マウスの腹骨テグメンタル領域内の光遺伝学を用いた2つの異なるリアルタイムプレイス優先パラダイム

Behavior
 

Summary

ここでは、マウスの光遺伝学を用いた場所優先パラダイムに関する2つの簡単なステップバイステッププロトコルを紹介します。これら 2 つの異なる設定を使用して、好みと回避の動作は、高い空間的および時間的選択性を持つ同一装置内で、簡単な方法で確実に評価できます。

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Bimpisidis, Z., König, N., Wallén-Mackenzie, Å. Two Different Real-Time Place Preference Paradigms Using Optogenetics within the Ventral Tegmental Area of the Mouse. J. Vis. Exp. (156), e60867, doi:10.3791/60867 (2020).

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Abstract

神経細胞活性化が特定の行動出力につながる方法を理解することは、現代の神経科学にとって基本です。げっ歯類の光遺伝学と検証済みのパラダイムでの行動試験を組み合わせることで、高い空間的および時間的選択性を有する、異なるニューロンの刺激に対する行動の結果をリアルタイムで測定することができ、したがって神経細胞の活性化と行動の因果関係。ここでは、リアルタイムの場所優先(RT-PP)パラダイム、古典的な条件付き場所優先(CPP)テストの修正版のためのステップバイステップのプロトコルについて説明します。RT-PPは、3区画装置で行われ、特定のニューロン集団の光遺伝学的刺激が報い、または回避的である場合に答えるために利用することができる。また、RT-PPプロトコルの代替バージョン、いわゆるニュートラルコンパートメント優先(NCP)プロトコルについても説明し、回避を確認するために使用することができます。2つのアプローチは、行動薬理学に由来する古典的方法論の拡張と神経科学分野における光遺伝学の最近の実施に基づいている。リアルタイムでの場所の好みの測定とは別に、これらの設定は、条件付きの動作に関する情報を提供することもできます。私たちは、独自のデータの例と一緒に簡単にステップバイステップのプロトコルを提供し、これらのタイプの実験を適用する際に考慮すべき重要な側面を議論します。

Introduction

光を使って神経活動を制御する現代の神経科学実験ツールである光遺伝学の実装は、近年、特定のニューロン集団が行動に与える影響を理解する上で大きな進歩を遂げている光遺伝学の顕著な空間的および時間的選択性は、興味のある細胞群の興奮または阻害と行動出力2、3との因果関係の確立を可能にする。光遺伝学における空間的選択性は、Cre recombinaseの活性が、いわゆる凝集対立する対立遺伝子(ロックス部位に隣接する)4と呼ばれる、ロクス部位間に存在する任意のDNA配列の組換えにつながるCre-Loxシステムを通じて一般的に保証される。光遺伝学におけるCre-Loxシステムの使用の目標は、周囲のニューロンに発現を欠くまま、関心のある特定のニューロンにおける光遺伝学的オプシンをコードする対立遺伝子の発現を達成することです。オプシンは、特定の波長の光刺激時に、神経興奮性に影響を与えるイオンの流れを可能にする光感受性タンパク質であり、下流のエフェクター経路を調節することによって細胞機能に影響を与えます。作用が異なるオプシン(興奮性、阻害性、変調性)の新しい変異体は、特定の実験アプローチのニーズを満たすために、光波長および運動特性5による活性化が継続的に開発されている。興奮性に関しては、脱分極または過偏光オプシンを使用すると、脳内に送達される特定の波長での光刺激に対するニューロンの活動(それぞれ励起または阻害)を決定する3。

選択的プロモーター活性は、Creリコンビナーゼの発現を目的のニューロンに向ける。対象のオプシンの凝集アレルを実施することにより、Cre媒介型の組換えにより、クレ・リコンビナーゼ3,6を共発現するニューロンでオプシンが選択的に発現することを保証する。この二重トランスジェニックを使用して空間選択性を直接使用することは、光遺伝学において非常に効率的であることが証明されています。従って、オプシンを活性化する光刺激は、光源(LEDまたはレーザー)3に接続された脳内移植光ファイバを介して広く送達される一方で、Cre recombinaseと凝集オプシンアレルの両方を発現するニューロンのみがこの刺激に応答するであろう。げっ歯類のCre-Loxシステムは、トランスジェニック(Cre recombinaseとfloxedオプシン構築物の両方がトランスジェニック動物にコードされている)のみを使用して異なる方法で達成することができ、ウイルス注射(Cre recombinaseとfloxedオプシンのDNA構築物は両方ともウイルスキャリアを介して送達される)、または2つの組み合わせ(例えば、2つの組み合わせ)を使用することによって達成することができる。 Cre recombinaseは、凝集オプシン構築物を運ぶウイルスを注射されたトランスジェニック動物によってコードされる)5.凝集オプシンDNA構築物は、通常、組織切片におけるCre媒介的再結合の可視化を可能にするためにレポーター遺伝子とフレームでクローニングされる。光遺伝学はラットでも行うことができるが、提示されたプロトコルはマウスに対して生成されている。簡単にするために、Creリコンビナーゼとフロキシドオプシンの両方を運ぶマウスを「光遺伝学マウス」と呼ぶ。以下に記載するプロトコルでは、光遺伝学マウスは、混合トランスジェニック(2つの異なるプロモーターの制御下にあるCre recombinase)およびウイルス(アデノ関連ウイルスAAVを使用して、凝集オプシンDNA構築物を送達する-我々の場合ChR2/H134R)アプローチによって生成された。トランスジェニックマウスラインの取得と維持は、方法論の重要な部分です。Cre-driverおよびfloxedオプシントランスジェニックマウスは、クレ・リコンビナーゼとフロックスオプシンを異なる形態でコードするDNA配列を運ぶウイルスの範囲と同様に、各目的のために製造されるか、または市販されている場合に購入することができる。

光遺伝学と行動検査は、特定の種類の行動における明確な脳領域、または離散ニューロン集団の役割を研究するための貴重なツールであることが証明されています。報酬関連行動の文脈では、光遺伝学は、行動薬理学および実験心理学の分野における以前の知見の検証を可能にし、また、特定のニューロンが行動にどのように影響するかを示す新しいレベルの時空間的に関連する解剖を可能にした。報酬関連の行動を評価するためにいくつかの研究で使用されている1つの方法は、条件付き場所の好み(CPP)として知られている古典的な方法の修正版である。古典的なCPPは、環境7、8の手がかりとパブロビアンの関連を誘導する能力を介して虐待の薬物のやりがいまたは回避的な特性を評価するために使用されている。パブロビアン用語では、薬は、それがそれぞれやりがいまたは回避的である場合、アプローチや撤退を引き出すことができるので、無条件の刺激です。様々な中立刺激を伴う薬物の連続的な組み合わせは、自身がいかなる応答も引き出さないということ、以前中立の提示の際に単にアプローチまたは離脱を招く可能性があるが、ペアリング後、いわゆる条件付き刺激9。CPP解析は通常、同じサイズの2つのコンパートメントを含む装置で実行されますが、各コンパートメントは床の質感、壁のパターン、照明(ニュートラル刺激)などの明確な特性によって定義されます。2つのコンパートメントは、廊下またはコンパートメント間の開口部によって接続されます。コンディショニング中、被験者は通常、小さなげっ歯類で、他の区画に制限されている間、2つの主要な区画および生理液の1つに制限されている間、薬物の受動注射を受ける。薬物のやりがいのある効果は、被験者が装置全体を自由に探索することが許される場合、薬物フリーセッションで評価される。以前に薬物対のコンパートメント(条件付き応答)に費やされた時間の量は、薬物のやりがいのある効果とその投与に関連するコンパートメントの手掛かりとの間に仲介されるパブロビアン学習メカニズムを反映すると考えられる(条件付き刺激)。動物が薬物対のコンパートメントでより多くの時間を費やす場合、薬物は行動にやりがいのある効果を有することを意味する条件付きの場所の好みを誘発した。一方、薬物が回避的であると認識された場合、動物は薬物対のコンパートメントを避け、生理前のコンパートメントに多くの時間を費やし、条件付きの場所回避(CPA)8、9、10、11を示す。

光遺伝学は「リアルタイム」での神経活動を制御するために実装することができるので、CPPセットアップと同様の、しかし異なる行動パラダイムの使用は、直接の神経活性化時の場所の好みの測定を可能にする。したがって、場所の嗜好の光遺伝学駆動分析は、しばしばリアルタイムの場所優先(RT-PP)分析パラダイムと呼ばれる。RT-PPパラダイムでは、Cre-Loxシステムを介した異なるニューロンの光遺伝学的刺激が古典的なCPPで行われる薬物の全身送達に取って代わるので、RT-PPパラダイムが光遺伝学的に誘導されたニューロン刺激が測定されるようにするやりがいまたは回避として認識されます。現在の記述は、マウスの光遺伝学に焦点を当てるが、同様のプロトコルを使用してラットをテストすることができる光遺伝学も。

古典的なCPPパラダイムのように一度に1つのコンパートメントにコンディショニングする代わりに、RT-PPパラダイムの光遺伝学マウスは、装置全体で自由に移動することができ、行動はセッション全体を通して記録される。コンパートメントの1つに入り、頭蓋内光刺激と組み合わされます。適切な光刺激パラメータの下で、興奮性オプシンを発現するニューロンがそれによって活性化される。光刺激がやりがいとして認識された場合、光遺伝学マウスは光対のコンパートメントに残り、光刺激が回避的であると認識された場合、マウスはコンパートメントを出て刺激を逃れます。このタイプの分析は、偶発的な学習を評価することを可能にする:被験者は、コンパートメントに入ることによって光刺激およびしたがって神経活性化を引き起こし、インストゥルメンタルタスク中のレバープレスと同様に、コンパートメントを出ることによって刺激を停止することができる。さらに、連想学習機構は、刺激がない状態で各区画で費やされた時間を測定する後続のセッションで評価することができる。このようにして、研究者は、関心のあるニューロンの刺激に対する即座にやりがいのある効果とそれに関連する連想記憶形成との間で解離することができる12.

現在の研究では、自由に動くマウスの光遺伝学駆動の場所優先行動に関する2つの段階的なセットアッププロトコルについて説明する。最初のプロトコルは、3区画の装置内でRT-PPを記述し、最近Rootと同僚13と他の著者12、14、15、16、17、18によって提示されたプロトコルに基づいて概説されています実験は、複数の日次セッションで構成される 2 つのフェーズから構成されます (図 1Aを参照)。各セッションは、異なる目的のために設計されており、コンパートメントとのカップリング刺激のパラメータは、それに応じて変更されます。最初のセッションである「Pretest」は、いずれかの区画に対する被験者の初期の好みを評価するために使用される。パッチコードに接続したまま、被験者は15分間の刺激がない状態で装置を自由に探索することが許される。1 つのコンパートメントの初期設定が 80% を超える場合、初期サイドバイアスが解析を歪める可能性があるため、マウスは分析から除外されます。"プリテスト" の後に、フェーズ 1が開始されます。最初の部分は、2つの連続して構成されています, 毎日, 30 分のセッションの"RT-PP".「フェーズ1」の間、光遺伝学マウスはパッチコードを介してレーザー源に接続され、それを自由に探索するためにアリーナに置かれる。マウスは、メインコンパートメントの1つに入ると頭蓋内レーザー刺激を受けます。パイロット実験を実行して、どのコンパートメントをレーザーペアとして割り当て、どのコンパートメントをペアリングしていないかを判断できます。刺激がやりがいがあると示された場合、レーザーは「プリテスト」の間に最も好ましくないコンパートメントに結合され、刺激が回避的であれば最も好ましい。したがって、提示されたRT-PPプロトコルは、レーザー刺激が2つの主要なコンパートメント(非バイアス設計)のいずれにもランダムに割り当てられていないという意味で偏った設計に従うが、マウスの初期の好みを避けるために選択される。2つのメインコンパートメントを接続する他のメインコンパートメントまたはニュートラルコンパートメントへの入口は、頭蓋内光刺激を生じさせないため、光対ではありません。これらのセッションは、特定の神経集団の刺激のやりがいまたは回避的な特性のリアルタイム評価を可能にする。「フェーズ1」の最終日に、刺激のない15分のセッションが行われます。このセッションは、刺激とそれが受け取られた環境との間の連想学習から生じる条件付き応答("CR")に対処するために役立ちます。「 フェーズ 1」 の少なくとも 3 日後に "逆転フェーズ" が行われ、これは "フェーズ 1" と同じ構造に従って行われますが、以前にペアになっていないメイン コンパートメントは光刺激と組み合わされます。「フェーズ1」の場合と同様に、2つの刺激セッションの後に「CR」セッションが続きます。"逆転相" は、マウスの挙動が光遺伝学的刺激に依存しており、ランダムパラメータとは関係ないことを確認するために使用されます。RT-PP実験の各セッションは、トラッキングソフトウェア内で個別にプログラムする必要があります。現在のプロトコルは特定のソフトウェア内でこのような設定を記述しますが、トランジスタ-トランジスタ-ロジック(TTL)変調信号を光源に送信できる他のトラッキングソフトウェアを使用することができます。

2 番目のプロトコルは、ニュートラル コンパートメント プリファレンス (NCP) パラダイムと呼ぶ新しい設定について説明します。RT-PPのこの変更されたプロトコルは狭く、透明な構成にマウスによって自然に避される接続の回廊の小さいサイズそして透明性を利用する。両方のメインコンパートメントを光刺激と組み合わせ、光刺激のない廊下を離れるだけで、NCPセットアップを使用して、光遺伝学的刺激が受け取りを避けるために廊下でより多くの時間を費やすことを強制するかどうかをテストすることができます光遺伝学的刺激。2つの光対コンパートメントで過ごした時間と廊下で過ごした時間を比較することによって、光遺伝学的に誘発された嫌悪感の検証を行うことができます。NCP実験は、光遺伝学マウスがリアルタイムで好みを測定するために刺激(それぞれ30分)を受ける2つの連続した毎日のセッションと、RT-PPのそれと同様に条件付き応答を評価するための1つのレーザーフリーセッション(15分)で構成されています。プロトコル。

以下に提供されるRT-PPおよびNCPプロトコルは、最近、腹側テグメンタル領域(VTA)に位置する異なるタイプのニューロンが報酬関連行動12の様々な側面にどのように関与しているかの研究において、我々の研究室で検証された。ここで、RT-PPおよびNCPプロトコルの実施を例示するために、ドーパミントランスポーター(DAT)-Cre19および小胞グルタミン酸トランスポーター2(VGLUT2)-Cre20トランスジェニックマウスを、VTA上に凝集チャネルロドプシン2(ChR2)DNA構築物を運ぶAAVを立体的に注入した。提供されたRT-PPおよびNCPプロトコルを用いてこれらのマウスの分析で得られた行動応答は、VTA内のドーパミン作動性およびグルタミン酸性ニューロンの活性化が異なる行動応答をもたらす方法を示している(図1)。

RT-PPおよびNCPパラダイムの段階的なプロトコルには、トランスジェニックマウスのジェノタイピング、立体性ウイルス注射、光ファイバーの配置、レーザー制御および行動のための追跡ソフトウェアのプログラミングに至るまでの情報が提供されます。評価。さらに、科学的成果に影響を与える可能性のある刺激パラメータおよび実験的側面の観点からプロトコルの改変に関する提案が議論される。プロトコルはVTAの文脈で記述されているが、関連するCre-driverおよびfloxedオプシンのような関連する光遺伝学ツールが利用可能である場合、それらは任意の脳領域または神経集団に適用することができる。

Protocol

この研究は、両性のヘテロ接合性DAT-Cre19およびVGLUT2-Cre20マウスを用いて行われ、年齢は>8週間、体重は>20gである。すべての実験は、スウェーデン(動物福祉法SFS 1998:56)と欧州連合法(条約ETS 123と指令2010/63/EU)に従って、地元の動物倫理委員会の許可を得て行われました。

1. マウスのジェノタイピング

  1. トランスジェニックマウスのジェノタイピングに使用する耳パンチャーを使用して耳の生検を取る。
  2. 耳のパンチを準備し、専用プライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)反応を行います。
    注: このプロトコルでは、Cre 指向プライマーが使用されました。
    1. 耳のパンチを含む各1.5 mLチューブに75μLのリシスバッファー(バッファー1:250 mM NaOH、2 mM EDTA)を加えます。
    2. 96°Cの加熱ブロックで30分間インキュベートします。
    3. サンプルを5分間冷却し、75 μLの中和バッファーを加えます(バッファ2:400 mM Tris-HCl pH 8.0)。
  3. 適切なプライマーを使用して、標準手順12、21に従ってPCRを実行します(ここでは、Cre FW 5'-ACGAGTGATGTGTCGCAAGA-3'、Cre REV 5'-ACCGACGATGAATCATGTTTAG-3')。
    注意:PCRフードの下で氷の上で作業し、試薬やサンプルを汚染しないように注意してください。
    1. PCR マスター ミックスを準備します。適切な制御サンプルを含め、分析するサンプル数に応じて、次の量を乗算します。蒸留水(18.9 μL)、MgCl2(2.5 μL)を使用した10倍のバッファー、10m dNTPミックス(0.5μL)、10μMフォワードプライマー(1μL)、10 μMリバースプライマー(1μL)、5 U/μL DNAポリマー(1μL)の単一の25 μL最終体積反応の試薬を混合します。 次のステップで追加されます)。
      注: 有効な結果を得るために、常に、否定、正、および空の (テンプレート DNA なし) コントロールを追加してください。
    2. PCRチューブに24 μLのマスターミックスを加えます。
    3. 各 PCR チューブにテンプレート DNA (各マウスの耳パンチから来る) を 1 μL 追加します。
    4. PCRチューブを簡単に遠心分離し、テンプレートDNAがマスターミックス内にあることを確認します。
    5. 表 1のサイクリング プログラムを使用してサーマルサイクラーで PCR を実行します。
  4. アガロースゲルを準備し、電気泳動を使用してサンプルを実行します。
    注: サイズは、分析する必要があるサンプルの数によって異なります。
    1. ガラス瓶に1xトリス酢酸EDTA(TAE)バッファーにアガロースパウダーを1%加えます。アガロースが完全に溶解するまで電子レンジで加熱し、沸騰していないことを定期的に確認します。
      注意: 火傷を避けるために注意してください。
    2. ゲルを約50°Cまで冷却し、核酸ゲル染色(0.5 μL/50 mLゲル)を加えます。
    3. よくくしを入れた鋳物トレイにゲルを注ぎ、完全に固まるまで室温にしておきます。くしをやさしく取り除きます。
    4. 電気泳動タンクに1x TAEバッファーを充填し、ゲルをタンクに入れます。
    5. 各DNAサンプルに1x DNAローディング染料を2μLずつ加えます。
    6. ゲルの最初のウェルに4μLのDNAラダーをロードし、残りのウェルにサンプルの全容をロードします。
    7. 電気泳動の電源を140Vに設定し、25〜30分間実行します。
    8. UV ソースの下にゲルを配置し、結果の写真を撮ります。

2. 立体性手術

  1. ジェノタイピング後、別々のマウスはCreに陽性のものを保ちます。彼らは少なくとも8週間になるまで待って、手術を行うために>20 gの重量を量る。
    1. 環境を消毒し、無菌状態下で手術を行うために外科用具を殺菌する。
    2. 手術前に痛鎮術を30分注射する。
    3. イソファフルラン(誘導の場合は通常の空気中で2〜3%、麻酔の維持のために1.5-2.0%)でマウスを麻酔します。マウスのつま先を軽くつまむことで痛みの反射がないことをテストすることによって、適切な麻酔レベルを達成してください。それに応じてイソファフルランの送達を調整します。
    4. ステレオタキシック装置にマウスを置きます。乾燥による眼の病変を防ぐために眼潤滑剤を追加し、頭蓋骨の上部の毛を剃ります。加熱パッドを使用して、マウスの温度を安定に保ちます。
    5. 頭蓋骨の皮膚の下に100μLの局所麻酔薬を注入し、5分を有効にします。
    6. ヨウ素と交互にアルコールまたは滅菌生理食分の3つの円形のアプリケーションによって切開部位を準備します。無菌綿の先端を使用し、切開ラインから外側にアプリケーションを開始します。
    7. シーズで皮膚を軽く持ち上げ、ロストロコーダル軸に沿って1.5cmの切開を外科用はさみで作り、頭蓋骨の表面を明らかにします。
    8. 綿棒を使用して、腹膜を除去するためにH2O2溶液を適用します。
    9. 滅菌生理食糸で頭蓋骨をすすぐ、滅菌綿の先端アプリケーターを使用して乾燥させます。
    10. ブレグマとラムダを見つけます。
    11. 注射針の先端を位置づけることによって平らな頭蓋骨の位置を確認し、ステレオタキシックフレーム上で調整し、ブレグマおよびラムダに置く。各位置の腹側座標を測定し、比較します。頭蓋骨が平らな場合、ブレグマとラムダの両方の腹側座標は同じです。もしそうでなければ、ヘッドの位置を調整し、測定を再度行ってください。
    12. 位置を見つけてマークする (AP: -3.45 mm, ML: -0.2 ブレグマからによると フランクリンとパキシノス22)の注射が行われ、光ファイバーの移植が行われ、マイクロドリルを使用して小さな穴を作ります.
    13. 精密ポンプを用いて立体タキシック装置に搭載された10μLシリンジに400nLのウイルスをロードする。
    14. VTA(AP:-3.45 mm)に300 nLのクレ依存性光遺伝学ウイルス(AAV5-EF1a-DIO-ChR2(H134)-eYFP[5.6 x 1012 vg/mL]を注入し、 ML:ブレグマから-0.2mm、頭蓋骨の表面から-4.4mm、フランクリンとパキシノス22)によると、精密ポンプを使用して100 nL /分の注入速度で。
    15. 注射後、ウイルスの拡散を可能にするために、針を10分間追加で所定の位置に残します(2A)。
    16. 注射部位からゆっくりと針を引っ込めます。
    17. 光ファイバーと歯科用セメント複合体を安定させるアンカーねじにマイクロドリルを使用して小さな穴を作ります。
    18. ブレグマの座標をもう一度取り、AP:-3.45 mm、ML: ブレグマから -0.2 mm、頭蓋骨の表面から -4.0 mm (図 2B)に光ファイバー (直径200μm、 0.37 NA) を埋め込みます(
    19. 歯科用セメントを使用して、頭蓋骨の繊維を固定します。光ファイバーフェルールの周りに十分なセメントを適用して頭蓋骨に固定しますが、パッチコードの接続を可能にするためにセメントのないフェルールの上部の3-4 mmを残すように注意してください(図2C)。
      注:これは脳組織の損傷を引き起こす可能性がありますので、セメントで穴を埋めないように注意してください。この問題が発生するのを防ぐために、止血材料を穴に加えることができます。
    20. 開いた創傷を閉じ、少なくとも2週間回復するために動物を残すために組織の接着剤または吸収可能な縫合糸を使用してください。手術後に鎮痛薬12-24時間の追加用量を与える。

3. レーザー光源の制御を設定する

  1. レーザー光源を制御するには、シングルボードマイクロコントローラを使用します。適切なソフトウェアを使用してスクリプトを記述します。コンピュータへの適切な接続ケーブルを使用して、マイクロコントローラボードにスクリプトをロードします。
    注: このスクリプトには、トラッキング ソフトウェアから TTL ボックスを介して受信する外部変調(入力)と、刺激パラメータを制御するためのレーザーへの出力を含める必要があります。20 Hz の周波数で 10 ミリ秒のパルス幅を求める場合は、補足コーディング ファイルに記載されているスクリプトを使用します。
  2. レーザーとトラッキングハードウェアのTTLボックスにボードを接続します。
    1. ネットワーク ケーブルを使用して、TTL ボックスをボード(指定されたスクリプトのピン 5)に接続します(図 3A,C)。
    2. レーザーが外部変調で制御されるように設定されていることを確認し、FC/PCケーブル(指定されたスクリプトのピン13)を使用してレーザーをボードに接続します(図3B,C)。
    3. 適切なピンをボードのアース部分に接続します。
  3. レーザー光源を光ファイバーに接続します。
    1. レーザー光源を回転関節に接続します(3D)。
    2. パッチコード(図3E)を回転関節に接続します。
    3. 装置の上のロータリージョイントを安定化するが、記録領域の外側に。光ファイバ パッチ コードの長さが、マウスがアリーナ内で問題なく移動できるように適切であることを確認します (図 3F)。

4. トラッキングソフトウェア内のRT-PPアプローチの実験の設定

  1. アリーナのセットアップを調整します。ルーラーを使用して、物理装置の特定の部分を測定し、ソフトウェア内の画像で測定した部分に対応する線を描画し、[調整する尺度を描画]タブの下に、既に既知の値を入力します(図4のステップ1)。
  2. アリーナを設計します。マウスの動きが記録される領域を描きます(図4のステップ2)。
  3. ゾーンを作成します。最終的にレーザーペア、レーザーペアなし、および「ニュートラル」として割り当てられるゾーンを描画します(図4のステップ3)。
  4. 設定を検証して、競合するパラメータ (たとえば、アリーナ外のゾーンなど) がないことを確認します (図 4 の手順4)
  5. タブのトライアル制御設定(図 4のステップ 5) で実験パラメータを設定します。
    1. 30分の RT-PP セッションの場合は、図 5 のステップ 1 に示すように、試用時間を設定します。
    2. 「ハードウェア制御」が有効になっていることを確認し、コンパートメントをレーザーペアとして割り当て、マウスのエントリがトラッキングソフトウェアを介してマイクロコントローラボードにTTL信号をトリガします。図5(ステップ2)では、レーザー対のコンパートメントがコンパートメントAである。反転フェーズでは、コンパートメント B がレーザーペアになり、コンパートメント A がペアリング解除されるようにコンパートメントを切り替えます。ソフトウェアで A を B に、B を A に置き換えて、A を A に置き換えます。

5. NCPアプローチを用いた刺激の回避特性をテストするための設定の変更

  1. 前述の手順 4.1-4.4 に従います。
  2. [参照] ボックスの設定 (図 6の手順 1) で、[繰り返し実行] オプションを使用して、実験の時間を 30 分に設定します。
  3. A および B コンパートメントの設定に関連する条件ボックスに「センターポイントがゾーン A とゾーン B のいずれかにある場合」を追加して、A ゾーンと B ゾーンの両方をレーザー ペアとして割り当てます (図 6の手順 2)。動物がニュートラルコンパートメントに配置されている場合、レーザーはオフになります。

6. レーザー刺激を用いて実験を行う

  1. 検出設定を設定します。
    1. 適切な検出設定を確認するために、マウスに似たダミーを使用します。
    2. 装置の1つのコンパートメントにダミーを置き、動的減算と自動セットアップを使用します。
    3. ダミーを取り外し、反対側のコンパートメントに置きます。ダミーが完全に検出されていることを確認し、正しく検出されない場合は、ソフトウェアを介して設定を調整します。
      1. このステップでは、刺激が想定どおりに機能するかどうかもチェックします。以前に設定されたトライアルコントロール設定を使用して取得を開始し、レーザーペアコンパートメントにダミーを配置し、刺激が必要に応じてトリガされるかどうかを確認します。次に、ダミーを不対のコンパートメントまたはニュートラルコンパートメントに配置し、刺激が停止しているかどうかを確認します。
  2. センサー付きのパワーメーターを使用して、レーザーのノブを使用してレーザーパワーを10 mWに設定します(図3B)。レーザー刺激を使用するたびにこの手順を実行します。
    注意: レーザー光への直接の露出は永久的な眼の損傷を引き起こす可能性がありますので、保護眼の機器を使用してください。
  3. 装置内にマウスを置きます。
    1. マウスをケージからそっと取り出し、セラミックスリーブを使用して光ファイバーインプラントを光ファイバーパッチコードに接続します。
    2. 3区画装置の中立コンパートメントにマウスをそっと置きます。
    3. マウスがソフトウェアによって検出されるまで待ちます。
    4. 動物がメインコンパートメントに入るのを制限する垂直スライドドアを取り外します。
    5. 動物が何の妨害もなく自由に探検することを許可します。
      注:手順6.2が不要で、レーザーがずっとオフになっているという例外を除き、動物が刺激を受けていない場合も、同じ手順が行われます。

Representative Results

3区画装置(3F)は、薬物の効果に対処し、光遺伝学を用いたニューロンの直接刺激の報酬または回避特性をリアルタイムで評価するのに適している。2つのメインコンパートメント(20cm [W]x 18 cm [L] x 25 cm [H])と1つの小さな接続コンパートメント(20 cm [W]x 7 cm [L]x 25 cm [H])で構成されています。メインコンパートメントは、接続/中立コンパートメントが狭くて透明であるため、マウスが自然に時間を費やす時間を減らすために、独特の壁と床の質感とパターンを持っています。上述したように、トラッキングソフトウェアは、各区画で費やされた動きおよび時間を含むマウスのいくつかの行動パラメータを記録し、レーザー刺激を制御するために使用することができる。RT-PP実験全体は8回のセッション(図1A)を通じて行われ、直接刺激のやりがいまたは回避的な特性(3日目、4日、6日、7日)の評価と、前の経験(5日目と8日目、「CR」)に応答して、正または負の関連の形成の両方を可能にする。

まず、VTAでAAV-ChR2-eYFPウイルスを注射したDAT-Creマウスを試験し、ドーパミン作動性ニューロンを標的とした。文献に従って、 我々は、マウスが刺激と組み合わせたコンパートメントで時間を過ごすことが好ましいことを観察した(図1B、フェーズ1、3日目および4日目、青い円、分散の双方向反復測定[RM]分析、コンパートメントF(2,18)の効果F(2,18)=141、p<0.001;セッションXコンパートメントFの効果F(12,108)= 42.108、lt;00;Tukey のポスト ホック テスト対対対ペアp < 0.001)。反転相は、レーザー刺激への区画の組み合わせが切り替えられたところで、これらの観察を確認した(図1B、6日目および7日目、青い円、Tukeyのポストホック検定対対対対不対コンパートメントp<0.001)したがって、フェーズ1から得られた結果がサイドバイアスまたはランダムパラメータに関連している可能性を除いた。 RT-PPの4日間の間に各コンパートメントで過ごした時間を平均すると、マウスは対比されていない(〜20%)とは対照的に、レーザー対コンパートメントで平均約70%の時間を費やしたことを確認しましたとニュートラル(約10%)コンパートメント(1B棒グラフ、一方向RM ANOVA、刺激F(2,6)の効果F(2,6)=139、p<0.001、Tukeyのポストのペアリングと非対および中立コンパートメントp< 0.001)。 さらに、刺激がない場合、5日目および8日目に、マウスは以前にレーザー刺激と組み合わせたコンパートメント(Tukeyのポストホックp <0.001)で有意に多くの時間を費やし、以前の経験が刺激の「シーク」として反映された連想学習行動を誘発するのに十分であることを示す。これらのデータは文献に従い、現在の方法が確実に使用できることを実証し、VTAにおける特定のニューロン集団の光遺伝学的刺激の効果を調べることができる。

次に、上記のようにVTAにAAV-ChR2-eYFPを注射したVGLUT2-Creマウスを試験し、VTAのグルタミン酸作動性ニューロンを標的とした。この実験では、DAT-Creマウスが示したものとは逆の行動表現型を観測した。したがって、マウスは刺激に対して組み合わせたコンパートメントを避け、すべてのRT-PP日間に対になっていないより多くの時間を費やしました(図1C左、双方向RM ANOVA、コンパートメントFの効果(2,12)=40.9、p<0.001;セッションxコンパートメントFの効果(12,72)= 16.1、p <.001; Tukey のポスト ホック テスト対対非ペアp < 0.001;図 1右、刺激 F(2,6) = 162, p < 0.001, Tukey のポストホック対対対と対中性コンパートメントp < 0.001 の効果。興味深いことに、5日目および8日目に、マウスは以前に対したコンパートメントの明確な回避を示さなかった(対と非対のコンパートメント間の差はない)。条件付き応答の欠如は、レーザー対コンパートメントに費やされた時間が不十分であるため、レーザー活性化とそれが行われた特定の環境との間の関連の形成を妨げた可能性があります。この回避表現型をさらに探索するために、変更されたプロトコルを使用し、NCPを省略した「ニュートラルコンパートメント優先」と名付けました。この実験では、両方の主要コンパートメントを刺激に対化し、中性コンパートメントは刺激フリーのままであった(7A)。我々は、刺激が回避特性を有する場合、マウスはそれを避けるために、より小さく、中立的なコンパートメントで時間を過ごすことを余儀なくされると仮定した。実際、刺激の両方の日(Stim1とStim2)で、マウスは中性コンパートメント(約80%)で時間の大半を過ごしましたペアになったコンパートメントと比較 (図 7B,C; 左: コンパートメント F(2,8) = 70.9, p < 0.001; セッション X コンパートメント F の効果(4,16) = 6.9, p = 0.002, トゥキーのポストホック "刺激 1" ニュートラルコンパートメント 1 と 2 p < 0.01, "刺激 2" ニュートラル対コンパートメント 1 と 2 p < 0.001; 右: 一方向 RM ANOVA, 刺激F (2,2,p4) 0.018、Tukeyのポストホックテストは1と2対ニュートラルp < 0.05) をペアにしました。RT-PPテスト中の「CR」日の場合と同様に、マウスはコンパートメントと刺激との間に負の関連を形成していないようでした。すなわち、刺激(CR)がない場合、彼らはすべての区画を同じ程度まで探索した(図7Bは、対のコンパートメントとニュートラルコンパートメントで過ごす時間に違いはない)。これらの実験の結果、RT-PPセットアップ中に観測された行動表現型を確認し、RT-PPとNCPパラダイムの両方の組み合わせ実装をサポートした。

Figure 1
図1:RT-PPパラダイムにおける光遺伝学を用いた行動試験(A)実験のタイムラインの概略図。(B,C)左上:DAT-Cre(N=10)およびVGLUT2-Cre(N=7)マウスに対するRT-PP実験を通して各区画で費やされた時間の割合を表すグラフにAAV-ChR2-eYFPを注入した。青い円: レーザー対のコンパートメント;白、黒の円:メインコンパートメント。灰色の円: ニュートラルコンパートメント。右上:3日、4日、6日、7日目(RT-PP)の各区画で費やされた時間の平均割合。下:DAT-CreとVGLUT2-Creマウスの各コンパートメントで費やされた時間の代表的なヒートマップ。すべてのデータは通常分布していた(シャピロ・ウィルク検定)。結果は平均値 ± SEM. ***p < 0.001 対と非対のペアとして表示されます。#p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 ペアとニュートラルコンパートメント;§§p < 0.01, §§§p < 0.001 対になっていないコンパートメントとニュートラル コンパートメント。この図は、ビンピシディスら12から修正されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:光遺伝学的実験のための外科手術(A) VTAにおけるCre依存性ウイルスベクターの注射(B) 射出部位の上の光ファイバの移植。安定のために使用されるアンカーねじに注意してください。(C) 歯科用セメントを用いて、頭蓋骨に繊維を固定します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:光遺伝学実験で使用される装置(A) 研究で使用される TTL ボックス。トラッキングソフトウェアから入力を受け取り、TTL信号をマイクロコントローラボードに送信します。(B) 実験に使用したレーザー光源の前面(上)と背面図(底面)。(C) レーザー刺激を制御するために使用されるマイクロコントローラボード。TTL ボックスとレーザー ソースからの接続に注意してください。(D) ロータリージョイント。(E) 実験で使用した光ファイバパッチコード。(F) RT-PPおよびNCP実験に用いる3区画装置。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:トラッキングソフトウェア内のアリーナとゾーンの設計ステップ1:セットアップのキャリブレーション。ステップ2:アリーナ全体の描画。ステップ3:アリーナ内のゾーンを描画します。ステップ 4: 設定の検証。ステップ5:時間と刺激パラメータを設定するための[トライアル制御設定]タブ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:トラッキングソフトウェア内でのRT-PP実験の時間と刺激パラメータの設定持続時間(ステップ1)および光刺激のための条件に対する特定の規則を追加する(ステップ2)。条件は、取消フェーズの要件に合わせて簡単に変更できます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:追跡ソフトウェア内でのNCP実験の時間および刺激パラメータの設定刺激セッションの持続時間(ステップ1)はRT−PPに対する期間と同様であるが、光刺激活性化のための条件(ステップ2)は異なる。いずれかのメインコンパートメント(ここでゾーンAとゾーンBという名前)に入ると、マウスが中性コンパートメントに入ったときにのみ終了する光遺伝学的刺激が生じる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:NCPパラダイムにおける光遺伝学を用いた行動試験(A) 実験用の設定の概略図。(B)左: 2日間の刺激の間に各区画で費やされた時間の割合を表すグラフ(Stim1およびStim2)およびVTAでAAV-ChR2を注入したVGLUT2-Creマウスに対する条件応答(CR)セッション(N=5)。右:NCPの刺激の2日間の間に各区画で費やされた時間の平均パーセント。(C)刺激日の1回の間にVGLUT2-Creマウスの各コンパートメントで費やされた時間の代表的なヒートマップ。データは通常分布していた(シャピロ・ウィルク検定)。結果は平均 ±SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 対ペアなし 1 とペアになった 2 コンパートメントとして表示されます。この図は、ビンピシディスら12から修正されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ステップ 温度 期間 サイクル
1. 最初の変性 95°C 4分 1
2. 変性 95°C 30 s 30
3. アニーリング 55 °C 30 s
4. 拡張 72 °C 40 s
5. 最終拡張 72 °C 6分 1
6. ホールド 4 °C 実験者に止められるまで 1

表1:PCRサイクリングプログラム。

補足コーディング ファイル。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。

Discussion

今回の研究では、マウスの光遺伝学を用いて異なるタイプの場所優先分析を行う方法の2つのステップバイステッププロトコルを提示する。概説されたプロトコルは、VTAニューロンのやりがいまたは回避的な行動表現型(図1および6)12)を評価するために使用されたが、他の脳領域におけるニューロンの行動的役割を調べるのにも利用できる。

いくつかの最近の研究では、2コンパートメント23、24および3コンパートメント装置13、14、15、16、17、18でRT-PPパラダイムを説明している。現在のプロトコルは、乱用薬物の投与に対する行動効果を評価するためにCPP実験で伝統的に使用されたものに似た3区画装置におけるRT-PPおよびNCPプロトコルの詳細な設定を記述している。結果は、マウスが各コンパートメントで費やした時間の割合としてのみここに提示されますが、トラッキングソフトウェアは、ゾーンへの遷移、速度、不動時間など、他のいくつかの行動パラメータの分析を可能にします。異なるパラメータの分析は、データの解釈に重要です。

現在のRT-PPプロトコルは柔軟性があり、異なるタイプの刺激パターンがやりがいのある効果を持つかどうかをテストするように変更することができます。レーザー制御のパラメータは、マイクロコントローラボードのスクリプトまたはトラッキングソフトウェア内で簡単に変更でき、セットアップの多様性を実証します。ドーパミン作動性およびグルタマティックニューロンとその末端部を研究するために、同じオプシン変異体(ChR2/H134R)を用いて以前の研究で適用された周波数の範囲内にあり、時には低い周波数の20Hzの刺激周波数を提案する。最近の研究では、高い刺激周波数は、低い刺激よりも行動に逆の効果を持つことができることを実証しています, そして、これらの効果は、より高い周波数によって引き起こされる脱分極ブロックを介して仲介されることを28.同様に、行動出力の違いは、横眼前視領域15におけるグルタミン酸作動性およびGABAergicニューロンを刺激する際に示されている。これらの研究は、VTAとは異なる領域のニューロンを調べ、最大の効果は、非グルタミン酸性ニューロン15、28の高周波数に観察された。20 Hzの我々の選択は、グルタミン酸作動性およびドーパミン作動性VTAニューロンの以前の研究に基づいており、刺激周波数の変化によって、報酬関連の行動出力が24、26に有意に変化しないことを実証している。

調整可能で、実験結果に影響を与える可能性のある追加パラメータは、光源のパワーです。レーザーパワーが高いほど光刺激領域のサイズを大きくすることができ、これはいくつかのタイプの実験では有益であるが、温度5の上昇の欠点を伴う。実際、最近の研究では、レーザーによる温度上昇が脳の生理学を変え、行動測定に影響を与える可能性があることを実証しました29.これらの観測は、実験計画にオプシン陰性制御を含む重要性を強調している。現在のプロトコルでは、同様の10 mWレーザーパワーを使用し、VTA16、24、26のドーパミン作動性およびグルタミン酸性ニューロンを刺激するのに有効であることが以前に示されている。実験を立てる際には、対象となるセルが位置する面積の大きさや、光ファイバーやパッチコードの特性(開口数、芯径)に注意することが重要です。これらのパラメータは、レーザーパワーに関連する計算を行う際に考慮に入れる必要があります。詳細については、カール・デイセロスの研究室(http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php)が開発した電卓を使用することができます。

Cre-Lox再結合の組織学的検証は、光遺伝学実験を行う際のもう一つの重要な側面である。組換え効率の検証は、大きな動物群での行動実験の開始前にパイロットコホートで常に行われるべきである。これは倫理的な理由だけでなく、最適化された実験的な出力のためにも重要です。各ウイルス構成体は、異なるニューロン型および異なる領域5において可変特異性を示す可能性があり、予測不可能な方法や誤解を招く方法で実験に影響を与える可能性のあるパラメータである。例えば、我々は以前にDAT-CreマウスのVTAにおけるAAV5ウイルスのCre-Lox組換えパターンを検証し、一方的な注射が関心領域の大部分を標的にするのに十分であることを発見した。その後、NeuroD6発現を特徴とするようなVTA内の空間的に制限された亜集団を研究したところ、二国間ウイルス注射は、光遺伝学的光刺激12でより顕著な行動効果を与えるより多くのニューロンを標的にするためにより効率的であることが観察された。さらに、手術から行動実験の開始までの時間は慎重に取り組まなければならない。ここで示すように、ChR2 DNAコンストラクトが細胞体で発現するのに十分な2週間ですが、研究者がプロジェクション領域13、14、15、17で刺激の効果をテストしている場合は、より長い待ち時間(〜8週間)が必要になる可能性があります。

VTAでニューロンを研究する際に注入されたウイルスの量(300nL)が適している可能性があることは注目に値するが、体積と力ターは、トランスダクションの効率と研究された構造の大きさに応じて調整されなければならない。さらに、二国間の構造が、平凡な軸から離れた位置にある場合、両側注射を行い、両半球の活性化/阻害を確実にするために二国間で光ファイバーを二国間に移植することが必要な場合がある。

最後に、Cre-Loxの組換えの効率を検証および確認し、目的の場所で光ファイバの正しい移植部位を検証するために、事後分析を行うことが常に必要です。予期せぬ、過度に制限された、または過剰なCre-Loxの再結合は、意図された領域の境界外にCreを発現するニューロンの未知の分布のために発生する可能性があり、またはウイルス血清型の違い、ウイルスの取り扱いの不良、目詰まりの原因ウイルスの配信や他の手術関連の問題のための注射器.満足のいくCre-Loxの組換えおよび正しい光ファイバー注入の検証は、安全な結論を導くために行動評価の統計的な結果を確認するために行われなくてはなりません。

ここで提供されるデータの観点から、2つの行動パラダイムがどのように使用できるかの例として、RT-PPパラダイムにおけるDAT-Creマウスを分析することによってVTAにおけるドーパミン作動性ニューロンの光遺伝学的刺激によって得られる光対側に対する有意な好みは、VGLUT2によって示されたこの側の回避に基づいて予想された23、24、25、26、27であった。VTAのVGLUT2ニューロンとその予測は、報酬と嫌悪感16、17、24、30、31の両方に関与することが示されており、したがって、現在のRT-PP設定で観察された明らかな回避行動をより詳細に評価するためにNCP分析を行った。狭く透明なコリドーを唯一の非光対コンパートメントとして使用してVTAグルタミン酸作動性ニューロンの刺激の回避特性を確認することにより、この特定の3区画のセットアップにおいて、これらのニューロンの光遺伝学的活性化が回避応答を引き起こすことが明らかである。RT-PPとNCPプロトコルの両方を使用して利益を得る可能性のある状況を例示するためにここに示されたこれらの実験は、最近発表された研究の一部であり、これらの知見に関する完全なデータセットおよびこれらの知見に関する議論は、この出版物12で見つけることができます。

NCPに加えて、回避を確認する別の方法は、レーザー活性化にアリーナの残りの部分をペアリングしながら、オープンフィールド領域内の領域の強い照明を含む、またはマウスがレーザー刺激15を終了するために特定の行動パターンを実行しなければならないアクティブ回避タスクを実行する。

要約すると、記載されているプロトコルは、報酬と嫌悪における神経活性化の役割を解明するために、RT-PPおよびNCP分析を最も効率的な方法で正常に実行する方法の重要な情報を提供する。科学的仮説に応じて、これらのプロトコルを使用して様々なパラメータを分析することができ、各プロトコルは、特定の脳に対処するために光遺伝学を実装する最適化された行動分析のために他の検証済みのパラダイムと組み合わせることもできます関心のある領域とニューロン。

Disclosures

著者たちは開示するものは何もない。

Acknowledgments

ウプサラ大学、ヴェテンスカプスローデット(スウェーデン研究評議会)、ハルンフォンデン、パーキンソンフォンデン、ベルティル・ホルステンの研究財団、OE&エドラ・ヨハンソン、ズーロギスク・フォルスクニング、オーレンなど、私たちの資金源は感謝しています。ウプサラ大学で動物を飼育し、ウプサラ大学行動施設で実験を行った。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV-Cre dependent virus UNC Vector Core - a great variety of viruses to suit any project's needs
Agarose VWR Life Science 443666A
Buffer for PCR KAPA BIOSYSTEMS KB1003 10x, contains 1.5mM MgCl2 at 1x
Bupivacaine (Marcain) Aspen N01BB01 local anesthetic, 5 mg/ml solution, requires prescription
Carprofen (Norocarp) N-Vet 27636 anti-inflammatory, analgesic; 50 mg/ml solution, requires prescription
dNTP set Thermo Fisher Scientific R0181 100mM, have to be dilluted to 10mM and mixed
DNA ladder Thermo Fisher Scientific SM0243 100 bp, 50 μg Gene Ruler
DNA loading dye Thermo Fisher Scientific R0611 6x, dilute to 1x before using
Ear puncher AgnThos AT7000 ear puncher to take tissue samples for PCR or to mark animals
Fiberoptic patchcords Doric Lenses MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25
Implantable fiberoptics Doric Lenses MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT the properties of the fibers might change depending on the experiment
Infusion pump for virus injections AgnThos Legato 130 contains remote pump to secure the syringe directly on the stereotexi frame
Isoflurane (Forane) Baxter N01AB06 Volatile anesthetic, requires prescription
Jewelry screws AgnThos MCS1x2
Laser source Marwell Laser Systems CNI MBL-III-473-100mW
Microcontroller board Arduino "Uno" board can be ordered from several companies
Microdrill AgnThos 1474 could be ordered with or without stereotaxic holder
Needle (34G) World Precision Instruments NF36BV
Nucleic Acid gel stain - GelRed Biotium 41003-T
PCR tubes Axygen PCR-0208-CP-C
Power meter Thorlabs PM100D
Place Preference Apparatus Panlab 76-0278
Rotary joint Doric Lenses FRJ_1x1_FC-FC
Sleeves Doric Lenses SLEEVE_ZR_1-25 mating sleeve to connect the patchcord with the implanted optic fiber
Stabilization cement Ivoclar Vivadent Tetric EvoFlow
Syringe (10ul) World Precision Instruments NanoFil
Taq polymerase KAPA BIOSYSTEMS KE1000 500U
TAE buffer Omega BIO-TEK SKU:AC10089 50x concentration, has to be dilluted before use
Thermal cycler BIO-RAD S1000 1852148 necessary to perfrom PCR reactions
Tissue glue AgnThos Vetbond
Tracking software Noldus Ethovision XT
TTL box Noldus Noldus USB-IO box
UV transilluminator Azure Biosystems c200 model

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