Preparación de pruebas de larvas y pupales de Drosophila para el análisis de la división celular en vivo, tejido intacto

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Developmental Biology

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Summary

El objetivo de este protocolo es analizar la división celular en tejido intacto mediante microscopía celular viva y fija utilizando esperamorcitos meióticos Drosophila. El protocolo demuestra cómo aislar testículos enteros e intactos de larvas de Drosophila y pusias tempranas, y cómo procesarlos y montarlos para microscopía.

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Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue. J. Vis. Exp. (159), e60961, doi:10.3791/60961 (2020).

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Abstract

El análisis experimental de las células que se dividen en tejidos y órganos vivos y intactos es esencial para nuestra comprensión de cómo la división celular se integra con el desarrollo, la homeostasis tisular y los procesos de la enfermedad. Los espermatocitos drosofílicos sometidos a meiosis son ideales para este análisis porque (1) los testículos enteros de Drosophila que contienen espermatocitos son relativamente fáciles de preparar para la microscopía, (2) el gran tamaño de los espermatocitos los hace muy adecuados para imágenes de alta resolución, y (3) potentes herramientas genéticas de Drosophila se pueden integrar con el análisis in vivo. Aquí, presentamos un protocolo de fácil acceso para la preparación de testículos enteros de larvas drosophila tercera instar y pupupas tempranas. Describimos cómo identificar esperamorcitos meióticos en testículos enteros preparados y cómo imaginarlos vivir por microscopía de lapso de tiempo. También se proporcionan protocolos para la fijación e inmunostainización de testículos enteros. El uso de testículos larvales tiene varias ventajas sobre los protocolos disponibles que utilizan testículos adultos para el análisis de espermatocitos. Lo más importante es que los testículos larvales son más pequeños y menos llenos de células que los testículos adultos, y esto facilita en gran medida la toma de imágenes de alta resolución de los espermatocitos. Para demostrar estas ventajas y las aplicaciones de los protocolos, presentamos resultados que muestran la redistribución del retículo endoplasmático con respecto a los microtúbulos del husillo durante la división celular en un solo espertacito que se muestra mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Los protocolos se pueden combinar con la expresión de cualquier número de proteínas etiquetadas fluorescentes u marcadores de orgánulos, así como mutaciones genéticas y otras herramientas genéticas, haciendo que este enfoque sea especialmente potente para el análisis de los mecanismos de división celular en el contexto fisiológico de tejidos y órganos enteros.

Introduction

La división celular se estudia a menudo utilizando líneas celulares cultivadas en el cultivo1. Si bien hemos obtenido una gran cantidad de información y comprensión inestimables de los mecanismos fundamentales de estos estudios2, las células cultivadas en el cultivo no pueden recapitular completamente la fisiología de la división celular como ocurre en el tejido vivo intacto. Por ejemplo, en los tejidos y órganos intactos, las células deben dividirse en el lugar correcto y en el momento adecuado para que las células de la progenie estén adecuadamente situadas dentro del tejido, de modo que puedan someterse a una adecuada diferenciación o programas funcionales, y para que la proliferación celular esté adecuadamente coordinada con el crecimiento tisular o la homeostasis3. En el caso de las células cultivadas en cultivo, por otro lado, la división celular está generalmente regulada por factores de crecimiento en el medio de cultivo4,y por lo tanto no podemos aprender de estas células cómo factores ambientales in vivo como la arquitectura de tejidos o la señalización del desarrollo influyen en el proceso de división. También es importante tener en cuenta que muchas de las líneas celulares utilizadas para estudiar la división celular, como las células HeLa y U2OS, se derivaron de tumores metastásicos5. Por lo tanto, muchos aspectos de la fisiología básica de estas células cancerosas, como los mecanismos reguladores del ciclo celular y la estabilidad cromosómica, probablemente han sido alterados en comparación con las células sanas. La comprensión completa de la fisiología de la división celular, por lo tanto, depende de nuestra capacidad para estudiar células divisorias en sus entornos nativos in vivo que preservan los mecanismos reguladores fisiológicos y la arquitectura de los tejidos.

Los avances en la comprensión de cómo funciona la división celular dentro de los tejidos y órganos intactos se ven obstaculizados por dificultades inherentes al análisis in vivo o ex vivo. En primer lugar, puede ser difícil o imposible acceder a las células divisorias para el análisis microscópico dentro de órganos grandes o tejidos gruesos. En segundo lugar, a menudo es difícil predecir cuándo las células individuales se dividirán in vivo. En tercer lugar, la fisiología tisular puede deteriorarse rápidamente durante el cultivo ex vivo. En este protocolo, describimos métodos fácilmente accesibles para el análisis en vivo y fijo de los espermatocitos Drosophila melanogaster a medida que se someten a divisiones celulares meióticas dentro de testículos totalmente intactos. Estas células son ideales para el análisis vivo y ex vivo porque son fácilmente accesibles con métodos ópticos estándar como la microscopía confocal, se dividen en momentos y ubicaciones predecibles, y los testículos intactos se pueden mantener en cultivo ex vivo durante aproximadamente 24 horas. Además, los espermatocitos Drosophila son células redondas grandes (aproximadamente de 20 a 30 m de diámetro) que no cambian de forma cuando se dividen, por lo que son ideales para imágenes de alta resolución y lapso de tiempo de componentes celulares como el aparato del husillo y los orgánulos citoplasma. Aunque estas células sufren meiosis en comparación con la mitosis, muchos de los procesos esenciales de división celular son muy similares entre estos dos mecanismos de división celular6. Estas ventajas, combinadas con potentes herramientas genéticas Drosophila, han hecho de los espermatocitos Drosophila un modelo ampliamente utilizado para el análisis ex vivo de procesos esenciales de división celular incluyendo la formación y regulación de husillos, la citokinesis, y la remodelación y partición de orgánulos7,,8,9,,10,11.

Los espermacitos son células que se encuentran en la etapa meiótica de la espermatogénesis. En Drosophila,la espermatogénesis comienza con un grupo de células madre germinales que se encuentran en una pequeña región o "hub" en un polo del testículo12,,13. Estas células se dividen por una mitosis asimétrica, dando lugar a un solo espermatogonio diferenciado. Luego, la espermatogonia se somete a cuatro mitosis síncronas para producir un grupo de 16 células que permanecen estrechamente asociadas dentro de un solo quiste. En esta etapa, las células pasan de un ciclo celular mitético a un ciclo celular meiótico y se conocen como espermatocitos. Los espermacitos pasan alrededor de dos a tres días en una etapa G2 extendida del ciclo celular, durante la cual crecen dramáticamente y experimentan cambios citológicos en la preparación para las dos divisiones meióticas y posterior espermiogénesis13,,14. Todo el grupo de 16 espermatocitos dentro de un solo quiste entonces entra en la primera división meiótica al mismo tiempo. Por lo tanto, varios esperamorcitos meióticos se pueden crear imágenes simultáneamente a medida que avanzan a través de la división celular. La primera división meiótica continúa durante aproximadamente 1,5 h y es seguida casi inmediatamente por la segunda división meiótica, produciendo 64 espermatozoides totales que pasan a diferenciarse en espermatozoides maduros.

Una ventaja única de usar espermacitos para estudiar la división celular en vivo, tejido intacto es que los grupos o quistes de las células progresan constantemente a través de las diferentes etapas de la espermatogénesis, y las células en todas las etapas de la espermatogénesis generalmente se pueden identificar en cualquier testículo dado (ver Figura 3A). Por lo tanto, es relativamente fácil encontrar células meióticas en testículos enteros. Por lo general, centramos nuestros análisis en la primera en lugar de la segunda meiosis porque estas células son mucho más grandes y más susceptibles a las imágenes de alta resolución, pero todo el proceso que abarca ambas divisiones meióticas se puede tomar imágenes con éxito. También debe tenerse en cuenta que el protocolo general para la preparación y el cultivo de testículos se puede utilizar para analizar otros procesos de espermatogénesis, así, como la célula madre mitotica anterior o divisiones espermatogoniales o los cambios citológicos que se producen a medida que los espermatozoides maduran en espermatozoides15. Muchos de estos aspectos de la espermatogénesis están muy conservados entre Drosophila y los seres humanos16.

Los espermatocitos drosófilos comienzan a alcanzar la fase meiótica de la espermatogénesis durante la tercera etapa larval instar del desarrollo de Drosophila 13. Por lo tanto, los testículos aislados de las etapas del ciclo de vida a partir de larvas de tercera estrella e incluyendo pupas y adultos se pueden utilizar para el análisis de la división de espermacitos. Varios protocolos excelentes están disponibles para la extracción de testículos de moscas macho adultas para análisis vivos y fijos de espermatogénesis17,18,19. Estos protocolos pueden ser preferibles para estudiar etapas tardías de la espermatogénesis o si se deben utilizar marcadores genéticos que solo son visibles en adultos. El protocolo se centra en cambio en la preparación de testículos a partir de larvas y pupae tempranas, porque los testículos en estas etapas tienen varias ventajas que son específicamente pertinentes para el análisis de la división celular por microscopía de lapso de tiempo de alta resolución. En primer lugar, los testículos de larvas y pusias son más pequeños que los de adultos, y las células dentro del órgano están menos llenas. Debido a esto, los espermismocitos divisorios a menudo se pueden tomar imágenes cerca de la superficie externa de los testículos larvales, sin tener que penetrar a través de múltiples capas de tejido de dispersión de luz. En segundo lugar, los testículos adultos se mueven rítmicamente debido a las contracciones de los órganos accesorios conectados, y estos movimientos hacen que la toma de imágenes de lapso de tiempo de células individuales sea un desafío. Y en tercer lugar, los testículos larvales son ventajosos cuando se estudian mutaciones genéticas que causan letalidad pupal o adulta. Nuestros métodos están optimizados para el cultivo a largo plazo de testículos en la etapa del microscopio, lo que permite la toma de imágenes de múltiples rondas de división celular o la progresión de células individuales a través de múltiples etapas de espermatogénesis en la misma preparación. También describimos un protocolo para la fijación y la inmunomanchación de testículos enteros. En general, nuestros protocolos son particularmente útiles para aquellos interesados en estudiar la división celular en tejido intacto, y la capacidad de combinar el análisis de espermatocitos con herramientas genéticas Drosophila altamente manejables hace de este un enfoque especialmente poderoso.

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Protocol

1. Preparar animales, herramientas y medios para la disección

  1. Cruz a las moscas macho y hembra para obtener progenie del genotipo deseado. Los marcadores transgénicos útiles para la identificación y puesta en escena de los espermatocitos meióticos incluyen GFP-tubulina para etiquetar el husillo meiotico y RFP-histone 2A para etiquetar los cromomasomas8. Utilice de cinco a diez hembras por cruz y mantenga cruces en alimentos de mosca estándar en viales en una incubadora de 25 oC hasta que las larvas de la tercera estrella comiencen a gatear por los lados del vial (4-5 días). Las primeras puas blancas comenzarán a formarse un día después.
  2. Consigue dos pares de fórceps rectos con puntas finas. Asegúrese de que las puntas sean afiladas, incluso en longitud, y rectas(Figura 1A). Utilice estos fórceps solo para disecciones y tapa con puntas de pipeta de 10 ml cuando no esté en uso.
  3. Prepare una herramienta de bisturí.
    1. Inserte el extremo romo de un pasador de insecto de acero anodizado negro en un soporte de pasador y gire el tornillo del soporte para fijar el pasador en su lugar. Usando un par de fórceps y bajo un microscopio de disección, agarre el pasador de insectos en el medio y dóblelo para formar un ángulo interno de 135o(Figura 1B). El extremo afilado es para cortar tejido, mientras que el borde se utiliza para transferir testículos entre gotas de medios.
    2. Tapa con una punta de pipeta de 1.000 ml cuando no esté en uso.
  4. Trabajando en una campana de cultivo de tejido, prepare alícuotas de 5 ml de los medios de Schneider y guárdelas a 4 oC hasta el momento de su uso. Cuando esté listo para comenzar las disecciones, caliente una alícuota media de 5 ml a temperatura ambiente. A continuación, transfiera el medio de disección calentado a una jeringa de 10 ml y conecte un filtro de jeringa de 0,22 m.

2. Disección de testículos de larvas y puas precoces

  1. Utilice la jeringa de filtro llena de medios para expulsar tres gotas de medios (50 ml cada una) en la parte superior, media e inferior de un portaobjetos de vidrio.
  2. Utilice una sonda de disección para transferir de cinco a diez terceras larvas instar o puas tempranas (pugas que todavía son blancas o amarillas) a la gota superior. Agitar suavemente las larvas y puepue en los medios con la sonda de diseción para eliminar cualquier alimento o escombros.
  3. Bajo un microscopio de disección, gire una sola larva o pupa de su lado con una sonda de disección para identificar los dos testículos bilaterales si están presentes, que aparecen como estructuras translúcidas de forma ovalada en el tercio posterior del cuerpo(Figura 2A, B). Los animales que carecen de testículos son hembras y deben ser desechados.
  4. Cuando se encuentre una larva o pupa macho y esté limpia, muévala a la segunda gota de medios. Repita hasta que se hayan transferido 3 o 4 larvas masculinas y/o pupae a la segunda gota de medios.
  5. Trabajando en la segunda gota de medios, agarra una sola larva macho o pupa con un par de fórceps en su región media, justo antes de los testículos. Usa el segundo par de fórceps para desgarrar suavemente al animal por la mitad.
  6. Sostenga el extremo posterior de la larva o pupupa hacia abajo en el tobogán de vidrio con un par de fórceps. Comenzando justo al lado de los fórceps, empuje hacia abajo en la cutícula usando el borde de la herramienta del bisturí y mueva el bisturí hacia el extremo cortado del animal. Esto expulsará los órganos internos del animal, que incluyen las tripas, cuerpos de grasa y testículos.
  7. Tome suavemente separar los testículos del resto de los órganos. Los testículos son órganos claros de forma ovalada incrustados en cintas de cuerpo gordo(Figura 2C).
  8. Transfiera los testículos de uno en uno a la tercera gota de medios. Para lograr esto, inserte el borde del bisturí debajo del cuerpo gordo, levante el tejido fuera del medio y muévalo rápidamente a la tercera gota.
  9. Alternativamente, si no hay suficiente cuerpo de grasa todavía unido a los testículos para levantar con éxito el tejido, transferir suavemente el tejido utilizando una pipeta Pasteur de vidrio que ha sido prehumedecida con medios de disección.
  10. Utilice el extremo afilado de la herramienta del bisturí para cortar suavemente el exceso de grasa del cuerpo de los testículos, dejando sólo un pequeño borde de cuerpo de grasa alrededor de los bordes(Figura 2C). No es necesario eliminar todo el cuerpo de grasa, y tratar de hacerlo probablemente resultará en dañar o romper de los testículos.
  11. Repita los pasos anteriores para todas las larvas masculinas en el tobogán de vidrio.
  12. Continúe con el paso 3 o el paso 5.

3. Pruebas de montaje para imágenes microscópicas en vivo

NOTA: Este procedimiento de montaje fue adaptado de un protocolo recientemente publicado para la toma de imágenes de los neuroblastos cerebrales larvales de Drosophila 20. Puede encontrar más detalles en esta referencia.

  1. Utilice la jeringa de filtro para depositar una sola gota de los medios de Schneider (alrededor de 30 ml) en el centro de un plato de cultivo permeable al gas de 50 mm.
  2. Utilice una pipeta Pasteur prehumedecida para transferir los testículos preparados a la gota del plato permeable al gas. Los testículos generalmente flotarán a la superficie de la gota.
  3. Utilice la herramienta del bisturí para empujar suavemente los testículos hacia abajo sobre la membrana permeable al gas. Tenga cuidado de no romper la membrana permeable al gas con el punto afilado del bisturí. Empuje todos los testículos al centro de la gota.
  4. Utilice una jeringa de 1 ml llena de aceite de halocarbono para hacer cuatro gotas de aceite, aproximadamente 30 l cada una, en la membrana permeable al gas. Espaciar las gotas de aceite alrededor de la gota de medios que contienen los testículos para que correspondan a las cuatro esquinas de un cubreobjetos de vidrio de 22 mm.
  5. Alinee las esquinas de un cubreobjetos de vidrio de 22 mm con las cuatro gotas de aceite de halocarbon y baje suavemente el cubreobjetos sobre el medio y el aceite. Deje que el cubreobjetos se asiente y que los medios que contienen los testículos se propaguen entre las gotas de aceite.
  6. Retire el exceso de medios para permitir que el cubreobjetos se asiente sobre la superficie de los testículos. Mientras observa los testículos bajo un microscopio de disección, inserte la esquina de una delicada toallita de tarea en el medio bajo el cubreobjetos para eliminar una pequeña cantidad de líquido. Retirar suficientes medios hasta que el cubreobjetos de vidrio sólo hace contacto con la superficie de los testículos más grandes. Es fundamental no eliminar demasiados medios y bajar demasiado el cubreobjetos, ya que esto ejercerá presión sobre los testículos y hará que se rompan (ver Figura 5).

4. Imágenes en vivo de los espermacitos meióticos

NOTA: Los espermatocitos se pueden crear imágenes utilizando un microscopio confocal de disco giratorio o de escaneo láser. El sistema debe tener una velocidad y sensibilidad adecuadas para evitar el fotoblanqueo de proteínas fluorescentes o fotodaños del tejido.

  1. Coloque una gota de aceite de inmersión en el cubreobjetos de vidrio justo encima de los testículos. Voltee el plato y colóquelo en la etapa del microscopio y mueva el objetivo del microscopio (40x o 60x) en el aceite hasta que esté justo debajo de los testículos. Utilice la luz transmitida para encontrar un solo testículo y ponerlo en foco.
  2. Mientras captura imágenes rápidas con el confocal, mueva el testis alrededor para examinar la organización de las celdas. Un extremo de los testículos tendrá muchas células pequeñas y densamente empaquetadas. Este extremo contiene las células madre germinales y la espermatogonia. Avanzando hacia el otro extremo del órgano, identifique células progresivamente más grandes organizadas en racimos o quistes discretos. Estas células grandes son los espermacitos(Figura 3A).
  3. Si toma imágenes de GFP-tubulina, identifique los espermatocitos que iniciarán la meiosis dentro de 30-60 min por la presencia de dos asteres de microtúbulos brillantes (es decir, centrosomas) ubicados en la corteza de la célula(Figura 3B, C).
  4. Una vez que se haya identificado un quiste de espermatocitos meióticos, configure los parámetros de adquisición para capturar pilas z de imágenes a lo largo del tiempo. Típicamente, la adquisición de 15–20 imágenes separadas 1,5 m en la dimensión z es suficiente para capturar el volumen completo de varios espermacitos dentro del mismo quiste.
  5. Adquiera pilas z completas cada 2 minutos si toma imágenes de toda la primera división meiótica, que tarda aproximadamente 1,5 horas. Es posible utilizar tasas de adquisición más rápidas, especialmente si sólo se va a analizar un evento específico de meiosis. Sin embargo, tenga cuidado de no causar fotoblanqueo o fotodaño debido a la exposición repetida de la muestra a la excitación láser.
  6. Utilice un sistema de control de enfoque continuo y automático para evitar la deriva focal durante el largo período de adquisición. Por lo general, no es necesario controlar la temperatura de la muestra en la etapa del microscopio, suponiendo una temperatura ambiente de aproximadamente 22-23 oC. Si hay control de temperatura disponible, mantenga la muestra a 25 oC en la etapa del microscopio.
  7. Si no se encuentran espermatocitos meióticos, almacene la muestra durante varias horas o durante la noche en una incubadora e imagen de 25 oC de nuevo.

5. Fijación e inmunomancha

  1. A partir del paso 2.10 anterior, utilice una pipeta Pasteur de vidrio para transferir los testículos a un pozo en un plato de desconexión de vidrio de 9 pozos que contenga 0,5 ml de paraformaldehído al 8% en PBSTx (solución salina tamponada de fosfato con 0,3% de tritón X-100). Asegúrese de que los testículos están colocando en la parte inferior del plato.
    NOTA: Paraformaldehyde es tóxico y debe manipularse con guantes en una campana de humo.
  2. Fijar los testículos durante 20 minutos a temperatura ambiente.
  3. Transfiera los testículos a un pozo que contenga 0,5 ml PBSTx. Lavar durante 5 min con agitación suave. Repita el paso de lavado en nuevos pozos con PBSTx fresco dos veces más.
  4. Diluir el anticuerpo primario a la concentración deseada en 0,5 ml de PBSTx que contiene 5% de albúmina sérica bovina (BSA) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Transfiera los testículos de la placa de desguace de vidrio de 9 metros a la sonda de anticuerpos primarios diluidos e incubadurante durante la noche a 4oC con una suave mecedora o nueces.
  5. Lave los testículos en 0,5 ml de PBSTx durante 5 minutos en un pozo de un plato de diselación de vidrio de 9 pozos. Repita el paso de lavado con PBSTx fresco dos veces más.
  6. Diluir el anticuerpo secundario en 250 ol de PBSTx que contiene 5% de BSA y dispensar en un pozo limpio de un plato de disificación de vidrio de 9 pozos. Si lo desea, agregue DAPI al ADN de manchas. Transfiera los testículos al pozo que contiene anticuerpos secundarios, cubra con una envoltura de plástico e incubar en la oscuridad con agitación suave durante 4 horas a temperatura ambiente.
  7. Transfiera los testículos a un pozo limpio lleno de 0,5 ml de PBSTx. Lavar con PBSTx fresco dos veces durante 5 minutos y una tercera vez durante 30 min.

6. Montaje de testículos fijos

  1. Transfiera los testículos del último lavado a un portaobjetos de microscopía de vidrio utilizando una pipeta Pasteur. Si es necesario, utilice el borde de la herramienta del bisturí para empujar los testículos hacia abajo sobre la superficie de la diapositiva.
  2. Utilice la esquina de una delicada toallita de tarea para eliminar el exceso de líquido de los testículos. Retire tanto líquido como sea posible.
  3. Aplique una gota de 30–50 l de medio de montaje de microscopía a los testículos.
  4. Coloque un cubreobjetos de 22 mm en la gota del medio de montaje y deje que el cubreobjetos se asiente y el medio de montaje se extienda por debajo de la cubierta. Aplique una presión suave al cubreobjetos si es necesario para exprimir el exceso de medio de montaje y dejar que el cubreobjetos descanse sobre la superficie de los testículos.
  5. Use esmalte de uñas para sellar los bordes de la cubierta.

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Representative Results

Cuando este protocolo se ejecuta con éxito, los testículos permanecerán completamente intactos para la toma de imágenes mediante microscopía confocal u otros métodos de microscopía de fluorescencia. Como se ve en la Figura 3A,se preserva la organización celular de los testículos, y la progresión de la diferenciación celular de un extremo del testículo al otro incluyendo espermatogonia, espermatocitos, y espermicidas haploides es visible. La GFP-tubulina es un marcador útil para identificar la división de los espermacitos y para la toma de imágenes en vivo de la progresión de las células a través de la meiosis. Como se muestra en la Figura 3B,los espermacitos sobre la meiosis de inicio pueden ser identificados por sus dos prominentes microtúbulos asters. Por metafase, los grandes husillos meióticos están bellamente etiquetados por GFP-tubulina(Figura 3C).

El gran tamaño de los espermatocitos drosófilos y su relativa lenta progresión a través de la meiosis los hacen ideales para el análisis de la dinámica y reorganización de componentes celulares como los orgánulos citoplasmáticos durante la división celular8,,11,,21. La Figura 4 y el Video 1 muestran un análisis de imágenes en vivo de la reorganización dinámica del retículo endoplasmático (ER) con respecto a los microtúbulos a través de la meiosis. Como se describió anteriormente, durante la interfase tardía justo antes de la aparición de la meiosis, dos centrosomas situados en la corteza de la célula son claramente visibles por fluorescencia de GFP-tubulina. En esta etapa, la fluorescencia RFP (RFP-KDEL) dirigida a ER revela que el ER se distribuye uniformemente a lo largo del citoplasma. Los centrosomas comienzan entonces a migrar a lados opuestos de la envolvente nuclear para establecer los dos polos del husillo. Durante este tiempo, la urgencia se acumula rápidamente alrededor de los microtúbulos centrosomales y se elimina progresivamente del resto del citoplasma. La descomposición de la envolvente nuclear (NEB) se revela por la aparición de fluorescencia de gFP-tubulina dentro de la región nuclear. Cabe señalar que las células droofáfilas se dividen por mitosis o meiosis semiabiertas, lo que significa que los componentes de la envolvente nuclear se descomponen y dispersan y grandes moléculas citoplasmáticas entran en la región nuclear, pero una envoltura de membranas derivadas de ER rodea el husillo y los cromátidos a lo largo de la división celular22,,23,24. En el momento de LA NEB y progresando a través de la metafase, el ER está casi completamente asociado con los microtúbulos astrales que rodean los dos centrosomas del polo del husillo. Estas dos acumulaciones de microtúbulos astrales del ER se dividen a las dos células hijas durante la anafase, asegurando la herencia adecuada de ER por las células recién formadas8,,11.

La Figura 5 muestra los efectos de la ruptura de los testículos en la toma de imágenes en vivo de los espermacitos. Como se describe en el protocolo, se debe tener mucho cuidado de no bajar el cubreobjetos demasiado sobre la superficie de los testículos durante los pasos de montaje, ya que esto aplicará presión a los testículos y hará que estallen. Como se ve en la Figura 5 y Video 2, los quistes de los espermatocitos fluyen rápidamente fuera de la rotura de testículos, y este movimiento de las células hace que la imagen viva, lapso de tiempo extremadamente difícil.

Figure 1
Figura 1: Herramientas necesarias para una disección correcta. (A) Los fórceps utilizados para la disección deben ser rectos y tener puntas afiladas e ininterrumpidas (indicadas por una marca de verificación verde). No utilice fórceps con puntas dobladas o rotas (marcas X rojas), ya que serán ineficaces para agarrar larvas y burlarse de los tejidos. (B) Para preparar la herramienta de bisturí, doble un pasador de insecto de acero anodizado negro en un ángulo interno de aproximadamente 135o. El punto afilado se utiliza como un cuchillo para cortar a través del tejido, y el borde recto se utiliza para mover los tejidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Identificación de testículos larvales y pupal. (A) Imágenes de larvas masculinas y femeninas. Los testículos son identificables en el macho como estructuras translúcidas circulares u ovaladas en el tercio posterior del animal (cabeza de flecha). Observe la falta de una estructura similar en la hembra. (B) Imagen de una pupa masculina temprana, con los dos testículos translúcidos indicados por puntas de flecha. (C) Testículos con cuerpos grasos adjuntos después de la disección. Los dos testículos de la izquierda tienen cuerpos de grasa excesivamente unidos que necesitan ser recortados. Los dos testículos de la derecha se han recortado correctamente de sus cuerpos grasos y están listos para la toma de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Identificación de esperamorocitos meióticos en un testículo preparado con éxito. (A) Imagen confocal de un testis vivo e intacto preparado con éxito que expresa GFP-tubulina. El cubo de las células madre se encuentra hacia la punta inferior de los testículos, aunque no es identificable en esta preparación. Varias capas de pequeña espermatogonia están indicadas, y estos son seguidos por numerosos quistes de espermacitos. Un quiste de esperamorcitos en la primera división meiótica es identificable en función del gran tamaño de las células (aproximadamente 20 – 30 m de diámetro) y la presencia de husillos meióticos etiquetados con GFP-tubulina. Los espermacitos en la segunda división meiótica tienen también husillos, pero estas células son aproximadamente la mitad del tamaño de las células de la meiosis I. Los espermicidas posmeióticos también son visibles, al igual que los espermatozoides alargados. (B)Los esperacitos que comenzarán la meiosis en un plazo de 30 – 60 min pueden ser identificados por sus dos grandes y muy brillantes microtúbulos (indicados por cabezas de flecha) etiquetados por GFP-tubulina. El quiste de las células premeióticas se delinea por la línea amarilla discontinua. (C) Las células de la meiosis son identificables por sus grandes husillos meióticos que se visualizan fácilmente con GFP-tubulina. El quiste de las células meióticas se delinea por la línea amarilla discontinua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes de lapso de tiempo de la meiosis en un solo espermacito. Un solo espermacito co-expresando GFP-tubulina y RFP dirigido a la ER (RFP-KDEL) fue imagenizado cada dos minutos a través del curso de la meiosis. Se muestran imágenes representativas del epertólogo en etapas específicas de la meiosis, comenzando a finales de la interfase y progresando a través de la telofase. Los tiempos son en minutos. Cada imagen es un único plano óptico de una pila de quince sectores ópticos adquiridos en cada punto de tiempo. Esta cifra fue modificada de Karabasheva y Smyth, 20198. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Imágenes representativas de un testis antes y después de la rupturing. La imagen de la izquierda, etiquetada como "Intact", muestra un GFP-tubulin que expresa el testis justo antes de la ruptuación. La imagen de la derecha muestra el mismo testis después de la ruptura. Los quistes de los espermatocitos se pueden ver saliendo de la rotura de testículos. Las puntas de flecha indican un quiste de esperamorcitos meióticos; notar el movimiento significativo de estos espermacitos después de que el testículo se rompe, haciendo que la toma de imágenes de estos espermacitos con el tiempo sea extremadamente difícil. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: División meiótica completa de un solo esperatocito. Se muestra el lapso de tiempo completo de la GFP-tubulina y RFP-KDEL que expresan el espermatocitos en la Figura 4. Las imágenes se capturaban cada dos minutos, y la velocidad de reproducción es de tres fotogramas por segundo. Este video fue modificado de Karabasheva y Smyth, 20198. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Testis rotos. El lapso de tiempo de un testículo es antes y después de la rupturing. La ruptura es evidente debido a la corriente repentina de quistes de células a través de la esquina inferior izquierda del testículo. Las imágenes se capturaban cada dos minutos, y la velocidad de reproducción es de tres fotogramas por segundo. Haga clic aquí para descargar este video.

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Discussion

Hemos descrito un protocolo para la preparación de testículos de Drosophila pupálida larvales o tempranas, optimizado para imágenes en vivo a largo plazo de la división celular de los espermatozoides. Este es un método poderoso para el análisis de la división celular en el contexto fisiológico del tejido intacto. El poder de este método se expande aún más cuando se combina con herramientas genéticas drosofílicas, como mutaciones genéticas específicas, supresión mediada por ARN específica del tejido y marcadores de proteínas y orgáyos etiquetados fluorescentemente. Además, el pequeño tamaño de los testículos larvales y pupal, y la capacidad de crear imágenes de células divisorias muy cerca de la cubierta de vidrio, hacen que el método sea ideal para imágenes de alta resolución, incluidos los enfoques de superresolución. La versatilidad de este sistema experimental queda demostrada por los resultados representativos que describen la reorganización dinámica del ERE durante la división celular. Los espermatocitos drosófilos son particularmente útiles para tal análisis de la dinámica de los órganos del órgano durante la división celular debido al gran tamaño de estas células y al tránsito relativamente lento a través de la meiosis. Además, las mismas células se pueden tomar imágenes post-meiotically para entender cómo los cambios en la dinámica de los orgánulos o los mecanismos de división celular afectan los eventos posteriores de la espermatogénesis. Por lo tanto, hay un gran potencial con este enfoque experimental para entender la fisiología de la división celular dentro del contexto más amplio de desarrollo de tejidos y diferenciación celular, resultados que son inalcanzables al estudiar células cultivadas en cultivo.

El protocolo incluye varios elementos que facilitan el cultivo ex vivo a largo plazo de los testículos durante aproximadamente 24 horas. En primer lugar, los medios de Schneider, que fueron desarrollados para el mantenimiento de células de cultivo de tejido Drosophila, contiene fuentes de energía fácilmente disponibles y está optimizado para mantener el pH fisiológico en el aire atmosférico. En segundo lugar, la membrana permeable al gas utilizada para las pruebas de montaje permite un intercambio rápido de gas. Una ventaja importante del cultivo a largo plazo es que si las células en la etapa deseada de desarrollo o meiosis no se encuentran inmediatamente después de la preparación de la muestra, la muestra se puede almacenar e imágenes de nuevo en un momento posterior. Hemos verificado que los testículos mantenidos en una incubadora de 25oC durante la noche, durante un total de 16-24 horas, son viables y parecen saludables en función de la presencia rutinaria de células que se someten activamente a la meiosis y progresan a través de etapas posteriores de diferenciación de espermatozoides. Sin embargo, se deben tomar precauciones al cultivar los testículos durante más de 2-3 horas para garantizar que la fisiología del tejido no se vea afectada negativamente. Lo más importante es que los testículos siguen creciendo en cultivo a medida que las células proliferan y maduran la alargación de espermatozoides. Esto puede hacer que los testículos se agranden hasta el punto en que estallan debido al espacio restrictivo entre la membrana y el cubreobjetos, haciendo que los testículos no sean adecuados para imágenes en vivo por las razones que se describen a continuación. Además, si los cultivos a largo plazo deben emplearse rutinariamente en experimentos, es aconsejable probar si las condiciones de cultivo extendido específicas del laboratorio dan lugar a anomalías meióticas como duraciones meióticas prolongadas o aumento de frecuencias de cromosomas rezagados o fallo de citoquinesis.

Con el fin de crear imágenes de células individuales durante largos cursos de tiempo, es importante que las células no se muevan significativamente una vez que los testículos preparados están en la etapa del microscopio. Por lo tanto, es esencial al ejecutar el protocolo que los testículos permanezcan intactos y sin daños, porque las células se derraman de los testículos dañados y todas las células dentro del órgano se mueven como resultado (ver Figura 5 y Video 2). Todavía puede ser posible tomar imágenes de espermatocitos en testículos dañados si las células finalmente se asientan y dejan de moverse, aunque para el momento en que esto ocurre las etapas de la meiosis que uno tiene la intención de analizar puede haber ocurrido ya. Además, los efectos del daño tisular en el proceso de división celular en sí no se pueden descontar. El daño a los testículos puede ocurrir al eliminar los cuerpos de grasa después de la eliminación de los testículos de las larvas. Por lo tanto, se debe tener mucho cuidado para evitar perforar o aflor los órganos durante este paso del protocolo. De hecho, a menudo no es necesario eliminar gran parte de los cuerpos de grasa, siempre y cuando no oscurezcan la visualización de los testículos. Más comúnmente, el daño de testículoes es el resultado de la eliminación de demasiado medio de cultivo después de la colocación del cubreobjetos durante el procedimiento de montaje para imágenes en vivo (paso 3.6). A medida que se retira el medio, el cubreobjetos cae más bajo y ejerce presión sobre los testículos, y el exceso de presión hará que los testículos se rompan. Por lo tanto, si bien es importante que el cubreobjetos esté lo más cerca posible de los testículos para facilitar la toma de imágenes óptimas de los espermatocitos, es necesario practicar para evitar eliminar demasiado medio y bajar demasiado el cubreobjetos demasiado lejos. También es útil señalar que para algunas aplicaciones, como la exposición aguda de espermacitos a fármacos u otras moléculas pequeñas, puede ser ventajoso interrumpir los testículos y dispersar los quistes de los espermatocitos para su análisis. Varios protocolos excelentes están disponibles para la preparación y cultivo de quistes de espermalato dispersos18,25.

Una consideración importante cuando se utilizan espermatocitos para el análisis de la división celular es que estas células ejecutan meiótico en lugar de divisiones mitológicas. Es importante destacar que muchos de los aspectos esenciales de la mecánica de división celular, como la arquitectura del husillo y la citoquinesis, son similares entre la meiosis masculina y la mitosis6. Por lo tanto, los conocimientos mecanicistas recopilados a partir del estudio de la meiosis de espermacitos pueden ser ampliamente aplicables a los mecanismos generales de la división celular animal7. Sin embargo, dependiendo de las cuestiones mecanicistas que se aborden, pueden tenerse en cuenta diferencias importantes entre los espermatocitos y las células mitoticas en procesos como la dinámica cromosómica y la regulación del ciclo celular26. Al mismo tiempo, los espermatocitos Drosophila presentan la oportunidad única de comparar células mitoticas y meióticas dentro del mismo tejido y linaje germinal. Por ejemplo, la misma preparación de testículos se puede utilizar para analizar células madre germinales o espermatozoides sometidos a mitosis y espermacitos sometidos a meiosis. Por lo general, no intentamos crear imágenes de células madre germinales o mitosis espermatogoniales en preparaciones de testículos en vivo porque el momento de estas divisiones es difícil de predecir. Sin embargo, hemos capturado fortuitamente estas divisiones en nuestros experimentos, demostrando que el protocolo general se puede aplicar al análisis de células mitóticas dentro de los testículos también.

La metodología presentada se centra en la preparación de testículos para la toma de imágenes en vivo de la meiosis de espermacitos, ya que esto permite el análisis en tiempo real de la dinámica celular y molecular. También proporcionamos un método para la fijación e inmunoutilización de los testículos intactos, ya que este enfoque puede ser preferible si no se dispone de construcciones de expresión etiquetadas fluorescentesmente o para evitar efectos de confunción de la sobreexpresión de proteínas. Sin embargo, una consideración importante es que la fijación no siempre preserva fielmente el tejido nativo y la arquitectura celular. Por ejemplo, nosotros y otros hemos encontrado que la fijación a menudo resulta en la fragmentación o interrupción del ER11,27. Algunos de estos problemas se pueden aliviar mediante el uso de diferentes fijadores o métodos de preparación de tejidos, y algunos problemas pueden ser necesarios para identificar el protocolo de fijación óptimo para la preservación de un componente celular en particular u organización de proteínas. Afortunadamente, una serie de protocolos adicionales para la fijación de los espermatozoides Drosophila también están disponibles18,28,29.

En conclusión, hemos descrito métodos versátiles para la preparación de testículos de Drosophila para el análisis de células vivas y fijas de la meiosis de espermacitos. Las fortalezas específicas de este enfoque experimental incluyen el análisis de la división celular en tejido intacto, imágenes de alta resolución de células grandes e integración con herramientas genéticas Drosophila. Los experimentos que emplean la metodología tienen el potencial de hacer contribuciones importantes a nuestra comprensión de cómo la división celular se integra con mecanismos complejos de desarrollo de tejidos y homeostasis.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por fondos iniciales del Departamento de Defensa para J.T.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5" Dissecting Probe Fisher 08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet Fisher 13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9703-100
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides Fisher 12-544-2 Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100 mL
Lumox Dish 50 Sarstedt SAR946077410 Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass Fisher 12-541-B 22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade Electron Microsocopy Sciences 15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides Fisher 12-549-5 Slides used for dissections
PYREX Spot Plates Fisher 13-748B 9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium Fisher 21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm EMD Millipore SLGS033SB
Triton X-100 Fisher BP151-500
Vectashield Vector Labs H-1000 Microscopy mounting medium

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References

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