Undersøgelse Neurobehavioral Virkninger af miljøforurenende stoffer på Zebrafisk Larver

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En detaljeret eksperimentel protokol præsenteres i dette papir til evaluering af neurobehavioral toksicitet af miljøforurenende stoffer ved hjælp af en zebrafisk larver model, herunder eksponeringsprocessen og test for neurobehavioral indikatorer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De seneste år flere og flere miljøforurenende stoffer er blevet bevist neurotoksiske, især i de tidlige udviklingsstadier af organismer. Zebrafisk larver er en fremtrædende model for neurobehavioral undersøgelse af miljøforurenende stoffer. Her er der fastsat en detaljeret forsøgsprotokol til evaluering af neurotoksiciteten af miljøforurenende stoffer ved hjælp af zebrafisklarver, herunder indsamling af embryoner, eksponeringsprocessen, neurobehavioralindikatorer, testprocessen og dataanalyse. Også kulturmiljøet, eksponeringsprocessen og forsøgsbetingelserne diskuteres for at sikre analysens succes. Protokollen er blevet brugt i udviklingen af psykopatiske lægemidler, forskning i miljømæssige neurotoksiske forurenende stoffer, og kan optimeres til at foretage tilsvarende undersøgelser eller være nyttige for mekanistiske undersøgelser. Protokollen viser en klar operation proces for at studere neurobehavioral virkninger på zebrafisk larver og kan afsløre virkningerne af forskellige neurotoksiske stoffer eller forurenende stoffer.

Introduction

I de senere år er flere og flere miljøforurenende stoffer blevet bevist neurotoksiske1,2,3,4. Vurderingen af neurotoksicitet in vivo efter eksponering for miljøforurenende stoffer er imidlertid ikke så let som vurderingen af hormonforstyrrende stoffer eller udviklingstoksicitet. Desuden har tidlig eksponering for forurenende stoffer, især ved miljømæssigt relevante doser, tiltrukket sig stigende opmærksomhed i toksicitetsundersøgelser5,6,7,8.

Zebrafisk er ved at blive etableret som et dyr model egnet til neurotoksicitet undersøgelser under tidlig udvikling efter udsættelse for miljøforurenende stoffer. Zebrafisk er hvirveldyr, der udvikler sig hurtigere end andre arter efter befrugtning. Larverne behøver ikke at blive fodret, fordi næringsstofferne i chorionen er nok til at opretholde dem i 7 dage efterbefrugtning (dpf)9. Larver kommer ud fra chorion på ~ 2 dpf og udvikle adfærd såsom svømning og drejning, der kan observeres, spores, kvantificeret, og automatisk ved hjælp af adfærdinstrumenter10,11,12,13 starter ved 3-4 dpf14,15,16,17,18. Desuden kan high-throughput test også realiseres ved adfærd instrumenter. Således zebrafisk larver er en fremragende model for neurobehavioral undersøgelse af miljøforurenende stoffer19. Her tilbydes en protokol ved hjælp af overvågning med høj gennemløb for at undersøge de neuroadfærdsmæssige toksicitet af miljøforurenende stoffer på zebrafisklarver under lette stimuli.

Vores laboratorium har studeret neurobehavioral toksicitet af 2,2',4'-tetrabromodiphenyl ether (BDE-47)20,21, 6'-Hydroxy/Methoxy-2,2',4,4'-tetrabromodiphenylether (6-OH/MeO-BDE-47)22, deca-brominated diphenylether (BDE-209), bly og kommercielle klorerede paraffiner23 ved hjælp af den præsenterede protokol. Mange laboratorier også bruge protokollen til at studere neurobehavioral virkninger af andre forurenende stoffer på larver eller voksne fisk24,25,26,27. Denne neurobehavioral protokol blev brugt til at hjælpe med at give mekanistisk støtte, der viser, at lav dosis eksponering for bisphenol A og udskiftning bisphenol S induceret for tidlig hypothalamotisk neurogenesis i embryonale zebrafisk27. Desuden optimerede nogle forskere protokollen til at udføre tilsvarende undersøgelser. En nylig undersøgelse elimineret toksiciteten af amyloid beta (Aβ) i en nem, høj gennemløb zebrafisk model ved hjælp af kasein-belagt guld nanopartikler (βCas AuNPs). Det viste, at βCas AunPs i systemisk cirkulation transtranslocated på tværs af blod - hjerne barrieren af zebrafisk larver og sequestered intracerebral Aβ42, fremkalde toksicitet i en uspecifik, chaperone-lignende måde, som blev støttet af adfærdsmæssige patologi28.

Bevægelse, stivinkel og social aktivitet er tre neuroadfærdsmæssige indikatorer, der anvendes til at undersøge neurotoksicitetsvirkningerne af zebrafisklarver efter eksponering for forurenende stoffer i den præsenterede protokol. Locomotion måles ved at svømme afstande af larver og kan blive beskadiget efter udsættelse for forurenende stoffer. Stivinkel og social aktivitet er tættere forbundet med hjernens funktion og centralnervesystemet29. Stien vinkel refererer til vinklen på stien af dyr bevægelse i forhold til svømning retning30. Der er indstillet otte vinkelklasser fra ~-180°-~+180° i systemet. For at forenkle sammenligningen defineres seks klasser i det endelige resultat som rutinesving (-10° ~0°, 0° ~+10°), gennemsnitlige sving (-10° ~-90°, +10° ~+90°) og responsive sving (-180° ~-90°, +90° ~+180°) ifølge vores tidligere undersøgelser21,22. To-fisk social aktivitet er grundlæggende for gruppe stimeradfærd; her defineres en afstand på < 0,5 cm mellem to larver gyldige som social kontakt.

Protokollen præsenteres her viser en klar proces for at studere neurobehavioral virkninger på zebrafisk larver og giver en måde at afsløre neurotoksicitet virkninger af forskellige stoffer eller forurenende stoffer. Protokollen vil gavne forskere interesseret i at studere neurotoksicitet af miljøforurenende stoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen er i overensstemmelse med retningslinjer, der er godkendt af Tongji Universitys etiske komité for Dyretik.

1. Indsamling af zebrafiskembryo

  1. Sæt to par sunde voksne Tubingen zebrafisk i gydeboksen om natten før eksponering, holde sex forholdet på 1:1.
  2. Fjern den voksne fisk tilbage til systemet 30-60 min efter dagslys næste morgen.
  3. Fjern embryonerne ud af gydeboksen.
  4. Skyl embryonerne med systemvand.
  5. Overfør embryonerne til en glaspetriskål (diameter på 9 cm) med nok systemvand.
  6. Observere embryonerne under mikroskopet og vælg sunde embryoner til senere eksponering.
    BEMÆRK: Sunde embryoner er normalt gennemsigtige med lys gylden farve under mikroskopet. De usunde embryoner er normalt blege og klumpet sammen som observeret under mikroskopet.

2. Præparat før eksponering

  1. Forbered Hanks 'løsning i henhold til retningslinjerne i zebrafisk bog31.
    BEMÆRK: Hanks 'løsning omfatter 0,137 M NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na2HPO4, 0.44 mM KH2PO4, 1.3 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, og 4.2 mM NaHCO3.
  2. Hanks opløsning til 10% Hanks 'løsning ved hjælp af sterilt vand.
  3. Tilføj 1 ml DMSO i 999 ml 10% Hanks' løsning for at lave en kontrolløsning på 10% Hanks' løsning, herunder 0,1% DMSO.
    BEMÆRK: De næste trin bruger BDE-47 som et eksempel på en eksponeringsopløsning.
  4. 5 mg af den pæne BDE-47 i 1 ml 100% DMSO opløses for at lave en standardeksponeringsopløsning på 5 mg/ml.
  5. Vortex 5 mg/ml opløsning i 1 min helt opløse BDE-47 i DMSO.
  6. 10 μL af 5 mg/ml opløsningen overføres til en 12 ml brun glasflaske.
  7. Tilsæt steriliseret vand til et endeligt volumen på 10 ml for at gøre koncentrationen af BDE-47 eksponeringsopløsning 5 mg/L og DMSO-forholdet på 0,1%, derefter vortex i 1 min.
  8. 10 μL og 100 μL af 5 mg/L opløsningen overføres til henholdsvis to 100 ml volumetriske kolber.
  9. Der tilsættes 10% Hanks' opløsning, herunder 0,1% DMSO (fremstillet i trin 2.3) til 100 ml for at gøre de endelige koncentrationer af BDE-47 eksponeringsopløsningerne 5 μg/L og 50 μg/L.
  10. Opløsningerne overføres til 100 ml brune glasflasker, og opbevar dem ved 4 °C.

3. Eksponering af embryoner

  1. Overfør ~ 50 embryoner i hver af de tre glas Petri skåle (6 cm diameter) 3-5 timer efter befrugtning (hpf).
  2. Brug en 1 ml pipettespids til at skamplet systemet vand omkring embryoner.
  3. Brug en pipette til at overføre betjeningstrækket og to BDE-47 eksponeringsopløsninger (kontrol, 5 μg/L, 50 μg/L) til henholdsvis tre glaspetriskåle.
  4. Ryst glaspetriskålene forsigtigt en efter en for at få embryonerne til at sprede sig i bunden af pladen.
  5. Sæt glaspetriskålene i lyskuvøserne under 28,5 °C.
  6. Forny halvdelen af eksponeringsopløsningerne hver 24 timer indtil 5 dpf.
  7. Kontroller de døde embryoner fra hver gruppe på 1 dpf og 2 dpf og beregne dødeligheden.
  8. Kontroller de inkuberede embryoner fra hver gruppe på 2 dpf og 3 dpf og udregn rugebarheden.
  9. Kontroller larvers deformitet hver dag, efter de kommer ud fra chorionen og beregner deformitetsraten for hver gruppe.
    BEMÆRK: Deformitet indikatorer omfatter perikardiecyste, spinal krumning, hale krumning, blandt andre faktorer32.

4. Forberedelse til adfærdstesten

  1. Forbered en 48 brønd mikroplade til bevægelse og sti vinkel test og tre 6 godt mikroplader til den sociale aktivitet test om morgenen 5 dpf.
  2. Overfør 800 μL eksponeringsopløsning til hver brønd af 48 brøndmikropladen.
    BEMÆRK: Brug 16 brønde til hver gruppe (dvs. kontrolopløsningen, 5 μg/L og 50 μg/L-gruppen).
  3. Brug en 1 ml pipettespids til at overføre 200 μL eksponeringsopløsning med en larver fra glasset Petri skålen til en brønd af 48 brøndmikropladen.
  4. Overfør 4 ml eksponeringsopløsning til hver brønd af 6 brøndmikropladen.
    BEMÆRK: Brug en 6 brønd mikroplade til hver gruppe.
  5. Brug en 1 ml pipettespids til at overføre 200 μL eksponeringsopløsning med to larver ind i hver brønd af den 6 brøndmikroplade.
    BEMÆRK: Hver gruppe har seks gentagne grupper.
  6. Sørg for, at temperaturen i prøverummet er 28 °C 2 h før prøvningen.
    BEMÆRK: Adfærdstest udføres normalt om eftermiddagen.

5. Adfærdstest

  1. Prøvning af bevægelse og kurvevinkel
    1. Klik på launcherikonet på computerskrivebordet for at åbne softwaren (se Materialetabel),der styrer overvågningskabinettet med høj overførselsovervågning for at starte programmet.
    2. Vælg modulet "Sporing, rotationer, kurvevinkler" for at komme ind i driftsgrænsefladen.
    3. Overfør den 48 brøndmikroplade, der er fremstillet i trin 4.3, til optagelsesplatformen, og træk dækslet ned.
    4. Klik på knappen "Filer" "Generer protokol" igen i softwaren for at begynde at generere en ny protokol.
    5. Indtast "48" i positionen "Placeringtæller" og klik på knappen "OK".
    6. Klik på knappen "Parametre" "Protokolparametre" "Time" til gengæld i softwaren. Indstil eksperimentets varighed for 1 time og 10 min. og sæt integrationsperioden til 60 s33.
    7. Tegn de fundne områder.
      1. Vælg den elliptiske form, og tegn den første cirkel rundt om den første øverste venstre brønd.
      2. Vælg cirklen, klik på knappen "Kopier" "Øverst til højre ""Indsæt" "Vælg" for at dreje, og brug musen til at trække den kopierede cirkel til øverste højre brønd.
      3. Vælg cirklen, klik på knappen "Kopier" "" Bundmarkering" "Indsæt" "Vælg" efter tur, og brug musen til at trække den kopierede cirkel til nederst til højre.
      4. Klik på knappen "Build" "Clear marks" efter tur.
        BEMÆRK: Systemet trækker automatisk alle andre brønd af pladen. De nyoprettede områder skal passe perfekt til hver brønd mellem de faktiske fisk og dens refleksion på siden af brønden.
    8. Klik på knappen "Tegn skala", tegn en kalibreringslinje på skærmen (en diagonal kurve eller parallelt med siden af mikropladen), angiv dens længde og indstil "Enheden". Klik derefter på knappen "Anvend på gruppe".
    9. Indstil dyrefarven til "Sort" i softwaren.
    10. Indstil detektionstærsklen til 16-18, så dyrene kan påvises.
    11. Input inaktiv/lille/stor hastighed ved henholdsvis 0,5 cm/s og 2,5 cm/s.
    12. Angiv stivinkelklasserne. Indgang "-90, -30, -10, 0, 10, 30 og 90" for at lave kurvevinkelklasser fra -180°-+180°.
    13. Indstil lysforholdene
      1. Klik på knappen "Parametre" "Light driving" " Bruger en af de3 udløsende metoder nedenfor" "Enhanced stimuli" for at indstille lysforholdene.
      2. Vælg knappen "Edge", og indstil derefter en mørk periode på 10 min efterfulgt af tre cyklusser med vekslende 10 min lys og mørke perioder.
    14. Gem protokollen og skru ned for lyset af testrummet.
    15. Akklimatiser larverne i systemet i 10 minutter, og klik på knappen "Eksperiment" "Udfør" igen, og vælg derefter den mappe, hvor eksperimentfilerne gemmes, og indtast resultatnavnet.
    16. Klik på knappen "Baggrund" "Start" for at starte testen.
    17. Klik på knappen "Eksperiment" "Stop" for at stoppe eksperimentet, når testen afsluttes.
      BEMÆRK: Systemet viser de data, der testes, når systemet stopper. Dataene omfatter den sporede afstand ved tre hastighedsklasser og kurvevinkelnumre i otte vinkelklasser i hvert minut. For bevægelsesprøven i det fremlagte eksempel beregnes den samlede afstand i hver lysperiode (10 min) og forskellen mellem kontrolgruppen og behandlingsgrupperne sammenlignet.
    18. Overfør 48 brøndmikropladen tilbage til lyskuvøsen til andre eksperimenter.
  2. Test af social aktivitet
    1. Klik på starterikonet på computerskrivebordet for at åbne den software, der styrer høj-throughput overvågning kabinet til at starte programmet.
    2. Vælg modulet"Sociale interaktioner"for at komme ind i driftsgrænsefladen.
    3. Overfør den forberedte 6 brøndmikroplade (kontrolgruppe) i trin 4.4 til optagelsesplatformen, og træk dækslet ned.
    4. Klik på knappen "Filer" "Generer protokol" igen i softwaren for at begynde at generere en ny protokol.
    5. Indtast "6" i positionen "Placeringtæller" og klik på knappen "OK".
    6. Klik på knappen "Parametre" "Protokolparametre" "Time" til gengæld i softwaren. Indstil eksperimentets varighed i 1 time og 10 min. og indstil integrationsperioden til 60 s.
    7. Tegn de fundne områder.
      1. Vælg den elliptiske form, og tegn den første cirkel rundt om den første øverste venstre brønd.
      2. Vælg cirklen, klik på knappen "Kopier" "Øverst til højre ""Indsæt" "Vælg" for at dreje, og brug musen til at trække den kopierede cirkel til øverste højre brønd.
      3. Vælg cirklen, klik på knappen "Kopier" "" Bundmarkering" "Indsæt" "Vælg" efter tur, og brug musen til at trække den kopierede cirkel til nederst til højre.
      4. Klik på knappen "Build" "Clear marks" efter tur.
        BEMÆRK: De nyoprettede områder skal passe godt til hinanden og mellem de faktiske larver og dens refleksion på siden af brønden.
    8. Klik på knappen "Tegn skala", tegn en kalibreringslinje på skærmen (en diagonal kurve eller parallelt med siden af mikropladen), angiv dens længde og angiv "Enheden". Klik derefter på knappen "Anvend på gruppe".
    9. Indstil detektionstærsklen til 16-18, så dyrene kan påvises.
    10. Klik på knappen "Sort dyr" i softwaren.
    11. Vælg knappen "Afstandstærskel" og input "5" i softwaren.
    12. Indstil lysforholdene.
      1. Klik på knappen "Parametre" "Light driving" " Bruger en af de3 udløsende metoder nedenfor" "Enhanced stimuli" for at indstille lysforholdene.
      2. Vælg knappen "Edge", og indstil derefter en mørk periode på 10 min efterfulgt af tre cyklusser med vekslende 10 min lys og mørke perioder.
    13. Gem protokollen og skru ned for lyset af rummet.
    14. Akklimatiser larverne i systemet i 10 minutter, og klik på knappen "Eksperiment" "Udfør" igen, og vælg derefter den mappe, hvor eksperimentfilerne gemmes, og indtast resultatnavnet.
    15. Klik på knappen "Baggrund" "Start" for at starte testen.
    16. Klik på knappen "Eksperiment" "Stop" for at stoppe eksperimentet i softwaren, når testen afsluttes.
      BEMÆRK: Systemet viser de data, der testes, når systemet stopper.
    17. Overfør 6 godt mikroplade (kontrolgruppe) tilbage til lyskuvøse for andre eksperimenter.
    18. De 6 brøndmikroplader (5 μg/L og 50 μg/L-grupper) overføres til registreringsplatformen og trinnene gentages fra 5.2.4 til 5.2.17 ved ordinal.

6. Dataanalyse

  1. Åbn regnearksfilen i bevægelses- og stivinklen.
  2. Vælg de tre afstandskolonner(inadist, smldist, lardist) og tilsæt dem op.
    BEMÆRK: Data fra inadist, smldistog lardist betyder forskellige afstande registreret af systemet i forskellige hastighedsklasser (inaktive/små/store).
  3. For hver 10 minutters lysperiode opsummerer afstanden for hver brønd, beregner den gennemsnitlige afstand på 16 brønde, og sammenlign dataene for de tre grupper under lette stimuli.
  4. For hver 10 minutters lysperiode opsummere vinkelnummeret på hver brønd i hver lys varighed fra cl01 til cl08 igen, og sammenligne data fra de tre grupper under lys stimuli.
    BEMÆRK: Dataene for kolonner fra cl01 til cl08 betyder forskellige kurvevinkelnumre, som systemet har registreret i forskellige kurvevinkler.
  5. Åbn regnearksfilen i resultaterne af den sociale aktivitet.
  6. Vælg contct og contdur kolonner, og for hver 10 min lys periode opsummere de sociale tider og deres varighed for hver brønd.
  7. Beregn de gennemsnitlige sociale tider og varigheden af en gruppe i hver lysvarighed, og sammenlign dataene for de tre grupper under lette stimuli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her beskriver vi en protokol til undersøgelse af de neuroadfærdsmæssige virkninger af miljøforurenende stoffer ved hjælp af zebrafisk larver under lette stimuli. Bevægelsesbevægelse, stivinkel og sociale aktivitetstest defineres i indledningen. Opsætningen af mikropladerne i bevægelse og stivinkel test og billeder af softwaren er vist nedenfor. Desuden præsenteres vores egne forskningsresultater som eksempler. To undersøgelser præsenterer bevægelse s- og stivinkeleffekterne efter eksponering for BDE-47 og 6-OH/MeO-BDE-47. Den tredje undersøgelse præsenterer virkningerne af fire kommercielle klorerede paraffiner på social adfærd.

Opsætningen af 48 brøndmikropladen og larvers bevægelseslocus i bevægelses- og stivinkeltesten.
Tre grupper, herunder en kontrolgruppe og to behandlingsgrupper, blev anvendt i protokollen. Da hver gruppe kan have 16 dyr, kan systemet bruges til at udføre højgennemløbstest af bevægelse sionog stivinkel i én mikroplade. Figur 1 viser en larver behandlet med kontrolopløsningen, 5 μg/L opløsning og 50 μg/L opløsning i hver brønd af henholdsvis første, midterste og sidste to rækker.

Figur 1 viser også alle larvers bevægelsesloci i bevægelses- og stivinkeltestene. Systemet sporede larvers bevægelse og beregnede svømmeafstanden ved forskellige hastighedsklasser. Systemet beregnede stivinkelnumrene på larver i forskellige kurvevinkelklasser. Forskere kan analysere de data, der registreres af systemet på deres egne måder.

Figure 1
Figur 1: Opsætningen af 48 brøndmikropladen og larvers bevægelsesloci i bevægelses- og kurvevinkeltesten. A1-A8, B1-B8 = kontrolgruppen; C1-C8, D1-D8 = 5 μg/L-gruppen E1-E8, F1-F8 = 50 μg/L-gruppen. Den sorte farvesporingslinje betyder inaktivitet eller små bevægelser. den grønne farvesporingslinje betyder normale bevægelser og den røde farvesporingslinje betyder store bevægelser. Klik her for at se en større version af denne figur.

De 6 godt mikroplade i den sociale aktivitet test.
Figur 2 viser en 6 brøndmikroplade i den sociale aktivitetstestproces. Hver brønd havde to larver, og systemet registreres afstanden mellem de to larver under hele testprocessen. Systemet registrerede de sociale aktivitetsnumre og varigheden i den indstillede testtid (1 min i denne protokol).

Figure 2
Figur 2: Den 6 brøndmikroplade i den sociale aktivitetstest. Hver brønd havde to larver. Den gule linje betyder, at afstanden mellem to dyr er < 0,5 cm. den røde linje betyder, at afstanden mellem to dyr er > 0,5 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.

BDE-47 eksponering påvirket bevægelse i zebrafisk larver ved 5 dpf.
Som vist i figur 3frembragte den højeste koncentrationsgruppe bde-47 udtalt hypoaktivitet i den mørke periode. Der var dog ingen observerede ændringer som følge af BDE-47 eksponering i lysperioderne.

Figure 3
Figur 3: Virkninger af BDE-47 eksponering på bevægelse af larve zebrafisk ved 5 dpf. Bevægelse (afstand flyttet målt i cm) blev registreret i vekslende perioder med mørke og lys i en samlet varighed på 70 min. Faste og åbne stænger i bunden indikerer henholdsvis mørke og lyse perioder. Data præsenteres som middel ± SEM (*p < 0,05 sammenlignet med kontrolgruppen). Dette tal er blevet ændret fra Zhao et al.17 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

6-OH/MeO-BDE-47 eksponering påvirkede stien vinkler af zebrafisk larver ved 5 dpf.
Som vist i figur 4udførte den høje koncentrationsgruppe 6-OH-BDE-47 færre rutinesving og gennemsnitlige sving ved 5 dpf. Men mere lydhør sving blev induceret af 6-MeO-BDE-47 eksponeringsgrupper.

Figure 4
Figur 4: Virkninger af 6-OH/MeO-BDE-47 på den kurvevinkel af larve zebrafisk i den mørke periode. Data præsenteres som den gennemsnitlige ± SEM (*p < 0,05 sammenlignet med kontrol). Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al.18 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

CPs eksponering påvirket social aktivitet zebrafisk larver på 5 dpf.
Som vist i figur 5var zebrafisklarvernes sociale adfærd påvirket af tre CP-produkter. Den sociale aktivitet blev stimuleret af CP-70 og den korte kæde CP-52b. Den lange kæde CP-52a forkortede varigheden pr. kontakt af larverne.

Figure 5
Figur 5: EF-medlemmernes virkninger af den gennemsnitlige sociale varighed pr. kontakt i forskellige lys-/mørke perioder. A) CP-42,B) CP-52a,C) CP-52b,D) CP-70. Dataene præsenteres som den gennemsnitlige ± SEM (*p < 0,05 sammenlignet med styringen). Dette tal er blevet ændret fra Yang et al.19 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette arbejde giver en detaljeret eksperimentel protokol til at vurdere neurotoksicitet af miljøforurenende stoffer ved hjælp af zebrafisk larver. Zebrafisk gennemgår processen fra embryoner til larver i eksponeringsperioden, hvilket betyder, at god pleje af embryoner og larver er afgørende. Alt, hvad der påvirker udviklingen af embryoner og larver, kan påvirke det endelige resultat. Her diskuteres kulturmiljøet, eksponeringsprocessen og forsøgsbetingelserne for at sikre, at hele analysen bliver en succes.

Til kulturmiljøet lever zebrafiskembryoner og larver under en stabil temperatur på ~28 °C. I dette arbejde, en lys kuvøse, der kan indstille lysforholdene automatisk og holde temperaturen stabil bruges til at huse embryoner og larver. Embryonerne kommer ikke ud fra chorionen ved 1 dpf og 2 dpf, så man skal passe på, at de uudklækkede embryoner ikke beskadiges, når eksponeringsopløsningen fornyes. Forholdet mellem DMSO i opløsningen skal også være under 0,1%34,35, og den friske eksponeringsopløsning skal være på 28 °C, før den anvendes til fornyelse.

Processen med at udvælge embryoner før eksponering er også en nøglefaktor for forsøgets succes. Valg af sunde embryoner, der udvikler sig sideløbende for hver gruppe, garanterer nøjagtigheden af toksicitetsvurderingen. Zebrafisk kan leve uden mad i løbet af de første 7 dage efter befrugtningen, så det er bedst ikke at fodre embryoner eller larver i hele eksponeringsperioden, fordi fødevarer kan påvirke det endelige resultat. Det er også bedst at forberede eksponeringsløsningen frisk, når det er nødvendigt.

Under adfærdstesten er det vigtigt at tilbyde larverne tilstrækkelig tid til at tilpasse sig miljøet i høj-throughput overvågning kabinet. Før testen skal hvert trin i den testede protokol kontrolleres omhyggeligt, herunder lystilstand, prøvningstid osv. Testrummet skal holdes helt stille og mørkt for ikke at forstyrre dyrene.

Protokollen præsenteres tilbyder en grundlæggende ramme til at studere neurobehavioral toksicitet af miljøforurenende stoffer. Der er også andre typer af adfærd, der anvendes, når de studerer neurobehavioral effekter, såsom farve-præference test36,nederste bolig test37,lys / mørk præference test38,39,osv. Disse test bruger dog hovedsageligt voksne zebrafisk, som ikke er egnede til high-throughput test. Desuden optog Weichert et al. til adfærden af spontane halebevægelser, som kan kvantificeres lige efter 24 h eksponering40. Evalueringen af neurobehavioral toksicitet omfatter også mekanisme undersøgelser af funktionen af hjernen og centralnervesystemet. De grundlæggende neurobehavioral indikatorer er indført her og kan danne grundlag for mere komplekse indikatorer ved hjælp af andre adfærdinstrumenter. I sidste ende, udviklingen af nye neurobehavioral indikatorer ledsaget af denne undersøgelse mekanisme kan anvendes i fremtidige undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige for den økonomiske støtte fra National Natural Science Foundation of China (21876135 og 21876136), National Major Science and Technology Project of China (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), Instituttet for MOE-Shanghai Nøglelaboratorium for børns miljøsundhed (CEH201807-5) og Det Svenske Forskningsråd (nr. 639-2013-6913).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35, (12), 2931-2940 (2016).
  2. Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
  3. Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57, (7), 775-793 (2016).
  4. Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
  5. Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. Environmental Organic Chemistry. John Wiley & Sons. (2016).
  6. Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24, (3), 253-273 (2016).
  7. Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90, (9), 2077-2107 (2016).
  8. Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113, (9), 1230-1233 (2005).
  9. Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
  10. Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3, (2), 235-247 (2006).
  11. Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234, (4), 549-558 (2017).
  12. Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
  13. Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
  14. Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4, (3), 567-576 (2008).
  15. Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55, (1), 1-16 (2015).
  16. Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31, (10), 1241-1249 (2016).
  17. Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 65 (2016).
  18. Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
  19. Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10, (1), 46 (2017).
  20. Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
  21. Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
  22. Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
  23. Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
  24. Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
  25. Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
  26. Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos? Environmental Science & Technology. 53, (1), 482-493 (2018).
  27. Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (5), 1475-1480 (2015).
  28. Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10, (1), 1-14 (2019).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210, (2), 266-271 (2012).
  30. Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207, (19), 3265-3279 (2004).
  31. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
  32. Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36, (3), 481-486 (2017).
  33. Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30, (1), 52-58 (2009).
  34. Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
  35. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Drug Safety Evaluation. Springer. 271-279 (2011).
  36. Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13, (4), 330-334 (2016).
  37. Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11, (3), 366-373 (2012).
  38. Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104, (5), 831-837 (2011).
  39. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7, (5), e36931 (2012).
  40. Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics