Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

JoVE Journal
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu protokolün amacı, Drosophila meyozetik spermatositler kullanarak canlı ve sabit hücre mikroskobu ile bozulmamış dokudaki hücre bölünmesini analiz etmektir. Protokol, Drosophila larvaları ve erken pupalardan bütün, bozulmamış testislerin nasıl izole edilip, mikroskopi için nasıl işleyip monte edilebildiğini gösteriyor.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue. J. Vis. Exp. (159), e60961, doi:10.3791/60961 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hücre bölünmesinin canlı, bozulmamış doku ve organlarda bölünmesi, hücre bölünmesinin gelişim, doku homeostazları ve hastalık süreçleri ile nasıl bütünleşiştüğünün anlaşılması için deneysel analizler gereklidir. (1) spermatosit içeren tüm Drosophila testisleri nispeten mikroskopi için hazırlamak kolay, çünkü meyozis geçiren Drosophila spermatositler bu analiz için idealdir, (2) spermatositlerin büyük boyutu onları iyi yüksek çözünürlüklü görüntüleme için uygun hale getirir, ve (3) güçlü Drosophila genetik araçları in vivo analizi ile entegre edilebilir. Burada, Drosophila üçüncü instar larvaları ve erken pupa tüm testislerin hazırlanması için kolayca erişilebilir bir protokol sıyoruz. Hazırlanan tüm testislerde meyotik spermatositlerin nasıl tanımlanabileceğimizi ve zaman atlamalı mikroskopi ile nasıl görüntülenebileceğimizi anlatıyoruz. Fiksasyon ve immünboyama tüm testisler için protokoller de sağlanmaktadır. Larva testislerinin kullanımı, spermatosit analizi nde yetişkin testislerini kullanan mevcut protokollere göre çeşitli avantajlara sahiptir. En önemlisi, larva testisleri erişkin testislere göre hücrelerle daha küçük ve daha az kalabalıktır ve bu spermatositlerin yüksek çözünürlüklü görüntülemesini büyük ölçüde kolaylaştırır. Bu avantajları ve protokollerin uygulamalarını göstermek için, zaman atlamalı konfokal mikroskopi ile görüntülenmiş tek bir spermatositte hücre bölünmesi sırasında iğ mikrotübüllerine göre endoplazmik retikulumun yeniden dağılımını gösteren sonuçlar sayılmaktadır. Protokoller floresan etiketli proteinler veya organel belirteçleri herhangi bir sayı ifadesi ile kombine edilebilir, yanı sıra gen mutasyonları ve diğer genetik araçlar, bu yaklaşım özellikle tüm doku ve organların fizyolojik bağlamında hücre bölünmesi mekanizmalarının analizi için güçlü hale.

Introduction

Hücre bölünmesi genellikle kültür1yetiştirilen hücre hatları kullanılarak incelenir. Biz bu çalışmalardan temel mekanizmaların paha biçilmez bir anlayış ve anlayış zenginliği kazanmış olsa da2, kültürde yetiştirilen hücreler tam olarak bozulmamış, canlı doku oluşur gibi hücre bölünmesi fizyolojisi özetlemek olamaz. Örneğin, bozulmamış doku ve organlarda, hücreler doğru yerde ve doğru zamanda bölmek gerekir, böylece döl hücreleri düzgün doku içinde yer, böylece uygun farklılaşma veya fonksiyonel programlar geçirebilir, ve böylece hücre çoğalması düzgün doku büyüme veya homeostaz ile koordine edilir3. Öte yandan kültürde yetişen hücreler için hücre bölünmesi genellikle kültür ortamı4'tekibüyüme faktörleri tarafından düzenlenir ve bu nedenle doku mimarisi veya gelişimsel sinyalizasyon gibi canlı çevresel faktörlerin bölünme sürecini nasıl etkilediğini bu hücrelerden öğrenemeyiz. HeLa ve U2OS hücreleri gibi hücre bölünmesini incelemek için kullanılan hücre hatlarının birçoğunun metastatik tümörlerden elde edildiğini belirtmek de önemlidir5. Bu nedenle, bu kanser hücrelerinin temel fizyolojisi birçok yönü, hücre döngüsü düzenleyici mekanizmalar ve kromozomal stabilite gibi, büyük olasılıkla sağlıklı hücrelere göre değiştirilmiştir. Hücre bölünmesi fizyolojisinin tam olarak anlaşılması, bu nedenle, fizyolojik düzenleyici mekanizmaları ve doku mimarisini koruyan, yerli, in vivo ortamlarda bölen hücreleri inceleme yeteneğimize bağlıdır.

Hücre bölünmesinin bozulmamış doku ve organlar da nasıl işlediğini anlamadaki gelişmeler, in vivo veya ex vivo analizine doğal zorluklar nedeniyle engellenir. İlk olarak, büyük organlar veya kalın dokular içinde mikroskobik analiz için bölen hücrelere erişmek zor veya imkansız olabilir. İkinci olarak, genellikle tek tek hücrelerin in vivo bölmek ne zaman tahmin etmek zordur. Üçüncü olarak, doku fizyolojisi hızla ex vivo kültür sırasında bozulabilir. Bu protokolde, Drosophila melanogaster spermatositlerin tam bozulmamış testisler içinde meyotik hücre bölünmeleri geçirerek canlı ve sabit analizi için kolayca erişilebilir yöntemleri açıklıyoruz. Bu hücreler canlı, ex vivo analiz için idealdir çünkü konfokal mikroskopi gibi standart optik yöntemlerle kolayca erişilebilirler, öngörülebilir zamanlarda ve konumlarda bölünürler ve bozulmamış testisler ex vivo kültüründe yaklaşık 24 saate kadar muhafaza edilebilir. Buna ek olarak, Drosophila spermatositler büyük yuvarlak hücrelerdir (yaklaşık 20-30 μm çapında) bölündüklerinde şekil değiştirmeyen, onları yüksek çözünürlükte, mil aparatı ve sitoplazmik organeller gibi hücresel bileşenlerin hızlandırılmış görüntülemesi için ideal hale getirir. Bu hücreler mitoz yerine meyozis geçmesine rağmen, temel hücre bölünmesi süreçlerinin çoğu bu iki hücre bölünmesi mekanizmaları arasında çok benzer6. Bu avantajlar, güçlü Drosophila genetik araçları ile birlikte, Drosophila spermatositler mil oluşumu ve düzenleme, sitokinenzis ve organel remodeling ve bölümleme7dahil olmak üzere temel hücre bölünmesi süreçlerinin ex vivo analizi için yaygın olarak kullanılan bir model yaptık7 ,8,9,10,11.

Spermatositler spermatogenezin meyotik evresinde olan hücrelerdir. Drosophilayılında, spermatogenez testis bir kutup küçük bir bölgede veya "hub" bulunan germline kök hücrelerin bir grup ile başlar12,13. Bu hücreler asimetrik bir mitoz bölünme, tek bir farklılaştırılmış spermatogonium yol açan. Spermatogonia sonra tek bir kist içinde yakından ilişkili kalır 16 hücrebir grup üretmek için dört senkron mitoz geçmesi. Bu aşamada hücreler mitotikten meyotik hücre döngüsüne geçiş tevesyetik olarak adlandırılırlar. Spermatositler hücre döngüsünün genişletilmiş bir G2 aşamasında yaklaşık iki ila üç gün geçirmek, sırasında onlar dramatik büyümek ve iki meiyotik bölünmeler ve sonraki spermiyogenez için hazırlık sitolojik değişikliklere uğrar13,14. Tek bir kist içinde 16 spermatosit tüm grup daha sonra aynı anda ilk meyotik bölünme girin. Böylece, birkaç meyotik spermatosit hücre bölünmesi ile devam ederken aynı anda görüntülenebilir. İlk meyotik bölünme yaklaşık 1,5 saat devam eder ve hemen ikinci meyotik bölünme tarafından takip edilir, olgun spermatozoa içine ayırt etmek için devam 64 toplam spermatidler verim.

Canlı hücre bölünmesi ni incelemek için spermatosit kullanmanın eşsiz bir avantajı, bozulmamış doku grupları nın veya hücrelerin kistlerinin spermatogenezin farklı aşamalarında sürekli ilerlemeleri dir ve spermatogenezin tüm aşamalarındaki hücreler genellikle herhangi bir testiste tanımlanabilir (Bkz. Şekil 3A). Bu nedenle, tüm testislerde meyotik hücreleri bulmak nispeten kolaydır. Bu hücreler yüksek çözünürlüklü görüntülemeye çok daha büyük ve daha elverişli olduğu için genellikle analizlerimizi ikinci meyozisyerine ilkine odaklarız, ancak her iki meyyotik bölümü de kapsayan tüm süreç başarılı bir şekilde görüntülenebilir. Ayrıca testis hazırlık ve kültür için genel protokol spermatogenez diğer süreçleri analiz etmek için de kullanılabilir unutulmamalıdır, önceki mitotik kök hücre veya spermatogonial bölünmeler veya spermatidler spermatozoa içine olgun olarak meydana gelen sitolojik değişiklikler gibi15. Spermatogenezbu yönlerinin çoğu drosophila ve insanlar arasında son derece korunur16.

Drosophila spermatositler Drosophila gelişiminin üçüncü instar larva evresi sırasında spermatogenezin meziyotik fazulaşmaya başlar13. Bu nedenle, üçüncü instar larvaları ile başlayan ve pupa ve yetişkinler de dahil olmak üzere yaşam döngüsü aşamalarından izole testisler spermatositlerin bölünmesi analizi için kullanılabilir. Spermatogenez17,18,,19canlı ve sabit analiz için yetişkin erkek sinekler testislerinin çıkarılması için çeşitli mükemmel protokoller mevcuttur. Bu protokoller spermatogenezin geç evrelerinin incelenmesi veya sadece yetişkinlerde görülebilen genetik belirteçlerin kullanılması gerekiyorsa tercih edilebilir. Protokol bunun yerine larvave erken pupadan testis hazırlığına odaklanır, çünkü bu aşamalarda testislerin özellikle yüksek çözünürlüklü, hızlandırılmış mikroskopi ile hücre bölünmesi analizine uygun çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, larva ve pupa testisleri yetişkinlerden daha küçüktür ve organ içindeki hücreler daha az kalabalıktır. Bu nedenle, spermatositlerin bölünmesi genellikle larva testislerinin dış yüzeyine yakın, ışık saçılma dokusunun birden fazla katmanından nüfuz etmek zorunda kalmadan görüntülenebilir. İkinci olarak, erişkin testisler bağlı aksesuar organların kasılmaları nedeniyle ritmik hareket, ve bu hareketler bireysel hücrelerin zaman atlamalı görüntüleme zor olun. Ve üçüncüsü, larva testisleri pupal veya erişkin öldürücüye neden olan gen mutasyonlarını incelerken avantajlıdır. Yöntemlerimiz mikroskop aşamasında testislerin uzun vadeli kültür için optimize edilmiştir, hücre bölünmesi birden fazla tur görüntüleme veya aynı hazırlık spermatogenez birden fazla aşamada bireysel hücrelerin ilerlemesi için izin. Ayrıca tüm testislerin fiksasyonu ve immünboyması için bir protokol uyguluyoruz. Genel olarak, protokollerimiz özellikle bozulmamış dokuda hücre bölünmesi eğitimi almak isteyenler için yararlıdır ve spermatosit analizini yüksek derecede çekici Drosophila genetik araçlarıyla birleştirme yeteneği bu özellikle güçlü bir yaklaşım dır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Diseksiyon için Hayvanları, Araçları ve Medyayı Hazırlayın

  1. Çapraz erkek ve kadın istenilen genotip atasını elde etmek için uçar. Meyotik spermatositlerin tanımlanması ve evrelemesi için yararlı transgenik belirteçler, kromozomlarıetiketlemekiçin GFP-tubulin ve rfp-histon 2A'yı etiketlemek için kromozom8 içerir. Çapraz başına beş ila on kadın kullanın ve üçüncü yıldız larvaları şişenin kenarlarında (4-5 gün) sürünmeye başlayana kadar 25 °C'lik bir kuluçka makinesinde standart sinek yiyeceğinde haçlar kullanın. Erken beyaz pupa bir gün sonra oluşmaya başlayacak.
  2. İnce uçlu iki çift düz forceps elde edin. Uçların keskin, hatta uzunlukta ve düz olduğundan emin olun (Şekil 1A). Bu forsepsleri yalnızca diseksiyonlar için kullanın ve kullanılmadığında 10 μL pipet uçları yla kaplayın.
  3. Bir neşter aleti hazırlayın.
    1. Siyah anodize edilmiş çelik böcek piminin künt ucunu bir pim tutucuya takın ve pimi yerinde sabitlemek için tutucunun vidasını bükün. Bir çift forseps kullanarak ve bir kesme mikroskobu altında, ortasındaki böcek iğnesini kavrar ve 135° bir iç açı oluşturacak şekilde bükün(Şekil 1B). Keskin uç doku kesmek için, kenar medya damlaları arasında testis aktarmak için kullanılırken.
    2. Kullanılmadığında 1.000 μL pipet ucu ile kap.
  4. Doku kültürü başlığında çalışarak, Schneider'ın medyasından 5 mL aliquot hazırlayın ve kullanım saatine kadar 4 °C'de saklayın. Diseksiyon lara başlamaya hazır olduğunuzda, oda sıcaklığına kadar 5 mL'lik bir ortam ısıtın. Daha sonra ısıtılmış diseksiyon ortamını 10 mL şırıngaya aktarın ve 0,22 m şırınga filtresi takın.

2. Larva ve Erken Pupa testislerinin diseksiyonu

  1. Bir cam kaydıranın üst, orta ve alt kısmındaüç damla (her biri 50°L) dışarı atmak için ortam dolu filtre şırıngını kullanın.
  2. Beş ila on üçüncü instar larvaları veya erken pupa (hala beyaz veya sarı pupa) üst damla aktarmak için bir kesme prob kullanın. Hafifçe herhangi bir gıda veya enkaz kaldırmak için diseksiyon sondası ile medyada larva ve pupa çalkalayın.
  3. Bir diseksiyon mikroskobu altında, vücudun arka üçüncü oval şekilli yarı saydam yapılar olarak görünen iki ikili testisleri tanımlamak için bir diseksiyon sondası ile yan tarafında tek bir larva veya pupa açın(Şekil 2A, B). Testisleri olmayan hayvanlar dişidir ve atılmalıdır.
  4. Bir erkek larva veya pupa bulunduğunda ve temiz olduğunda, medyanın ikinci damlasına taşıyın. 3 veya 4 erkek larva ve/veya pupa medyanın ikinci damlasına aktarılana kadar tekrarlayın.
  5. Medyanın ikinci damlasında çalışmak, tek bir erkek larva veya pupa ile orta bölgesinde bir çift forceps kavramak, sadece testisler için ön. Hayvanı yavaşça ikiye ayırmak için ikinci çift forceps'u kullanın.
  6. Larva veya pupanın arka ucunu bir çift forceps ile cam kaydırak üzerinde tutun. Ponpların hemen yanından başlayarak, neşter aracının kenarını kullanarak miteyi aşağı itin ve neşteri hayvanın kesilen ucuna doğru hareket ettirin. Bu bağırsaklar, yağ organları ve testisler dahil hayvanın iç organları, dışarı atacaktır.
  7. Testisleri diğer organlardan ayırın. Testisler açık, yağ vücut şeritler gömülü oval şekilli organlar (Şekil 2C).
  8. Testisleri birer birer üçüncü ortam düşüşüne aktarın. Bunu başarmak için, yağ gövdesi altında neşter kenarına eklemek, ortamdan doku kaldırın ve hızlı bir şekilde üçüncü damla hareket ettirin.
  9. Alternatif olarak, hala başarılı bir şekilde doku kaldırmak için testisler bağlı yeterli yağ vücut yoksa, yavaşça diseksiyon ortamı ile önceden ıslak olan bir cam Pasteur pipet kullanarak doku transferi.
  10. Neşter aletinin keskin ucunu kullanarak aşırı yağ gövdesini testislerden hafifçe dilimleyin, kenarlarda sadece küçük bir yağ kenarı bırakarak kullanın(Şekil 2C). Tüm yağ vücut kaldırmak için gerekli değildir, ve bunu yapmaya çalışırken büyük olasılıkla zarar veya testislerin yırtılması neden olacaktır.
  11. Cam slayt üzerinde erkek larvatüm yukarıdaki adımları tekrarlayın.
  12. Adım 3'e veya adım 5'e geçin.

3. Canlı Mikroskobik Görüntüleme Için Montaj Testisleri

NOT: Bu montaj prosedürü Drosophila larva beyin nöroblastları görüntüleme için yeni yayınlanan bir protokol uyarlanmıştır20. Bu başvuruda ek ayrıntılar bulunabilir.

  1. 50 mm gaz geçirgen kültür yemeğinin ortasına Schneider'ın medyasından (yaklaşık 30°L) tek bir damla sını (yaklaşık 30°L) yatırmak için filtre şırıngasını kullanın.
  2. Hazırlanan testisleri gaz geçirilme çanağı üzerindeki damlaya aktarmak için önceden ıslak pasteur pipeti kullanın. Testisler genellikle damla yüzeyine yüzer.
  3. Testisleri gaz geçirilebilir membrana hafifçe itmek için neşter aletikullanın. Neşterin keskin noktası ile gaz geçirilebilir membran yırtMak için dikkat edin. Tüm testisleri damlanın ortasına doğru itin.
  4. Gaz geçirgen membranÜzerinde her biri yaklaşık 30°L olmak üzere dört damla yağ yapmak için halokarbon yağıyla dolu 1 mL'lik bir şırınga kullanın. 22 mm'lik cam kapak lı bir kapağın dört köşesine karşılık gelecek şekilde testisleri içeren ortam damlasının etrafına yağ damlalarını boşluk bırakın.
  5. 22 mm'lik cam kapak lı bir kapağın köşelerini dört damla halokarbon yağıyla hizalayın ve coverslip'i hafifçe ortama ve yağa indirin. Coverslip yerleşmek ve testisler içeren medya petrol damlaları arasında yayılmasını bekleyin.
  6. Coverslip'in testislerin yüzeyine yerleşmesine izin vermek için fazla ortamı çıkarın. Bir diseksiyon mikroskobu altında testisler gözlemlerken, sıvı küçük bir miktar uzakta wick için kapak altında ortama hassas bir görev silme köşesi ekleyin. Cam kapak kayma sadece en büyük testis yüzeyi ile temas edene kadar wick yeterli medya. Bu testisler üzerinde baskı uygulamak ve yırtılma neden olacak gibi çok fazla medya kaldırmak ve coverslip çok uzak düşürmek için önemlidir (Şekil 5'ebakınız).

4. Meiyotik Spermatositlerin Canlı Görüntülenmesi

NOT: Spermatositler lazer tarama veya dönen disk konfokal mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. Sistem, floresan proteinlerin fotobeyazmasını veya dokunun fotohasarından kaçınmak için yeterli hız ve duyarlılığa sahip olmalıdır.

  1. Testislerin hemen üzerinde cam kapak üzerine bir damla daldırma yağı yerleştirin. Çanak üzerinde çevirin ve mikroskop aşamasında yerleştirin ve testisler hemen altında olana kadar yağ içine mikroskop hedefi (40x veya 60x) taşıyın. Tek bir testis bulmak ve odak haline getirmek için iletilen ışığı kullanın.
  2. Konfokal ile hızlı görüntüler yakalarken, hücrelerin organizasyonunu incelemek için testis'i hareket ettirin. Testislerin bir ucunda çok sayıda küçük, yoğun paketlenmiş hücre bulunur. Bu uç germline kök hücreleri ve spermatogoniiçerir. Organın diğer ucuna doğru hareket, ayrıkümeler veya kistler halinde organize giderek daha büyük hücreleri belirlemek. Bu büyük hücreler spermatositlerdir (Şekil 3A).
  3. GFP-tubulin görüntüleme ise, hücrenin korteksinde bulunan iki parlak mikrotübül asterin (yani, centrozomlar) varlığı ile 30-60 dakika içinde meyozasyon başlayacak spermatositleri tanımlayın(Şekil 3B, C).
  4. Bir kez meyotik spermatosit bir kist tespit edilmiştir, zaman içinde görüntülerin z-yığınları yakalamak için edinim parametreleri kurmak. Tipik olarak, z boyutunda 1,5 μm aralıklı 15-20 görüntü elde etmek aynı kist içinde çeşitli spermatositlerin tam hacmiyakalamak için yeterlidir.
  5. Yaklaşık 1,5 saat süren ilk meyotik bölümün tamamını görüntülemede her 2 dakikada bir tam z-yığınları edinin. Özellikle sadece belirli bir meyozolayı nın incelenmesi durumunda daha hızlı edinme oranları kullanmak mümkündür. Ancak, örneğin lazer uyarma sına tekrar maruz kalmasına bağlı olarak fotobeyazrlama veya fotohasara neden olmamak için dikkatli olmaya özen.
  6. Satın alma uzun zaman boyunca odak kayması önlemek için sürekli, otomatik odaklama kontrol sistemi kullanın. Numunenin mikroskop aşamasında ki sıcaklık kontrolü genellikle 22-23 °C oda sıcaklığında olduğu varsayılsa gerekli değildir. Sıcaklık kontrolü varsa, numuneyi mikroskop aşamasında 25 °C'de saklayın.
  7. Meyotik spermatosit bulunamazsa, numuneyi birkaç saat veya gece boyunca 25 °C'lik bir kuluçka makinesinde ve görüntüde tekrar saklayın.

5. Fiksasyon ve İmmünBoyama

  1. Yukarıdaki adım 2.10 itibaren, PBSTx 0.5 mL içeren 9 kuyulu cam diseksiyon çanak bir kuyuya testisaktarmak için bir cam Pasteur pipet kullanın (fosfat% 0.3 Triton X-100 ile tamponlu salin). Testislerin yemeğin altında olduğundan emin olun.
    NOT: Paraformaldehit toksiktir ve duman kaputunda eldivenlerle işlenmelidir.
  2. Testisleri oda sıcaklığında 20 dk olarak düzeltin.
  3. Testisleri 0,5 mL PBSTx içeren bir kuyuya aktarın. 5 dakika boyunca hafif ajitasyonla yıkayın. Taze PBSTx ile yeni kuyularda yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın.
  4. 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte %5 büyükbaş serum albumin (BSA) içeren 0,5 mL PBSTx'te primer antikorları istenilen konsantrasyona seyreltin. Testisleri 9 kuyulu cam kesme kabından seyreltilmiş primer antikor tüpüne aktarın ve bir gecede 4 °C'de hafif sallanan veya fındıkla kuluçkaya yatırın.
  5. Testisleri 0,5 mL PBSTx'te 5 dakika boyunca 9 kuyulu cam diseksiyon kabında yıkayın. Taze PBSTx ile yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın.
  6. %5 BSA içeren 250 μL PBSTx'teki sekonder antikorları seyreltin ve 9 kuyulu cam kesme kabının temiz bir kuyuya dağıtın. İstenirse, DNA leke için DAPI ekleyin. Testisleri ikincil antikor içeren kuyuya aktarın, plastik sargı ile kaplayın ve oda sıcaklığında 4 saat boyunca hafif ajitasyon la karanlıkta kuluçkaya yatırın.
  7. Testisleri 0,5 mL PBSTx ile dolu temiz bir kuyuya aktarın. 5 dakika boyunca iki kez taze PBSTx ile yıkayın ve 30 dakika boyunca üçüncü kez yıkayın.

6. Montaj Sabit Testisler

  1. Testisleri son yıkamadan pasteur pipeti kullanarak cam mikroskopi slaytına aktarın. Gerekirse, testisleri slayt yüzeyine itmek için neşter aracının kenarını kullanın.
  2. Testislerden fazla sıvıyı uzaklaştırmak için hassas bir görev silme nin köşesini kullanın. Mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın.
  3. Testislere 30-50 μL'lik bir damla mikroskopi montaj ortamı uygulayın.
  4. Montaj ortamının damlasına 22 mm'lik bir kapak kayması yerleştirin ve coverslip'in yerleşmesine ve montaj ortamının kapak altına yayılmasına izin verin. Aşırı montaj ortamını sıkmak için gerekirse coverslip'e hafif basınç uygulayın ve örtünün testislerin yüzeyinde dinlenmesine izin verin.
  5. Kapak kayma kenarları mühür için oje kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol başarıyla yürütüldüğünde, testisler konfokal mikroskopi veya diğer floresan mikroskopi yöntemleri ile görüntüleme için tamamen bozulmadan kalacaktır. Şekil 3A'dagörüldüğü gibi testislerin hücresel organizasyonu korunur ve hücre farklılaşmasının testisin bir ucundan spermatogonia, spermatositler ve haploid spermatidler gibi diğer ucuna ilerlemesi görülebilir. GFP-tubulin spermatositlerin bölünmesini belirlemek ve hücrelerin meyozis yoluyla ilerlemesinicanlı görüntüleme için yararlı bir belirteçtir. Şekil 3B'degösterildiği gibi, başlangıç meyozisi hakkında spermatositler iki belirgin mikrotübül asterleri ile tanımlanabilir. Metafaza göre büyük meyotik iğler GFP-tubulin(Şekil 3C)ile güzel bir şekilde etiketlenir.

Drosophila spermatositlerin büyük boyutu ve meyozozyoluyla göreceli yavaş ilerlemesi onları hücre bölünmesi sırasında sitoplazmik organeller gibi hücre bileşenlerinin dinamiği ve yeniden düzenlenmesi için ideal hale getirmek8,11,21. Şekil 4 ve Video 1, endoplazmik retikulum (ER) ve mikrotübüllerin meyozasyon seyri boyunca dinamik yeniden yapılandırımının canlı görüntüleme analizini göstermektedir. Yukarıda açıklandığı gibi, geç interfaz sırasında sadece mezozasyon başlangıcından önce, hücrenin kortekste bulunan iki centrozomlar açıkça GFP-tubulin floresan tarafından görülebilir. Bu aşamada, ER hedefli RFP (RFP-KDEL) floresan ER eşit sitoplazma boyunca dağıtılır ortaya koymaktadır. Centrosomes sonra iki mil kutup kurmak için nükleer zarfın zıt taraflarına göç başlar. Bu süre zarfında, ER hızla sentozomal mikrotübüller etrafında birikir ve giderek sitoplazma geri kalanından temizlenir. Nükleer zarf dökümü (NEB), nükleer bölge içinde GFP-tubulin floresan görünümü ile ortaya konur. Bu Drosophila hücreleri yarı açık mitoz veya meyozbölünme, nükleer zarf bileşenleri yıkmak ve dağıtmak ve büyük sitoplazmik moleküller innükleer bölgeye girmek anlamına gelir unutulmamalıdır, ancak ER kaynaklı membranlar bir zarf hücre bölünmesi boyunca mil ve kromatitler çevreleyen22,23,24. NEB zaman ve metafaz ile ilerleyen, ER neredeyse tamamen iki mil kutup centrozsomes çevreleyen astral mikrotübüller ile ilişkilidir. ER bu iki astral mikrotübül birikimleri sonra anafaz sırasında iki kızı hücrelere bölümleme, yeni oluşan hücreler tarafından uygun ER kalıtım sağlanması8,11.

Şekil 5 testis rüptürünün spermatositlerin canlı görüntülemesi üzerindeki etkilerini göstermektedir. Protokolde açıklandığı gibi, montaj adımları sırasında testislerin yüzeyine çok fazla örtü kaymadüşürmemeye özen izlenmelidir, çünkü bu testislere basınç uygulayacak ve patlamalarına neden olacaktır. Şekil 5 ve Video 2'degörüldüğü gibi, spermatosit kistleri yırtık testisten hızla dışarı akar ve hücrelerin bu hareketi canlı, zaman atlamalı görüntülemeyi son derece zorlaştırır.

Figure 1
Şekil 1: Başarılı diseksiyon için gerekli araçlar. (A) Diseksiyon için kullanılan forsepsler düz olmalı ve keskin, kırılmamış uçlar olmalıdır (yeşil onay işareti ile gösterilir). Bükülm veya kırık uçlu (kırmızı X işaretleri) ile çiller kullanmayın, çünkü larvaları kavramave ayrı dokularla alay etmede etkisiz kalacaktır. (B) Neşter aletihazırlamak için siyah anodize edilmiş çelik böcek iğnesini yaklaşık 135°'lik bir iç açıya bükün. Keskin nokta doku kesmek için bir bıçak olarak kullanılır, ve düz kenar dokuların taşınması için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Larva ve pupal testislerinin belirlenmesi. (A) Erkek ve dişi larvagörüntüleri. Testisler, hayvanın arka üçüncü (ok ucu) dairesel veya oval yarı saydam yapılar olarak erkekte tanımlanabilir. Kadında benzer bir yapının olmamasına dikkat edin. (B) Erken bir erkek pupa görüntüsü, iki yarı saydam testis ok başları ile gösterilir. (C) Diseksiyon dan sonra bağlı yağ vücutları ile test eder. Soldaki iki testis, hala kesilmesi gereken aşırı yağ vücutlarına sahiptir. Sağdaki iki testis düzgün yağ vücutlarını kesilmiş ve görüntüleme için hazır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Başarılı bir şekilde hazırlanmış bir testiste meyotik spermatositlerin belirlenmesi. (A) Başarıyla hazırlanmış canlı, bozulmamış testis In Confocal görüntü GFP-tubulin ifade. Kök hücrelerin merkezi testisin alt ucuna doğru yer alır, ancak bu hazırlıkta tanımlanamaz. Küçük spermatogonia çeşitli tabakalar gösterilir, ve bu spermatositler çok sayıda kist ler tarafından takip edilmektedir. İlk meyyoli bölünmede spermatosit bir kist hücrelerin büyük boyutuna göre tanımlanabilir (yaklaşık 20 - 30 μm çapında) ve GFP-tubulin varlığı meiyotik iğ ler etiketli. İkinci meyyolit bölümündeki spermatositler de benzer şekilde iğlere sahiptir, ancak bu hücreler yaklaşık olarak meyosis I hücrelerinin yarısı büyüklüğündedir. Post-meiotik spermatidler de görülebilir, spermatozoa uzaması gibi. (B) 30 - 60 dk içinde meyozluğa başlayacak spermatositler, GFP-tubulin etiketli iki büyük, çok parlak mikrotübüle asters (ok başları ile gösterilir) ile tanımlanabilir. Ön meyiyotik hücrelerin kisti kesikli sarı çizgi ile belirlenir. (C) Meyozisteki hücreler GFP-tubulin ile kolayca görselleştirilen büyük meyozik iğleri ile tanımlanabilir. Meiyotik hücrelerin kisti kesikli sarı çizgi ile belirlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Tek bir spermatositte meyozisin hızlandırılmış görüntülemesi. ER'yi (RFP-KDEL) hedefleyen GFP-tubulin ve RFP'yi birlikte ifade eden tek bir spermatosit, her iki dakikada bir kekozis boyunca görüntülenmiştir. Gösterilen geç interfaz başlayan ve telofaz yoluyla ilerleyen, mezozis belirli aşamalarında spermatosit temsili görüntüler. Zaman dakikalar içinde. Her görüntü, her zaman noktasında elde edilen on beş optik dilimden oluşan bir yığından elde edilen tek bir optik düzlemdir. Bu rakam Karabağ ve Smyth, 20198değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Bir testisin yırtılmadan önceki ve sonrası temsili görüntüleri. Soldaki "Bozulmamış" etiketli görüntü, yırtılmadan hemen önce testis ifade eden bir GFP-tubulin gösterir. Sağdaki resim yırtılma sonrası aynı testis gösterir. Rüptüre testisten spermatosit kistleri görülebilir. Ok başları meyiyotik spermatosit bir kist gösterir; testis rüptürü nden sonra bu spermatositlerin önemli hareketine dikkat edin, bu spermatositlerin zaman içinde görüntülenmesi son derece zordur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Tek bir spermatositin tam meiyotik bölünmesi. Gösterilen Şekil 4spermatosit ifade GFP-tubulin ve RFP-KDEL tam zamanlı hızlandırılmış olduğunu. Görüntüler her iki dakikada bir yakalanır ve oynatma hızı saniyede üç karedir. Bu video Karabasheva ve Smyth, 20198değiştirildi . Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 2: Yırtık testis. Bir testin yırtılmadan önce ve sonra zaman aşımı. Yırtık, testisin sol alt köşesinden hücrelerin kistlerinin ani akışına bağlı olarak belirgindir. Görüntüler her iki dakikada bir yakalanır ve oynatma hızı saniyede üç karedir. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Spermatosit hücre bölünmesinin uzun süreli canlı görüntülemesi için optimize edilmiş larva veya erken pupal Drosophila testislerinin hazırlanması için bir protokol tanımladık. Bu bozulmamış doku fizyolojik bağlamında hücre bölünmesi analizi için güçlü bir yöntemdir. Bu yöntemin gücü, spesifik gen mutasyonları, dokuya özgü RNAi aracılı baskılama ve floresan olarak etiketlenmiş protein ve organel belirteçleri gibi Drosophila genetik araçlarıyla birleştirildiğinde daha da genişletilir. Buna ek olarak, larva ve pupal testislerinin küçük boyutu ve bölücü hücreleri cam kapak kaymaya çok yakın görüntüleme yeteneği, süper çözünürlüklü yaklaşımlar da dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü görüntüleme için yöntemi ideal hale getirin. Bu deneysel sistemin çok yönlülüğü, hücre bölünmesi sırasında ER'nin dinamik yeniden yapılandırılmalarını açıklayan temsili sonuçlarla gösterilmiştir. Drosophila spermatositler özellikle bu hücrelerin büyük boyutu ve nispeten yavaş geçiş nedeniyle hücre bölünmesi sırasında organel dinamikleri bu tür analiz için yararlıdır. Ayrıca, aynı hücreler post-meiotically nasıl organel dinamikleri veya hücre bölünmesi mekanizmaları değişiklikleri spermatogenez sonraki olayları etkilediğini anlamak için görüntülenebilir. Bu nedenle, doku gelişimi ve hücre farklılaşması bağlamında hücre bölünmesinin fizyolojisini anlamak için bu deneysel yaklaşımla büyük bir potansiyel vardır, kültürde yetiştirilen hücreler incelenirken ulaşılamayan sonuçlar.

Protokol, testislerin uzun süreli ex vivo kültürünü yaklaşık 24 saate kadar kolaylaştıran çeşitli unsurlar içermektedir. İlk olarak, Drosophila doku kültür hücrelerinin bakımı için geliştirilen Schneider'ın medya, hazır enerji kaynakları içerir ve atmosferik havada fizyolojik pH korumak için optimize edilmiştir. İkinci olarak, testismontajı için kullanılan gaz geçirimli membran hızlı gaz değişimine olanak sağlar. Uzun süreli kültürün önemli bir avantajı, istenilen gelişim veya mayoz dönemindeki hücreler numune hazırlığından hemen sonra bulunamazsa, numunenin daha sonra tekrar depolanıp görüntülenebilmelidir. Bir gecede 25 °C'lik bir kuluçka makinesinde tutulan testislerin, toplam 16-24 saat boyunca, aktif olarak meyozasyon geçiren ve sperm farklılaşmasının sonraki aşamalarında ilerleyen hücrelerin rutin varlığına bağlı olarak canlı ve sağlıklı göründüğünü doğruladık. Ancak doku fizyolojisi olumsuz etkilenmemesi için testislerin 2-3 saatten uzun süre doku dan sıcandığınızda önlemler alınmalıdır. En önemlisi, testisler hücreler çoğalır ve sperm uzaması olarak kültür büyümeye devam ediyor. Bu, testislerin membran ve kapak kaymaarasındaki kısıtlayıcı boşluk nedeniyle patlayacak ları noktaya kadar büyümesine neden olabilir ve testisleri aşağıda açıklanan nedenlerle canlı görüntüleme için uygun hale getirebilir. Buna ek olarak, uzun vadeli kültürler rutin deneylerde istihdam edilecekise, uzun meiyotik süreler veya gecikmeli kromozomveya sitokinaz yetmezliği artan frekansları gibi meyotik anormallikler ile sonuçlanıp sonuçlanmadığını laboratuvara özgü genişletilmiş kültür koşulları test etmek için tavsiye edilir.

Uzun zaman boyunca hücreleri tek tek görüntülemek için, hazırlanan testisler mikroskop aşamasında olduğunda hücrelerin önemli ölçüde hareket etmemeleri önemlidir. Bu nedenle, testislerin bozulmadan ve hasarsız kalması protokolünü uygularken önemlidir, çünkü hücreler hasarlı testislerden dökülür ve sonuç olarak organ içindeki tüm hücreler hareket eder (Bkz. Şekil 5 ve Video 2). Hücreler sonunda yerleşmek ve hareket durdurmak eğer hasarlı testislerde spermatosit görüntü hala mümkün olabilir, bu zaman akadar mayoz bölünme aşamaları meydana gelir rağmen bir zaten meydana gelmiş olabilir. Buna ek olarak, hücre bölünmesi sürecinin kendisi üzerinde doku hasarı etkileri göz ardı edilemez. Testislerde hasar larvalardan testislerin çıkarılmasından sonra yağ vücutlarının temizlenmesinde oluşabilir. Bu nedenle protokolün bu adımında organların delinmesi veya çekilmesini önlemek için büyük özen gerekir. Aslında, genellikle çok yağ organları kaldırmak için gerekli değildir, sürece testis görselleştirme belirsiz değil. Daha yaygın olarak, testis hasarı canlı görüntüleme için montaj işlemi sırasında coverslip yerleştirildisonra çok fazla kültür ortamı kaldırma sonucudur (adım 3.6). Orta çıkarılır gibi, coverslip daha düşük düşer ve testisler üzerinde basınç uygular, ve aşırı basınç testisrü rüptürü neden olur. Bu nedenle, spermatositlerin optimal görüntülemesini kolaylaştırmak için coverslip'in testislere mümkün olduğunca yakın olması önemli olmakla birlikte, çok fazla orta ortamın çıkarılmasını ve kapağı çok fazla düşürmemesi için bazı pratikler gereklidir. Spermatositlerin ilaçlara veya diğer küçük moleküllere akut maruziyeti gibi bazı uygulamalarda, testisleri bozmak ve analiz için spermatosit kistlerini dağıtmak da avantajlı olabilir. Birkaç mükemmel protokoller hazırlık ve dağınık spermatosit kistlerin kültürü için kullanılabilir18,25.

Hücre bölünmesi analizi için spermatosit kullanırken önemli bir husus bu hücrelerin mitotik bölünmeler aksine meiyotik yürütmek olduğunu. Daha da önemlisi, iğ mimarisi ve sitokinaz gibi hücre bölünmesi mekaniğinin temel yönlerinin çoğu, erkek meyozis ve mitoz arasında benzer6. Böylece spermatosit meziyozunun incelenmesinden elde edilen mekanistik anlayışlar hayvan hücresi bölünmesi7'ningenel mekanizmalarına geniş ölçüde uygulanabilir. Ancak, ele alınmakta olan mekanistik sorulara bağlı olarak, kromozomal dinamiği ve hücre döngüsü düzenlemesi gibi süreçlerde spermatositler ve mitotik hücreler arasındaki önemli farkların26dikkate alınması gerekebilir. Aynı zamanda, Drosophila spermatositler aynı doku ve germline soy içinde mitotik ve meyotik hücreleri karşılaştırmak için eşsiz bir fırsat mevcut. Örneğin, aynı testis preparatgermline kök hücreleri veya spermatogonia mitoz ve spermatositler meyozis geçiren analiz etmek için kullanılabilir. Bu bölümlerin zamanlamasını tahmin etmek zor olduğu için canlı testis preparatlarında genellikle germline kök hücre veya spermatogonial mitozları görüntülemeye çalışmayız. Ancak, deneylerimizde bu bölünmeleri tesadüfen yakaladık ve genel protokolün testisler içindeki mitotik hücrelerin analizine de uygulanabileceğini gösterdik.

Sunulan metodoloji spermatosit meyoziscanlı görüntüleme için testis hazırlık odaklanır, bu hücresel ve moleküler dinamiklerin gerçek zamanlı analizi için izin verir. Ayrıca bozulmamış testislerin fiksasyonu ve immünboyması için bir yöntem de salıyoruz, çünkü bu yaklaşım floresan olarak etiketlenmiş ifade yapılarının mevcut olmaması veya protein aşırı ekspresyonunun şaşırtıcı etkilerinden kaçınmak için tercih edilebilir. Önemli bir husus olsa da fiksasyon her zaman sadakatle yerli doku ve hücresel mimari korumak değildir. Örneğin, biz ve diğerleri fiksasyon genellikle parçalanma veya ER11,27bozulması ile sonuçlanır bulduk. Bu sorunlardan bazıları farklı fiksatifler veya doku hazırlama yöntemleri kullanılarak hafifletilebilir ve bu nedenle belirli bir hücre bileşeninin veya protein organizasyonunun korunması için en uygun fiksasyon protokolünü belirlemek için bazı sorun giderme yöntemleri gerekebilir. Neyse ki, Drosophila spermatosit fiksasyon için ek protokoller bir dizi de mevcuttur18,28,29.

Sonuç olarak, spermatosit kekozisin canlı ve sabit hücre analizi için Drosophila testislerinin hazırlanması için çok yönlü yöntemler tanımlanmıştır. Bu deneysel yaklaşımın özel güçlü yönleri bozulmamış dokuda hücre bölünmesi analizi, büyük hücrelerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Drosophila genetik araçları ile entegrasyon içerir. Metodolojiyi kullanan deneyler, hücre bölünmesinin doku gelişimi ve homeostazın karmaşık mekanizmaları ile nasıl bütünleştirilebildiğini anlamamıza önemli katkılarda bulunabilmek için potansiyele sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Savunma Bakanlığı'nın J.T.S.'ye verdiği başlangıç fonları tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5" Dissecting Probe Fisher 08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet Fisher 13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9703-100
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides Fisher 12-544-2 Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100 mL
Lumox Dish 50 Sarstedt SAR946077410 Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass Fisher 12-541-B 22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade Electron Microsocopy Sciences 15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides Fisher 12-549-5 Slides used for dissections
PYREX Spot Plates Fisher 13-748B 9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium Fisher 21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm EMD Millipore SLGS033SB
Triton X-100 Fisher BP151-500
Vectashield Vector Labs H-1000 Microscopy mounting medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
  2. Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294, (30), 11382-11390 (2019).
  3. Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131, (10), 2241-2246 (2004).
  4. Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291, (28), 14628-14638 (2016).
  5. Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14, (4), 111 (2013).
  6. Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
  7. Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69, (11), Hoboken, N.J. 869-881 (2012).
  8. Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9, (1), 12456 (2019).
  9. Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187, (6), 847-858 (2009).
  10. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2, (1), 8 (2004).
  11. Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5, (8), (2015).
  12. Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68, (1), San Diego, Calif. 218-227 (2014).
  13. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. Cold Spring Harbor Press. 71-147 (1993).
  14. Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10, (12), 1001460 (2012).
  15. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, (3), 197-212 (2012).
  16. Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20, (12), 1169-1179 (2014).
  17. Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
  18. Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).
  19. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
  20. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  21. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125, (22), 5441-5452 (2012).
  22. Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94, (3), 463-470 (1989).
  23. Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19, (9), 3652-3666 (2008).
  24. Tates, A. D. Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. (1971).
  25. Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).
  26. Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, (5), (2015).
  27. Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190, (3), 363-375 (2010).
  28. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, (10), 1270-1272 (2011).
  29. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (1), 102-104 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics