Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier beschreven is een methode voor gerichte, markerless gen verwijdering in Chlamydia trachomatis met behulp van floxed cassette allelic uitwisseling mutagenese, FLAEM.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Keb, G., Fields, K. A. Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (155), e60848, doi:10.3791/60848 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Chlamydia trachomatis is een obligate intracellulaire ziekteverwekker die historisch moeilijk te manipuleren is geweest. Definitieve vooruitgang bij het verduidelijken van de mechanismen die C. trachomatis gebruiken om een bevoorrechte intracellulaire niche te creëren en te behouden, is beperkt door een gebrek aan genetische hulpmiddelen. Gelukkig zijn er onlangs verschillende nieuwe ontwikkelingen in genetische manipulatie technieken. Een daarvan is de ontwikkeling van fluorescentie-gerapporteerde allelic uitwisseling mutagenese (FRAEM). Deze methode maakt gerichte genverwijdering mogelijk in combinatie met het inbrengen van een selectiecassette die antibioticaresistentie en groen fluorescerend eiwit (GFP) inkaartbrengt. Vertrouwen op deze strategie kan ingewikkeld zijn bij het richten van genen binnen polycistronic operons vanwege het potentieel van polaire effecten op downstream genen. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), het protocol waarvoor hier wordt beschreven, werd ontwikkeld om cassette-geïnduceerde polaire effecten te verlichten. FLAEM maakt gebruik van Cre-loxP genoombewerking om de selectiecassette te verwijderen na gerichte verwijdering door allelic exchange. De resulterende stammen bevatten markerless gendeleties van een of meer coderingssequenties. Deze techniek vergemakkelijkt de directe beoordeling van de genfunctie en breidt het repertoire van instrumenten voor genetische manipulatie in C. trachomatis uit.

Introduction

Chlamydia trachomatis is de belangrijkste oorzaak van bacteriële seksueel overdraagbare aandoeningen en vormt een aanzienlijke last voor de menselijke gezondheid. Meer dan 100 miljoen mensen zijn elk jaar besmet met C. trachomatis1. Ongeveer 70% van de infecties bij vrouwen zijn asymptomatisch ondanks schadelijke reproductieve gezondheidseffecten, zoals bekkenontstekingsziekte, buitenbaarmoederlijke zwangerschap en/of onvruchtbaarheid. Ziekte sequela zijn direct gerelateerd aan immunopathologie geïnitieerd door C. trachomatis infectie2. Er moet nog een effectief vaccin worden ontwikkeld; daarom is het begrijpen van de functie van bacteriële virulentiefactoren en andere bacteriële genproducten een belangrijke en dringende onderzoeksvraag.

Als intracellulaire bacteriën zijn gastheercelinvasie, intracellulaire replicatie, het vrijkomen van nakomelingen en ontduiking van gastheerimmunologische reacties kritieke processen. C. trachomatis vormt een parasitophoreuze membraan gebonden vacuole, genoemd een opname, voor intracellulaire ontwikkeling. De totstandbrenging van de opneming en vele andere kritieke processen worden bereikt door afscheiding van effectorproteïnen via een type III secretiesysteem (T3SS)3. Het verduidelijken van de functies van deze uitgescheiden effectoren was beperkt voor vele jaren als gevolg van de genetische onmateerbaarheid van C. trachomatis. In tegenstelling tot E. colizijn veel klassieke kloontechnieken niet van toepassing op Chlamydia. Een paar grote beperkingen omvatten transformatie-efficiëntie, gebrek aan tegenselectie verslaggevers zoals SACB, en plasmid onderhoud. Terwijl E. coli plasmiden over het algemeen voor onbepaalde tijd kunnen worden gehandhaafd met een oorsprong van replicatie en passende selectieve druk, vereist C. trachomatis plasmids nog eens acht open leesframes(pgp1-8) voor onderhoud dat op de inheemse pL2 plasmid binnen de L2 serovar4wordt aangetroffen.

In de afgelopen jaren zijn er meerdere genetische instrumenten gegenereerd die geschikt zijn voor chlamydia's unieke biologie, maar er zijn nog steeds beperkingen5,6,7. Chemische mutagenese door ethylmethaansulfonaat (EMS) behandeling kan brengen verkeerde mutaties, of (minder vaak) kan resulteren in nucleotide overgangen de invoering van een voortijdige stop codon om een onzin mutatie opleveren8. Transposon inbrengen is efficiënt voor genverstoring, maar de huidige technologie in Chlamydia onderzoek is moeizaam en tijdrovend9. Zowel EMS-behandeling als transposon mutagenesetechnieken genereren willekeurige mutaties en vereisen rigoureuze screeningsmethoden om gemuteerde stammen te isoleren. Een methode om genen te verstoren door het inbrengen van groep II-intronen (bijvoorbeeld TargeTron) maakt gerichte mutagenese mogelijk; deze methode wordt echter beperkt door efficiëntie en de invoegplaats wordt niet altijd goed voorspeld10.

Fluorescentie-gerapporteerde allelic exchange mutagenesis (FRAEM) is een strategie die wordt gebruikt voor gerichte genverwijdering in combinatie met het inbrengen van een selectiecassette die antibioticaresistentie en een fluorescentiereporter11biedt. Toch wordt FRAEM gecompliceerd door het potentieel van door cassettegeïnduceerde polaire effecten op downstream genen, vooral wanneer het zich richt op genen binnen polycistronic operonen. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM) is een nieuwe genetische benadering ontwikkeld om de cassette-geïnduceerde polaire effecten eerder waargenomen met de FRAEM selectie cassette12te verlichten . FLAEM maakt gebruik van Cre-loxP genoombewerking om de selectiecassette te verwijderen en de expressie van downstreamgenen te herstellen. De selectiecassette met antibioticaresistentie en groen fluorescerend eiwit (GFP) is opnieuw ontworpen met flankerende loxP-sites. Deze loxP-sites kunnen opnieuw combineren in aanwezigheid van Cre recombinase en resulteren in excisie van de cassette uit het genoom13. Deze strategie is aangetoond dat het verlichten van cassette geïnduceerde polaire effecten bij het richten tmeA voor schrapping12,14.

Zowel FRAEM en FLAEM methoden maken gebruik van dezelfde zelfmoord vector, pSUmC 4.0, die voorwaardelijk kan worden gehandhaafd door middel van onuitleidbare expressie van pgp6. Uiting van pgp6 is eerder aangetoond dat het noodzakelijk is voor plasmidretentie en wordt daarom ingezet om plasmid onderhoud te controleren11,15. Wanneer C. trachomatis wordt geteeld in de media aangevuld met anhydrous tetracycline (aTc) om pgp6 expressie te induceren, wordt de vector gehandhaafd. Bij afwezigheid van aTc gaat de vector verloren. Gerichte genverwijdering wordt bereikt door allelic uitwisseling van het gen voor de selectiecassette. De 3 kb-regio's direct stroomopwaarts en stroomafwaarts van het beoogde gen dienen als homologiearmen voor recombinatie. Deze armen worden gekloond in de pSUmC 4.0 vector flankeren de selectie cassette. Succesvolle C. trachomatis transformatie en recombinatie gebeurtenissen worden waargenomen door middel van fluorescentie rapportage. Expressie van mCherry op de vector backbone en gfp binnen de selectie cassette opbrengst rode en groene fluorescerende insluitsels. Zodra aTc uit kweekmedia is verwijderd, wijzen green-only insluitsels op succesvolle recombinatiegebeurtenissen met het verlies van de zelfmoordvector en de integratie van de selectiecassette in het bacteriële genoom.

FLAEM vertegenwoordigt een uitbreiding van FRAEM via de daaropvolgende transformatie van een Cre recombinase-uitdrukkende vector, pSU-Cre, in de nieuw gecreëerde mutantenstam. Cre recombinase vergemakkelijkt de combinatie tussen loxP-sites en excisie van de selectiecassette. Recombinatie gebeurtenissen worden aangegeven via fluorescentie rapportage. De pSU-Cre vector codeert mCherry; succesvolle transformatie wordt dus aangegeven door toevoeging van rode fluorescentie aan gfp-uitdrukkendeinsluitsels. De teelt bij afwezigheid van selectieve druk voor de cassette resulteert in cre-gemedieerde recombinatie op de loxP-locaties, en het verlies van de cassette wordt aangegeven door rood-only insluitsels. Net als bij pSUmC-4.0 wordt onuitleidbare expressie van pgp6 gebruikt om pSU-Cre voorwaardelijk te onderhouden. Zodra aTc en antibiotica selectie zijn verwijderd, de plasmid is genezen, en de resulterende markerless deletie stam is niet fluorescerend. Deze methode pakt het probleem van cassette-geïnduceerde polaire effecten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ontwerp en montage van pSUmC-4.0 met homologie armen specifiek voor het gen van belang

  1. Identificeer ~3 kb-regio's direct stroomopwaarts en stroomafwaarts van het gen dat is gericht op verwijdering om te dienen als de homologiearmen van 5 ' en 3 voor homologe recombinatie (figuur 1).
  2. Ontwerp PCR primers tot 1) versterken de 3 kb 5 'homologie arm van chlamydia genomische DNA en 2) bevatten een 15-30 bp overhang specifiek voor pSUmC-4.0 wanneer verteerd op de Sall beperking enzym site. Zorg ervoor dat de primergebieden die overlappen met pSUmC-4.0 smelttemperaturen van 55 °C hebben en dat de smelttemperatuur voor de gehele primer <35 °C is.
  3. Ontwerp PCR primers tot 1) versterken de 3 kb 3 'homologie arm van chlamydia genomische DNA en 2) bevatten een 15-30 bp overhang specifiek voor pSUmC-4.0 wanneer verteerd op de SbfI beperking enzym site. Zorg ervoor dat de primergebieden die overlappen met pSUmC-4.0 smelttemperaturen van 55 °C hebben en dat de smelttemperatuur voor de gehele primer <35 °C is.
  4. Ontwerp PCR screening primers die het inbrengen van elke homologie arm in de pSUmC-4.0 vector zal versterken na een DNA-assemblage reactie16. Ontwerp deze primers naar anneal ~ 500 bp buiten de beperking sites om eenvoudige visualisatie van een PCR-product mogelijk te maken, zelfs als de invoeging niet succesvol was(figuur 1).
  5. Versterk de 3 kb 5' en 3' homologie armen uit vers geëxtraheerd chlamydia genomic DNA door PCR in een tot twee reacties om genoeg fragment voor latere DNA-assemblage opleveren. Volg het protocol van de fabrikant van DNA voor specifieke reactieopstelling en fietsomstandigheden.
  6. Controleer of beide PCR-producten de juiste grootte hebben en of de reacties geen vervuilende banden bevatten. Voer 5 μL van elke PCR-reactie uit op een 1% DNA-agarosegel.
  7. Zuiver en concentreer de PCR-fragmenten door fenol/chloroformextractie en ethanolneerslag.
    1. Bundel alle 3' PCR reacties samen in een 1,5 mL buis en breng tot een laatste volume van 200 μL met nuclease-vrije H2O. Herhaal dit proces voor de 5' PCR reacties.
    2. Voeg 200 μL fenol toe aan elke buis en vortex gedurende 30-60 s. Draai elke buis in een microcentrifuge op >21.000 x g voor 20 min bij kamertemperatuur (RT).
    3. Breng de waterige fase toplaag van elke buis in een nieuwe 1,5 mL buis, voeg een tiende van het volume van 3 M natriumacetaat aan elke buis, dan flick om te mengen.
    4. Voeg 3 volumes van 100% ethanol toe aan elke buis en flick om te mengen. Incubeer beide buizen bij -80 °C gedurende 20 min.
    5. Pellet het DNA door het draaien van elke buis op >21,000 x g voor 5 min bij RT. Gooi de supernatant.
    6. Was de DNA-pellet met 100 μL 70% ethanol. Draai elke buis op >21.000 x g voor 5 min bij RT. Gooi de supernatant weg.
    7. Was de DNA-pellet opnieuw met 100 μL 100% ethanol. Draai elke buis op >21.000 voor 5 min bij RT. Gooi de supernatant weg.
    8. Laat de pellet volledig luchtdrogen en zet het DNA voorzichtig op in 12 μL nuclease-vrije H2O door te vegen om te mengen.
  8. Digest 500 ng pSUmC-4.0 vector in een 20 μL reactie met 1 eenheid Sall en 1 eenheid SbfI volgens het protocol van de vervaardiging. Incubeer de reactie ongeveer 3 uur of 's nachts om volledige vertering van de vector te garanderen.
  9. Zuiver en concentreer de verteerde ruggengraat door fenol/chloroformextractie en ethanolneerslag zoals eerder beschreven (stap 1.7.1–1.7.9).
  10. Combineer de verteerde pSUmC-4.0 vector en zowel de 5' en 3' homologie arm PCR producten samen bij een verhouding van 0,01 pmol pSUmC-4.0 tot 0,09 pmol elke homologie arm. Monteer de fragmenten in een DNA-assemblagereactie volgens het protocol van de fabrikant.
  11. Transformeer 50 μL elektrocompetente E. coli met 1 μL van de DNA-assemblagereactie. Plaats de getransformeerde E. coli op LB agar platen met 100 μg/mL spectinomycine door 150 μL per plaat te verspreiden. Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C.
  12. De volgende dag, scherm kolonies voor groene en rode fluorescentie met behulp van een epifluorescentie omgekeerde microscoop. In totaal worden 5-30 kolonies per agarplaat verwacht.
  13. Pluk 5-10 kolonies om 4 mL LB bouillon in te enten aangevuld met 100 μg/mL spectinomycine. Incubeer culturen bij 37 °C 's nachts met schudden bij 250 rpm.
  14. Met behulp van de nachtelijke E. coli culturen, het uitvoeren van kleinschalige DNA-zuivering. Elute het DNA met 50 μL nuclease-vrije H2O.
  15. Bevestig het inbrengen van elke homologiearm in de pSUmC-4.0-vector met behulp van de PCR-screeningprimers (ontworpen in stap 1.4) om elke invoeging te versterken. Als DNA-assemblage succesvol is, moet een ~ 4 kb PCR product worden waargenomen in een 1% DNA agarose gel voor zowel de 5 'en 3 ' arm regio's. Een ~ 1 kb PCR product geeft een gebrek aan invoeging.
    OPMERKING: Als het inbrengen van de homologie armen niet succesvol is in een dubbele fragment montage reactie, voeren twee montage reacties om de 5 'arm dan 3 'arm, individueel. Vermeer de vector met alleen Sall voordat u met de 5'-arm wordt gemonteerd en verteer de vector met SbfI om de arm van 3 te monteren.
  16. Transformatie dam-/dcm- competente E. coli met 200 ng pSUmc-4.0 geassembleerd met beide homologie armen. Plaats de getransformeerde bacteriën op LB agarplaten met 100 μg/mL spectinomycine door 25 μL per plaat te verspreiden. Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C. In totaal worden 20-200 kolonies verwacht.
  17. Screen de platen voor rode en groene fluorescerende kolonies zoals beschreven in stap 1.13.
  18. Zet een cultuur op voor een grootschalige DNA-zuivering door 100 mL LB-bouillon met 100 μg/mL spectinomycine met rode en groene kolonies in te enten. Incubeer de cultuur bij 37 °C 's nachts met schudden bij 250 rpm.
  19. Oogst de cultuur en zuiver het DNA met behulp van een grootschalige DNA-zuivering.
    1. Resuspend the purified plasmid DNA in 100 μL of NF-H2O. Een totale DNA-opbrengst van ten minste 2 μg/μL is ideaal voor C. trachomatis transformatie.
    2. Volg de 5' en 3' homologie arm regio's om een juiste montage in pSUmC-4.0 te garanderen alvorens C. trachomatiste transformeren .

2. Transformatie van C. trachomatis met pSUmC 4.0 + Homologie Armen voor Genverwijdering door Allelic Exchange

  1. Zaad McCoy cellen, muis fibroblasten standaard gebruikt voor het cultiveren van Chlamydia, in twee 6 put platen (1 x 106 cellen / goed) met groei media #1. Incubeer de platen bij 37 °C met 5% CO2 totdat de monolayer confluent is (ongeveer 24 uur).
  2. Voeg in een buis van 1,5 mL een volume c. trachomatis WT serovar L2 elementaire lichamen (EB's) toe die voldoende zijn om 12 putten van een 6-put plaat te infecteren op een MOI van 2. Pellet de EBs op >20.000 x g voor 30 min, gooi dan de supernatant.
  3. Start chlamydiatransformatie door de EB's voorzichtig op te schorten in 600 μL CaCl2-buffer en voeg vervolgens 24 μg pSUmC-4.0 + homologiearmen toe aan de buis. Meng de oplossing voorzichtig door te vegen. Incubeer de buis op RTfor 30 min en flick om elke 10 min te mengen.
  4. Voeg de transformatieoplossing toe aan 24 mL van Hanks' uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en meng door zachtjes te besmeifen. Breng 2 mL van het inoculum over op elke put van confluent McCoy-cellen in de 6 putplaten en infecteer door centrifugering bij 900 x g gedurende 1 uur bij 20 °C.
  5. Verwijder het inoculum en vervang door 2 mL/well RPMI groeimedia #2. Bebroed de platen bij 37 °C met 5% CO2.
  6. Na minimaal 7 uur, maar niet meer dan 12 uur, vervang de media door 2 mL/well van de selectiemedia #1. Zet de incubatie voort bij 37 °C gedurende 48 uur vanaf het moment van infectie.
  7. Oogst en doorleg de bacteriën op een verse monolaag van McCoy cellen.
    1. Met behulp van een celschraper, voorzichtig schraap de McCoy monolayer om de cellen te tillen in de media. Breng het materiaal van elke put in een 2 mL buis. Pellet het celmateriaal op >20.000 x g in een microcentrifuge gedurende 30 min bij 4 °C.
    2. Verwijder en gooi de supernatant weg. Brep de celpellet opnieuw in 1 mL HBSS door zachtjes te besmepelen.
    3. Pellet het celpuin op 200 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Breng de supernatant over op een frisse put van confluent McCoy cellen. Voeg een extra 1 mL HBSS aan elk goed voor een totaal volume van 2 mL/well.
    4. Infecteer door centrifugeren bij 900 x g gedurende 1 uur bij 20 °C. Vervang het intmateriaal door selectiemedia #1 onmiddellijk na infectie.
  8. Doorgaan met het doorgeven van de bacteriën op een verse monolayer van McCoy cellen (sectie 2.7) om de 48 uur voor drie of meer passages totdat rode en groene insluitsels worden gedetecteerd met behulp van een epifluorescentie omgekeerde microscoop 24 uur post-infectie (24 hpi).
  9. Zodra rode en groene insluitsels worden gedetecteerd, blijven doorgeven van de monolayer (sectie 2.7) met behulp van selectiemedia #2.
  10. Doorgaan met het doorgeven van de monolayer totdat groen-only insluitsels worden gedetecteerd 24 hpi (passage #3 of hoger), wat het verlies van de pSUmC-4.0 vector en de integratie van de loxP selectie cassette in het genoom aangeeft.
  11. Kies een goed van groen-only insluitsels te verrijken door middel van passaging. Oogst en vries alle andere putten die ook groen-only insluitsels bevatten in sucrose-fosfaat-glutamaat buffer (SPG).
    1. Om groen-only insluitsels te verrijken, passage de monolayer uit een put van een 6 goed plaat zoals gedaan in stap 2.7, maar na pelleting de cel puin (stap 2.7.3), breng de supernatant in een conische met 12 mL hbss. Gebruik dit enoculum om twee 6 putplaten te infecteren door 2 mL per put toe te voegen en draai de platen vervolgens op 900 x g gedurende 60 min bij 20 °C.
    2. Om extra putten te bevriezen, oogst de monolayer als in stap 2.7.1, maar breg de pellets opnieuw op in 1 mL SPG in plaats van HBSS. Pellet de cel puin (stap 2.7.3) en breng de supernatant in een 1,5 mL cryotube. Bevries het materiaal op -80 °C.
  12. Na het verrijken van groen-only insluitsels aan een MOI van 0,5-1.0 (nog een tot twee passages na detectie), oogst de monolagen in SPG zoals beschreven in stap 2.11.2. Verkrijg aliquots van 50 μL in 1,5 mL buizen en vries op -80 °C.
  13. Titer groen-only bacteriën om opname te bepalen, vormen eenheden / μL, volgens een standaard titratie protocol17.

3. Clonal Isolation of Green-only C. trachomatis Deletion Mutant Containing the loxP Geflankeerd Selection Cassette by Limiting Dilution 3. Clonal Isolation of Green-only C. trachomatis Deletion Mutant Containing the loxP Geflankeerd Selection Cassette by Limiting Dilution 3. Clonal Isolation of Green-only C. trachomatis Deletion Mutant Containing the loxP Geflankeerd Selection Cassette by Limiting Dilution 3. Clonal

  1. Zaai een 384 put weefsel kweekplaat met 50 μL McCoy cellen op ~ 2.000 cellen / goed in groeimedia #1. Incubeer bij 37 °C met 5 % CO2 voor ~24 uur of tot confluent.
  2. Verdun een aliquot van groen-only bacteriën in HBSS te bereiken ~ 50 EBs per 20 mL. Breng het verdunde intmateriaal over op een reservoirlade.
    1. Verwijder de media van de 384 putplaat door de hele plaat ondersteboven in een afvalcontainer te vegen. Voeg met behulp van een meerkanaals pipet 50 μL C. trachomatis inoculum toe aan elke put. Infecteer door centrifugeren bij 900 x g gedurende 1 uur bij 20 °C.
      LET OP: Houd er rekening mee dat u niet zo hard veegt dat de monolayer loskomt. Als cellen over-confluent zijn, zullen ze gemakkelijker loskomen.
  3. Verwijder het inoculum door te vegen en te vervangen door 50 μL/well growth media #2. Incubeer platen bij 37 °C met 5% CO2.
    OPMERKING: In dit stadium is de integratie van de selectiecassette in het genoom stabiel, dus antibioticaselectie met spectinomycine is niet langer nodig.
  4. Na het uitbroeden van de plaat voor 5-12 dagen, identificeren individuele putten met groene fluorescerende insluitsels met behulp van een epifluorescentie omgekeerde microscoop of een hoog gehalte screening platform.
  5. Oogst putten met groen-only insluitsels door de monolayer te schrapen met een p-10 tip en de volledige inhoud van de put over te brengen in een buis met 2 mL HBSS. Meng en breng de 2 mL inoculum voorzichtig aan op een verse confluentMcCoy monolayer in een 6-putplaat voor infectie.
    OPMERKING: Bij het identificeren van individuele putten met insluitsels, zullen de insluitsels in een cluster te wijten aan uitbreiding van de eerste opname. Als een put meerdere clusters heeft, is het waarschijnlijk dat meer dan één EB in eerste instantie die put heeft geïnfecteerd. Deze putten mogen niet worden geoogst, en in sommige gevallen kunnen meerdere rondes van klonale isolatie door seriële verdunning noodzakelijk zijn.
  6. Infecteer de 6 putplaat door centrifugeren bij 900 x g gedurende 1 uur bij 20 °C. Vervang het inoculum door 2 mL/well growth media #2. Incubeer bij 37 °C met 5 % CO2 gedurende 48 uur.
  7. Herhaal de stappen 2.11–2.13 om de kloonpopulaties te verrijken, te bevriezen en te titeren.
  8. Bevestig de verwijdering van gerichte genen uit clonally geïsoleerde C. trachomatis met qPCR zoals eerder beschreven12.

4. Transformatie van C. trachomatis FRAEM Mutant met pSU-Cre om verwijdering van loxP geflankeerde selectiecassette te initiëren

  1. Herhaal het transformatieproces in een 6-bronplaat zoals eerder beschreven (stappen 2.1–2.8) met behulp van de clonally geïsoleerde C. trachomatis FRAEM mutant, pSU-Cre vector en selectiemedia #3.
    OPMERKING: Een succesvolle transformatie wordt aangegeven door insluitsels die rood en groen fluorescerend zijn.
    1. Passage van de monolayer tot rood-only insluitsels worden gedetecteerd met behulp van een epifluorescentie omgekeerde microscoop, die het verlies van de selectie cassette (twee tot drie passages) aangeeft. Doorgaan met het doorgeven van de monolayer totdat rood-only insluitsels zijn verrijkt met een MOI van ~ 0,5.
  2. Clonally isoleren van alleen rood-only insluitsels door verdunning te beperken in een 384-putplaat zoals eerder beschreven (stappen 3.1–3.8); gebruik echter selectiemedia #3 voor alle stappen.
  3. Verrijk de klonalpopulaties door te passeren tot een MOI van 0,1. Vervang sectiemedia eenmaal door groeimedia #2 om verlies van de pSU-Cre-vector (ongeveer drie tot vier passages) te initiëren.
  4. Clonally isoleren van niet-fluorescerende bacteriën (stappen 3.1–3.8); scan de plaat echter handmatig met een brightfield microscoop om insluitsels te detecteren. Verrijk en vries bacteriën (stap 2.11–2.12).
  5. Scherm voor de mutant stam met behulp van kwantitatieve real-time PCR, Western blotting, en hele genoom DNA Sequencing zoals eerder beschreven12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De methode voor markerless gendeletie in C. trachomatis met FLAEM is afhankelijk van zorgvuldige klonen en transformatietechnieken. Succesvolle allelic recombinatie is een essentiële eerste stap en vereist de identificatie en inbrengen van homologie armen in de pSUmC-4.0 klonen vector (Figuur 1). Een essentiële tweede stap voor markerless gendeletie is het verwijderen van de fluorescentiereporter en antibioticaselectiecassette door Cre-lox genoombewerking, vertegenwoordigd in figuur 2. De vectoren die worden gebruikt om elk van deze stappen te volbrengen, worden geannoteerd in figuur 3. Figuur 4 toont een schematische weergave van de transformatiestrategie om een markerless deletiemutant te genereren wanneer u begint met wildtype C. trachomatis.

Representatieve gegevens worden weergegeven in figuur 5 en figuur 6,waarin tmeA is gericht op genverwijdering. De C. trachomatis tmeA deletiestam wordt gegenereerd met Behulp van FRAEM, en de C. trachomatis tmeA-lx stam wordt gegenereerd met behulp van FLAEM. Beide gemuteerde stammen bevatten een schrapping van de tmeA locus; tmeA-lx bevat echter niet de selectiecassette, zoals blijkt uit de afwezigheid van gfp-DNA in figuur 5. De tmeA mutant stam heeft verminderde expressie van tmeB, weergegeven in figuur 6 door mRNA en eiwitniveaus. Wanneer FLAEM wordt gebruikt om de tmeA-lx mutant stam te genereren, figuur 6 laat zien dat de expressie van tmeB wordt hersteld.

Figure 1
Figuur 1: Schematische representatie voor het identificeren van 5' en 3' homologie armen uit genomische DNA en PCR screening voor hun inbrengen in pSUmC-4.0. (A) Een gen gericht op verwijdering uit het C. trachomatis genoom wordt vertegenwoordigd door de blauwe pijl. De 3 kb-gebieden die zijn geïdentificeerd als de homologiearmen van 5 en 3 voor allelic recombinatie zijn respectievelijk in paars en rood. (B,C) Het inbrengen van de 5' en 3' homologie armen in pSUmC-4.0 wordt bepaald door PCR screening. De Sall en Sbfl beperking enzym sites worden getoond flankerende de aadA (zwarte pijl) en gfp (groene pijl) selectie cassette die wordt geflankeerd door loxP sites (gele vierkanten) op de pSUmC-4.0 vector. (B) Geen invoeging wordt bepaald door een 1 kb PCR product wanneer 5 'screening primers (paarse pijlpunten) worden gebruikt om PCR versterken over de Sall site, of 3 'screening primers (rode pijlkoppen) worden gebruikt om te versterken over de SbfI site. (C) Succesvolle invoeging wordt bepaald door 3 kb PCR producten onder dezelfde omstandigheden. 5' en 3' homologie armen worden vertegenwoordigd door de paarse en rode beugels, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schematische weergave van Cre-lox bemiddelde recombinatie om de gfp-aadA selectiecassette te verwijderen. In aanwezigheid van Cre recombinase worden de loxP-sites (geel) opnieuw gecombineerd, wat resulteert in excisie van de gfp-aadA-selectiecassette (groene en zwarte vierkanten). De resulterende locus wordt weergegeven met een resterende loxP litteken sequentie. Upstream (VS) en downstream (DS) regio's worden grijs weergegeven. Dit cijfer is gewijzigd van Keb et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Genetische organisatie van pSUmC-4.0 en pSU-CRE. Voor controleerbaar onderhoud van de vectoren in C. trachomatis is pgp6 stroomafwaarts van een tetracycline-inducible promotor ontworpen. De resterende pgp-genen zijn stroomafwaarts van hun oorspronkelijke Chlamydial promotors, en mCherry wordt constitutief uitgedrukt op beide vectoren. (A) pSUmC-4.0 bevat een cassette codering constitutief uitgedrukt aadA en gfp genen voor antibiotica en fluorescentie selectie vermogen, respectievelijk. LoxP-sites voor Cre bemiddelde recombinatie en beperkingenzymsites voor het inbrengen van genspecifieke homologiearmen flankeren de selectiecassette. b) pSU-CRE een soortgelijke ruggengraat bevat als pSUmC-4.0; maar in plaats van de recombinatie cassette, blaM en cre worden constitutief uitgedrukt voor antibiotica selectiviteit en CRE recombinase generatie, respectievelijk. Deze cijfers zijn gewijzigd van Keb et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Schematische weergave van de FLAEM-transformatiestrategie die wordt gebruikt om een markerless deletiemutant te maken. De algemene FLAEM-methode wordt hier weergegeven waar Wild-type C. trachomatis achtereenvolgens wordt getransformeerd en seriële passage wordt gemaakt om een markerless deletiemutant te genereren. Transformatiestappen worden vertegenwoordigd door de toevoeging van kleine pijlen, en het verlies van genetische elementen wordt vertegenwoordigd door het aftrekken van kleine pijlen. C. trachomatis intermediates (cirkels) zijn vertegenwoordigd met antibioticagevoeligheden (penicilline-resistente of penicilline-gevoelige = PenGr of PenGs; spectinomycine-resistente of spectinomycine-gevoelig = Specr of Specs) en fluorescentie-rapportage kwaliteiten (groen = gfp +, rood = mCherry +, grijs = geen fluorescentie). Schematische voorstellingen van het gen locus bij elke stap worden hieronder weergegeven. Dit cijfer is gewijzigd van Keb et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: FRAEM en FLAEM worden gebruikt om tmeA-gendeleties te genereren. (A) FRAEM werd gebruikt om tmeAte genereren, en FLAEM werd gebruikt om tmeA-lx te genereren. Relatieve DNA-kopienummers van tmeA en downstream tmeB; gfp op de pSUmC-4.0-selectiecassette; en cre op pSU-CRE vector worden allemaal getoond. McCoy cellen besmet met gelijke inclusie vormen eenheden van WT, L2 tmeA, of L2RiftmeA-lx C. trachomatis werden geoogst op 24 hpi, en DNA werd gewonnen voor qPCR. Relatieve kopie nummers werden beoordeeld door signaal normalisatie naar chlamydial 16sRNA. ND = geen gedetecteerd. (B) De gesequencede tmeAB locus van L2RiftmeA-lx wordt weergegeven met een enkele resterende loxP litteken sequentie (onderstreept). De flankerende gebieden van DNA worden in het blauw weergegeven, de startcodons worden in het groen weergegeven en de TmeA stop codon wordt in het rood weergegeven. De niet-canonieke start codon voor TmeB is ook afgebeeld. Deze cijfers zijn gewijzigd van Keb et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Excisie van de selectiecassette met FLAEM herstelt de expressie van tmeB bij het richten op tmeA en verstoort geen downstreamgenen. (A) Relatief mRNA-gehalte van C. trachomatis tmeA en tmeB mutantstammen. De aanwezigheid van transcripties stroomafwaarts van tmeA werd bepaald door reverse transcriptase (RT) kwantitatieve PCR. De regio direct stroomafwaarts van de tmeA/B operon codeert ct696. Total RNA werd geïsoleerd op 24 pk uit McCoy cellen besmet op een MOI van 1 met WT, L2 tmeA, L2 tmeB, of L2RiftmeA-lx. Transcripties voor tmeA, tmeBen ct696 werden gedetecteerd door qRT-PCR. Signalen worden gepresenteerd na normalisatie naar rpoD. ND = geen gedetecteerd. (B) Westerse vlek voor de aanwezigheid van TmeA en TmeB in C. trachomatis mutant stammen. Gelijke hoeveelheden materiaal uit de hele cultuur uit 24 pkculturen besmet met gelijke inclusie vormeneenheden van WT, L2 tmeA, L2RiftmeA-lx, of L2RiftmeA-lx ptmeA werden onderzocht in immunoblots voor TmeA en TmeB. Hsp60 werd gebruikt als een ladingscontrole, en eiwitten werden gevisualiseerd door chemiluminescentie. Figuur is gewijzigd van Keb et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het hier beschreven protocol voor de generatie markerless gendeleties in C. trachomatis door FLAEM maakt gerichte verwijdering van niet-essentiële genen mogelijk en elimineert door cassette-geïnduceerde polaire effecten. Het protocol is gebaseerd op een zorgvuldig ontwerp van 5' en 3' homologie armen ingevoegd in de pSUmC 4.0 zelfmoord vector, efficiënte transformatie van C. trachomatis, en zorgvuldige screening van geïsoleerde mutant stammen. Succesvolle genoomengineering via deze methode resulteert in bacteriën die niet fluorescerend zijn en een enkele loxP-littekensequentie bevatten op de plaats van gerichte genverwijdering. Bovendien heeft deze methode het potentieel om te worden aangepast voor sequentiële targeting van genen binnen dezelfde C. trachomatisstam.

Zorgvuldig ontwerp van de 5' en 3' homologie armen en inbrengen in de zelfmoord vector is de eerste en meest kritische stap van het klonen proces. Het is gebleken dat 3 kb homologie armen bieden de meest efficiënte allelic recombinatie. Terwijl het inbrengen van deze armen genereert een vector die groot is en soms moeilijk om mee te werken, is er minder succes met kortere armen, met ~ 2 kb die een minimum voor succes. Gebruik van de Sall en Sbfl beperking sites biedt een handige one-step constructie reactie bij het uitvoeren van DNA-assemblage.

Andere kloonmethoden, zoals het inbrengen van PCR, zijn ook effectief geweest in het invoegen van homologiearmen, maar ze introduceren een grotere kans op pcr-gebaseerde fouten. Interessant is dat is geconstateerd dat het klonen van de 5 'arm is relatief efficiënter dan de 3 'arm. Als zich een probleem voordoen, wordt aanbevolen om de DNA-assemblage in twee reacties te verdelen en de vector stapsgewijs te construeren. Vervolgens wordt geadviseerd om de vectorruggengraat met SbfI te verteren, eerst de arm van 3 in te voegen, vervolgens de vector met Sall te verteren en de 5' arm in een tweede DNA-assemblagereactie te plaatsen.

Bij het versterken van PCR-fragmenten voor de homologiearmen wordt het ook aanbevolen om vers gezuiverd C. trachomatis genomic DNA te gebruiken dat nog niet eerder bevroren was. Dit beperkt de mogelijkheid van DNA-afschuining en verhoogt de efficiëntie voor het genereren van grotere amplicons. Als het versterken van homologie armen van een andere vector, de gezuiverde PCR product zal moeten worden DpnI beperking enzym behandeld alvorens over te gaan tot DNA-assemblage om achtergrondkolonies te verminderen tijdens E. coli transformatie.

Transformatie is een andere cruciale stap van dit protocol waarin problemen zich kunnen voordoen. Als de transformatie met pSUmC 4.0 succesvol is, moeten groene en rode insluitsels zichtbaar zijn door #3; het kan echter nog enkele passages duren voordat transformatoren worden verrijkt. Net als andere mutagenese benaderingen, deze methode is beperkt tot targeting van niet-essentiële genen, maar transformatie moet nog steeds gemakkelijk worden bereikt. Langdurige passaging van transformatoren bij afwezigheid van allelic uitwisseling, aangegeven door het behoud van rode fluorescentie, kan erop wijzen dat het verwijderen van het beoogde gen een dodelijke gebeurtenis is.

Omdat transformatievectoren voor C. trachomatis dezelfde oorsprong van replicatie bevatten als de oorspronkelijke pL2, is het niet ongewoon dat de inheemse plasmid na meerdere (>5) passages wordt genezen. De pgp-genen op de pSUmC-vectoren zijn in een andere volgorde dan de eigen pL2; daarom kan PCR worden gebruikt om de aanwezigheid van pL2 in een geïsoleerde stam te detecteren door het gebied pgp7pgp8– te versterken. Als de inheemse plasmid verloren gaat in de uiteindelijke verwijdering mutant, zal het opnieuw moeten worden geïntroduceerd voordat het uitvoeren van ontwikkelingsstudies. Laterale genoverdracht (LGT) kan worden gebruikt om de pL2 plasmid19opnieuw in te voeren.

In veel gevallen bevatten vroege verwijderingmutanten met de selectiecassette nog steeds de pL2 plasmid. We hebben gebruik gemaakt van deze stammen voor LGT met succes om pL2 opnieuw te introduceren en te voorkomen dat reparatie van de verwijderde gen. LGT kan ook worden gebruikt als een secundaire methode voor transformatie bij de invoering van pSU-Cre. In sommige gevallen was LGT efficiënter dan de klassieke CaCl 2-transformatie. In gevallen waarin LGT wordt gebruikt om pSU-Cre te introduceren, is het belangrijk om te beginnen met C. trachomatis die een rpoB-allel uitdrukken, dat rifampineresistentie verleent vóór allelic exchange en invoeging van de spectinomycine selectiecassette12,19. Te beginnen met rifampin resistente bacteriën maakt selectie na co-cultuur.

FLAEM maakt reverse-genetische benaderingen mogelijk met gerichte verwijdering van hele coderingssequenties, in vergelijking met andere genetische methoden die afhankelijk zijn van willekeurige mutagenese of het inbrengen van nucleotidesequenties om genverstoring te bereiken. FLAEM is in wezen een uitbreiding van FRAEM, omdat het verwijdering van de selectiecassette mogelijk maakt en eerder waargenomen cassette-geïnduceerde polaire effecten elimineert. Deze methode creëert ook de mogelijkheid om meerdere gendeleties in een enkele C. trachomatis stam te genereren.

Meerdere mutaties kunnen worden gegenereerd via twee verschillende mechanismen. In de eerste kan FLAEM worden gebruikt om een markerloze genmutatie te genereren en sequentieel worden gebruikt om een ander gen in dezelfde stam te richten. De eerste deletiemutant kan worden omgevormd met de pSUmC 4.0-vector die homologiearmen bevat die specifiek zijn voor secundair gen van belang. In dit geval moet het protocol op dezelfde manier worden herhaald als de eerste verwijdering en meerdere keren worden herhaald om genen achtereenvolgens te richten. In het tweede mechanisme kan de markerless deletie mutant geïsoleerd na FLAEM worden mede-geïnfecteerd met een verwijdering mutant die nog steeds een selectie cassette bevat. Via LGT wordt de tweede verwijdering verkregen en kan worden geselecteerd voor. Bij het gebruik van deze aanpak worden extra mutaties beperkt door het aantal unieke selectiecassettes dat nog in het genoom zit. Veelgebruikte antibiotica die worden gebruikt als selectieve druk tijdens de transformatie zijn beperkt voor C. trachomatis, maar ze omvatten penicilline, chlooramphenicol en spectinomycine. Het verwijderen van de selectiecassette door Cre-loxP genoombewerking vermindert de noodzaak om meerdere antibiotica te gebruiken voor selectieve druk. Het verwijderen van meerdere gensequenties tegelijkertijd is nuttig bij het bestuderen van eiwitten met verwante functies of biologische processen die meerdere belangrijke spelers kunnen hebben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de GGD van het National Institute of Health, NIAID (subsidies A1065530 en Al124649), aan K.A. Fields.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose KSE Scientific BMK-A1705 Molecular Biology Grade
Anhydrotetracycline hydrochloride ACROS Organics 233131000
CaCl2 Buffer 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate
Calcium Chloride Dihydrate Sigma C7902-500G Suitable for cell culture
Cycloheximide Sigma 7698-1G
dam-/dcm- Competent E. coli New England BioLabs C2925H
DMSO ATCC 4-X Sterile filtered cell culture tested
Glutamic acid Sigma G8415-100G L-Glutamic acid
Growth Media #1 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).
Growth Media #2 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) Gibco 24020-117
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) Gibco A38402-02
McCoy Cells ATCC CRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep Kit New England BioLabs T1010S Small scale DNA purification
NaH2PO4 Sigma S3139-250G Sodium phosphate monobasic
Na2HPO4 Sigma S5136-500G Sodium phosphate dibasic
NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells New England BioLabs C3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit New England BioLabs E5520S Gibson Assembly Kit
Penicillin G sodium salt Sigma P3032-10MU Bioreagent suitable for cell culture
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162 Large scale DNA purification
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0515 Fragment PCR Polymerase
RPMI 1640 Medium (1x) Gibco 11875-093 Containing 2mM L-glutamine
Sall-HF New England BioLabs R3138S
Sbfl-HF New England BioLabs R3642S
Selection Media #1 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO
Selection Media #2 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin
Selection Media #3 RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin
Sodium Acetate Buffer Solution Sigma S7899-100ML 3M
SOC Outgrowth Medium New England BioLabs B9020SVIAL
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade Alfa Aesar J61820
Sucrose Sigma S1888-1KG Bioreagent suitable for cell culture
Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water
Tris AMRESCO 0497-5KG Ultrapure grade
Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056 0.25%
Water Sigma W3500-500ML Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
  2. Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
  3. Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
  4. Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239 (2009).
  5. Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
  6. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
  7. Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20, (7-8), 445-450 (2018).
  8. Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
  9. LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10, (4), 01343 (2019).
  10. Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989 (2013).
  11. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817 (2016).
  12. Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).
  13. Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
  14. McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85, (12), 00640 (2017).
  15. Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81, (3), 636-644 (2013).
  16. Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
  17. Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, (11), 4877-4881 (1995).
  18. Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142 (2013).
  19. Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics