Två olika Real-Time Place Preferens Paradigms använda optogenetik inom Ventral Tegmental Området för musen

Behavior
 

Summary

Här presenterar vi två lättatt följa steg-för-steg-protokoll för plats preferens paradigm med optogenetik hos möss. Använda dessa två olika inställningar, preferens och undvikande beteenden kan bedömas stabilt inom samma apparat med hög rumslig och tidsmässig selektivitet, och på ett enkelt sätt.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bimpisidis, Z., König, N., Wallén-Mackenzie, Å. Two Different Real-Time Place Preference Paradigms Using Optogenetics within the Ventral Tegmental Area of the Mouse. J. Vis. Exp. (156), e60867, doi:10.3791/60867 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Förstå hur neuronal aktivering leder till specifika beteendemässiga resultat är grundläggande för modern neurovetenskap. Genom att kombinera optogenetik hos gnagare med beteendetester i validerade paradigm möjliggör mätning av beteendemässiga konsekvenser vid stimulering av distinkta nervceller i realtid med hög rumslig och tidsmässig selektivitet, och därmed inrättandet av orsakssamband mellan neuronal aktivering och beteende. Här beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll för ett realtidsställe preferens (RT-PP) paradigm, en modifierad version av den klassiska konditionerade plats preferens (CPP) test. RT-PP utförs i en tre-fack apparat och kan användas för att svara om optogenetisk stimulering av en viss neuronal befolkning är givande eller aversive. Vi beskriver också en alternativ version av RT-PP-protokollet, det så kallade protokoll för neutrala fackpreferens (NCP), som kan användas för att bekräfta motvilja. De två metoderna bygger på förlängningar av klassisk metodik som härrör från beteendefarmakologi och nyligen genomförda implementering av optogenetik inom neurovetenskapområdet. Förutom att mäta plats preferens i realtid, kan dessa inställningar också ge information om konditionerat beteende. Vi erbjuder lättatt följa steg-för-steg-protokoll tillsammans med exempel på våra egna data och diskutera viktiga aspekter att tänka på när du tillämpar dessa typer av experiment.

Introduction

Genomförandet av optogenetik, en modern neurovetenskap experimentellt verktyg där ljuset används för att kontrollera neuronal aktivitet, har under de senaste åren lett till stora framsteg i att förstå hur specifika neuronala populationer inverkan beteende1,2,3. Den enastående rumsliga och tidsmässiga selektivitet optogenetik tillåter upprättandet av kausala samband mellan excitation eller hämning av cellgrupper av intresse och beteendemässiga produktion2,3. Rumslig selektivitet i optogenetik säkerställs ofta genom Cre-Lox-systemet där aktiviteten hos Cre rekombinas leder till rekombination av alla DNA-sekvenser som finns mellan Lox platser, så kallade floxed alleler (flankerad av lox platser)4. Målet med att använda Cre-Lox-systemet i optogenetik är att uppnå uttryck för alleler kodning optogenetiska opsins i specifika nervceller av intresse samtidigt som omger nervceller saknar uttryck. Opsins är ljuskänsliga proteiner som vid ljusstimulering av specifika våglängd tillåter jonflöde som påverkar neuralret eller påverkar cellulära funktioner genom att modulera nedströms effektorvägar. Nya varianter av opsins som skiljer sig åt i aktion (excitatoriska, hämmande, modulerande), mekanism, aktivering av ljusvåglängd och kinetik egenskaper5 utvecklas kontinuerligt för att möta behoven hos specifika experimentella metoder. När det gäller retbarhet, med hjälp av en depolariserande eller hyperpolariserande opsin dikterar aktiviteten hos nervceller (excitation eller hämning, respektive) på ljusstimulering vid en viss våglängd levereras in i hjärnan3.

Selektiv promotor aktivitet leder uttrycket av Cre recombinase till nervceller av intresse. Genom att genomföra en floxed allel av opsin av intresse, Cre-medierad rekombination kommer att se till att opsin är selektivt uttryckt i nervceller som co-express Cre recombinase3,6. Denna användning av dubbla transgena för att rikta rumslig selektivitet har visat sig vara mycket effektiv i optogenetik. Således, medan ljusstimulering för att aktivera opsins levereras i stort sett genom en intracerebralt implanterad optisk fiber ansluten till en ljuskälla (LED eller laser)3, endast nervceller uttrycker både Cre rekombinas och floxed opsin allel kommer att svara på denna stimulering. Cre-Lox-systemet hos gnagare kan uppnås på olika sätt genom att endast använda transgena (både Cre rekombinas och floxed opsin-konstruktionen kodas i transgena djur), endast virusinjektioner (DNA-konstruktioner för Cre rekombinas och floxed opsin levereras båda via en virusbärare) eller en kombination av de två (t.ex. Cre recombinase kodas av ett transgent djur som injiceras med ett virus som bär floxed opsin konstruktion)5. Den floxed opsin DNA konstruerar klonas vanligt in rama med en reportergen för att möjliggöra visualisering av Cre-medierad rekombination i vävnaddelar. Optogenetik kan också utföras på råttor, har de presenterade protokollen genererats för möss. För enkelhetens skull kommer möss som bär både Cre rekombinas och floxed opsin att kallas "optogenetics möss". I de protokoll som beskrivs nedan, optogenetik möss har genererats av en blandad transgen (Cre recombinase under kontroll av två olika initiativtagare) och viral (med hjälp av en adeno-associerade virus, AAV, för att leverera floxed opsin DNA konstruera - i vårt fall ChR2/H134R) strategi. Att erhålla och underhålla transgena muslinjer är en viktig del av metoden. Cre-driver och floxed opsin transgena möss kan produceras för varje ändamål, eller köpas om kommersiellt tillgängliga, liksom en rad virus som transporterar DNA-sekvenser kodning Cre rekombinas och floxed opsins i olika former.

Optogenetik i kombination med beteendetester har visat sig vara ett värdefullt verktyg för att studera rollen av olika hjärnregioner, eller diskreta neuronala populationer, i synnerhet typer av beteende. I samband med belöningsrelaterat beteende har optogenetik möjliggjort verifiering av tidigare resultat inom beteendefarmakologi och experimentell psykologi, och även tillåtit en ny nivå av spatio-temporally relevant dissekering i hur vissa nervceller påverkar beteende. En metod som har använts i flera studier för att bedöma belöningsrelaterat beteende är en modifierad version av den klassiska metoden som kallas Conditioned Place Preference (CPP). Klassisk CPP har använts för att bedöma de givande eller aversive egenskaperna hos droger av missbruk genom sin förmåga att inducera Pavlovian föreningar med ledtrådar av miljön7,8. I Pavlovian termer är läkemedlet en obetingad stimulans eftersom det kan framkalla strategi eller tillbakadragande om det är givande eller aversive, respektive. Kontinuerlig parning av läkemedlet med olika neutrala stimuli, som själva inte framkallanågot svar, kan leda till tillvägagångssätt eller tillbakadragande endast vid presentation av den tidigare neutrala, men efter parning, så kallad konditionerad stimuli9. CPP-analys utförs vanligtvis i en apparat som innehåller två fack av samma storlek, men där varje fack definieras av olika egenskaper, såsom golvtextur, väggmönster och belysning (neutral stimuli). De två utrymmena är anslutna antingen genom en korridor eller en öppning mellan facken. Under konditionering får ämnet, vanligtvis en liten gnagare, passiva injektioner av ett läkemedel samtidigt som det är begränsat till ett av de två huvudfacken och saline medan det är begränsat till det andra facket. Läkemedlets givande effekter bedöms därefter i en drogfri session när ämnet får fritt utforska hela apparaten. Den tid som tillbringas i det tidigare drogparade utrymmet (det konditionerade svaret) anses återspegla Pavlovianinlärningsmekanismer som förmedlas mellan läkemedlets givande effekter och köerna i det fack som är förknippat med dess administration(konditionerad stimuli). Om djuret tillbringar mer tid i det drogparade facket, har läkemedlet framkallat en konditionerad plats preferens vilket innebär att det har givande effekter på beteende. Å andra sidan, om läkemedlet uppfattas som aversive, kommer djuret att undvika det läkemedelsparade facket och tillbringa mer tid i saltlösningsparfacket, vilket indikerar konditionerad platsaversion (CPA)8,9,10,11.

Eftersom optogenetik kan genomföras för att kontrollera neuronal aktivitet i "realtid", användningen av ett beteendebeteende paradigm som liknar, men skiljer sig från, cpp setup möjliggör mätning av plats preferens vid direkt neuronal aktivering. Optogenetics-driven analys av plats preferens är därför ofta kallad en realtid plats preferens (RT-PP) analys paradigm. I RT-PP paradigm, optogenetisk stimulering av distinkta nervceller via Cre-Lox systemet ersätter systemisk leverans av ett läkemedel som utförs i den klassiska CPP, så att RT-PP paradigm istället åtgärder om optogenetiskt inducerad neuronal stimulering är uppfattas som givande eller aversive. Den nuvarande beskrivningen kommer att fokusera på optogenetik möss, men även optogenetik råttor kan testas med liknande protokoll.

Istället för konditionering till ett fack i taget som i den klassiska CPP paradigm, optogenetik musen i RT-PP paradigm är tillåtet att röra sig fritt i hela apparaten och beteende registreras under hela sessionen. Inträde i ett av facken paras ihop med intrakraniell ljusstimulering. Under lämpliga ljusstimuleringparametrar aktiveras nervceller som uttrycker en excitatorisk opsin. Om ljusstimuleringuppfattas som givande, kommer optogenetik musen kvar i ljus-parade facket, medan om ljusstimulering uppfattas som avrerisk, musen kommer att lämna facket för att undkomma stimulering. Denna typ av analys gör det möjligt att bedöma villkorad inlärning: Motivet kan utlösa ljusstimulering och därmed neuronal aktivering genom att gå in i ett fack, och stoppa stimuleringgenom att lämna facket, liknande spak-pressning under en instrumental uppgift. Dessutom kan associativa inlärningsmekanismer bedömas under efterföljande sessioner där tiden i varje delav laup mäts i avsaknad av stimulering. På så sätt kan forskaren separera mellan de omedelbart givande effekterna vid stimulering av nervceller av intresse och associativ minnesbildning i samband med det12.

I den aktuella studien beskriver vi två steg-för-steg-inställningsprotokoll för optogenetik-driven plats preferens beteende fritt rörliga möss. Det första protokollet beskriver RT-PP inom en trefacksapparat och har beskrivits baserat på de protokoll som root och kollegorna 13 och andra författare 13 och andra författare12,14,15,16,17,18. Experimentet består av två faser bestående av flera dagliga sessioner (visas i figur 1A). Varje session är utformad för olika ändamål och parametrarna för kopplingstimulering med ett fack ändras i enlighet med detta. Den första sessionen, den "Pretest", används för att bedöma första preferensen för ämnet till någon av facken. När motivet är anslutet till plåstret är tillåtet att fritt utforska apparaten i avsaknad av stimulering i 15 min. Om den ursprungliga inställningen till ett enda fack är mer än 80%, musen är utesluten från analysen eftersom inledande sida partiskhet kan skeva analysen. Efter "Pretest"börjar "fas 1". Den första delen består av två på varandra följande, dagliga, 30 min sessioner av "RT-PP". Under "Fas 1" är optogenetics musen ansluten till laserkällan genom patchsladden och placeras i arenan för att fritt utforska den. Musen får intrakraniell laserstimulering vid inresa i ett av huvudfacken. Pilotexperiment kan utföras för att avgöra vilket fack som ska tilldelas som laserparade och som som oparade. Om stimuleringen visar sig vara givande, kommer lasern att kopplas till det minst föredragna utrymmet under "Pretest" och till den mest föredragna om stimuleringen är aversive. Således följer den presenterade RT-PP-protokollet en partisk design i den meningen att laserstimulering inte slumpmässigt tilldelas någon av de två huvudfacken (opartisk design), men väljs för att undvika alla inledande preferenser musen. Inträde i det andra huvudfacket eller det neutrala fack som förbinder de två huvudfacken ger inte upphov till intrakraniell ljusstimulering och är därför inte ljuskopplade. Dessa sessioner möjliggör bedömning i realtid av de givande eller aversiva egenskaperna hos stimulering av specifika neuronala populationer. På den sista dagen av "Fas 1", en 15 min session utan någon stimulans äger rum. Denna session tjänar till att ta itu med konditionerade svar ("CR") som beror på associativinlärning mellan stimulering och miljö där den togs emot. Minst tre dagar efter "fas 1", äger "återföringsfasen" rum som följer samma struktur som "fas 1" men det tidigare icke-parade huvudfacket paras nu ihop med ljusstimulering. Som i fallet med "fas 1"följs de två stimulanssessionerna av en "CR"session. Återföringsfasenanvänds för att bekräfta att musens beteende är beroende av optogenetisk stimulering och inte relaterad till slumpmässiga parametrar. Varje session i RT-PP-experimentet måste programmeras separat i spårningsprogrammet. Det aktuella protokollet beskriver sådana inställningar i en viss programvara, men alla andra spårningsprogram som kan skicka ttl-moduleringssignaler (Transistor-transistor-logic) till ljuskällan kan användas.

Det andra protokollet beskriver en ny inställning som kallas Neutral Compartment Preference (NCP) paradigm. Detta ändrade protokoll från RT-PP drar nytta av den ringa storleken och öppenheten i anslutningskorridoren, som naturligtvis undviks av musen på grund av dess smala och genomskinliga sammansättning. Genom att para ihop båda huvudfacken med ljusstimulering och bara lämna korridoren fri från ljusstimulering kan NCP-installationen användas för att testa om den optogenetiska stimuleringen tvingar musen att spendera mer tid i korridoren för att undvika att ta emot optogenetisk stimulering. Genom att jämföra den tid som tillbringas i de två ljusparade facken med den tid som tillbringas i korridoren kan en kontroll av optogenetiskt inducerad motvilja göras. NCP-experimentet består av två dagliga sessioner i följd där optogenetikmöss får stimulans (30 min vardera) för att mäta preferens i realtid, och en laserfri session (15 min) för att bedöma konditionerade svar på samma sätt som de i RT-PP Protokollet.

RT-PP och NCP protokoll nedan validerades nyligen i vårt labb i studiet av hur olika typer av nervceller som ligger i ventralt tegmental område (VTA) är involverade i olika aspekter av belöningsrelaterat beteende12. Här, för att exemplifiera genomförandet av RT-PP och NCP protokoll, dopamin transportör (DAT)-Cre19 och vesicular glutamat transportör 2 (VGLUT2)-Cre20 transgena möss var stereotaktiskt injiceras med AAV bär en floxed channelrhodopsin2 (ChR2) DNA konstruera i VTA varpå en optisk fiber implanterades ovanför VTA. Beteendemässiga svar som erhållits vid analys av dessa möss med hjälp av de angivna RT-PP och NCP protokoll visar hur aktivering av dopaminerga och glutamaterga nervceller inom VTA leder till olika beteendemässiga svar (Figur 1).

Steg-för-steg-protokoll för RT-PP och NCP paradigm är försedda med information som sträcker sig från genotypning av transgena möss, stereotaxic viral injektioner och fiberoptik placering, till programmering av spårningsprogram för laser-kontroll och beteendemässiga Bedömning. Dessutom diskuteras förslag till ändringar av protokollet när det gäller stimuleringsparametrar och experimentella aspekter som kan påverka det vetenskapliga resultatet. Medan protokoll beskrivs i samband med VTA, kan de tillämpas på alla hjärnområden eller neuronal population, förutsatt att relevanta optogenetik verktyg, såsom relevanta Cre-förare och floxed opsins, finns tillgängliga.

Protocol

Denna studie har genomförts med hjälp av heterozygous DAT-Cre19 och VGLUT2-Cre20 möss av båda könen, åldern > 8 veckor och vägning > 20 g. Alla experiment utfördes enligt djurskyddslagen SFS 1998:56 och EU-lagstiftning (konvention ETS 123 och direktiv 2010/63/EU) med tillstånd från de lokala djurskyddskommittéerna.

1. Genotypning av möss

  1. Ta öronbiopsier med hjälp av en öronpropp för att använda för genotypning av transgena möss.
  2. Förbered öronslag för att utföra en polymeraskedjereaktion (PCR) reaktion med hjälp av specialtillverkade primers.
    I det här protokollet användes Cre-riktade primers.
    1. Tillsätt 75 μl lysbuffert (buffert 1: 250 mM NaOH, 2 mM EDTA) i varje 1,5 ml-rör som innehåller en öronslagning.
    2. Inkubera i ett värmeblock vid 96 °C i 30 min.
    3. Låt proverna svalna i 5 min och tillsätt sedan 75 μL av neutraliseringsbufferten (buffert 2: 400 mM Tris-HCl pH 8.0).
  3. Utför PCR enligtstandardrutinerna 12,21 med lämpliga primers (här: Cre FW 5'-ACGAGTGATGAGGTTCGCAAGA-3', Cre REV 5'-ACCGACGATGAAGCATGTTTAG-3").
    VARNING: Arbeta på is under en PCR huva och var uppmärksam på att inte förorena reagenser och prover.
    1. Förbered PCR-huvudmixen. Multiplicera följande volymer beroende på hur många prover som ska analyseras, inklusive lämpliga kontrollprover. Blanda reagenserna för en enda 25 μL slutlig volymreaktion i följande ordning: destillerat vatten (18,9 μL), 10x buffert med MgCl2 (2,5 μL), 10 mM dNTP mix (0,5 μL), 10 μM framåt primer (1 μL), 10 μM omvänd primer (1 μL), 5 U/μL DNA polymeras (0,1 μL) och mall DNA (1 μL; kommer att läggas till i nästa steg).
      Lägg alltid till en negativ, positiv och en tom (utan mall-DNA) för att säkerställa giltiga resultat.
    2. Tillsätt 24 μL master mix i PCR-rör.
    3. Tillsätt 1 μL mall-DNA (som kommer från öronstansningen från varje mus) i varje PCR-rör.
    4. Centrifugera PCR-rören kort för att säkerställa att mallen DNA är inuti huvudmixen.
    5. Utför PCR med en termisk cycler med hjälp av cykelprogrammet i tabell 1.
  4. Förbered en agarose gel för att köra proverna med elektrofores.
    Storleken beror på antalet prover som behöver analyseras.
    1. Tillsätt 1% w /v agarose pulver i 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert i en glasflaska. Värm i mikrovågsugn tills agarose är helt upplöst, kontrollera regelbundet att det inte kokar över.
      VARNING: Vidta försiktighetsåtgärder för att undvika brännskador.
    2. Låt gelen svalna till ca 50 °C och tillsätt en nukleinsyragelfläck (0,5 μL/50 ml gel).
    3. Häll gelen i gjutbrickan som innehåller väl kammar och låt den stå i rumstemperatur tills den blir helt stelnat. Ta försiktigt bort kammarna.
    4. Fyll elektroforestanken med 1x TAE-buffert och placera gelen i tanken.
    5. Tillsätt 2 μL 1x DNA-lastfärgämne i vart och ett av DNA-proverna.
    6. Ladda 4 μL AV DNA-stege i gelens första brunn och fortsätt sedan att ladda hela volymen av proverna i de återstående brunnarna.
    7. Ställ in elektroforesens kraftkälla till 140 V och kör i 25−30 min.
    8. Placera gelen under en UV-källa och ta en bild av resultaten.

2. Stereotaxic kirurgi

  1. Efter genotypning, separera möss hålla de positiva för Cre. Vänta tills de är minst 8 veckor gamla och väga "20 g för att utföra kirurgi.
    1. Sanera miljön och sterilisera de kirurgiska verktygen för att utföra kirurgi under aseptiska tillstånd.
    2. Injicera mössen subkutant med smärtstillande 30 min före operation.
    3. Bedövning mössen med isofflun (2−3% i normal luft för induktion och 1,5−2,0% för underhåll av anestesi). Se till att adekvat anestesinivå uppnås genom att testa frånvaron av smärtreflexer genom att försiktigt nypa musens tå. Justera isofluranleveransen därefter.
    4. Placera musen på stereotaxic apparaten. Tillsätt ögonsmörjmedel för att förhindra ögonskador på grund av torrhet och raka håret på toppen av skallen. Använd en värmeplatta för att bibehålla musens temperatur stabil.
    5. Injicera 100 μl lokalbedövning under skallens hud och låt 5 min börja gälla.
    6. Förbered snittet sitret genom tre cirkulära tillämpningar av alkohol eller steril saline alternerand evig med jod. Använd en steril bomullsspets och initiera appliceringen från snittets linje, utåt.
    7. Lyft försiktigt huden med pincett och gör ett snitt på ~1,5 cm längs rostrocaudalaxeln med kirurgisk sax för att avslöja skallens yta.
    8. Använd en bomullspinne, applicera H2O2-lösning för att ta bort periosteumen.
    9. Skölj skallen med steril kokolin och torka den med steril bomullspetsapplikatorer.
    10. Hitta brastoch lambda.
    11. Kontrollera platt skalle justering genom att placera spetsen på injektionnålen, justeras på stereotaxic ramen, på braskan och lambda. Mät ventralkoordinaterna för varje position och jämför. När skallen är platt ventrala koordinaten för både brasien och lambda är identiska. Om inte, justera huvudets position och ta mätningarna igen.
    12. Hitta och markera positionen (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm från brasiet enligt Franklin och Paxinos22) där injektionen av cre-beroende virus och implantation av optikfiber kommer att äga rum och göra ett litet hål med hjälp av en mikroborr.
    13. Last 400 nL virus i 10 μL spruta monterad på stereotaxic apparaten med hjälp av en precisionspump.
    14. Sänk nålen (34 G, avvek) försiktigt och injicera 300 nL cre-beroende optogenetiska virus(AAV5-EF1a-DIO-ChR2(H134)-eYFP [5,6 x 1012 vg/ml]) i VTA (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm från brasien och -4,4 mm från skallens yta, enligt Franklin och Paxinos22) vid 100 nL/min injektionshastighet med hjälp av precisionspumpen.
    15. Efter injektionen, lämna nålen på plats i ytterligare 10 min för att möjliggöra spridning av viruset(figur 2A).
    16. Dra tillbaka nålen långsamt från injektionsstället.
    17. Gör små hål med hjälp av en mikroborr för att passa ankare skruvar som kommer att stabilisera optik fiber och tandcement komplex.
    18. Ta bragma koordinaterna igen och implantera optikfibern (200 μm diameter, 0,37 NA) vid: AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm från brasa och -4,0 mm från skallans yta (figur 2B)enligt Franklin och Paxinos22.
    19. Säkra fibern på skallen med tandcement. Applicera tillräckligt med cement runt den optiska fiberferule för att säkra den på skallen men var uppmärksam på att lämna 3−4 mm av toppen av ferule fri från cement för att möjliggöra anslutning av patchsladden(figur 2C).
      OBS: Var uppmärksam på att inte fylla hålet med cement eftersom detta kan orsaka skador på hjärnvävnaden. Hemostatiska material kan läggas till i hålet för att förhindra att detta händer.
    20. Använd vävnadlim eller absorberbara suturer för att stänga alla öppna sår och låt djuret återhämta sig i minst två veckor. Ge en extra dos av smärtstillande 12−24 h efter operationen.

3. Ställa in laserkällans kontroll

  1. Använd mikrokontroller med en kortbräda för att styra laserkällan. Skriv ett skript med rätt programvara. Fyll på skriptet på mikrostyrenheten med hjälp av lämplig anslutningskabel till datorn.
    SKRIPTET bör innehålla extern modulering (ingång) som kommer från spårningsprogrammet via en TTL-ruta och en utgång till lasern för att styra stimuleringsparametrar. För 10 ms pulsbredd vid 20 Hz frekvens, använd skriptet som finns i Supplemental Coding File.
  2. Anslut kortet till lasern och TTL-rutan för spårningsmaskinvaran.
    1. Använd en nätverkskabel för att ansluta TTL-rutan till kortet (stift 5 för det medföljande skriptet)(bild 3A,C).
    2. Se till att lasern är inställd på att styra genom extern modulering och anslut lasern till kortet med hjälp av en FC / PC-kabel (stift 13 för det angivna skriptet)(figur 3B,C).
    3. Anslut lämpliga stift till slipdelar på brädet.
  3. Anslut laserkällan till den optiska fibern.
    1. Anslut laserkällan till en roterande led(figur 3D).
    2. Anslut en patchsladd(figur 3E)till den roterande leden.
    3. Stabilisera vridleden ovanför apparaten men utanför inspelningsområdet. Se till att längden på den fiberoptiska plåstret sladden är lämplig för att musen ska kunna röra sig utan problem i arenan(figur 3F).

4. Ställa in experimentet för RT-PP-metoden i spårningsprogrammet

  1. Kalibrera arenainstallationen. Använd en linjal för att mäta en viss del av den fysiska apparaten, rita en linje som motsvarar den del som mäts på bilden i programvaran under fliken Rita skala för att kalibrera och ange det redan kända värdet (steg 1 i figur 4).
  2. Designa arenan. Rita det område där mössens rörelse kommer att registreras (steg 2 i figur 4).
  3. Skapa zonerna. Rita de zoner som så småningom kommer att tilldelas som laser-parade, laser-unpaired och "neutral" (steg 3 i figur 4).
  4. Validera inställningen för att bekräfta att det inte finns några motstridiga parametrar, till exempel zoner utanför arenan (steg 4 i figur 4)
  5. Ställ in de experimentella parametrarna under tabbkontrollinställningarna (steg 5 i bild 4).
    1. Ställ in testtiden som visas i steg 1 i figur 5 för en 30 min RT-PP-session.
    2. Se till att "maskinvarukontroll" är aktiverat, tilldela ett fack som laser-ihopkopplade där inmatning av musen kommer att utlösa en TTL-signal genom spårningsprogrammet till microcontroller styrelsen. I bild 5 (steg 2) är det laserparade facket fack A. För återföringsfasen växlar du facken så att fack B kommer att laserparas ihop och fack A kommer att vara oparade. Gör det genom att ersätta A med B och B med A i programvaran.

5. Ändring av installationen för att testa stimuleringens aversiva egenskaper med hjälp av NCP-metoden

  1. Följ steg 4.1−4.4 som beskrivits tidigare.
  2. Ställ in tiden för experimentet till 30 min genom alternativet "Upprepa till" i inställningarna "Referens" (steg 1 i bild 6).
  3. Tilldela både A- och B-zoner som laserparade (steg 2 i bild 6)genom att lägga till "när mittpunkten finns i någon av zon A och zon B" för villkorsrutan som är relaterad till inställningarna för A- och B-fack. Observera att lasern stängs av när djuret sitter i det neutrala facket.

6. Utföra ett experiment med laserstimulering

  1. Ställ in identifieringsinställningarna.
    1. Använd en docka för att likna musen för att säkerställa lämpliga identifieringsinställningar.
    2. Placera dockan i ett fack av apparaten och använd automatiserad installation med dynamisk subtraktion.
    3. Ta bort dockan och placera den i det motsatta facket. Se till att dockan är helt upptäckt och om inte, justera inställningarna via programvaran för att uppnå korrekt upptäckt.
      1. Under detta steg också kontrollera om stimulering fungerar som det är tänkt att. Börja förvärv med de tidigare konfigurerade inställningar för försökskontroll och placera dockan i laserparfacket och se om stimuleringen utlöses som den ska. Placera sedan dockan i det oparade och/eller det neutrala facket och se om stimuleringen stoppas.
  2. Använd en effektmätare med en sensor för att ställa in lasereffekten på 10 mW med hjälp av ratten på lasern(bild 3B). Utför detta steg varje gång laserstimulering används.
    VARNING: Använd skyddsglasögon som direkt exponering för laserljus kan orsaka permanenta ögonskador.
  3. Placera musen i apparaten.
    1. Ta försiktigt musen ur sin bur och anslut det fiberoptiska implantatet till fiberoptisk patchsladd med hjälp av en keramisk hylsa.
    2. Placera musen försiktigt i trefacks apparatens neutrala fack.
    3. Vänta tills musen upptäcks av programvaran.
    4. Ta bort de vertikala skjutdörrar som begränsar djuret från att komma in i huvudfacken.
    5. Låt djuret utforska fritt utan några störningar.
      OBS: Samma förfarande följs när djuret inte får stimulering med undantag för att steg 6.2 inte behövs och att lasern är avstängd hela tiden.

Representative Results

Trefacksapparaten(figur 3F)är lämplig för att ta itu med de givande effekterna av läkemedel och att i realtid bedöma de givande eller aversive egenskaperna hos direkt stimulering av nervceller med optogenetik. Den består av två huvudfack (20 cm [W] x 18 cm [L] x 25 cm [H]) och ett mindre anslutningsfack (20 cm [W] x 7 cm [L] x 25 cm [H]). De viktigaste facken har distinkt vägg och golv konsistens och mönster för att underlätta associativ inlärning, medan ansluta / neutrala facket är smal och transparent så att mössen tillbringar naturligt mindre tid i den. Som beskrivits ovan kan spårningsprogrammet användas för att registrera flera beteendemässiga parametrar för mössen, inklusive rörelse och tid i varje fack, och för att styra laserstimuleringen. Hela RT-PP-experimentet äger rum under 8 sessioner(figur 1A)och möjliggör både bedömning av den direkta stimuleringens givande eller aversiva egenskaper (dag 3, 4, 6 och 7) och bildandet av associationer, positiva eller negativa, som svar på tidigare erfarenheter (dag 5 och 8, "CR").

För det första testade vi DAT-Cre möss injiceras med AAV-ChR2-eYFP virus i VTA att rikta dopaminerga nervceller. I enlighet med litteraturen Vi observerade att mössen föredrog att tillbringa tid i facket i kombination med stimulering (figur 1B,fas 1, dagar 3 och 4, blå cirklar, tvåvägsupprepade åtgärder [RM] analys av varians [ANOVA], effekten av fack F(2,18) = 141, p < 0,001; effekten av session x delf(12,108) = 42,1, p < 0,001; Tukeys post hoc-test parat vs oparade p < 0,001). Återföringsfasen, där parningen av facken till laserstimulering byttes, bekräftade dessa observationer (figur 1B,dag 6 och 7, blå cirklar, Tukeys post hoc-test parat vs oparade fack p < 0,001) vilket utesluter möjligheten att de resultat som erhållits från fas 1 var relaterade till sidofördomar eller slumpmässiga parametrar. I genomsnitt den tid som tillbringas i varje fack under de fyra dagarna av RT-PP bekräftade att mössen tillbringade i genomsnitt cirka 70% av sin tid i laser parade facket i motsats till den oparade (~ 20%) och neutral (~10%) fack(bild 1B-stapeldiagram, enkelriktad RM ANOVA, effekten av stimulering F(2,6) = 139, p < 0.001, Tukeys inlägg hur parat vs oparade och neutrala fack p < 0,001). I avsaknad av stimulans, på dag 5 och 8, tillbringade mössen betydligt mer tid i facket som tidigare parats ihop med laserstimulering (Tukeys post hoc p < 0.001), vilket tyder på att den tidigare upplevelsen var tillräcklig för att inducera associativa inlärningsbeteenden som återspeglas som "söker" av stimuleringen. Dessa data är i enlighet med litteraturen och visar att den nuvarande metoden kan användas tillförlitligt för att undersöka de givande effekterna av optogenetisk stimulering av specifika neuronala populationer i VTA.

Vi testade sedan VGLUT2-Cre möss injiceras med AAV-ChR2-eYFP i VTA enligt ovan, för att rikta glutamaterga nervceller i VTA. I detta experiment observerade vi en motsatt beteendemässig fenotyp från den som visades av DAT-Cre möss. Mössen undvek således facket i kombination med stimuleringen och tillbringade mer tid i de oparade under alla RT-PP-dagar(figur 1C vänster, tvåvägs RM ANOVA, effekt av fack F(2,12) = 40,9, p < 0.001; effekten av session x fack F(12,72) = 16,1, p < 0.001; Tukeys post hoc-test parat vs oparade p < 0,001; Figur 1C höger, enkelriktad RM ANOVA effekt av stimulering F(2,6) = 162, p < 0.001, Tukeys post hoc parat vs oparade och neutrala fack p < 0,001). Intressant nog visade mössen under "CR" dagar 5 och 8 inte ett tydligt undvikande av det tidigare parade facket (inga skillnader mellan parade och oparade fack). Det är möjligt att bristen på konditionerat svar beror på otillräcklig tid i laserparerade fack, vilket förhindrade bildandet av associationer mellan laseraktivering och den särskilda miljön där det ägde rum. För att ytterligare utforska denna undvikande fenotyp använde vi ett modifierat protokoll som vi kallade "neutrala fackpreferens", förkortat NCP. I detta experiment var båda huvudfacken kopplade till stimulering och det neutrala facket förblev stimuleringsfritt(figur 7A). Vi hypotesen att om stimuleringen har aversive egenskaper, då musen kommer att tvingas tillbringa tid i mindre, neutrala fack, för att undvika det. I båda stimuleringsdagarna (Stim1 och Stim2) tillbringade mössen större delen av tiden i det neutrala facket (ca 80%) jämfört med de parade facken(figur 7B,C; vänster: tvåvägs RM ANOVA-effekt av delF(2,8) = 70,9, p < 0.001; effekten av session x fack F(4,16) = 6,9, p = 0,002, Tukeys post hoc "Stimulering 1" neutralt fack vs fack 1 och 2 p < 0,01, "Stimulering 2" neutralt fack vs fack 1 och 2 p < 0,001; höger: enkelriktad RM ANOVA, effekten av F stimulering(2,2) = 54,2, p = 0.018, Tukeys post hoc-test parade 1 och 2 vs neutralp < 0,05). Liksom i fallet med "CR" dagar under RT-PP-testet, verkade mössen inte bilda negativa associationer mellan facken och stimulering; det vill i avsaknad av stimulans (CR) undersökte de alla fack i samma utsträckning(figur 7B, inga skillnader mellan tid i parade fack och neutralt fack). Resultaten av dessa experiment bekräftade beteendemässiga fenotyp observerats under RT-PP setup och därmed stödja kombinatoriska genomförandet av både RT-PP och NCP paradigm.

Figure 1
Figur 1: Beteendetester med optogenetik i RT-PP paradigm. (A)Schematisk representation av experimentens tidslinje. (B,C) Överst till vänster: diagram som representerar den procentandel tid som tillbringas i varje fack under RT-PP-experimentet för DAT-Cre (N = 10) och VGLUT2-Cre (N = 7) möss injiceras med AAV-ChR2-eYFP. Blå cirklar: laserparerat fack; Vita, svarta cirklar: huvudfack; grå cirklar: neutralt fack. Övre högra: genomsnittlig andel av tiden i varje fack under dag 3, 4, 6 och 7 (RT-PP). Botten: representativa värmekartor över tid som tillbringas i varje fack för en DAT-Cre och en VGLUT2-Cre mus. Alla data distribuerades normalt (Shapiro-Wilk test). Resultaten presenteras som medelvärde ± SEM. ***p < 0.001 parade vs oparade; #p < 0,05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 parade vs neutrala fack; §§p < 0.01, §§§§p < 0.001 oparade vs neutrala fack. Denna siffra har ändrats från Bimpisidis et al.12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Kirurgiskt ingrepp för optogenetiska experiment. (A)Injektion av cre-beroende virusvektor i VTA. (B)Implantation av optikfibern ovanför injektionsstället. Notera de fästskruvar som används för stabilisering. (C)Permanent förankring av fibern på skallen med tandcement. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Utrustning som används i optogenetikexperimenten. (A)Den TTL-låda som används i studierna. Den får indata från spårningsprogrammet och skickar TTL-signaler till mikrokontrollerkortet. (B)Fram (överst) och bakifrån (nederst) av laserkällan som används för experimenten. (C)Mikrokontrollerkortet som används för att styra laserstimuleringen. Observera anslutningarna från TTL-rutan och laserkällan. (D)Rotarygemensamma. (E) Fiberoptiskt plåstret som används i experimenten. F)Den trefacksapparat som används för RT-PP- och NCP-experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Bild 4: Designa arena och zoner i spårningsprogrammet. Steg 1: Kalibrering av installationen. Steg 2: Ritning av hela arenan. Steg 3: Ritningszoner inom arenan. Steg 4: Konfigurationsvalidering. Steg 5: Fliken Inställningar för testkontroll för att ställa in tids- och stimuleringsparametrar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Bild 5: Ställa in tids- och stimuleringsparametrar för ett RT-PP-experiment i spårningsprogrammet. Lägga till specifika regler för varaktigheten (steg 1) och villkoren för ljusstimulering (steg 2). Förhållandena kan enkelt ändras för att passa kraven för återföringsfasen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Bild 6: Ställa in tids- och stimuleringsparametrar för NCP-experiment i spårningsprogrammet. Varaktigheten av stimulering sessioner (steg 1) liknar de för RT-PP men villkoren för ljus stimulering aktivering (steg 2) är olika. Inträde till antingen huvudfacket (här med namnet zon A och zon B) resulterar i optogenetisk stimulering som avslutas endast när musen kommer in i det neutrala facket. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Beteendetester med optogenetik i NCP paradigm. (A)Schematisk representation av den experimentella installationen. (B)Vänster: diagram som representerar den procentandel tid som tillbringas i varje fack under de två stimuleringsdagarna (Stim1 och Stim 2) och under den konditionerade svarssessionen (CR) för VGLUT2-Cre-möss som injiceras med AAV-ChR2 i VTA (N = 5). Höger: genomsnittlig procentandel av tiden i varje fack under de två dagarna av stimulering av NCP. (C)Representativ värmekarta över den tid som tillbringas i varje fack för en VGLUT2-Cre mus under en av stimuleringsdagarna. Data distribuerades normalt (Shapiro-Wilk test). Resultaten presenteras som medelvärde ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 oparade vs parade 1 och parade 2 fack. Denna siffra har ändrats från Bimpisidis et al.12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Steg Temperatur Varaktighet Cykler
1. Inledande denaturering 95 °C 4 min 1
2. Denaturering 95 °C 30 s 30
3. Glöde 55 °C 30 s
4. Förlängning 72 °C 40 s
5. Slutlig förlängning 72 °C 6 min 1
6. Håll 4 °C Tills stoppas av experimentören 1

Tabell 1: PCR cykelprogram.

Kompletterande kodningfil. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).

Discussion

I den aktuella studien presenterar vi två steg-för-steg-protokoll om hur man utför olika typer av platspreferensanalyser med optogenetik hos möss. De protokoll som beskrivs användes för att bedöma givande eller aversiv beteendemässiga fenotyper av VTA nervceller(Figur 1 och figur 6)12, men kan användas för att utforska beteendemässiga roll nervceller i andra hjärnregioner också.

Flera nyligen genomförda studier har beskrivit RT-PP paradigm i två-fack23,24 och tre-fack apparater13,14,15,16,17,18. De nuvarande protokollen beskriver detaljerade inställningar för RT-PP- och NCP-protokollen i en apparat med tre fack som liknar dem som traditionellt används i CPP-experiment för att bedöma beteendemässiga effekter vid administrering av missbruksläkemedel. Medan resultaten presenteras endast här som den procentandel av tiden musen tillbringade i varje fack, gör spårningsprogrammet möjliggör analys av flera andra beteendemässiga parametrar, såsom övergångar till zoner, hastighet, tid som spenderas immobilisera och mycket mer. Analys av olika parametrar kan vara av betydelse för tolkningen av data.

De nuvarande RT-PP-protokollen är flexibla och kan ändras för att testa om olika typer av stimuleringsmönster har givande effekter. Parametrarna för laserkontroll kan enkelt ändras antingen genom skriptet på mikrokontroller kortet eller inom spårningsprogrammet, vilket visar mångsidigheten i installationen. Vi föreslår en 20 Hz stimulering sats som är inom intervallet, och ibland lägre, av frekvenser som tillämpas i tidigare studier med samma opsin variant (ChR2/H134R) för att studera dopaminerga och glutamaterga nervceller och deras terminaler13,14,16,17,18,23,24,25,26,27. Nyligen genomförda studier har visat att högre stimuleringsfrekvenser kan ha motsatta effekter på beteendet än lägre, och att dessa effekter medieras genom ett depolariseringsblock som orsakas av högre frekvenser28. På samma sätt har skillnader i beteendeproduktion visats när stimulera glutamaterga och GABAergic nervceller i det laterala preoptic området15. Dessa studier undersökte nervceller i olika områden än VTA och de största effekterna observerades på höga frekvenser av icke-glutamaterga nervceller15,28. Vårt val på 20 Hz är baserat på tidigare studier av glutamatergiska och dopaminerga VTA nervceller visar att genom varierande stimulering frekvenser, belöning-relaterade beteendemässiga produktionen inte väsentligt ändras24,26.

En ytterligare parameter som kan justeras och som kan påverka det experimentella resultatet är ljuskällans kraft. Högre laserkraft kan öka storleken på det ljusstimulerade området, vilket kan vara fördelaktigt i vissa typer av experiment men med nackdelen med en ökning av temperaturen5. Faktum är att en färsk studie har visat att laser-inducerad temperaturökningar kan förändra hjärnans fysiologi och påverka beteendemässiga mätningar29. Dessa observationer belyser vikten av att inkludera opsin-negativa kontroller i den experimentella designen. I det nuvarande protokollet använde vi 10 mW laserkraft som är liknande och har tidigare visat sig vara effektiva för att stimulera dopaminerga och glutamaterga nervceller i VTA16,24,26. När du ställer in experiment är det viktigt att vara uppmärksam på storleken på det område där de olika cellerna i intresse finns och fiberoptik och patchegenskaper (numerisk bländare, kärndiameter). Dessa parametrar är viktiga att ta hänsyn till när du utför beräkningar relaterade till laserkraft. För mer information kan kalkylatorn som utvecklats av Karl Deisseroths labb (http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php) användas.

Histologisk kontroll av Cre-Lox rekombination är en annan kritisk aspekt vid tillämpning av optogenetik experiment. Validering av rekombinationseffektiviteten bör alltid ske i en pilotkohort innan beteendeexperiment i en stor grupp av djur inleds. Detta är viktigt av etiska skäl men också för optimerad experimentell produktion. Varje viruskonstruktion kan visa varierande specificitet för olika neuronala typer och i olika regioner5, en parameter som kan påverka experimenten på oförutsägbara och till och med vilseledande sätt. Till exempel har vi tidigare validerat Cre-Lox rekombination mönster av AAV5 virus i VTA av DAT-Cre möss och fann att ensidiga injektioner var tillräckliga för att rikta majoriteten av intresseområdet. När vi sedan studerade rumsligt begränsade subpopulationer inom VTA, såsom en som kännetecknas av NeuroD6 uttryck, observerade vi att bilaterala viral injektioner var effektivare att rikta större antal nervceller ger mer uttalade beteendemässiga effekter på optogenetiska ljusstimulering12. Dessutom måste tiden från operation till inledande av beteendeexperiment behandlas noggrant. Två veckor är tillräckligt med tid för en ChR2 DNA-konstruktion som skall uttryckas i cellorgan som vi visar här, men längre väntetider (~ 8 veckor) kan behövas om utredaren testar effekten av stimulering i projektionsområden13,14,15,17.

Det värt att notera att volymen av virus injiceras (i vårt fall 300 nL) kan vara lämplig när man studerar nervceller i VTA, men volym och titer måste justeras beroende på effektiviteten av transduktion och storleken på den studerade strukturen. Dessutom, för bilaterala strukturer som ligger på avstånd från den mediolaterala axeln, kan det vara nödvändigt att utföra bilaterala injektioner, och att även implantera fiberoptik bilateralt för att säkerställa aktivering / hämning på båda halvkloten.

Slutligen är det alltid nödvändigt att utföra post-mortem histologisk analys för att validera och bekräfta effektiviteten i Cre-Lox rekombination och att kontrollera rätt implantation plats för optikfiber på avsedd plats. Oväntad, överbegränsad eller överdriven Cre-Lox rekombination kan uppstå på grund av okänd distribution av nervceller som uttrycker Cre utanför gränserna för det avsedda området, eller på grund av skillnader i viruset serotyp, dålig hantering av viruset, igensättning av viruset spruta för virusleverans eller andra operationsrelaterade problem. Verifiering av tillfredsställande Cre-Lox rekombination och korrekt fiberoptik-implantation måste utföras för att bekräfta eventuella statistiska resultat av beteendemässiga bedömningar för att dra säkra slutsatser.

När det gäller de data som ges här som exempel på hur de två beteendemässiga paradigm kan användas, den betydande preferens till ljus-parade sida erhålls genom optogenetisk stimulering av dopaminerga nervceller i VTA genom att analysera DAT-Cre möss i RT-PP paradigm förväntades baserat på tidigare resultat23,24,25,26,27 medan undvikande av denna sida som visas av VGLUT2-Cre möss inte förväntades. VGLUT2 nervceller i VTA och deras prognoser har visat sig vara inblandade i både belöning och motvilja16,17,24,30,31, och vi utförde därför NCP analys för att bedöma den uppenbara undvikande beteende som observerats i den nuvarande RT-PP setup mer i detalj. Genom att använda den smala, transparenta korridoren som den enda icke-lätta ihopkopplade facket för att bekräfta de aversiva egenskaperna hos stimulering av VTA glutamaterga nervceller, är det uppenbart att i denna särskilda tre-fack setup, optogenetisk aktivering av dessa nervceller orsakar en aversiv reaktion. Dessa experiment, som visades här för att exemplifiera situationer som kan dra nytta av att använda både RT-PP och NCP protokoll, var en del av en nyligen publicerad studie, och den fullständiga datauppsättningen samt diskussioner om dessa resultat finns i denna publikation12.

Förutom NCP, alternativa sätt att bekräfta motvilja inkluderar stark belysning av ett område inom ett öppet fält område medan para ihop resten av arenan till laser aktivering, eller utföra en aktiv undvikande uppgift där musen måste utföra ett specifikt beteendemönster för att avsluta laser stimulering15.

Sammanfattningsvis ger de beskrivna protokollen kritisk information om hur du framgångsrikt utför RT-PP- och NCP-analys på det mest effektiva sättet för att reda ut rollen som neuronal aktivering i belöning och motvilja. Beroende på den vetenskapliga hypotesen kan en rad parametrar analyseras med hjälp av dessa protokoll, och varje protokoll kan också kombineras med andra validerade paradigm för optimerade beteendeanalyser som implementerar optogenetik för att ta itu med specifika hjärnan områden och nervceller av intresse.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Våra finansieringskällor är tacksamt erkända: Uppsala universitet, Vetenskapsrådet, Hjärnfonden, Parkinsonfonden, Bertil Hållstens forskningsstiftelser, OE&Edla Johansson, Zoologisk Forskning och Åhlén. Djur hölls vid Uppsala universitet och experiment utfördes vid Uppsala universitets beteendeanläggning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV-Cre dependent virus UNC Vector Core - a great variety of viruses to suit any project's needs
Agarose VWR Life Science 443666A
Buffer for PCR KAPA BIOSYSTEMS KB1003 10x, contains 1.5mM MgCl2 at 1x
Bupivacaine (Marcain) Aspen N01BB01 local anesthetic, 5 mg/ml solution, requires prescription
Carprofen (Norocarp) N-Vet 27636 anti-inflammatory, analgesic; 50 mg/ml solution, requires prescription
dNTP set Thermo Fisher Scientific R0181 100mM, have to be dilluted to 10mM and mixed
DNA ladder Thermo Fisher Scientific SM0243 100 bp, 50 μg Gene Ruler
DNA loading dye Thermo Fisher Scientific R0611 6x, dilute to 1x before using
Ear puncher AgnThos AT7000 ear puncher to take tissue samples for PCR or to mark animals
Fiberoptic patchcords Doric Lenses MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25
Implantable fiberoptics Doric Lenses MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT the properties of the fibers might change depending on the experiment
Infusion pump for virus injections AgnThos Legato 130 contains remote pump to secure the syringe directly on the stereotexi frame
Isoflurane (Forane) Baxter N01AB06 Volatile anesthetic, requires prescription
Jewelry screws AgnThos MCS1x2
Laser source Marwell Laser Systems CNI MBL-III-473-100mW
Microcontroller board Arduino "Uno" board can be ordered from several companies
Microdrill AgnThos 1474 could be ordered with or without stereotaxic holder
Needle (34G) World Precision Instruments NF36BV
Nucleic Acid gel stain - GelRed Biotium 41003-T
PCR tubes Axygen PCR-0208-CP-C
Power meter Thorlabs PM100D
Place Preference Apparatus Panlab 76-0278
Rotary joint Doric Lenses FRJ_1x1_FC-FC
Sleeves Doric Lenses SLEEVE_ZR_1-25 mating sleeve to connect the patchcord with the implanted optic fiber
Stabilization cement Ivoclar Vivadent Tetric EvoFlow
Syringe (10ul) World Precision Instruments NanoFil
Taq polymerase KAPA BIOSYSTEMS KE1000 500U
TAE buffer Omega BIO-TEK SKU:AC10089 50x concentration, has to be dilluted before use
Thermal cycler BIO-RAD S1000 1852148 necessary to perfrom PCR reactions
Tissue glue AgnThos Vetbond
Tracking software Noldus Ethovision XT
TTL box Noldus Noldus USB-IO box
UV transilluminator Azure Biosystems c200 model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The Development and Application of Optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, (1), 389-412 (2011).
  2. Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18, (4), 222-235 (2017).
  3. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18, (9), 1213-1225 (2015).
  4. Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, (2), 99-109 (2000).
  5. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71, (1), 9-34 (2011).
  6. Pupe, S., Wallén-Mackenzie, Å Cre-driven optogenetics in the heterogeneous genetic panorama of the VTA. Trends in Neurosciences. 38, (6), 375-386 (2015).
  7. Spanagel, R. Animal models of addiction. Dialogues in Clinical Neuroscience. 19, (3), 247-258 (2017).
  8. Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: Update of the last decade. Addiction Biology. 12, (3-4), 227 (2007).
  9. Hoffman, D. C. The use of place conditioning in studying the neuropharmacology of drug reinforcement. Brain Research Bulletin. 23, (4-5), 373-387 (1989).
  10. Huston, J. P., Silva, M. A. D. S., Topic, B., Müller, C. P. What's conditioned in conditioned place preference? Trends in Pharmacological Sciences. 34, (3), 162-166 (2013).
  11. Bardo, M. T., Bevins, R. A. Conditioned place preference: What does it add to our preclinical understanding of drug reward? Psychopharmacology. 153, (1), 31-43 (2000).
  12. Bimpisidis, Z., et al. The NeuroD6 subtype of VTA neurons contributes to psychostimulant sensitization and behavioral reinforcement. eNeuro. 6, (3), e0066 (2019).
  13. Root, D. H., Mejias-Aponte, C. A., Qi, J., Morales, M. Role of Glutamatergic Projections from Ventral Tegmental Area to Lateral Habenula in Aversive Conditioning. Journal of Neuroscience. 34, (42), 13906-13910 (2014).
  14. Steidl, S., Wang, H., Ordonez, M., Zhang, S., Morales, M. Optogenetic excitation in the ventral tegmental area of glutamatergic or cholinergic inputs from the laterodorsal tegmental area drives reward. European Journal of Neuroscience. 45, (4), 559-571 (2017).
  15. Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21, (7), 1757-1769 (2017).
  16. Wang, H. L., Qi, J., Zhang, S., Wang, H., Morales, M. Rewarding Effects of Optical Stimulation of Ventral Tegmental Area Glutamatergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 35, (48), 15948-15954 (2015).
  17. Qi, J., et al. VTA glutamatergic inputs to nucleus accumbens drive aversion by acting on GABAergic interneurons. Nature Neuroscience. 19, 725-733 (2016).
  18. Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nature Communications. 5, 5390 (2014).
  19. Ekstrand, M. I., et al. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (4), 1325-1330 (2007).
  20. Borgius, L., Restrepo, C. E., Leao, R. N., Saleh, N., Kiehn, O. A transgenic mouse line for molecular genetic analysis of excitatory glutamatergic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 45, (3), 245-257 (2010).
  21. Papathanou, M., et al. Targeting VGLUT2 in Mature Dopamine Neurons Decreases Mesoaccumbal Glutamatergic Transmission and Identifies a Role for Glutamate Co-release in Synaptic Plasticity by Increasing Baseline AMPA/NMDA Ratio. Frontiers in Neural Circuits. 12, 64 (2018).
  22. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Academic Press. Boston, MA. (2008).
  23. Tsai, H. C., et al. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning. Science. 324, (5930), 1080-1084 (2009).
  24. Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 1-13 (2016).
  25. Pascoli, V., Terrier, J., Hiver, A., Lüscher, C. Sufficiency of Mesolimbic Dopamine Neuron Stimulation for the Progression to Addiction. Neuron. 88, (5), 1054-1066 (2015).
  26. Ilango, A., Kesner, A. J., Broker, C. J., Wang, D. V., Ikemoto, S. Phasic excitation of ventral tegmental dopamine neurons potentiates the initiation of conditioned approach behavior: parametric and reinforcement-schedule analyses. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 155 (2014).
  27. Kim, K. M., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PLoS ONE. 7, (4), 1-8 (2012).
  28. Kroeger, D., et al. Galanin neurons in the ventrolateral preoptic area promote sleep and heat loss in mice. Nature Communications. 9, 4129 (2018).
  29. Owen, S. F., Liu, M. H., Kreitzer, A. C. Thermal constraints on in vivo optogenetic manipulations. Nature Neuroscience. 22, (7), 1061-1065 (2019).
  30. Root, D. H., Estrin, D. J., Morales, M. Aversion or Salience Signaling by Ventral Tegmental Area Glutamate Neurons. iScience. 2, 51-62 (2018).
  31. Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85, (2), 429-438 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics