הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

JoVE Journal
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לנתח את חלוקת התא ברקמה שלמה על ידי מיקרוסקופ התאים החיים והקבוע באמצעות דרוסוילה מיוטיק מאיוציטים. הפרוטוקול מדגים כיצד לבודד את כל האשכים שלמים, מזחלים מדרוזופילה ומהגלמים המוקדמים, וכיצד לעבד ולטעון אותם למיקרוסקופיה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue. J. Vis. Exp. (159), e60961, doi:10.3791/60961 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ניתוח ניסיוני של תאים חילוק בחיים, רקמות ואיברים שלמים הוא חיוני להבנת איך חלוקת התא משתלב עם פיתוח, רקמות הומאוסטזיס, ותהליכי מחלות. דרוזופילה ספרמטוציטים שעוברים מיוזיס הם אידיאליים עבור ניתוח זה, כי (1) כל drosophila האשכים המכילים spermatocytes קל יחסית להתכונן למיקרוסקופיה, (2) בגודל גדול של הספרציטים הופך אותם מתאימים היטב לדימות ברזולוציה גבוהה, ו (3) הכלים הגנטיים של drosophila יכול להיות משולב כאן, אנו מציגים פרוטוקול נגיש בקלות להכנת האשכים שלמים מדרוזוהילה הזחלים השלישי והגלמים המוקדמים. אנו מתארים כיצד לזהות ספרמטציטים מיוטיות בתוך האשכים המוכנים וכיצד לדמות אותם חיים על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות. פרוטוקולים עבור קיבוע והכתים האשכים שלם מסופקים גם. השימוש האשכים זחל יש מספר יתרונות על פרוטוקולים זמינים המשתמשים באשכים מבוגרים לניתוח spermatocyte. החשוב ביותר, האשכים זחל הם קטנים פחות צפוף עם תאים מאשר האשכים למבוגרים, וזה מאפשר מאוד הדמיה ברזולוציה גבוהה של spermatocytes. כדי להדגים את היתרונות הללו ואת היישומים של הפרוטוקולים, אנו מציגים את התוצאות המציגות את ההפצה משנה של הרשת האנדופלזמית לגבי מיקרוטובוקלס במהלך חלוקת תאים באמצעות מיקרוסקופ בודד שנוצר על-ידי מיקרוסקופיה בזמן הקפיצה. הפרוטוקולים יכולים להיות משולבים עם הביטוי של כל מספר של חלבונים מתויגים fluorescently או סמנים ארגונית, כמו גם מוטציות גנטיות וכלים גנטיים אחרים, מה שהופך גישה זו חזק במיוחד עבור ניתוח של מנגנוני חלוקת התא בהקשר הפיזיולוגי של רקמות ואיברים שלמים.

Introduction

חלוקת התא לומדת לעתים קרובות באמצעות קווי תאים הגדלים בתרבות1. למרות שרכשנו שפע של תובנה והבנה לא יסולא בפז של מנגנונים בסיסיים ממחקרים אלה2, תאים שגדלו בתרבות לא יכולים ללכוד באופן מלא את הפיזיולוגיה של חלוקת התא כפי שהוא מתרחש ברקמה חיה שלמה. לדוגמה, ברקמות ובאיברים שלמים, התאים חייבים להתחלק במקום הנכון ובזמן הנכון כך שתאים צאצאים ממוקמים כראוי בתוך הרקמה, כך שהם יכולים לעבור בידול מתאים או תוכניות פונקציונלי, ולכן התפשטות התא מתואמת כראוי עם צמיחה רקמות או הומאוסטזיס3. עבור תאים שגדלו בתרבות מצד שני, החטיבה התא מוסדר בדרך כלל על ידי גורמי גדילה במדיום התרבות4, ולכן אנחנו לא יכולים ללמוד מתאים אלה איך בvivo גורמים סביבתיים כגון אדריכלות רקמות או איתות התפתחותי להשפיע על תהליך החלוקה. חשוב גם לציין כי רבים של קווי התא המשמשים לחקר חלוקת התא, כגון התאים הלה ו U2OS, נגזר גידולים גרורתי5. לכן, היבטים רבים של הפיזיולוגיה הבסיסית של תאים אלה סרטניים, כגון מנגנוני הרגולציה מחזור התא ויציבות כרומוזומלית, סביר להניח ששונו לעומת תאים בריאים. הבנה מלאה של הפיזיולוגיה של חלוקת התא, לפיכך, תלויה ביכולתנו ללמוד את התאים המקוריים שלהם, בסביבות vivo השימור מנגנונים פיזיולוגיים וארכיטקטורת רקמות.

ההתקדמות בהבנת האופן שבו חטיבת התאים פועלת בתוך רקמות ואברים שלמים, מתקשים בvivo או בניתוח vivo לשעבר. ראשית, זה יכול להיות קשה או בלתי אפשרי כדי לגשת מחלוקת תאים לניתוח מיקרוסקופי בתוך איברים גדולים או עבה רקמות. שנית, קשה לעתים קרובות לנבא כאשר תאים בודדים מתחלקים בvivo. שלישית, פיזיולוגיה של רקמות עלולה להתדרדר במהירות במהלך התרבות הvivo לשעבר. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות נגישות בקלות לניתוח בשידור חי וקבוע של דרוסופילה מלאנומנוציטים בזמן שהם עוברים מחלקות תאים מיוטיות בתוך האשכים שלמים לחלוטין. תאים אלה הם אידיאליים עבור לחיות, לשעבר ניתוח vivo כי הם נגישים בקלות עם שיטות אופטיות סטנדרטיות כגון קונפוקלית מיקרוסקופ, הם מתחלקים בזמנים צפויים ומיקומים, ואת האשכים שלמים ניתן לשמור בתרבות לשעבר vivo עד כ 24 h. בנוסף, דרוזופילה ספרציטים הם תאים עגולים גדולים (כ -20-30 יקרומטר בקוטר) שאינם משנים צורה כאשר הם מתחלקים, והופכים אותם לאידיאליים ברזולוציה גבוהה, הדמיה של מרכיבי הסלולר כגון מנגנון הצירים והאורגלים הציטוטיים. למרות תאים אלה עוברים מיוזה לעומת mitosis, רבים של התהליכים החיוניים החטיבה התא דומים מאוד בין שני אלה מנגנוני חלוקת התא6. יתרונות אלה, בשילוב עם כלים גנטיים בעלי עוצמה דרוזוהילה , עשו דרוזוהילה ספרמטציטים בשימוש נרחב בדגם vivo ex של תהליכים של חטיבת תאים חיוניים, כולל היווצרות צירים ורגולציה, ציטוקינזה, ושיפוץ ארגונית וחלוקה למחיצות7,8,9,10,11.

הספרציטים הם תאים הנמצאים בשלב המיוטיסטי של זרע. בדרוזופילה, מתחילה הזרע עם קבוצה של תאי גזע של germline הממוקמים באזור קטן או "hub" בעמוד אחד של ה-12,13. תאים אלה מתחלקים על ידי מיטוזיס אסימטרית, ומעניק הרבה spermatogonium אחד הבדיל. הזרע לאחר מכן לעבור ארבעה mitoses סינכרוני כדי לייצר קבוצה של 16 תאים שנותרו קשורים היטב בתוך ציסטה אחת. בשלב זה, התאים מעבר מmitotic למחזור התא meiotic ומכונים spermatocytes. Spermatocytes לבלות שניים עד שלושה ימים בשלב מורחב G2 של מחזור התא, במהלכו הם גדלים באופן דרמטי ולעבור שינויים ציטולוגיים בהכנה עבור שתי חטיבות meiotic ו spermiogenesis הבאים13,14. הקבוצה כולה של 16 spermatocytes בתוך ציסטה אחת ולאחר מכן להיכנס החלוקה meiotic הראשון באותו זמן. לפיכך, ניתן לבצע יצירת תמונות של מספר ספרציטים במקביל כשהם ממשיכים דרך מחלקת התאים. החטיבה meiotic הראשון ההכנסות עבור כ 1.5 h והוא עקב כמעט מיד על ידי החטיבה השנייה meiotic, מניב 64 הכולל הכוללת כי להמשיך להבדיל לתוך הזרע בוגרת.

היתרון הייחודי של שימוש בספרציטים כדי ללמוד החטיבה התא בחיים, רקמה שלמה היא כי קבוצות או ציסטות של תאים התקדמות מתמדת דרך בשלבים שונים של הזרע, ותאים בכל שלבי הזרע ניתן בדרך כלל להיות מזוהה בכל בעיות נתון (ראה איור 3A). לכן, קל יחסית למצוא תאים meiotic באשכים שלמים. אנחנו בדרך כלל למקד את הניתוחים שלנו על הראשון לעומת מיוזה השני משום תאים אלה הם הרבה יותר גדול ומקובל יותר הדמיה ברזולוציה גבוהה, אבל התהליך כולו המקיף הן מחלקות מיוזה ניתן לבצע דימות בהצלחה. יצוין גם כי הפרוטוקול הכללי לקראת הכנה ותרבות ניתן להשתמש כדי לנתח תהליכים אחרים של הזרע כמו גם, כגון תא הגזע הקודם mitotic או מחלקות spermatogonial או שינויים ציטולוגיים המתרחשים כמו זכותנו מבוגרים לתוך הזרע15. רבים מן ההיבטים הללו של הזרע נשמרים במידה רבה בין דרוזוהילה לבני אדם16.

דרוזוהפילה ספרציטים מתחיל להגיע לשלב המיוסטי של הזרע במהלך הזחל השלישי של דרוזוהילה לפיתוח13. לפיכך, האשכים מבודדים משלבי מחזור חיים המתחילים בזחלים שלישיים ובכללם גלמים ומבוגרים יכולים לשמש לניתוח של חלוקת ספרציטים. פרוטוקולים מצוינים מספר זמינים עבור חילוץ של האשכים של גברים בוגרים זבובים לניתוח חי וקבוע של זרע בראשית17,18,19. פרוטוקולים אלה עשויים להיות עדיפים ללמוד בשלבים מאוחרים של הזרע או אם סמנים גנטיים הגלויים רק אצל מבוגרים יש להשתמש. הפרוטוקול מתמקד בהכנה של בדיקת הרימות והגלמים המוקדמים, משום שלאשכים בשלבים אלה יש מספר יתרונות הרלוונטיים במיוחד לניתוח של חלוקת תאים ברזולוציה גבוהה, מיקרוסקופ בזמן הקפיצה. ראשית, האשכים של הזחלים והגלמים קטנים יותר מאלה של מבוגרים, והתאים בתוך האיבר הם פחות צפוף. בגלל זה, חלוקת הספרציטים יכולה לעתים קרובות להיות בתמונה ליד המשטח החיצוני של האשכים זחל, מבלי לחדור דרך שכבות מרובות של רקמת פיזור אור. שנית, האשכים מבוגרים לזוז בקצב בשל התכווצויות של אברי האביזר המצורף, ותנועות אלה להפוך זמן לפקיעה הדמיה של תאים בודדים מאתגרת. ושלישית, האשכים הזחל הם יתרון כאשר לומדים מוטציות גנים הגורמות גולמי או מבוגרים השפעה. השיטות שלנו ממוטבת לתרבות ארוכת טווח של האשכים על הבמה המיקרוסקופ, המאפשר דימות של סיבובים מרובים של חלוקת התא או התקדמות של תאים בודדים באמצעות שלבים מרובים של הזרע באותו הכנה. אנו מתארים גם פרוטוקול עבור קיבוע וכתמים חיסוני של האשכים שלמים. בסך הכל, הפרוטוקולים שלנו שימושיים במיוחד עבור אלה המעוניינים ללמוד חלוקת תאים ברקמה שלמה, ואת היכולת לשלב ניתוח spermatocyte עם מאוד צייתן הכלים הגנטיים הופך את זה גישה חזקה במיוחד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת בעלי חיים, כלים ומדיה לחיתוך

  1. להצליב זבובים זכר ונקבה כדי להשיג צאצאים של גנוטיפ הרצוי. סמנים הטרנסגניים שימושיים לזיהוי ואחסון זמני של הספרציטים כוללים GFP-טובולין כדי לתייג את ציר meiotic ו RFP-histone 2A כדי תווית כרומזומים8. השתמש חמש עד עשר נקבות לחצות ולשמור על צלבים על מזון לעוף רגיל בבקבוקונים בחממה של 25 ° c עד הזחלים השלישי להתחיל לזחול לצדדים של הבקבוקון (4 – 5 ימים). הגלמים הלבנים המוקדמים יתחילו להרכיב יום אחד לאחר מכן.
  2. להשיג שני זוגות של מלקחיים ישר עם טיפים קנס. ודא שהטיפים חדים, אפילו באורך וישר (איור 1A). השתמש מלקחיים אלה רק לניתוח, וכובע עם 10 μL הצינורות טיפים כאשר לא בשימוש.
  3. . הכן כלי אזמל
    1. הכנס את הקצה הקהה של סיכת חרק שחור מפלדה למחזיק פינים, וסובב את הבורג של המחזיק כדי לאבטח את הסיכה במקומה. באמצעות זוג מלקחיים ותחת מיקרוסקופ מבתר, אחוז בסיכת החרק באמצע וכופף אותו לצורת זווית פנימית של 135 ° (איור 1B). הקצה החד הוא לחיתוך רקמה, בעוד הקצה משמש להעברת האשכים בין טיפות התקשורת.
    2. Cap עם תשר של 1,000 μL לאחר שאינו בשימוש.
  4. בעבודה במכסה של תרבות רקמה, הכינו 5 מעלות מדיה של שניידר והחנות ב -4 ° c עד לזמן השימוש. כאשר מוכנים להתחיל בניתוח, חם אחד 5 mL מדיה לטמפרטורת החדר. ואז להעביר את מדיית החיתוך החמם למזרק 10 מ ל ולצרף מסנן מזרק 0.22 יקרומטר.

2. חיתוך אשכים מזחלים וגלמים מוקדמים

  1. השתמש במזרק מילוי המדיה כדי לגרש שלוש טיפות של מדיה (50 μL לכל אחד) בחלק העליון, האמצעי והתחתון של שקופית זכוכית.
  2. השתמשו במקדח מבתר כדי להעביר חמישה עד עשרה זחלים שלישיים או גלמים מוקדמים (הגלמים שעדיין לבנים או צהובים) ועד לירידה העליונה. מתפרעים בעדינות את הזחלים והגלמים בתקשורת בעזרת המקדח החוצה כדי להסיר מזון או פסולת.
  3. תחת מיקרוסקופ מבתר, הפוך את הזחל היחיד או הגולם לצדו באמצעות בדיקה מבתר כדי לזהות את שתי האשכים הדו, שנראים כמבנים שקופים בצורת אליפסה בשליש האחורי של הגוף (איור 2א, ב). בעלי חיים שחסרי האשכים הם נקבה ויש להיפטר מהם.
  4. כאשר מוצאים זחל או גולם זכרים נקיים, הזיזו אותו לטיפת המדיה השנייה. חזרה עד 3 או 4 זחלים זכרים ו/או גלמים הועברו לטיפת המדיה השנייה.
  5. עבודה בטיפה השנייה של התקשורת, אחוז בזחל גברי או גולם עם זוג מלקחיים באמצע האזור, רק הקדמי של האשכים. השתמש בזוג השני של מלקחיים כדי לקרוע בעדינות את החיה לשניים.
  6. החזיקו את הקצה האחורי של הזחל או הגולם על מגלשת הזכוכית עם זוג מלקחיים. מתחיל רק ליד מלקחיים, לדחוף על הקוטיקולה באמצעות הקצה של כלי אזמל ולהעביר את האזמל לכיוון הקצה החתוך של החיה. זה יהיה לגרש את האיברים הפנימיים של החיה, אשר כוללים את המעיים, גוף שומן, והאשכים.
  7. להקניט בעדינות להפריד את האשכים משאר האיברים. האשכים הם ברורים, איברים בצורת אליפסה מוטבע רצועות של גוף שומן (איור 2C).
  8. להעביר את האשכים אחד בכל פעם כדי טיפה השלישי של התקשורת. כדי לבצע זאת, הכנס את קצה האזמל מתחת לגוף השומן, הרם את הרקמה מתוך המדיה, ובמהירות הזז אותה לירידה השלישית.
  9. לחילופין, אם אין מספיק גוף שומן עדיין מחובר האשכים כדי להרים בהצלחה את הרקמה, בעדינות להעביר את הרקמה באמצעות זכוכית פסטר מיכל כי כבר מראש עם מדיה לחיתוך.
  10. השתמש בקצה חדה של הכלי אזמל כדי לחתוך בעדינות את הגוף שומן עודף מן האשכים, השארת רק שפה קטנה של גוף השומן סביב הקצוות (איור 2C). אין צורך להסיר את כל הגוף fat, ומנסה לעשות זאת עלול לגרום נזק או בתפירה של האשכים.
  11. חזרו על הצעדים שלעיל עבור כל הזחלים הזכרים על מגלשת הזכוכית.
  12. המשך או לשלב 3 או צעד 5.

3. הרכבה האשכים עבור הדמיה חיה מיקרוסקופיים

הערה: הליך ההרכבה הזה הותאם מפרוטוקול שפורסם לאחרונה לדימות של דרוזוהילה זחל מוח באורך20. פרטים נוספים ניתן למצוא בהפניה זו.

  1. השתמש מזרק מסנן כדי להפקיד טיפה אחת של המדיה של שניידר (כ 30 μL) על מרכז של צלחת התרבות החדיר 50 מילימטר גז.
  2. להעביר את האשכים מוכנים לירידה על הצלחת חדיר גז. האשכים בדרך כלל לצוף אל פני השטח של הירידה.
  3. השתמש בכלי אזמל כדי לדחוף בעדינות את האשכים לתוך קרום חדיר גז. לדאוג לא לקרוע את קרום חדיר גז עם הנקודה החדה של האזמל. לדחוף את כל האשכים למרכז הירידה.
  4. השתמש 1 מזרק mL מלא עם שמן הלוקרבון לעשות 4 טיפות שמן, כ 30 μL כל אחד, על קרום חדיר גז. מרחב טיפות של שמן סביב טיפת התקשורת המכילה את האשכים כדי להתאים את ארבע פינות של שמיכות זכוכית 22 מ"מ.
  5. לסדר את הפינות של שמיכות זכוכית 22 מ"מ עם ארבע טיפות של שמן הלוגן ולהקטין בעדינות את coverslip על התקשורת והנפט. אפשר שמיכות להתיישב ולתקשורת המכילה את האשכים להתפשט בין טיפות שמן.
  6. להסיר את המדיה העודפים כדי לאפשר את coverslip להתיישב על פני השטח של האשכים. בעוד התבוננות האשכים תחת מיקרוסקופ מבתר, להכניס את הפינה של משימה עדינה לנגב לתוך התקשורת תחת coverslip לפתיל משם כמות קטנה של נוזל. וויק מספיק תקשורת עד שcoverslip זכוכית רק יוצר קשר עם פני השטח של הפנים הגדולות. זה קריטי לא להסיר יותר מדי מדיה ולהקטין את שמיכות רחוק מדי, כמו זה יהיה להפעיל לחץ על האשכים ולגרום להם קרע (ראה איור 5).

4. הדמיה חיה של הספרציטים

הערה: הזרע ניתן לדימות באמצעות סריקת לייזר או מיקרוסקופ הדיסק המסתובב. המערכת חייבת להיות מהירות נאותה ורגישות כדי למנוע הלבנת של חלבונים פלואורסצנטי או פוטונזק של הרקמה.

  1. מניחים טיפה של שמן טבילה על שמיכות זכוכית בדיוק מעל האשכים. להתהפך התבשיל ולמקם אותו על הבמה המיקרוסקופ ולהעביר את מטרת המיקרוסקופ (40x או 60x) לתוך השמן עד שזה רק מתחת לאשכים. השתמש באור משודר כדי למצוא ביקורות בודדות ולהביא אותה לפוקוס.
  2. בזמן לכידת תמונות מהירות עם הקונמוקד, להזיז את המוח סביב כדי לבחון את הארגון של התאים. קצה אחד של הב, יהיו בעלי תאים קטנים וצפופים. הקצה הזה מכיל את תאי הגזע. הגרמקו והזרע במעבר לקצה השני של העוגב, זהה תאים גדולים בהדרגה מאורגנים לאשכולות או ציסטות נפרדים. תאים גדולים אלה הם הספרציטים (איור 3A).
  3. אם הדמיה gfp-טובולין, לזהות spermatocytes שיחל מיוזה בתוך 30 – 60 דקות על ידי נוכחות של שתי מיקרוטוכתים בהירים (כלומר, centrosomes) ממוקם בקליפת התא (איור 3ב, ג).
  4. לאחר ציסטה של ספרציטים meiotic זוהה, להגדיר פרמטרים הרכישה כדי ללכוד z-ערימות של תמונות לאורך זמן. בדרך כלל, רכישה של 15 עד 20 תמונות במרווחים 1.5 יקרומטר מלבד בממד z מספיק כדי ללכוד את הנפח המלא של מספר spermatocytes בתוך אותה ציסטה.
  5. לרכוש מלא z-ערימות כל 2 דקות אם הדמיה כל החלוקה meiotic הראשון, אשר לוקח כ 1.5 שעות. ניתן להשתמש בתעריפי רכישה מהירים יותר, במיוחד אם יש לנתח רק אירוע ספציפי של מיוזיס. עם זאת, לדאוג לא לגרום photobleaching לבנת או נזק עקב חשיפה חוזרת של המדגם לעירור לייזר.
  6. השתמש במערכת בקרת מיקוד רציפה אוטומטית כדי למנוע סחף ממוקד לאורך זמן הרכישה. בדרך כלל אין צורך בבקרת טמפרטורה של המדגם על במת המיקרוסקופ, בהנחה שטמפרטורת החדר היא כ -22-23 ° c. אם בקרת טמפרטורה זמינה, שמור על המדגם ב -25 ° c על במת המיקרוסקופ.
  7. אם הספרציטים לא נמצאו, אחסן את המדגם במשך מספר שעות או לילה בחממה ובתמונה של 25 ° c.

5. קיבוע וכתמים חיסוני

  1. משלב 2.10 לעיל, להשתמש מזכוכית פסטר הצינורות כדי להעביר את האשכים לבאר ב 9-היטב מבתר זכוכית צלחת המכיל 0.5 mL של 8% פאראפורמלדהיד ב PBSTx (פוספט מואגור מלוחים עם 0.3% טריטון X-100). ודא כי האשכים הם הנחת על החלק התחתון של המנה.
    הערה: פאראפורמלדהיד הוא רעיל ויש לטפל עם כפפות בתוך מכסה.
  2. תקן את האשכים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. להעביר את האשכים היטב המכיל 0.5 mL PBSTx. לשטוף 5 דקות עם עצבנות עדינה. חזור על הצעד לשטוף בארות חדשות עם PBSTx טרי פעמיים יותר.
  4. לדלל את הנוגדן העיקרי לריכוז הרצוי ב 0.5 mL PBSTx המכיל 5% בסרום ב (BSA) בשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. העברת האשכים מן 9-הבאר מבתר את הצלחת לתוך הצינור של הנוגדן הראשוני מדולל הדגירה לילה ב 4 ° צ' עם נדנדה עדין או התנדנד.
  5. לשטוף את האשכים ב 0.5 mL של PBSTx עבור 5 דקות בבאר של 9-היטב מבתר זכוכית צלחת. חזור על שלב השטיפה עם PBSTx טריים פעמיים נוספות.
  6. לדלל את הנוגדן המשני ב 250 μL של PBSTx המכיל 5% BSA ו לוותר על הבאר נקי של הצלחת מנתח זכוכית 9. אם רצונך בכך, הוסף DAPI כדי להכתים דנ א. העברת האשכים כדי היטב המכיל נוגדן משני, לכסות עם ניילון לעטוף, ו דגירה בחושך עם עצבנות עדינה עבור 4 שעות בטמפרטורת החדר.
  7. להעביר את האשכים היטב נקי מלא עם 0.5 mL של PBSTx. לשטוף עם PBSTx טרי פעמיים עבור 5 דקות ופעם שלישית עבור 30 דקות.

6. הרכבה קבוע האשכים

  1. להעביר את האשכים מן השטיפה האחרונה על שקופית זכוכית מיקרוסקופ באמצעות הצינורות פסטר. במקרה הצורך, השתמשו בשולי כלי האזמל כדי לדחוף את האשכים אל פני השטח של השקופית.
  2. השתמש בפינה של משימה עדינה לנגב לפתיל החוצה נוזל עודף מן האשכים. הסר ככל האפשר את הכמות הנוזלית.
  3. החלת ירידה של 30 עד 50 μL של מיקרוסקופיה בינונית הרכבה לאשכים.
  4. מקום שמיכות 22 מ"מ על ירידה של המדיום הגובר ולאפשר coverslip ליישב את המדיום ההרכבה להתפשט מתחת coverslip. להחיל לחץ עדין על שמיכות אם יש צורך לסחוט החוצה בינונית גובר ולאפשר coverslip לנוח על פני השטח של האשכים.
  5. להשתמש לק לציפורניים לאטום את הקצוות של הכיסויים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאשר פרוטוקול זה מבוצע בהצלחה, האשכים יישארו שלמים לחלוטין לדימות על ידי מיקרוסקופ מוקד או שיטות אחרות מיקרוסקופ הזריחה. כפי שניתן לראות באיור 3a, הארגון הסלולר של האשכים נשמר, ואת ההתקדמות של בידול התא מקצה אחד של הפנים אל השני כולל הזרע, spermatציטים, ו פלואידי spermatids הוא גלוי. GFP-טובולין הוא סמן שימושי לזיהוי חלוקה ספרציטים והדמיה חיה של ההתקדמות של התאים דרך meiosis. כפי שניתן לראות באיור 3B, אפשר לזהות הספרציטים על התחלת המכינה על ידי שתי הרימות הבולטות. באמצעות מטא-שלב הצירים הגדולים מתויגים יפה על ידי GFP-טובולין (איור 3C).

דרוזוהילה ספרמטציטים בגודל גדול וההתקדמות האיטית שלהם באמצעות מיוזה הופכים אותם לאידיאליים לניתוח הדינמיקה וארגון משנה של רכיבים סלולריים כגון אורגטולסמטי במהלך חטיבת8התאים 8,11,21. איור 4 ווידאו 1 הצג ניתוח הדמיה בשידור חי של התארגנות משנה דינמית של הרשתית האנדופלזמית (ER) ביחס למיקרוטובולים דרך מסלול המסזיס. כפי שמתואר לעיל, במהלך interphase מאוחרת בדיוק לפני תחילת meiosis, שני סנטזומים ממוקם בקליפת התא הם גלויים בבירור על ידי הזריחה GFP-טובולין. בשלב זה, ממוקד ER RFP (RFP-KDEL) הזריחה מגלה כי ER הוא מופץ באופן שווה בכל הציטופלסמה. הסנטזומים מתחילים לעבור לצדדים מנוגדים של המעטפה הגרעינית כדי לבסס את שני עמודי הציר. במהלך הזמן הזה, ER מצטבר במהירות סביב המיקרוטוקזומיום microtubules והוא מנוקה בהדרגתיות משאר הציטופלסמה. התמוטטות מעטפת גרעינית (NEB) מתגלה על ידי הופעתו של הזריחה GFP-טובולין בתוך האזור הגרעיני. יש לציין כי התאים drosophila ילה לחלק על ידי חצי פתוח מיטוזיס או meiosis, כלומר מעטפת גרעינית רכיבים לשבור ולפזר ומולקולות cytoplasmic גדול הזן את האזור הגרעיני, אבל מעטפה של ממברנות ER מקיף את ציר כרומאטידים ברחבי החטיבה תא22,23,24. בזמן NEB ומתקדם באמצעות מטא-פאזה, המיון משויך כמעט לחלוטין למיקרוטובוקלס האסטראליים המקיפים את שני מרחבי הציר. שני אלה מיקרוצטברויות אסטרל האסטרלי של ER ולאחר מכן מחיצה על שתי התאים בת במהלך אנאפיום, הבטחת הירושה הנכון ER על ידי התאים החדשים שנוצרו8,11.

איור 5 מראה את ההשפעות של קרע בתוך הראש על הדמיה חיה של spermatocytes. כפי שמתואר בפרוטוקול, הטיפול הגדול חייב להילקח לא להנמיך את שמיכות רחוק מדי על פני השטח של האשכים במהלך השלבים ההרכבה, כמו זה להחיל לחץ על האשכים ולגרום להם להתפוצץ. כפי שנראה באיור 5 וידאו 2, ציסטות של spermatocytes במהירות זורם מתוך הראש קרע, ואת התנועה הזאת של התאים עושה חיים, הדמיה זמן ההדמיה קשה מאוד.

Figure 1
איור 1: כלים הדרושים לחיתוך מוצלח. (א) מלקחייםהמשמשים לניתוח חייב להיות ישר ויש להם טיפים חדים, לא רצוף (מסומן על ידי סימן ביקורת ירוק). אין להשתמש מלקחיים עם טיפים כפופים או שבורים (אדום סימני X), כפי שהם יהיו יעילים באוחז הזחלים ולהקניט רקמות לגזרים. (ב) להכין את כלי האזמל, לכופף סיכת חרק שחור פלדה לזווית פנימית של כ 135 °. הנקודה החדה משמשת כסכין לחיתוך רקמות, והקצה הישר משמש לצורך הזזת רקמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: זיהוי של זחל באשכים גולמי. (א) תמונות של זחלים של זכר ונקבה. האשכים הם לזיהוי הזכר כמבנה מעגלי או סגלגל שקוף בשליש האחורי של בעל החיים (ראש חץ). שימו לב לחוסר מבנה דומה אצל הנקבה. (ב) דמות של גולם גברי מוקדם, עם שתי האשכים השקופים המצוינים על ידי ראשי חץ. (ג) אשכים עם גוף שומן המצורפת לאחר הקרע. שתי האשכים בצד שמאל יש גופים שומן מופרז עדיין מחוברים כי צריך לחתוך משם. שתי האשכים בצד ימין נחתכו כראוי של גופם שומן והם מוכנים הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: זיהוי של הספרציטים מיוטיות בתוך הראש שהוכן בהצלחה. (א) דימוי ממוקד של בהצלחה מוכנה לחיות,בטעותשלמה בהבעת gfp-טובולין. הרכזת של תאי גזע ממוקם לכיוון הקצה התחתון של הבטושים, למרות שהוא אינו ניתן לזיהוי בהכנה זו. מספר שכבות של גונדווניה קטנים מסומנים, ואלה לאחר מכן ציסטות רבות של spermatציטים. ציסטה של ספרציטים בחטיבת meiotic הראשון ניתן לזיהוי מבוסס על גודל גדול של התאים (כ 20-30 יקרומטר בקוטר) ונוכחות של gfp-טובולין הצירים מיוטיים. הספרציטים בחטיבה השנייה באופן דומה יש צירים, אבל תאים אלה הם כמחצית התאים meiotic בגודל. מספרדים פוסט-מיוטיים גלויים גם הם, כפי שלהאריך הזרע. (ב) ספרמטציטים שיתחילו מיוזה בתוך 30 – 60 דקות יכול להיות מזוהה על ידי שני גדול שלהם, מאוד בהיר מאוד מיקרוטונים (מסומנים על ידי ראשי חץ) המסומנים על ידי gfp-טובולין. הציסטה של תאים טרום מיוטיים מוקף בקו צהוב מקווקו. (ג) תאים במיוזיס ניתן לזיהוי על ידי הצירים הגדולים שלהם, כי הם בקלות דמיינו עם gfp-טובולין. הציסטה של תאים מיוטיים מקורה על-ידי הקו הצהוב המקווקו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: שעות ההדמיה הדמיה של מיוזיס בספרטציט יחיד. שיתוף יחיד המבטא GFP-טובולין ו RFP המיועד ל-ER (RFP-KDEL) היתה התמונה כל שתי דקות במהלך של meiosis. המוצגים הם תמונות מייצגות של הספרציט בשלבים ספציפיים של meiosis, החל interphase מאוחר ומתקדם דרך telophase. . הזמנים בתוך דקות כל תמונה היא מישור אופטי יחיד מערימה של 15 פרוסות אופטיות שנרכשו בכל נקודת זמן. הדמות הזאת השתנתה מקראשאבה וסמית ', 2019שמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תמונות מייצגות של ביקורות לפני ואחרי התפירה. התמונה בצד שמאל, התווית "ללא שינוי", מראה טובולין ביטוי GFP לפני בדיוק לפני התפירה. התמונה מימין מציגה את אותן הטעויות לאחר שהיא מרופנות. ניתן לראות ציסטות של ספרציטים מתוך הקרע. ראשי החץ מצביעים על ציסטה של ספרציטים מיוטיות; שימו לב לתנועה המשמעותית של הספרציטים האלה לאחר הצערות, הפיכת הדמיה של הספרציטים אלה לאורך זמן מאתגרת ביותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: חלוקה מיוטית מלאה של ספרטציט יחיד. מוצג הוא מלוא הזמן מעידה של GFP-טובולין ו-RFP-KDEL המבטא spermatocyte באיור 4. התמונות נלכדו כל שתי דקות, ושיעור ההשמעה הוא שלוש מסגרות לשניה. וידאו זה השתנה מ קראשאבה ו סמית, 20198. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 2: בנות מקרע. מעידה בזמן של ביקורות. לפני ואחרי התפירה הקרע ברור בשל הזרמה פתאומית של ציסטות של תאים דרך הפינה השמאלית התחתונה של הב, בנות. התמונות נלכדו כל שתי דקות, ושיעור ההשמעה הוא שלוש מסגרות לשניה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תיארנו פרוטוקול להכנת זחל או גולמי מוקדם drosophila ילה האשכים, אופטימיזציה לטווח ארוך, לחיות הדמיה של מחלקת התא spermatocyte. זוהי שיטה רבת-עוצמה לניתוח חלוקת תאים בהקשר הפיזיולוגי של רקמות שלמות. העוצמה של שיטה זו מורחבת עוד יותר כאשר בשילוב עם כלים גנטיים דרוזוהילה , כגון מוטציות גנטיות ספציפיות, דיכוי ספציפי לרקמות rnai-בתיווך, ו-fluorescently אופן שכותרתו סמנים חלבונים ו אורגל. בנוסף, בגודל קטן של זחל והאשכים גולמי, ואת היכולת תמונה חלוקת תאים קרוב מאוד שמיכות זכוכית, להפוך את השיטה אידיאלית עבור דימות ברזולוציה גבוהה כולל גישות ברזולוציה סופר. הרבגוניות של מערכת ניסויית זו מוכחת על ידי תוצאות הנציג המתארות את התארגנות משנה דינאמית של המיון במהלך חלוקת התא. דרוזופילה ספרמטציטים שימושיים במיוחד לניתוח מסוג זה של הדינמיקה הארגונית במהלך חלוקת תאים בגלל הגודל הגדול והמעבר האיטי יחסית דרך מיוזיס. יתר על כן, אותם תאים יכולים להיות התמונה הפוסט מבחינה מלאכותית כדי להבין כיצד שינויים ב-אורגונל דינמיקה או מנגנוני חלוקת תאים משפיעים על האירועים הבאים של הזרע. כך, יש פוטנציאל גדול עם גישה ניסיונית זו כדי להבין את הפיזיולוגיה של חלוקת התא בתוך ההקשר הגדול של פיתוח רקמות ובידול התא, תוצאות כי הם בלתי מושג כאשר לומדים תאים הגדלים בתרבות.

הפרוטוקול כולל מספר גורמים המאפשרים תרבות vivo ex לטווח ארוך של האשכים עד כ 24 שעות. ראשית, התקשורת של שניידר, שפותחה לצורך תחזוקה של תאי תרבות הרקמה של דרוזופילה , מכילה מקורות אנרגיה זמינים וממוטבת לשמירת חומציות פיזיולוגית באוויר אטמוספרי. שנית, הממברנה חדירות הגז המשמש להרכבה האשכים מאפשר החלפת גז מהיר. יתרון חשוב של תרבות ארוכת טווח הוא שאם תאים בשלב הרצוי של פיתוח או מיוזה לא נמצאים מיד לאחר ההכנה לדוגמה, ניתן לאחסן את המדגם ולשוב בתמונה במועד מאוחר יותר. יש לנו לוודא כי האשכים הנשמרים בחממה 25 ° c לילה, עבור סך של 16-24 שעות, הם קיימא ומופיעים בריאים על בסיס נוכחות שגרתית של תאים העוברים ממאיוזיס ומתקדמים בשלבים מאוחרים יותר של בידול זרע. עם זאת, אמצעי זהירות יש לנקוט כאשר culturing האשכים עבור יותר מ 2-3 שעות כדי להבטיח את הפיזיולוגיה רקמות לא נפגע לרעה. והכי חשוב, האשכים להמשיך לצמוח בתרבות כמו תאים מתרבים והתבגרות זרע האריך. זה עלול לגרום לאשכים להגדיל עד לנקודה שהם התפוצצו בשל החלל המגביל בין קרום שמיכות, עיבוד האשכים מתאים הדמיה חיה מסיבות המתוארות להלן. בנוסף, אם התרבויות לטווח ארוך הם להיות מועסקים באופן שגרתי בניסויים, מומלץ לבדוק אם מעבדה ספציפית התנאים בתרבות המורחבת התוצאה ליקויים meiotic כגון משכים ממושכים ממושך או תדרים מוגברת של כרומוזומים בפיגור או כשל ציטוקינזה.

על מנת לדמות תאים בודדים במשך זמן רב, חשוב כי התאים לא זזים באופן משמעותי פעם האשכים המוכנים על הבמה במיקרוסקופ. לכן, זה חיוני בעת ביצוע הפרוטוקול כי האשכים נשארים ללא פגע, כי התאים לשפוך מתוך האשכים פגום כל התאים בתוך המעבר איבר כתוצאה (ראה איור 5 ו- Video 2). זה יכול להיות עדיין אפשרי התמונה spermatocytes באשכים פגומים אם התאים בסופו של דבר להתפשר ולהפסיק לזוז, אם כי בזמן זה מתרחש בשלבים של מיוזה כי אחד מתכוון לנתח ייתכן כבר התרחשו. בנוסף, השפעות של נזק לרקמות על תהליך חלוקת התא עצמו לא ניתן להנחות. נזק האשכים יכול להתרחש בעת ניקוי הגופים שומן בעקבות הסרת האשכים מפני הזחלים. הטיפול הגדול צריך אפוא להילקח כדי למנוע פירסינג או למשוך על האיברים במהלך שלב זה של הפרוטוקול. למעשה, לעתים קרובות אין צורך להסיר את רוב הגופים השמנים, כל עוד הם אינם מסתירים את ההדמיה החזותית. לעתים קרובות יותר, הנזק הנגרם הוא תוצאה של הסרת מדיום התרבות יותר מדי לאחר מיקום שמיכות במהלך הליך ההרכבה עבור הדמיה חיה (שלב 3.6). כמו בינוני מוסר, coverslip נופל נמוך יותר מפעיל לחץ על האשכים, ולחץ עודף יגרום האשכים לקרע. כך, בעוד שהוא חשוב עבור coverslip להיות קרוב ככל האפשר האשכים כדי להקל על הדמיה אופטימלית של spermatocytes, חלק מהתרגול הוא הכרחי כדי למנוע הסרת מדיום יותר מדי והנמכת הכיסויים רחוק מדי. זה גם עוזר לציין כי עבור יישומים מסוימים, כגון חשיפה חריפה של spermatocytes לסמים או מולקולות קטנות אחרות, זה יכול להיות יתרון כדי לשבש את האשכים ולפזר את ציסטות של spermatocytes לניתוח. מספר פרוטוקולים מצוינים זמינים להכנה ולתרבות של ציסטות מפוזרת של הספרציט18,25.

שיקול חשוב בעת שימוש spermatocytes לניתוח החטיבה התא הוא כי תאים אלה לבצע meiotic לעומת mitotic חטיבות. חשוב מכך, רבים מההיבטים המהותיים של מכניקת חלוקת התא, כגון הארכיטקטורה והציטוקינזה של הצירים, דומים בין המיוזיס הגברי לבין מיטוזיס6. לפיכך, תובנות מכניסטיות שנאספו מלמידה ספרציט מיוזיס ניתן לטפל באופן כללי במנגנונים כלליים של חטיבת תאי בעלי חיים7. עם זאת, בהתאם לשאלות מכניסטיות הממוענות, הבדלים חשובים בין התאים הmitotic ובתהליכים כגון דינמיקה כרומוזומלית ורגולציה של מחזור התא עשויים להיחשב26. באותו הזמן, דרוזוהילה ספרמטציטים מציגים את ההזדמנות הייחודית להשוות תאים mitotic ו-meiotic בתוך אותה רקמה ושושלת germline. לדוגמה, ניתן להשתמש באותה הכנה באותה הדרך כדי לנתח תאי גזע של germline או שעברו מיטוזיס והזרע העובר meiosis. אנחנו בדרך כלל לא מנסים התמונה germline גזע תא או spermatogonial mitoses ההכנות לחיות בגלל העיתוי של חטיבות אלה קשה לנבא. עם זאת, יש לנו אקראי לכד את החטיבות האלה בניסויים שלנו, הוכחת כי הפרוטוקול הכללי ניתן להחיל על ניתוח של תאים mitotic בתוך האשכים כמו גם.

המתודולוגיה המוצגת מתמקדת בהכנת האיות להדמיה חיה של מיאיוציט, שכן הדבר מאפשר ניתוח בזמן אמת של דינמיקה תאית ומולקולרית. אנו מספקים גם שיטה לקיבוע וכתמים של האשכים שלמים, כמו גישה זו עשויה להיות עדיפה אם נדרש fluorescently אופן תווית ביטוי מבנים אינם זמינים או כדי למנוע השפעות מייסדים של ביטוי עודף חלבון. שיקול חשוב למרות שקיבעון זה לא תמיד לשמר בנאמנות רקמה מקורית ואדריכלות סלולרית. לדוגמה, אנו ואחרים מצאו כי קיבעון לעתים קרובות גורמת לפיצול או הפרעה של ER11,27. ניתן להקל על חלק מהבעיות הללו באמצעות שיטות מיוחדות או הכנת רקמה שונות, ולכן ייתכן שיהיה צורך בפתרון בעיות כדי לזהות את פרוטוקול הקיבוע האופטימלי לשימור רכיב תא או חלבון מסוים. למרבה המזל, מספר פרוטוקולים נוספים עבור קיבעון דרוזוהילה ספרמטציט זמינים גם הם18,28,29.

לסיכום, תיארנו שיטות רב-תכליתית להכנת האשכים של דרוזוהילה לניתוח בדיקה ותיקון תאים בשידור חי וקבוע. העוצמות הספציפיות של הגישה הניסיונית הזאת כוללות ניתוח של חלוקת תאים ברקמה שלמה, הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים גדולים ואינטגרציה עם כלים גנטיים דרוזוהילה . ניסויים המעסיקים את המתודולוגיה יש פוטנציאל לתרום תרומה חשובה ההבנה שלנו איך חלוקת התא משתלב עם מנגנונים מורכבים של פיתוח רקמות הומאוסטזיס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מחלקת ההגנה הסטארט-up לJ.T.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5" Dissecting Probe Fisher 08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet Fisher 13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9703-100
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides Fisher 12-544-2 Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100 mL
Lumox Dish 50 Sarstedt SAR946077410 Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass Fisher 12-541-B 22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade Electron Microsocopy Sciences 15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides Fisher 12-549-5 Slides used for dissections
PYREX Spot Plates Fisher 13-748B 9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium Fisher 21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm EMD Millipore SLGS033SB
Triton X-100 Fisher BP151-500
Vectashield Vector Labs H-1000 Microscopy mounting medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
  2. Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294, (30), 11382-11390 (2019).
  3. Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131, (10), 2241-2246 (2004).
  4. Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291, (28), 14628-14638 (2016).
  5. Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14, (4), 111 (2013).
  6. Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
  7. Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69, (11), Hoboken, N.J. 869-881 (2012).
  8. Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9, (1), 12456 (2019).
  9. Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187, (6), 847-858 (2009).
  10. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2, (1), 8 (2004).
  11. Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5, (8), (2015).
  12. Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68, (1), San Diego, Calif. 218-227 (2014).
  13. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. Cold Spring Harbor Press. 71-147 (1993).
  14. Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10, (12), 1001460 (2012).
  15. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, (3), 197-212 (2012).
  16. Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20, (12), 1169-1179 (2014).
  17. Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
  18. Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).
  19. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
  20. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  21. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125, (22), 5441-5452 (2012).
  22. Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94, (3), 463-470 (1989).
  23. Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19, (9), 3652-3666 (2008).
  24. Tates, A. D. Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. (1971).
  25. Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).
  26. Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, (5), (2015).
  27. Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190, (3), 363-375 (2010).
  28. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, (10), 1270-1272 (2011).
  29. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (1), 102-104 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics