleticilerin nörotoksisitesinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bir deneysel protokol sağlanmaktadır, embriyoların toplanması, maruz kalma süreci, nörodavranışsal göstergeler, test süreci ve veri analizi. Ayrıca, kültür ortamı, pozlama süreci ve deneysel koşullar, tsanın başarısını sağlamak için tartışılmıştır. Protokol psikopatik ilaçların geliştirilmesinde, çevresel nörotoksik kirleticiler üzerinde araştırma da kullanılmıştır ve ilgili çalışmalar yapmak veya mekanistik çalışmalar için yararlı olmak için optimize edilebilir. Protokol zebra balığı larvaları üzerinde nörodavranışsal etkileri incelemek için net bir çalışma süreci göstermektedir ve çeşitli nörotoksik maddeler veya kirleticilerin etkilerini ortaya çıkarabilir.

Introduction

Son yıllarda daha fazla çevresel kirleticiler nörotoksik kanıtlanmıştır1,2,3,4. Ancak, çevresel kirleticilere maruz kaldıktan sonra vivo nörotoksisite nin değerlendirilmesi endokrin bozulma veya gelişimsel toksisite kadar kolay değildir. Buna ek olarak, kirleticilere erken maruz kalma, özellikle çevre ile ilgili dozlarda, toksisite çalışmalarında artan dikkat çekti5,6,7,8.

Zebrabalığı çevresel kirleticilere maruz kaldıktan sonra erken gelişim sırasında nörotoksisite çalışmaları için uygun bir hayvan modeli olarak kurulmuştur. Zebra balıkları döllenme sonrası diğer türlere göre daha hızlı gelişen omurgalılardır. Korriondaki besinler 7 gün postfertilizasyon (dpf)9için onları sürdürmek için yeterli olduğu için larvaların beslenmesine gerek yoktur. Larvalar chorion dan ~ 2 dpf çıkmak ve gözlemlenebilir, izlenen, niceleme ve otomatik olarak davranış aletleri10,11,12,13 3-4 dpf14,15,16,17,18kullanarak analiz olabilir yüzme ve tornalama gibi davranışlar geliştirmek . Buna ek olarak, yüksek iş letimat testleri davranış araçları ile de gerçekleştirilebilir. Böylece, zebra balığı larvaları çevresel kirleticilerin nörodavranışsal çalışma için olağanüstü bir model19. Burada, zebra balığı larvaları üzerindeki çevresel kirleticilerin nörodavranışsal toksisitesini ışık uyaranları altında incelemek için yüksek iş lenme li izleme kullanılarak bir protokol sunulmaktadır.

Laboratuvarımız 2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl eter (BDE-47)20,21,6'-Hidroksi/Methoxy-2,2', 4,4'-tetrabromodiphenyl eter (6-OH/MeO-BDE-47)22, deca-bromlu difen eter (BDE-29), nörodavranışsal toksisitesi inceledi ve ticari klorlu parafinler23 sunulan protokol kullanılarak. Birçok laboratuvarda da larva veya yetişkin balık24,25,26,27diğer kirleticilerin nörodavranışsal etkilerini incelemek için protokolü kullanın. Bu nörodavranışsal protokol, embriyonik zebra balığında bisfenol A ve replasman bisfenol S indüklenen erken hipotalamik nörogenezi gösteren mekanistik destek sağlamak için kullanılmıştır27. Buna ek olarak, bazı araştırmacılar ilgili çalışmaları gerçekleştirmek için protokolü optimize etti. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada kazein kaplı altın nano tanecikleri (βCas AuNPs) kullanılarak kolay, yüksek iş sahibi zebra balığı modelinde amiloid beta (Aβ) toksisitesi ortadan kaldırılmıştır. Bu βCas AuNPs sistemik dolaşımda zebrafish larvaları kan-beyin bariyeri boyunca translocated ve ayrılmış intraserebral Aβ42, nonspesifik toksisite ortaya, davranışsal patoloji tarafından desteklenen şaperon benzeri bir şekilde,28.

Lokomotion, yol açısı, ve sosyal aktivite sunulan protokolde kirleticilere maruz kaldıktan sonra zebra balığı larvalarının nörotoksisite etkilerini incelemek için kullanılan üç nörodavranışsal göstergedir. Hareket, larvaların yüzme mesafesi ile ölçülür ve kirleticilere maruz kaldıktan sonra zarar görebilir. Yol açısı ve sosyal aktivite daha yakından beyin fonksiyonu ve merkezi sinir sistemi29ile ilişkilidir. Yol açısı yüzme yönü30göre hayvan hareket yolu açısı anlamına gelir. ~-180°-~+180° arasında sekiz açı sınıfı sistemde ayarlanır. Karşılaştırmayı basitleştirmek için, nihai sonuçtaki altı sınıf rutin dönüşler (-10° ~0°, 0°~+10°), ortalama dönüşler (-10° ~-90°, +10° ~+90°) ve duyarlı dönüşler (-180° ~-90°, +90°) olaraktanımlanır. İki balıklı sosyal aktivite, grup şolama davranışının temelini oluşturmaktadır; burada < 0.5 cm'lik bir mesafe iki larva arasında geçerli sosyal temas olarak tanımlanır.

Burada sunulan protokol zebra balığı larvaları üzerinde nörodavranışsal etkileri incelemek için net bir süreç göstermektedir ve çeşitli maddeler veya kirleticilerin nörotoksisite etkilerini ortaya çıkarmak için bir yol sağlar. Protokol, çevresel kirleticilerin nörotoksisitesini incelemek isteyen araştırmacılara fayda sağlayacak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokol, Tongji Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanan yönergelere uygundur.

1. Zebra balığı embriyo toplama

  1. Maruz kalmadan önceki gece yumurtlama kutusuna iki çift sağlıklı yetişkin Tubingen zebra balığı koyun, seks oranını 1:1'de tutarak.
  2. Ertesi sabah gün ışığından sonra yetişkin balığı sisteme 30-60 dk geri kaldırın.
  3. Embriyoları yumurtlama kutusundan çıkarın.
  4. Embriyoları sistem suyuyla durulayın.
  5. Yeterli sistem suyu ile bir cam Petri kabı (9 cm çapında) içine embriyolar aktarın.
  6. Mikroskop altında embriyoları gözlemleyin ve daha sonra maruz kalmak için sağlıklı embriyolar seçin.
    NOT: Sağlıklı embriyolar genellikle mikroskop altında açık altın renk ile saydamdır. Sağlıksız embriyolar genellikle solgun ve mikroskop altında gözlendiği gibi birlikte kümelenmiş.

2. Maruz kalmadan önce hazırlık

  1. Hanks'in çözeltisini zebra balığı kitabı31'inkurallarına göre hazırlayın.
    NOT: Hanks'in çözeltisi 0.137 M NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na2HPO4, 0.44 mM KH2PO4, 1.3 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4ve 4.2 mM NaHCO3'üiçerir.
  2. Hanks'in çözeltisini steril su kullanarak %10 Hanks çözeltisine seyreltin.
  3. %0,1 DMSO dahil olmak üzere %10 Hanks çözeltisine kontrol çözümü yapmak için %10 Hanks çözeltisine 999 mL'lik 1 mMSO DMSO ekleyin.
    NOT: Sonraki adımlarda bir pozlama çözümü örneği olarak BDE-47 kullanın.
  4. 5 mg/mL standart pozlama çözeltisi yapmak için düzgün BDE-47'nin 5 mg'ını 1 mL 100 DMSO'da çözün.
  5. Girdap 5 mg/mL çözeltisi için 1 dk Tamamen DMSO BDE-47 eritmek için.
  6. 5 mg/mL çözeltinin 10 μL'sini 12 mL kahverengi cam şişeye aktarın.
  7. BDE-47 pozlama çözeltisi konsantrasyonu 5 mg/L ve DMSO oranını %0,1, daha sonra 1 dk için girdap yapmak için 10 mL'lik son hacme sterilize su ekleyin.
  8. 5 mg/L çözeltinin 10 μL ve 100 μL'sini sırasıyla 100 mL hacimli şişeye aktarın.
  9. BDE-47 pozlama solüsyonlarının son konsantrasyonlarını 5 g/L ve 50 g/L yapmak için %0,1 DMSO (adım 2,3'te hazırlanmış) ila 100 mL dahil olmak üzere %10 Hanks çözeltisi ekleyin.
  10. Çözeltileri 100 mL kahverengi cam şişeye aktarın ve 4 °C'de saklayın.

3. Embriyoların maruz kalma

  1. Üç cam Petri çanak (6 cm çapında) 3-5 saat sonra döllenme (hpf) içine transfer ~ 50 embriyolar.
  2. Embriyoların etrafındaki sistem suyunu lekelemek için 1 mL pipet ucu kullanın.
  3. Kontrolü ve iki BDE-47 pozlama çözeltisini (kontrol, 5 μg/L, 50 g/L) sırasıyla üç cam Petri kabına aktarmak için bir pipet kullanın.
  4. Embriyoların tabağın dibine dağılmasını sağlamak için cam Petri tabaklarını hafifçe birer birer salla.
  5. 28,5 °C altında ışık kuvöz içine cam Petri yemekleri koyun.
  6. Her 24 saatte 5 dpf'ye kadar her 24 saatte bir pozlama çözeltilerinin yarısını yenileyin.
  7. 1 dpf ve 2 dpf her grubun ölü embriyolar kontrol edin ve ölüm oranını hesaplamak.
  8. Her grubun kuluçka embriyolarını 2 dpf ve 3 dpf üzerinde kontrol edin ve yumurtadan çıkışlığı hesaplayın.
  9. Onlar chorion çıktıktan sonra her gün larvade deformite kontrol edin ve her grubun deformite oranını hesaplamak.
    NOT: Deformite göstergeleri arasında perikardiyal kist, spinal eğrilik, kuyruk eğriliği, diğer faktörler arasında32.

4. Davranış testine hazırlık

  1. 5 dpf sabahı sosyal aktivite testi için hareket ve yol açısı testi için 48 kuyuluk ve üç 6 iyi mikroplaka hazırlayın.
  2. 48 kuyunun her kuyusu içine 800 μL pozlama çözeltisi aktarın.
    NOT: Her grup için 16 kuyu kullanın (örn. kontrol çözeltisi, 5 g/L ve 50 g/L grubu).
  3. Cam Petri kabından bir larva ile 200 μL pozlama çözeltisi ile 48 kuyunun bir kuyusu içine 1 mL pipet ucu kullanın.
  4. 6 kuyu mikroplakasının her kuyunun içine 4 mL pozlama çözeltisi aktarın.
    NOT: Her grup için bir adet 6 kuyuluk kullanın.
  5. 6 kuyunun her kuyunun her bir kuyunun içine 200 μL pozlama çözeltisi ve iki larva aktarmak için 1 mL'lik pipet ucu kullanın.
    NOT: Her grubun altı tekrar grubu vardır.
  6. Test odasının sıcaklığının testten önce 28 °C 2 saat olduğundan emin olun.
    NOT: Davranış testleri genellikle öğleden sonra yapılır.

5. Davranış testi

  1. Hareket ve yol açısı testi
    1. Programı başlatmak için yüksek iş başı izleme kasasını kontrol eden yazılımı açmak için bilgisayar masasındaki başlatıcı simgesini tıklatın (Bkz. Malzeme Tablosu).
    2. Çalışma arabirimine girmek için "İzleme, Döndürmeler, Yol Açıları" modüllerini seçin.
    3. Adım 4.3'te hazırlanan 48 kuyumikroplakasını kayıt platformuna aktarın ve kapağı aşağı çekin.
    4. Yeni bir protokol oluşturmaya başlamak için sırayla yazılımda "Dosya" " "" Protokol Oluştur" düğmesini tıklatın.
    5. "48" i giriş "Konum sayısı" konumuna ve "Tamam" düğmesine tıklayın.
    6. Yazılımda sırayla "Parametreler" "Protokol Parametreleri" "Zaman" butonuna tıklayınız. Deneme süresini 1 saat ve 10 dakika olarak ayarlayın ve entegrasyon süresini 60 s33olarak ayarlayın.
    7. Algılanan alanları çizin.
      1. Eliptik şekli seçin ve ilk üst sol iyi etrafında ilk daire çizin.
      2. Daireyi seçin, "Kopyala" "Üst Sağ İşareti" "Yapıştır" "" Seç" düğmesini sırayla tıklatın ve kopyalanan daireyi sağ üste doğru sürüklemek için fareyi kullanın.
      3. Daireyi seçin, "Kopyala"Alt İşareti" "Yapıştır" " "" Sırayla "düğmesini seçin ve kopyalanan daireyi sağ alta doğru sürüklemek için fareyi kullanın.
      4. Sırayla "Build" " " "Clear marks" butonuna tıklayın.
        NOT: Sistem otomatik olarak plaka nın diğer her kuyu çizecektir. Yeni oluşturulan alanlar mükemmel gerçek balık ve kuyunun tarafında yansıması arasında her iyi uygun olmalıdır.
    8. "Pul Çek "düğmesine tıklayın, ekrana bir kalibrasyon çizgisi çizin (çapraz bir yol veya mikroplakanın yan tarafına paralel), uzunluğunu girin ve "Birim" tuşunu ayarlayın. Daha sonra " Gruba uygula "düğmesinetıklayın.
    9. Yazılımdaki "Black" de hayvan rengini ayarlayın.
    10. Hayvanların tespitini sağlamak için algılama eşiğini 16-18 olarak ayarlayın.
    11. Giriş inaktif/küçük ve küçük/büyük hız sırasıyla 0,5 cm/s ve 2,5 cm/s.
    12. Yol açısı sınıflarını ayarlayın. -180°-+180°'den yol açısı sınıfları yapmak için "-90, -30, -10, 0, 10, 30 ve 90" giriş yapın.
    13. Işık koşullarını ayarlama
      1. "Parametreler" "Hafif sürüş" " " Işık koşullarını ayarlamak için sırayla "Gelişmiş uyaranlar" düğmesininaltındaki 3 tetikleme yönteminden birini kullanır.
      2. "Edge" düğmesini seçin, ardından 10 dk'lık karanlık bir süre ayarlayın ve ardından 10 dk açık ve karanlık periyotlar üç devre alternatif.
    14. Protokolü kaydedin ve test odasının ışığını kısın.
    15. Sistemde larvaları 10 dakika süreyle alıştırın ve sırayla "Experiment"Execute" düğmesine tıklayın, ardından deneme dosyalarının kaydedildiği klasörü seçin ve sonuç adını girin.
    16. Testi başlatmak için sırayla "Background" " "Başlat" düğmesini tıklatın.
    17. Test sona erdiğinde denemeyi durdurmak için "Deney" "Durdur" düğmesini tıklatın.
      NOT: Sistem durduğunda test edilen verileri sistem gösterir. Veriler, üç hız sınıfta izlenen mesafeyi ve her dakikanın sekiz açı sınıflarında yol açısı numaralarını içerir. Sunulan örnekteki lokomotion testiiçin, her ışık periyodundaki toplam mesafe (10 dk) hesaplanır ve kontrol grubu ile tedavi grupları arasındaki fark karşılaştırılır.
    18. Diğer deneyler için 48 kuyumikroplakasını ışık kuvöze geri aktarın.
  2. Sosyal etkinlik testi
    1. Programı başlatmak için yüksek iş başı izleme muhafazasını kontrol eden yazılımı açmak için bilgisayar masasındaki başlatıcı simgesine tıklayın.
    2. Çalışma arabirimine girmek için "Sosyal Etkileşimler" modüllerini seçin.
    3. Hazırlanan 6 kuyu mikroplakasını (kontrol grubu) adım 4.4'te kayıt platformuna aktarın ve kapağı aşağı çekin.
    4. Yeni bir protokol oluşturmaya başlamak için sırayla yazılımda "Dosya" " "" Protokol Oluştur" düğmesini tıklatın.
    5. "6" i giriş "konum sayımı" konumuna ve "Tamam" düğmesine tıklayın.
    6. Yazılımda sırayla "Parametreler" "Protokol Parametreleri" "Zaman" butonuna tıklayınız. Deneme süresini 1 saat ve 10 dakika olarak ayarlayın ve entegrasyon süresini 60 s olarak ayarlayın.
    7. Algılanan alanları çizin.
      1. Eliptik şekli seçin ve ilk üst sol iyi etrafında ilk daire çizin.
      2. Daireyi seçin, "Kopyala" "Üst Sağ İşareti" "Yapıştır" "" Seç" düğmesini sırayla tıklatın ve kopyalanan daireyi sağ üst kuyuya sürüklemek için fareyi kullanın.
      3. Daireyi seçin, "Kopyala"Alt İşareti" "Yapıştır" " "" Sırayla "düğmesini seçin ve kopyalanan daireyi sağ alta doğru sürüklemek için fareyi kullanın.
      4. Sırayla "Build" " " "Clear marks" butonuna tıklayın.
        NOT: Yeni oluşturulan alanlar her iyi mükemmel ve gerçek larva ve kuyunun yan yansıması arasında uygun olmalıdır.
    8. "Pul Çek "düğmesine tıklayın, ekrana bir kalibrasyon çizgisi çizin (çapraz bir yol veya mikroplakanın yan tarafına paralel), uzunluğunu girin ve "Birim" tuşunu ayarlayın. Daha sonra " Gruba uygula "düğmesinetıklayın.
    9. Hayvanların tespitini sağlamak için algılama eşiğini 16-18 olarak ayarlayın.
    10. Yazılımdaki "Black animal" butonuna tıklayın.
    11. Yazılıma "Mesafe Eşik" düğmesini ve "5" i girişini seçin.
    12. Işık koşullarını ayarlayın.
      1. "Parametreler" "Hafif sürüş" " " Işık koşullarını ayarlamak için sırayla "Gelişmiş uyaranlar" düğmesininaltındaki 3 tetikleme yönteminden birini kullanır.
      2. "Edge" düğmesini seçin, ardından 10 dk'lık karanlık bir süre ayarlayın ve ardından 10 dk açık ve karanlık periyotlar üç devre alternatif.
    13. Protokolü kaydedin ve odanın ışığını kısın.
    14. Sistemde larvaları 10 dakika süreyle alıştırın ve sırayla "Experiment"Execute" düğmesine tıklayın, ardından deneme dosyalarının kaydedildiği klasörü seçin ve sonuç adını girin.
    15. Testi başlatmak için sırayla "Background" " "Başlat" düğmesini tıklatın.
    16. Test sona erdiğinde yazılımdaki denemeyi durdurmak için sırayla "Deneme" " "Durdur" düğmesini tıklatın.
      NOT: Sistem durduğunda test edilen verileri sistem gösterir.
    17. Diğer deneyler için 6 kuyu mikroplakasını (kontrol grubu) ışık kuvöze geri aktarın.
    18. 6 kuyu mikroplakasını (5 μg/L ve 50 μg/L grupları) kayıt platformuna aktarın ve 5,2,4'ten 5,2,17'ye kadar olan adımları sırayla tekrarlayın.

6. Veri analizi

  1. Elektronik tablo dosyasını hareket ve yol açısı sonuçlarında açın.
  2. Üç mesafe sütunları seçin(inadist, smldist, lardist) ve onları ekleyin.
    NOT: İnadist, smldistve lardist verileri, sistem tarafından farklı hız sınıflarında (etkin olmayan/küçük/büyük) kaydedilen farklı mesafeler anlamına gelir.
  3. Her 10 dakikalık ışık periyodu için her kuyunun uzaklıklarını özetler, ortalama 16 kuyunun mesafesini hesaplayın ve ışık uyaranları altındaki üç grubun verilerini karşılaştırın.
  4. Her 10 dakikalık ışık periyodu için cl01'den cl08'e kadar her ışık süresindeki her kuyunun açı numarasını özetler ve ışık uyaranları altında üç grubun verilerini karşılaştırın.
    NOT: Cl01'den cl08'e kadar olan sütunların verileri, sistem tarafından farklı yol açılarında kaydedilen farklı yol açısı sayıları anlamına gelir.
  5. Sosyal etkinlik sonuçlarında elektronik tablo dosyasını açın.
  6. Contct ve contdur sütunlarını seçin ve her 10 dk ışık dönemi için her kuyu için sosyal süreleri ve sürelerini özetleyin.
  7. Her ışık süresinde bir grubun ortalama sosyal sürelerini ve süresini hesaplayın ve ışık uyaranları altında üç grubun verilerini karşılaştırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada, insan balıkları kullanarak çevresel kirleticilerin nörodavranışsal etkilerini araştırmak için bir protokol uyguluyoruz. Girişte hareket, yol açısı ve sosyal aktivite testleri tanımlanır. Mikroplakaların hareket ve yol açısı testlerinde kurulumu ve yazılımın görüntüleri aşağıda gösterilmiştir. Ayrıca, kendi araştırma sonuçlarımız örnek olarak sunulmuştur. İki çalışma, BDE-47 ve 6-OH/MeO-BDE-47'ye maruz kaldıktan sonra hareket ve yol açısı etkilerini ortaya koyamaz. Üçüncü çalışma, dört ticari klorlu parafinin sosyal davranış üzerindeki etkilerini ortaya konur.

48 kuyu mikroplaka ve hareket ve yol açısı testi nde larvaların hareket lokusu kurulumu.
Protokolde bir kontrol grubu ve iki tedavi grubu olmak üzere üç grup kullanıldı. Her grupta 16 hayvan olabileceğinden, sistem tek bir mikroplakada yüksek işlem ve yol açısı testleri yapmak için kullanılabilir. Şekil 1, sırasıyla ilk, orta ve son iki sıranın her kuyuda kontrol solüsyonu, 5 g/L çözeltisi ve 50 g/L çözeltisi ile tedavi edilen bir larvayı gösterir.

Şekil 1 ayrıca hareket ve yol açısı testlerinde larvaların tüm hareket lokasyonlarını gösterir. Sistem larvaların hareket izini sürdü ve farklı hız sınıflarında yüzme mesafesini hesapladı. Sistem, larvaların yol açı numaralarını farklı yol açısı sınıflarında hesapladı. Araştırmacılar sistem tarafından kaydedilen verileri kendi yöntemleriyle analiz edebilirler.

Figure 1
Şekil 1: 48 kuyu mikroplakasının kurulumu ve hareket ve yol açısı testinde larvaların hareket lokusu. A1-A8, B1-B8 = kontrol grubu; C1-C8, D1-D8 = 5 μg/L grubu; E1-E8, F1-F8 = 50 μg/L grubu. Siyah renk izleme çizgisi hareketsizlik veya küçük hareketler anlamına gelir; yeşil renk izleme çizgisi normal hareketler anlamına gelir; ve kırmızı renk izleme çizgisi büyük hareketler anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sosyal aktivite testinde 6 kuyu mikroplakası.
Şekil 2, sosyal aktivite test sürecinde 6 kuyuluk göstermektedir. Her kuyuda iki larva vardı ve sistem tüm test sürecinde iki larva arasındaki mesafeyi kaydetti. Sistem, belirlenen test süresi (bu protokolde 1 dk) sosyal aktivite numaralarını ve süresini kaydetmiştir.

Figure 2
Şekil 2: Sosyal aktivite testinde 6 kuyu mikroplakası. Her kuyuda iki larva vardı. Sarı çizgi iki hayvan arasındaki mesafenin < 0.5 cm; kırmızı çizgi iki hayvan arasındaki mesafenin > 0,5 cm olduğu anlamına gelir.

BDE-47 maruziyeti 5 dpf'de zebra balığı larvalarında hareket hareketini etkilemiştir.
Şekil 3'tegösterildiği gibi, BDE-47'nin en yüksek konsantrasyon grubu karanlık dönemde belirgin hipoaktivite üretti. Ancak ışık dönemlerinde BDE-47 maruziyetine bağlı olarak gözlenen bir değişiklik gözlenmedi.

Figure 3
Şekil 3: 5 dpf'de larva zebra balığının hareket halindeki BDE-47 maruziyetinin etkileri. Lokomotion (cm cinsinden ölçülen mesafe) toplam 70 dk. Katı ve alttaki açık çubuklar sırasıyla karanlık ve açık dönemleri gösterir. Veriler ortalama ± SEM (*p < 0.05 kontrol grubu ile karşılaştırıldığında) olarak sunulur. Bu rakam Zhao ve ark.17'den izinle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6-OH/MeO-BDE-47 maruziyeti 5 dpf'de zebra balığı larvalarının yol açılarını etkilemiştir.
Şekil 4'tegösterildiği gibi, 6-OH-BDE-47'nin yüksek konsantrasyon grubu 5 dpf'de daha az rutin dönüş ve ortalama dönüş ler gerçekleştirmiştir. Ancak, daha duyarlı dönüşler 6-MeO-BDE-47 maruziyet grupları tarafından indüklendi.

Figure 4
Şekil 4: 6-OH/MeO-BDE-47'nin karanlık dönemde larva zebra balığının yol açısı üzerindeki etkileri. Veriler ortalama ± SEM (*p < 0.05 kontrol ile karşılaştırıldığında) olarak sunulur. Bu rakam Zhang ve ark.18'den izinle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

CPs maruziyeti 5 dpf zebrabalığı larvalarının sosyal aktivitesini etkilemiştir.
Şekil 5'tegösterildiği gibi, zebra balığı larvalarının sosyal davranışları üç CP ürününden etkilenmiştir. Sosyal aktivite CP-70 ve kısa zincirli CP-52b tarafından teşvik edildi. Uzun zincir CP-52a larvaların temas süresini kısalttı.

Figure 5
Şekil 5: CP'lerin farklı Açık/karanlık dönemlerde kişi başına ortalama sosyal süre üzerindeki etkileri. (A) CP-42, (B) CP-52a, (C) CP-52b, (D) CP-70. Veriler ortalama ± SEM (*p < 0.05 kontrol ile karşılaştırıldığında) olarak sunulmaktadır. Bu rakam Yang ve ark.19'dan izinle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışma, zebra balığı larvaları kullanarak çevresel kirleticilerin nörotoksisitesini değerlendirmek için ayrıntılı bir deneysel protokol sağlar. Zebra balığı maruz kalma döneminde embriyolardan larvalara kadar olan süreçten geçer, bu da embriyo ve larvaların iyi bakımının şart olduğu anlamına gelir. Embriyo ve larvagelişimini etkileyen her şey nihai sonucu etkileyebilir. Burada kültür ortamı, pozlama süreci ve deneysel koşullar tüm tsay başarısını sağlamak için tartışılmıştır.

Kültür ortamı için zebra balığı embriyoları ve larvaları ~28 °C'lik sabit bir sıcaklık altında yaşarlar. Bu çalışmada, ışık koşullarını otomatik olarak ayarlayabilen ve ısıyı sabit tutabilen bir ışık kuluçka makinesi embriyo ve larvaları barındırmak için kullanılır. Embriyolar 1 dpf ve 2 dpf de chorion çıkmaz, bu nedenle maruz kalma çözeltisi yenilerken yumurtadan çıkmamış embriyolar zarar önlemek için dikkatli olmalıdır. Ayrıca çözeltideki DMSO oranı %0,134,35'inaltında olmalı ve taze pozlama çözeltisi yenileme için kullanılmadan önce 28 °C'de olmalıdır.

Maruz kalmadan önce embriyo seçme süreci de deneyin başarısı için önemli bir faktördür. Her grup için aynı anda gelişen sağlıklı embriyoların seçilmesi toksisite değerlendirmesinin doğruluğunu garanti eder. Zebra balığı döllenmeden sonraki ilk 7 gün boyunca gıda olmadan yaşayabilir, bu yüzden gıda nihai sonucu etkileyebilir, çünkü tüm maruz kalma süresi boyunca embriyoveya larva beslemek için en iyisidir. Ayrıca, gerektiğinde pozlama çözeltisini taze hazırlamak en iyisidir.

Davranış testi sırasında larvalara yüksek iş lenme li izleme muhafazasının ortamına uyum sağlamak için yeterli zaman sunmak önemlidir. Testten önce, test edilen protokolün her adımı, ışık durumu, test süresi, vb. dahil olmak üzere dikkatle kontrol edilmelidir. Hayvanları rahatsız etmemek için test odası tamamen sessiz ve karanlık tutulmalıdır.

Sunulan protokol, çevresel kirleticilerin nörodavranışsal toksisitesini incelemek için temel bir çerçeve sunuyor. Renk tercihi testleri36, alt konut testleri37, Açık/koyu tercih testleri38,39, vb gibi nörodavranışsal etkileri çalışırken kullanılan davranışların diğer türleri de vardır. Ancak, bu testler esas olarak yüksek iş testi için uygun olmayan yetişkin zebra balıkları kullanır. Buna ek olarak, Weichert ve ark. 24 saat maruz kalma40hemen sonra sayısal olabilir spontan kuyruk hareketlerinin davranışı videoya . Nörodavranışsal toksisite nin değerlendirilmesi de beyin ve merkezi sinir sisteminin fonksiyonu üzerinde mekanizma çalışmaları içerir. Temel nörodavranışsal göstergeler burada tanıtıldı ve diğer davranış araçları kullanarak daha karmaşık göstergeler için temel oluşturabilir. Sonuç olarak, bu çalışma mekanizması ile birlikte yeni nörodavranışsal göstergelerin geliştirilmesi gelecekteki çalışmalarda kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (21876135 ve 21876136), Çin Ulusal Büyük Bilim ve Teknoloji Projesi (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), MOE-Şangay Vakfı tarafından mali destek için müteşekkir Çocuk Çevre Sağlığı Temel Laboratuvarı (CEH201807-5) ve İsveç Araştırma Konseyi (No. 639-2013-6913).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35, (12), 2931-2940 (2016).
  2. Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
  3. Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57, (7), 775-793 (2016).
  4. Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
  5. Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. Environmental Organic Chemistry. John Wiley & Sons. (2016).
  6. Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24, (3), 253-273 (2016).
  7. Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90, (9), 2077-2107 (2016).
  8. Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113, (9), 1230-1233 (2005).
  9. Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
  10. Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3, (2), 235-247 (2006).
  11. Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234, (4), 549-558 (2017).
  12. Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
  13. Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
  14. Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4, (3), 567-576 (2008).
  15. Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55, (1), 1-16 (2015).
  16. Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31, (10), 1241-1249 (2016).
  17. Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 65 (2016).
  18. Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
  19. Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10, (1), 46 (2017).
  20. Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
  21. Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
  22. Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
  23. Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
  24. Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
  25. Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
  26. Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos? Environmental Science & Technology. 53, (1), 482-493 (2018).
  27. Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (5), 1475-1480 (2015).
  28. Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10, (1), 1-14 (2019).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210, (2), 266-271 (2012).
  30. Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207, (19), 3265-3279 (2004).
  31. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
  32. Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36, (3), 481-486 (2017).
  33. Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30, (1), 52-58 (2009).
  34. Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
  35. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Drug Safety Evaluation. Springer. 271-279 (2011).
  36. Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13, (4), 330-334 (2016).
  37. Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11, (3), 366-373 (2012).
  38. Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104, (5), 831-837 (2011).
  39. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7, (5), e36931 (2012).
  40. Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics