Studere neurobehavioral effekter av miljøforurensende stoffer på sebrafisk larver

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En detaljert eksperimentell protokoll presenteres i dette papiret for evaluering av nevroatferdstoksisitet av miljøgifter ved hjelp av en sebrafisk larvermodell, inkludert eksponeringsprosessen og tester for nevroatferdsindikatorer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De siste årene har flere og flere miljøgifter vist seg nevrotoksisk, spesielt i de tidlige utviklingsstadiene av organismer. Sebrafisk larver er en fremtredende modell for nevroatferdsstudie av miljøgifter. Her er det gitt en detaljert eksperimentell protokoll for evaluering av nevrotoksisiteten til miljøgifter ved hjelp av sebrafisklarver, inkludert samlingen av embryoene, eksponeringsprosessen, nevroatferdsindikatorer, testprosessen og dataanalyse. Også kulturmiljøet, eksponeringsprosessen og eksperimentelle forhold diskuteres for å sikre analysens suksess. Protokollen har blitt brukt i utviklingen av psykopatiske legemidler, forskning på miljømessige nevrotoksiske forurensende stoffer, og kan optimaliseres for å gjøre tilsvarende studier eller være nyttig for mekanistiske studier. Protokollen demonstrerer en klar operasjonsprosess for å studere nevroatferdseffekter på sebrafisklarver og kan avsløre effekten av ulike nevrotoksiske stoffer eller forurensende stoffer.

Introduction

De siste årene har flere og flere miljøgifter vist seg nevrotoksisk1,2,3,4. Vurderingen av nevrotoksisitet in vivo etter eksponering for miljøgifter er imidlertid ikke så lett som endokrinforstyrrelse eller utviklingstoksisitet. I tillegg har tidlig eksponering for forurensende stoffer, spesielt ved miljørelevante doser, tiltrukket seg økende oppmerksomhet itoksisitetsstudier5,6,7,8.

Sebrafisk etableres som en dyremodell som passer for nevrotoksisitetsstudier under tidlig utvikling etter eksponering for miljøgifter. Sebrafisk er virveldyr som utvikler seg raskere enn andre arter etter befruktning. Larvene trenger ikke å bli matet fordi næringsstoffene i koret er nok til å opprettholde dem i 7 dager etterfertilisering (dpf)9. Larver kommer ut fra koret på ~ 2 dpf og utvikle atferd som svømming og snu som kan observeres, spores, kvantifiseres, og analyseres automatisk ved hjelp av atferdsinstrumenter10,11,12,13 starter på 3-4 dpf14,15,16,17,18. I tillegg kan tester med høy gjennomstrømning også realiseres av atferdsinstrumenter. Sebrafisk larver er dermed en enestående modell for nevroatferdsstudie av miljøgifter19. Her tilbys en protokoll ved hjelp av høy gjennomstrømningsovervåking for å studere nevroatferdstoksisiteten til miljøgifter på sebrafisklarver under lette stimuli.

Vårt laboratorium har studert nevroatferdstoksisiteten til 2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl eter (BDE-47)20,21, 6'-Hydroxy/ Methoxy-2,2',4,4'-tetrabro modiphenyl eter (6-OH/MeO-BDE-47)22, deca-brominert diphenyl eter (BDE-209), bly, og kommersielle klorerte parafiner23 ved hjelp av den presenterte protokollen. Mange laboratorier bruker også protokollen til å studere de nevroatferdsmessige effektene av andre forurensende stoffer på larver eller voksen fisk24,25,26,27. Denne neurobehavioral protokollen ble brukt til å gi mekanistisk støtte som viser at lavdose eksponering for bisfenol A og erstatning bisfenol S indusert for tidlig hypothalamus nevrogenese i embryonale sebrafisk27. I tillegg optimaliserte noen forskere protokollen for å utføre tilsvarende studier. En fersk studie eliminert toksisitet av amyloid beta (Aβ) i en enkel, høy gjennomstrømning sebrafisk modell ved hjelp av kasein-belagt gull nanopartikler (βCas AuNPs). Det viste at βCas AuNPs i systemisk sirkulasjon translocated over blod-hjernebarrieren av sebrafisk larver og sequestered intracerebral Aβ42, eliciting toksisitet på en uspesifikk, chaperone-lignende måte, som ble støttet av atferdspatologi28.

Bevegelse, banevinkel og sosial aktivitet er tre nevroatferdsindikatorer som brukes til å studere nevrotoksisitetseffektene av sebrafisklarver etter eksponering for forurensende stoffer i den presenterte protokollen. Bevegelse måles ved svømmeavstand av larver og kan bli skadet etter eksponering for forurensende stoffer. Banevinkel og sosial aktivitet er tettere knyttet til hjernens funksjon og sentralnervesystemet29. Banevinkelen refererer til vinkelen på banen til dyrebevegelse i forhold til svømmeretningen30. Åtte vinkelklasser fra ~-180°-~+180° er angitt i systemet. For å forenkle sammenligningen defineres seks klasser i det endelige resultatet som rutinemessige svinger (-10° ~0°, 0° ~+10°), gjennomsnittlige svinger (-10° ~-90°, +10° ~+90°), og responsive svinger (-180° ~-90°, +90° ~+180°) i henhold til våre tidligere studier21,22. To-fisk sosial aktivitet er grunnleggende for gruppe shoaling atferd; her er en avstand på < 0,5 cm mellom to larver gyldig definert som sosial kontakt.

Protokollen som presenteres her viser en klar prosess for å studere nevroatferdseffekter på sebrafisk larver og gir en måte å avsløre nevrotoksisitetseffektene av ulike stoffer eller forurensende stoffer. Protokollen vil være til nytte for forskere som er interessert i å studere nevrotoksisiteten til miljøgifter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen er i samsvar med retningslinjer godkjent av Dyreetikkkomiteen ved Tongji Universitet.

1. Sebrafisk embryo samling

  1. Sett to par sunn voksen Tubingen sebrafisk inn i gyteboksen på natten før eksponering, og hold sexforholdet på 1:1.
  2. Fjern den voksne fisken tilbake til systemet 30-60 min etter dagslys neste morgen.
  3. Fjern embryoene ut av gyteboksen.
  4. Skyll embryoene med systemvann.
  5. Overfør embryoene til en glass Petriskål (9 cm diameter) med nok systemvann.
  6. Vær oppmerksom på embryoene under mikroskopet og velg friske embryoer for senere eksponering.
    MERK: Friske embryoer er vanligvis gjennomsiktige med lys gylden farge under mikroskopet. De usunne embryoene er vanligvis bleke og klumpet sammen som observert under mikroskopet.

2. Forberedelse før eksponering

  1. Forbered Hanks' løsning i henhold til retningslinjene i sebrafiskboken31.
    MERK: Hanks' løsning inkluderer 0.137 M NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4,0,44 mM KH2PO4,1,3 mM CaCl2,1,0 mM MgSO4og 4,2 mM NaHCO3.
  2. Fortynn Hanks' løsning for å 10% Hanks' løsning ved hjelp av sterilt vann.
  3. Tilsett 1 ml DMSO i 999 ml 10 % Hanks' løsning for å lage en kontrollløsning på 10 % Hanks' løsning, inkludert 0,1 % DMSO.
    MERK: De neste trinnene bruker BDE-47 som et eksempel på en eksponeringsløsning.
  4. Oppløs 5 mg av den pene BDE-47 i 1 ml 100 % DMSO for å lage en standard eksponeringsoppløsning på 5 mg/ml.
  5. Vortex 5 mg/ml oppløsning en 1 min for å oppløse BDE-47 helt i DMSO.
  6. Overfør 10 μL av 5 mg/ml oppløsning til en 12 ml brun glassflaske.
  7. Tilsett sterilisert vann til et endelig volum på 10 ml for å gjøre konsentrasjonen av BDE-47 eksponeringsoppløsning 5 mg/L og DMSO-forhold ved 0,1 %, deretter vortex i 1 min.
  8. Overfør 10 μL og 100 μL av 5 mg/l-oppløsningen til henholdsvis to 100 ml volumetriske flasker.
  9. Tilsett 10 % Hanks' løsning, inkludert henholdsvis 0,1 % DMSO (utarbeidet i trinn 2,3) til 100 ml for å gjøre de endelige konsentrasjonene av eksponeringsløsningene bDE-47 5 μg/L og 50 μg/L.
  10. Overfør løsningene til 100 ml brune glassflasker og oppbevar dem ved 4 °C.

3. Eksponering av embryoer

  1. Overfør ~ 50 embryoer til hver av de tre glass Petri retter (6 cm diameter) 3-5 timer etter befruktning (hpf).
  2. Bruk en 1 ml pipettespiss for å blot systemet vann rundt embryoene.
  3. Bruk en pipette til å overføre kontrollen og to BDE-47 eksponeringsløsninger (kontroll, henholdsvis 5 μg/L, 50 μg/L) til de tre petriskålene i glass.
  4. Rist glasset Petri retter forsiktig en etter en for å gjøre embryoene spre seg i bunnen av platen.
  5. Sett glasspetriskålene i den lette inkubatoren under 28,5 °C.
  6. Forny halvparten av eksponeringsløsningene hver 24 timer til 5 dpf.
  7. Kontroller de døde embryoene i hver gruppe på 1 dpf og 2 dpf og beregn dødsraten.
  8. Kontroller de inkuerte embryoene til hver gruppe på 2 dpf og 3 dpf og beregn klekkerbarheten.
  9. Sjekk larvernes deformitet hver dag etter at de kommer ut fra koret og beregndeformitetsraten til hver gruppe.
    MERK: Deformitetsindikatorene inkluderer perikardial cyste, spinalkrumning, halekrumning, blant andre faktorer32.

4. Forberedelse til atferdstesten

  1. Forbered en 48 brønnmikroplate for bevegelses- og banevinkeltesten og tre 6 brønnmikroplater for den sosiale aktivitetstesten om morgenen 5 dpf.
  2. Overfør 800 μL eksponeringsoppløsning til hver brønn i 48 brønnmikroplaten.
    MERK: Bruk 16 brønner for hver gruppe (dvs. kontrollløsningen, 5 μg/L og 50 μg/l-gruppe).
  3. Bruk en 1 ml pipettespiss til å overføre 200 μL eksponeringsoppløsning med en larve fra glasspetriskålen til en brønn av 48 brønnmikroplaten.
  4. Overfør 4 ml eksponeringsoppløsning til hver brønn av 6 brønnmikroplaten.
    MERK: Bruk én mikroplate på 6 brønn for hver gruppe.
  5. Bruk en 1 ml pipettespiss til å overføre 200 μL eksponeringsoppløsning med to larver til hver brønn av 6 brønnmikroplaten.
    MERK: Hver gruppe har seks gjentatte grupper.
  6. Kontroller at temperaturen på testrommet er 28 °C 2 timer før testen.
    MERK: Atferdstester utføres vanligvis om ettermiddagen.

5. Atferdstest

  1. Bevegelses- og banevinkeltest
    1. Klikk på startikonet på datadesken for å åpne programvaren (se Materialtabell) som styrer høy gjennomstrømningsovervåkingskabinettet for å starte programmet.
    2. Velg modulen"Sporing, rotasjoner, banevinkler"for å gå inn i operativsystemet.
    3. Overfør 48 brønnmikroplaten som er utarbeidet i trinn 4.3 til opptaksplattformen og trekk ned dekselet.
    4. Klikk på"File" "" Generate Protocol" knappen i sin tur i programvaren for å begynne å generere en ny protokoll.
    5. Inngang "48" i "Posisjon teller" posisjon og klikk på "OK" -knappen.
    6. Klikk på"Parametere" "Protokollparametere" "Time" i sin tur i programvaren. Angi eksperimentvarigheten i 1 t og 10 min, og sett integrasjonsperioden til 60 s33.
    7. Tegn de oppdagede områdene.
      1. Velg elliptisk form og tegn den første sirkelen rundt den første øversttil venstre brønnen.
      2. Velg sirkelen, klikk på"Kopier" "Top-Right Mark" "Lim inn" "Velg" i sin tur, og bruk musen til å dra den kopierte sirkelen til øverst til høyre godt.
      3. Velg sirkelen, klikk på "Kopier" "Bunnmerke" "Lim inn" "Velg" i sin tur, og bruk musen til å dra den kopierte sirkelen til nedre høyre brønn.
      4. Klikk på"Bygg" "Fjern merker" -knappen i sin tur.
        MERK: Systemet vil automatisk trekke annenhver brønn av platen. De nyopprettede områdene skal passe godt mellom selve fisken og dens refleksjon på siden av brønnen.
    8. Klikk på"Tegnskala"-knappen, tegn en kalibreringslinje på skjermen (en diagonal bane eller parallell til siden av mikroplaten), skriv inn lengden og angi "Enhet". Klikk deretter på"Bruk på gruppe"-knappen.
    9. Sett dyrefargen på"Black"i programvaren.
    10. Sett deteksjonsterskelen til 16-18 for å tillate påvisning av dyrene.
    11. Inngang inaktiv/liten og liten/stor hastighet på henholdsvis 0,5 cm/s og 2,5 cm/s.
    12. Angi banevinkelklassene. Inngang "-90, -30, -10, 0, 10, 30 og 90" for å gjøre banevinkelklasser fra -180°-+180°.
    13. Angi lysforholdene
      1. Klikk på"Parametere" "Lyskjøring" "Bruker en av de 3 utløsende metodene nedenfor" " Forbedretstimuli" knappen i sin tur for å stille inn lysforholdene.
      2. Velg"Edge"-knappen, og still deretter inn en mørk periode på 10 min, etterfulgt av tre sykluser med vekslende 10 min lys og mørke perioder.
    14. Lagre protokollen og skru ned lyset fra testrommet.
    15. Akklimatiser larver i systemet i 10 min og klikk på "Experiment" "Execute" knappen i sin tur, og velg deretter mappen der eksperimentfilene er lagret og skriv inn resultatnavnet.
    16. Klikk på"Bakgrunn" "Start" knappen i sin tur for å starte testen.
    17. Klikk på"Experiment" "Stop" knappen i sin tur for å stoppe eksperimentet når testen slutter.
      MERK: Systemet viser dataene som testes når systemet stopper. Dataene inkluderer sporet avstand på tre hastighetsklasser og banevinkelnumre i åtte vinkelklasser i hvert minutt. For bevegelsestesten i det presenterte eksemplet beregnes den totale avstanden i hver lysperiode (10 min) og forskjellen mellom kontrollgruppen og behandlingsgruppene sammenlignet.
    18. Overfør 48 brønnmikroplaten tilbake til lysinkubatoren for andre eksperimenter.
  2. Sosial aktivitet test
    1. Klikk på startikonet på datadesken for å åpne programvaren som styrer høy gjennomstrømningsovervåkingskabinettet for å starte programmet.
    2. Velg modulen"Sosiale interaksjoner"for å gå inn i driftsgrensesnittet.
    3. Overfør den forberedte 6 brønnmikroplaten (kontrollgruppen) i trinn 4.4 til opptaksplattformen og trekk ned dekselet.
    4. Klikk på"File" "" Generate Protocol" knappen i sin tur i programvaren for å begynne å generere en ny protokoll.
    5. Inngang "6" i "Posisjon teller" posisjon og klikk på "OK" -knappen.
    6. Klikk på"Parametere" "Protokollparametere" "Time" i sin tur i programvaren. Angi eksperimentvarigheten i 1 t og 10 min, og angi integrasjonsperioden til 60 s.
    7. Tegn de oppdagede områdene.
      1. Velg elliptisk form og tegn den første sirkelen rundt den første øversttil venstre brønnen.
      2. Velg sirkelen, klikk på"Kopier" "Top-Right Mark" "Lim inn" "Velg" i sin tur, og bruk musen til å dra den kopierte sirkelen til øverst til høyre godt.
      3. Velg sirkelen, klikk på "Kopier" "Bunnmerke" "Lim inn" "Velg" i sin tur, og bruk musen til å dra den kopierte sirkelen til nedre høyre brønn.
      4. Klikk på"Bygg" "Fjern merker" -knappen i sin tur.
        MERK: De nyopprettede områdene skal passe hver perfekt og mellom de faktiske larver og dens refleksjon på siden av brønnen.
    8. Klikk på"Tegnskala"-knappen, tegn en kalibreringslinje på skjermen (en diagonal bane eller parallell til siden av mikroplaten), skriv inn lengden og angi "Enhet". Klikk deretter på"Bruk på gruppe"-knappen.
    9. Sett deteksjonsterskelen til 16-18 for å tillate påvisning av dyrene.
    10. Klikk på"Svart dyr"-knappen i programvaren.
    11. Velg tasten "Avstandsgrense"og inngang "5" i programvaren.
    12. Still inn lysforholdene.
      1. Klikk på"Parametere" "Lyskjøring" "Bruker en av de 3 utløsende metodene nedenfor" " Forbedretstimuli" knappen i sin tur for å stille inn lysforholdene.
      2. Velg"Edge"-knappen, og still deretter inn en mørk periode på 10 min, etterfulgt av tre sykluser med vekslende 10 min lys og mørke perioder.
    13. Lagre protokollen og skru ned lyset i rommet.
    14. Akklimatiser larver i systemet i 10 min og klikk på "Experiment" "Execute" knappen i sin tur, og velg deretter mappen der eksperimentfilene er lagret og skriv inn resultatnavnet.
    15. Klikk på"Bakgrunn" "Start" knappen i sin tur for å starte testen.
    16. Klikk på"Experiment" "Stop" knappen i sin tur for å stoppe eksperimentet i programvaren når testen slutter.
      MERK: Systemet viser dataene som testes når systemet stopper.
    17. Overfør 6 brønnmikroplaten (kontrollgruppen) tilbake til lysinkubatoren for andre eksperimenter.
    18. Overfør de 6 brønnmikroplatene (5 μg/L og 50 μg/l-grupper) i sin tur til opptaksplattformen og gjenta trinnene fra 5,2,4 til 5,2,17 ved ordinal.

6. Dataanalyse

  1. Åpne regnearkfilen i resultatene for bevegelses- og banevinkel.
  2. Velg de tre distansekolonnene (inadist, smldist, lardist) og legg dem sammen.
    MERK: Dataene til inadist, smldistog lardist betyr forskjellige avstander registrert av systemet i forskjellige hastighetsklasser (inaktive/ små / store), henholdsvis.
  3. For hver 10 minutters lysperiode oppsummerer avstanden til hver brønn, beregner gjennomsnittlig avstand på 16 brønner, og sammenlign dataene til de tre gruppene under lette stimuli.
  4. For hver 10 minutters lysperiode oppsummerer vinkelnummeret til hver brønn i hver lysvarighet fra cl01 til cl08 i sin tur, og sammenligndataene til de tre gruppene under lette stimuli.
    MERK: Dataene for kolonner fra cl01 til cl08 betyr forskjellige banevinkelnumre registrert av systemet i forskjellige banevinkler.
  5. Åpne regnearkfilen i resultatene for sosial aktivitet.
  6. Velg contct og contdur kolonner, og for hver 10 min lysperiode oppsummere sosiale tider og deres varighet for hver brønn.
  7. Beregn gjennomsnittlig sosial tid og varighet for en gruppe i hver lysvarighet og sammenlign dataene til de tre gruppene under lette stimuli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her beskriver vi en protokoll for å studere de nevroatferdsmessige effektene av miljøgifter ved hjelp av sebrafisklarver under lette stimuli. Bevegelses-, banevinkel- og sosiale aktivitetstester defineres i innledningen. Oppsettet av mikroplatene i bevegelses- og banevinkeltestene og bildene av programvaren vises nedenfor. I tillegg presenteres våre egne forskningsresultater som eksempler. To studier presenterer bevegelses- og banevinkeleffektene etter eksponering for BDE-47 og 6-OH/MeO-BDE-47. Den tredje studien presenterer effekten av fire kommersielle klorerte parafiner på sosial atferd.

Oppsettet av 48 brønnmikroplaten og bevegelseslokusen til larver i bevegelses- og banevinkeltesten.
Tre grupper, inkludert én kontrollgruppe og to behandlingsgrupper, ble brukt i protokollen. Fordi hver gruppe kan ha 16 dyr, kan systemet brukes til å utføre tester med høy gjennomstrømning av bevegelse og banevinkel i en mikroplate. Figur 1 viser én larve behandlet med kontrollløsningen, 5 μg/L-oppløsning og 50 μg/L-oppløsning i hver brønn i henholdsvis første, midterste og to siste rader.

Figur 1 viser også alle bevegelsesloci av larver i bevegelse og banevinkeltester. Systemet sporet bevegelse av larver og beregnet svømmeavstanden ved forskjellige hastighetsklasser. Systemet beregnet banevinkelnumrene til larver i forskjellige banevinkelklasser. Forskere kan analysere dataene som er registrert av systemet på sine egne måter.

Figure 1
Figur 1: Oppsettet av 48 brønnmikroplaten og bevegelseslokten til larver i bevegelses- og banevinkeltesten. A1-A8, B1-B8 = kontrollgruppen; C1-C8, D1-D8 = 5 μg/L-gruppen; E1-E8, F1-F8 = 50 μg/L-gruppen. Den svarte fargesporingslinjen betyr inaktivitet eller små bevegelser; den grønne fargesporingslinjen betyr normale bevegelser; og den røde fargesporingslinjen betyr store bevegelser. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Den 6 brønnmikroplaten i den sosiale aktivitetstesten.
Figur 2 viser en 6 brønnmikroplate i den sosiale aktivitetstestprosessen. Hver brønn hadde to larver, og systemet registrerte avstanden mellom de to larver under hele testprosessen. Systemet registrerte de sosiale aktivitetstallene og varigheten i den innstilte testtiden (1 min i denne protokollen).

Figure 2
Figur 2: Den 6 brønnmikroplaten i den sosiale aktivitetstesten. Hver brønn hadde to larver. Den gule linjen betyr avstanden mellom to dyr er < 0,5 cm; den røde linjen betyr avstanden mellom to dyr er > 0,5 cm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

BDE-47 eksponering påvirket bevegelse i sebrafisk larver ved 5 dpf.
Som vist i figur 3,produserte den høyeste konsentrasjonsgruppen av BDE-47 uttalt hypoaktivitet i den mørke perioden. Det var imidlertid ingen observerte endringer på grunn av BDE-47 eksponering i lysperiodene.

Figure 3
Figur 3: Effekter av BDE-47 eksponering på bevegelse av larvesebrafisk ved 5 dpf. Bevegelse (avstand målt i cm) ble registrert i vekslende perioder med mørke og lys for en total varighet på henholdsvis 70 min. Faste og åpne stenger nederst indikerer henholdsvis mørke og lyse perioder. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM (*p < 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen). Dette tallet er endret fra Zhao et al.17 med tillatelse. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

6-OH/MeO-BDE-47 eksponering påvirket banevinsvinsvinene ved 5 dpf.
Som vist i figur 4,utførte den høye konsentrasjonsgruppen på 6-OH-BDE-47 færre rutinemessige svinger og gjennomsnittlige svinger ved 5 dpf. Imidlertid ble mer responsive svinger indusert av 6-MeO-BDE-47 eksponeringsgrupper.

Figure 4
Figur 4: Effekter av 6-OH/MeO-BDE-47 på stivinkelen til larvesebrafisk i den mørke perioden. Data presenteres som gjennomsnittet ± SEM (*p < 0,05 sammenlignet med kontroll). Dette tallet er endret fra Zhang et al.18 med tillatelse. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

CPs eksponering påvirket sosial aktivitet av sebrafisk larver ved 5 dpf.
Som vist i figur 5,ble den sosiale oppførselen til sebrafisklarver påvirket av tre CP-produkter. Den sosiale aktiviteten ble stimulert av CP-70 og kortkjedede CP-52b. Den lange kjeden CP-52a forkortet varigheten per kontakt av larver.

Figure 5
Figur 5: Effekter av CPer på gjennomsnittlig sosial varighet per kontakt i forskjellige lys/mørke perioder. (A) CP-42, (B) CP-52a, (C) CP-52b, (D) CP-70. Dataene presenteres som gjennomsnittet ± SEM (*p < 0,05 sammenlignet med kontrollen). Dette tallet er endret fra Yang et al.19 med tillatelse. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette arbeidet gir en detaljert eksperimentell protokoll for å evaluere nevrotoksisiteten til miljøgifter ved hjelp av sebrafisklarver. Sebrafisk går gjennom prosessen fra embryoer til larver i eksponeringsperioden, noe som betyr at god omsorg for embryoer og larver er avgjørende. Alt som påvirker utviklingen av embryoer og larver kan påvirke sluttresultatet. Her diskuteres kulturmiljøet, eksponeringsprosessen og eksperimentelle forhold for å sikre at hele analysen lykkes.

For kulturmiljøet lever sebrafiskembryoer og larver under en stabil temperatur på ~ 28 °C. I dette arbeidet brukes en lett inkubator som kan stille inn lysforholdene automatisk og holde temperaturen stabil til å huse embryoer og larver. Embryoene kommer ikke ut av koret ved 1 dpf og 2 dpf, så det bør utvises forsiktighet for å unngå å skade de uklekkede embryoene når eksponeringsløsningen fornyes. Forholdet mellom DMSO i oppløsningen bør også være under 0,1 %34,35, og den friske eksponeringsløsningen bør være ved 28 °C før den brukes til fornyelse.

Prosessen med å velge embryoer før eksponering er også en viktig faktor for eksperimentets suksess. Valg av friske embryoer som utvikler seg samtidig for hver gruppe garanterer nøyaktigheten av toksisitetsvurdering. Sebrafisk kan leve uten mat i løpet av de første 7 dagene etter befruktning, så det er best å ikke mate embryoer eller larver i hele eksponeringsperioden fordi mat kan påvirke det endelige resultatet. Det er også best å forberede eksponeringsløsningen frisk når det trengs.

Under atferdstesten er det viktig å tilby larver nok tid til å tilpasse seg miljøet i det høygjennomstrømningsovervåkingskabinettet. Før testen bør hvert trinn i den testede protokollen kontrolleres nøye, inkludert lystilstanden, testtiden osv. Testrommet skal holdes helt stille og mørkt for ikke å forstyrre dyrene.

Protokollen som presenteres gir en grunnleggende ramme for å studere nevroatferdstoksisiteten til miljøgifter. Det finnes også andre typer atferd som brukes når du studerer nevroatferdseffekter, for eksempel fargepreferansetester36, bunnboligtester37, lys / mørke preferansetester38,39, etc. Disse testene bruker imidlertid hovedsakelig voksen sebrafisk, som ikke er egnet for tester med høy gjennomstrømning. I tillegg, Weichert et al. videotaped til oppførselen til spontane hale bevegelser som kan kvantifiseres like etter 24 t eksponering40. Evalueringen av nevroatferdstoksisitet inkluderer også mekanismestudier på hjernens funksjon og sentralnervesystemet. De grunnleggende nevroatferdsindikatorene introduseres her og kan danne grunnlaget for mer komplekse indikatorer ved hjelp av andre atferdsinstrumenter. Til syvende og sist kan utviklingen av nye neurobehavioral indikatorer ledsaget av denne studiemekanismen brukes i fremtidige studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlige for den økonomiske støtten fra National Natural Science Foundation of China (21876135 og 21876136), National Major Science and Technology Project of China (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), Stiftelsen av MOE-Shanghai Hovedlaboratorium for barns miljøhelse (CEH201807-5) og Svensk forskningsråd (nr. 639-2013-6913).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35, (12), 2931-2940 (2016).
  2. Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
  3. Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57, (7), 775-793 (2016).
  4. Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
  5. Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. Environmental Organic Chemistry. John Wiley & Sons. (2016).
  6. Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24, (3), 253-273 (2016).
  7. Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90, (9), 2077-2107 (2016).
  8. Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113, (9), 1230-1233 (2005).
  9. Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
  10. Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3, (2), 235-247 (2006).
  11. Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234, (4), 549-558 (2017).
  12. Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
  13. Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
  14. Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4, (3), 567-576 (2008).
  15. Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55, (1), 1-16 (2015).
  16. Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31, (10), 1241-1249 (2016).
  17. Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 65 (2016).
  18. Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
  19. Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10, (1), 46 (2017).
  20. Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
  21. Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
  22. Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
  23. Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
  24. Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
  25. Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
  26. Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos? Environmental Science & Technology. 53, (1), 482-493 (2018).
  27. Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (5), 1475-1480 (2015).
  28. Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10, (1), 1-14 (2019).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210, (2), 266-271 (2012).
  30. Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207, (19), 3265-3279 (2004).
  31. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
  32. Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36, (3), 481-486 (2017).
  33. Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30, (1), 52-58 (2009).
  34. Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
  35. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Drug Safety Evaluation. Springer. 271-279 (2011).
  36. Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13, (4), 330-334 (2016).
  37. Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11, (3), 366-373 (2012).
  38. Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104, (5), 831-837 (2011).
  39. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7, (5), e36931 (2012).
  40. Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics