Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto

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Developmental Biology

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Summary

O objetivo deste protocolo é analisar a divisão celular em tecido intacto por microscopia celular viva e fixa usando espermatocitos meióticos drosophila. O protocolo demonstra como isolar testículos inteiros e intactos das larvas de Drosophila e pupas primitivas, e como processá-los e montá-los para microscopia.

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Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue. J. Vis. Exp. (159), e60961, doi:10.3791/60961 (2020).

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Abstract

A análise experimental das células que se dividem em tecidos e órgãos vivos e intactos é essencial para nossa compreensão de como a divisão celular se integra com o desenvolvimento, homeostase tecidual e processos de doenças. Os espermatocitos drosophila submetidos a meiose são ideais para esta análise porque (1) testículos de Drosophila inteiros contendo espermatocitos são relativamente fáceis de preparar para a microscopia, (2) o tamanho grande dos espermatocitos os torna adequados para imagens de alta resolução, e (3) poderosas ferramentas genéticas drosophila podem ser integradas com análise viva. Aqui, apresentamos um protocolo facilmente acessível para a preparação de testículos inteiros de larvas de Drosophila terceira instar e pupas precoces. Descrevemos como identificar espermatocitos meióticos em testículos inteiros preparados e como imaginá-los vivendo por microscopia de lapso de tempo. Também são fornecidos protocolos de fixação e imunocoloração de testículos inteiros. O uso de testículos larvais tem várias vantagens sobre os protocolos disponíveis que usam testículos adultos para análise de espermatocitos. Mais importante, os testículos larvais são menores e menos cheios de células do que testículos adultos, e isso facilita muito a imagem de alta resolução de espermatocitos. Para demonstrar essas vantagens e as aplicações dos protocolos, apresentamos resultados mostrando a redistribuição do retículo endoplasmático em relação aos microtúbulos do fuso durante a divisão celular em um único espermatocito, imagem por microscopia confocal de lapso de tempo. Os protocolos podem ser combinados com a expressão de qualquer número de proteínas ou marcadores de organela fluorescentemente marcados, bem como mutações genéticas e outras ferramentas genéticas, tornando esta abordagem especialmente poderosa para a análise de mecanismos de divisão celular no contexto fisiológico de tecidos e órgãos inteiros.

Introduction

A divisão celular é frequentemente estudada usando linhas celulares cultivadas na cultura1. Embora tenhamos adquirido uma riqueza de insights inestimáveis e compreensão de mecanismos fundamentais a partir desses estudos2, as células cultivadas na cultura não podem recapitular totalmente a fisiologia da divisão celular como ocorre em tecido vivo intacto. Por exemplo, em tecidos e órgãos intactos, as células devem se dividir no lugar certo e no momento certo para que as células prole estejam adequadamente situadas dentro do tecido, para que possam se submeter a programas de diferenciação ou funcionais adequados, e para que a proliferação celular seja devidamente coordenada com o crescimento tecidual ou a homeostase3. Para as células cultivadas na cultura, por outro lado, a divisão celular é geralmente regulada por fatores de crescimento no meio de cultura4, e, portanto, não podemos aprender com essas células como fatores ambientais in vivo, como arquitetura tecidual ou sinalização de desenvolvimento, influenciam o processo de divisão. Também é importante notar que muitas das linhas celulares usadas para estudar a divisão celular, como as células HeLa e U2OS, foram derivadas de tumores metastáticos5. Portanto, muitos aspectos da fisiologia básica dessas células cancerosas, como mecanismos de regulação do ciclo celular e estabilidade cromossômica, provavelmente foram alterados em comparação com células saudáveis. A compreensão completa da fisiologia da divisão celular, portanto, depende de nossa capacidade de estudar células divisórias em seus ambientes nativos, in vivo, que preservam mecanismos regulatórios fisiológicos e arquitetura tecidual.

Os avanços na compreensão de como a divisão celular opera dentro de tecidos e órgãos intactos são dificultados por dificuldades inerentes à análise in vivo ou ex vivo. Primeiro, pode ser difícil ou impossível acessar células divisórias para análise microscópica dentro de órgãos grandes ou tecidos grossos. Em segundo lugar, muitas vezes é difícil prever quando as células individuais se dividirão in vivo. Em terceiro lugar, a fisiologia do tecido pode se deteriorar rapidamente durante a cultura ex vivo. Neste protocolo, descrevemos métodos facilmente acessíveis para análise viva e fixa de espermatocitos drosophila melanogaster à medida que eles se submetem a divisões de células meióticas dentro de testículos totalmente intactos. Essas células são ideais para análise viva, ex vivo, pois são facilmente acessíveis com métodos ópticos padrão, como microscopia confocal, se dividem em momentos e locais previsíveis, e testículos intactos podem ser mantidos na cultura ex vivo por até cerca de 24h. Além disso, os espermatocitos drosophila são células redondas grandes (aproximadamente 20-30 μm de diâmetro) que não mudam de forma quando se dividem, tornando-os ideais para imagens de alta resolução e lapso de tempo de componentes celulares, como o aparelho de fuso e organelas citoplasmáticas. Embora essas células sejam submetidas à meiose em oposição à mitose, muitos dos processos essenciais de divisão celular são muito semelhantes entre esses dois mecanismos de divisão celular6. Essas vantagens, combinadas com poderosas ferramentas genéticas drosophila, tornaram drosophila espermatocitos um modelo amplamente utilizado para a análise ex vivo de processos essenciais de divisão celular, incluindo formação e regulação de fuso, citocinese e remodelação de organela77,8,9,10,11.

Spermatocitos são células que estão no estágio meioático da espermatogênese. Em Drosophila,a espermatogênese começa com um grupo de células-tronco germinais que estão localizadas em uma pequena região ou "hub" em um pólo do testículo12,13. Essas células se dividem por uma mitose assimétrica, dando origem a um único espermatogonium diferenciado. A espermatogonia então se submete a quatro mitoses síncronas para produzir um grupo de 16 células que permanecem intimamente associadas dentro de um único cisto. Nesta fase, as células transitam de um ciclo mitótico para um ciclo celular meiótico e são referidas como espermatocitos. Os espermatocitos passam cerca de dois a três dias em um estágio G2 prolongado do ciclo celular, durante o qual crescem dramaticamente e sofrem alterações citológicas na preparação para as duas divisões meióticas e posterior esperetriogênese13,14. Todo o grupo de 16 espermatocitos dentro de um único cisto então entram na primeira divisão meiotica ao mesmo tempo. Assim, vários espermatocitos meióticos meioticos podem ser imagemao mesmo, à medida que prosseguem através da divisão celular. A primeira divisão meiótica prossegue por aproximadamente 1,5 h e é seguida quase imediatamente pela segunda divisão meiotica, produzindo 64 espermatozóides totais que passam a se diferenciar em espermatozoides maduros.

Uma vantagem única do uso de espermatocitos para estudar a divisão celular em tecido vivo e intacto é que grupos ou cistos de células progridem constantemente através dos diferentes estágios da espermatogênese, e as células em todos os estágios da espermatogênese geralmente podem ser identificadas em qualquer determinado testículo (ver Figura 3A). Portanto, é relativamente fácil encontrar células meióticas em testículos inteiros. Geralmente focamos nossas análises na primeira em oposição à segunda meiose porque essas células são muito maiores e mais acessíveis a imagens de alta resolução, mas todo o processo que abrange ambas as divisões meióticas pode ser visto com sucesso. Deve-se notar também que o protocolo geral para preparação e cultura de testículos pode ser usado para analisar outros processos de espermatogênese também, como as divisões mitóticas anteriores ou as formas espermagogoniais ou as alterações citológicas que ocorrem à medida que os espermatids amadurecem em espermatozoides15. Muitos desses aspectos da espermatogênese são altamente conservados entre drosophila e humanos16.

Os espermatocitos drosophila começam a atingir a fase meiótica da espermatogênese durante o terceiro estágio larval instar do desenvolvimento da Drosophila 13. Portanto, testículos isolados dos estágios do ciclo de vida começando com a terceira larva instar e incluindo pupas e adultos podem ser usados para análise de espermatocitos divisórias. Vários protocolos excelentes estão disponíveis para extração de testículos de moscas machos adultas para análise viva e fixa da espermatogênese17,18,19. Esses protocolos podem ser preferíveis para estudar estágios tardios da espermatogênese ou se marcadores genéticos que só são visíveis em adultos devem ser usados. O protocolo se concentra, em vez disso, na preparação de testículos de larvas e pupas precoces, pois os testículos nessas fases têm várias vantagens que são especificamente pertinentes à análise de divisão celular por microscopia de alta resolução e lapso de tempo. Primeiro, os testículos de larvas e pupas são menores do que os de adultos, e as células dentro do órgão são menos aglomeradas. Por causa disso, a divisão de espermatocitos pode muitas vezes ser imagem próxima da superfície externa dos testículos larvais, sem ter que penetrar através de múltiplas camadas de tecido disperso de luz. Em segundo lugar, os testículos adultos se movem ritmicamente devido a contrações dos órgãos acessórios ligados, e esses movimentos tornam a imagem de lapso de tempo de células individuais desafiadora. E terceiro, os testículos larvais são vantajosos ao estudar mutações genéticas que causam letalidade pupal ou adulta. Nossos métodos são otimizados para a cultura de longo prazo dos testículos no estágio do microscópio, permitindo a imagem de múltiplas rodadas de divisão celular ou a progressão de células individuais através de múltiplos estágios de espermatogênese na mesma preparação. Também descrevemos um protocolo de fixação e imunocoloração de testículos inteiros. No geral, nossos protocolos são particularmente úteis para os interessados em estudar a divisão celular em tecido intacto, e a capacidade de combinar análise de espermatocitos com ferramentas genéticas drosophila altamente tratáveis faz desta uma abordagem especialmente poderosa.

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Protocol

1. Prepare animais, ferramentas e mídia para dissecação

  1. Cruze moscas machos e fêmeas para obter a descendência do genótipo desejado. Marcadores transgênicos úteis para identificação e estadiamento de espermatocitos meióticos incluem gfp-tubulina para rotular o fuso meiótico e rfp-histona 2A para rotular cromossomos8. Use de cinco a dez fêmeas por cruz e mantenha cruzes em alimentos de mosca padrão em frascos em uma incubadora de 25 °C até que as larvas instar terceiros comecem a rastejar pelos lados do frasco (4-5 dias). Pupas brancas começarão a se formar um dia depois.
  2. Obtenha dois pares de fórceps retos com pontas finas. Certifique-se de que as pontas estão afiadas, mesmo em comprimento, e retas(Figura 1A). Use estes fórceps apenas para dissecções, e tampa com pontas de pipeta de 10 μL quando não estiver em uso.
  3. Prepare uma ferramenta de bisturi.
    1. Insira a extremidade contundente de um pino de inseto de aço anodizado preto em um suporte de pino e torça o parafuso do suporte para fixar o pino no lugar. Usando um par de fórceps e sob um microscópio dissecando, segure o pino de inseto no meio e dobre-o para formar um ângulo interno de 135°(Figura 1B). A extremidade afiada é para cortar tecido, enquanto a borda é usada para transferir testículos entre gotas de mídia.
    2. Tampa com uma ponta de pipeta de 1.000 μL quando não estiver em uso.
  4. Trabalhando em uma capa de cultura de tecido, prepare as alíquotas de 5 mL da mídia de Schneider e armazene a 4 °C até o momento do uso. Quando estiver pronto para iniciar as dissecções, aqueça uma alíquota de 5 mL de mídia à temperatura ambiente. Em seguida, transfira a mídia de dissecção aquecida para uma seringa de 10 mL e conecte um filtro de seringa de 0,22 μm.

2. Dissecção de Testículos de Larvas e Pupas Primitivas

  1. Use a seringa do filtro cheia de mídia para expelir três gotas de mídia (50 μL cada) na parte superior, média e inferior de um slide de vidro.
  2. Use uma sonda dissecação para transferir de cinco a dez terceiros larvas instar ou pupas precoces (pupas que ainda são brancas ou amarelas) para a queda superior. Agite suavemente as larvas e as pupas na mídia com a sonda dissecante para remover qualquer alimento ou detrito.
  3. Sob um microscópio dissecando, gire uma única larva ou pupa de lado com uma sonda dissecante para identificar os dois testículos bilaterais, se presentes, que aparecem como estruturas translúcidas em forma oval no terço posterior do corpo(Figura 2A, B). Animais que não possuem testículos são fêmeas e devem ser descartados.
  4. Quando uma larva macho ou pupa é encontrada e está limpa, mova-a para a segunda gota de mídia. Repita até que 3 ou 4 larvas machos e/ou pupas tenham sido transferidas para a segunda gota de mídia.
  5. Trabalhando na segunda gota da mídia, segure uma única larva masculina ou pupa com um par de fórceps em sua região média, apenas anterior aos testículos. Use o segundo par de fórceps para rasgar suavemente o animal ao meio.
  6. Segure a extremidade posterior da larva ou pupa no escorregador de vidro com um par de fórceps. Começando ao lado dos fórceps, empurre para baixo a cutícula usando a borda da ferramenta do bisturi e mova o bisturi em direção à extremidade cortada do animal. Isso expulsará os órgãos internos do animal, que incluem as entranhas, corpos gordos e testículos.
  7. Gentilmente provoque os testículos do resto dos órgãos. Os testículos são órgãos claros, em forma oval embutidos em fitas de corpo gordo(Figura 2C).
  8. Transfira os testículos um de cada vez para a terceira gota de mídia. Para isso, insira a borda do bisturi sob o corpo de gordura, levante o tecido para fora da mídia e mova-o rapidamente para a terceira gota.
  9. Alternativamente, se não houver corpo de gordura suficiente ainda ligado aos testículos para levantar com sucesso o tecido, transfira suavemente o tecido usando uma pipeta pasteur de vidro que foi pré-molhada com mídia de dissecção.
  10. Use a extremidade afiada da ferramenta do bisturi para cortar suavemente o excesso de gordura do corpo dos testículos, deixando apenas uma pequena borda de corpo de gordura ao redor das bordas(Figura 2C). Não é necessário remover todo o corpo gordo, e tentar fazê-lo provavelmente resultará em danos ou rupturas dos testículos.
  11. Repita os passos acima para todas as larvas masculinas no escorregador de vidro.
  12. Proceda para o passo 3 ou para o passo 5.

3. Montagem de testículos para imagens microscópicas ao vivo

NOTA: Este procedimento de montagem foi adaptado a partir de um protocolo recentemente publicado para imagens de neuroblastos cerebrais larvais drosophila 20. Podem ser encontrados detalhes adicionais nesta referência.

  1. Use a seringa do filtro para depositar uma única gota da mídia de Schneider (cerca de 30 μL) no centro de um prato de cultura permeável a gás de 50 mm.
  2. Use uma pipeta pasteur pré-molhada para transferir os testículos preparados para a queda no prato permeável a gás. Os testículos geralmente flutuam até a superfície da gota.
  3. Use a ferramenta do bisturi para empurrar suavemente os testículos para baixo na membrana permeável a gás. Tome cuidado para não romper a membrana permeável a gás com o ponto afiado do bisturi. Empurre todos os testículos para o centro da queda.
  4. Use uma seringa de 1 mL cheia de óleo de halocarboneto para fazer quatro gotas de óleo, cerca de 30 μL cada, na membrana permeável a gás. Espaça as gotas de óleo ao redor da gota de mídia contendo os testículos para corresponder aos quatro cantos de uma tampa de vidro de 22 mm.
  5. Alinhe os cantos de uma tampa de vidro de 22 mm com as quatro gotas de óleo de halocarboneto e abaixe suavemente o deslizamento de cobertura sobre a mídia e o óleo. Deixe que o deslizamento de cobertura se acomode e para a mídia que contém os testículos se espalhem entre as gotas de óleo.
  6. Remova o excesso de mídia para permitir que o deslizamento de cobertura se instale na superfície dos testículos. Enquanto observa os testículos sob um microscópio dissecando, insira o canto de uma delicada tarefa limpando a mídia sob o deslizamento de cobertura para afastar uma pequena quantidade de líquido. Afaste-se da mídia suficiente até que a tampa de vidro faça contato com a superfície do maior testículo. É fundamental não remover muita mídia e baixar muito o deslizamento de cobertura, pois isso irá exercer pressão sobre os testículos e fazê-los romper (ver Figura 5).

4. Imagem ao vivo de espermatocitos meioticos

NOTA: Os espermatocitos podem ser imagematravés de um escaneamento a laser ou microscópio confocal de disco giratório. O sistema deve ter velocidade e sensibilidade adequadas para evitar o fotobranqueamento de proteínas fluorescentes ou fotodanos do tecido.

  1. Coloque uma gota de óleo de imersão na tampa do vidro logo acima dos testículos. Vire o prato e coloque-o no estágio do microscópio e mova o objetivo do microscópio (40x ou 60x) para dentro do óleo até que ele esteja logo abaixo dos testículos. Use a luz transmitida para encontrar um único testículo e trazê-la em foco.
  2. Enquanto captura imagens rápidas com o confocal, mova os testículos ao redor para examinar a organização das células. Uma extremidade do testículo terá muitas células pequenas e densamente embaladas. Esta extremidade contém as células-tronco germinais e a espermatogonia. Movendo-se para a outra extremidade do órgão, identifique células progressivamente maiores organizadas em aglomerados discretos ou cistos. Essas células grandes são os espermatocitos(Figura 3A).
  3. Se a imagem gfp-tubbulina, identifique os espermatocitos que iniciarão a meiose dentro de 30-60 min pela presença de duas asters microtúbulas brilhantes (ou seja, centrossomos) localizadas no córtex da célula(Figura 3B, C).
  4. Uma vez identificado um cisto de espermatocitos meiticos, estabeleça parâmetros de aquisição para capturar pilhas z de imagens ao longo do tempo. Normalmente, a aquisição de imagens de 15 a 20 imagens espaçadas a 1,5 μm de distância na dimensão z é suficiente para capturar o volume total de vários espermatocitos dentro do mesmo cisto.
  5. Adquira pilhas de z a cada 2 min se a imagem de toda a primeira divisão meiótica, que leva cerca de 1,5 horas. É possível utilizar taxas de aquisição mais rápidas, especialmente se apenas um evento específico de meiose for analisado. No entanto, tome cuidado para não causar fotobranqueamento ou fotodagem devido à exposição repetida da amostra à excitação a laser.
  6. Use um sistema de controle de foco automático e contínuo para evitar a deriva focal durante o longo tempo de aquisição. O controle de temperatura da amostra no estágio do microscópio geralmente não é necessário, assumindo a temperatura ambiente de aproximadamente 22-23 °C. Se houver controle de temperatura, mantenha a amostra a 25 °C no estágio do microscópio.
  7. Se os espermatocitos meiticos não forem encontrados, armazene a amostra por várias horas ou durante a noite em uma incubadora e imagem de 25 °C novamente.

5. Fixação e Imunocoloração

  1. A partir do passo 2.10 acima, use uma pipeta pasteur de vidro para transferir testículos para um poço em um prato de dissecção de vidro de 9 poços contendo 0,5 mL de 8% de paraformaldeído em PBSTx (solução tamponada de fosfato com 0,3% Triton X-100). Certifique-se de que os testículos estão deitados na parte inferior do prato.
    NOTA: O paraformaldeído é tóxico e deve ser manuseado com luvas em uma capa de fumaça.
  2. Fixe os testículos por 20 min em temperatura ambiente.
  3. Transfira os testículos para um poço contendo 0,5 mL PBSTx. Lave por 5 min com agitação suave. Repita o passo de lavagem em novos poços com PBSTx fresco mais duas vezes.
  4. Diluir o anticorpo primário à concentração desejada em PBSTx de 0,5 mL contendo albumina de soro bovino de 5% (BSA) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Transfira os testículos do prato de dissecção de vidro de 9 poços para o tubo de anticorpo primário diluído e incuba rasteira durante a noite a 4 °C com balanço suave ou porca.
  5. Lave os testículos em 0,5 mL de PBSTx por 5 min em um poço de um prato de dissecar de vidro de 9 poços. Repita o passo de lavagem com PBSTx fresco mais duas vezes.
  6. Diluir o anticorpo secundário em 250 μL de PBSTx contendo 5% de BSA e dispensar em um poço limpo de um prato de dissecar de vidro de 9 poços. Se desejar, adicione DAPI para manchar o DNA. Transfira os testículos para o poço que contém anticorpo secundário, cubra com plástico e incuba no escuro com agitação suave por 4 horas em temperatura ambiente.
  7. Transfira os testículos para um poço limpo cheio de 0,5 mL de PBSTx. Lave com PBSTx fresco duas vezes por 5 min e uma terceira vez por 30 min.

6. Montagem de testes fixos

  1. Transfira os testículos da última lavagem para um slide de microscopia de vidro usando uma pipeta Pasteur. Se necessário, use a borda da ferramenta do bisturi para empurrar os testículos para baixo na superfície do slide.
  2. Use o canto de uma limpeza de tarefa delicada para afastar o excesso de líquido dos testículos. Remova o máximo de líquido possível.
  3. Aplique uma gota de 30-50 μL de meio de montagem de microscopia nos testículos.
  4. Coloque uma tampa de 22 mm sobre a gota do meio de montagem e deixe que a tampa se acomode e o meio de montagem se espalhe sob a tampa. Aplique pressão suave na tampa, se necessário, para espremer o excesso de montagem média e permitir que a tampa repouse sobre a superfície dos testículos.
  5. Use esmalte para selar as bordas do deslizamento de cobertura.

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Representative Results

Quando este protocolo for executado com sucesso, os testículos permanecerão totalmente intactos para a imagem por microscopia confocal ou outros métodos de microscopia de fluorescência. Como visto na Figura 3A,a organização celular dos testículos é preservada, e a progressão da diferenciação celular de uma extremidade do testículo para a outra, incluindo espermatogonia, espermatocitos e espermatides haplóides é visível. GFP-tubbulin é um marcador útil para identificar espermatocitos divisórias e para imagens vivas da progressão das células através da meiose. Como mostrado na Figura 3B,os espermatocitos sobre a meiose de partida podem ser identificados por seus dois asters microtúbulos proeminentes. Por metafase, os grandes eixos meióticos são lindamente rotulados por GFP-tubbulina(Figura 3C).

O grande tamanho dos espermatocitocitos de Drosophila e sua progressão relativa lenta através da meiose os tornam ideais para análise da dinâmica e reorganização de componentes celulares, como organelas citoplasmáticas durante a divisão celular8,11,21. A Figura 4 e o Vídeo 1 mostram análise de imagem ao vivo da reorganização dinâmica do retículo endoplasmático (ER) em relação aos microtúbulos durante o curso da meiose. Como descrito acima, durante a interfase tardia pouco antes do início da meiose, dois centrossomos localizados no córtex da célula são claramente visíveis pela fluorescência GFP-tuborescência. Nesta fase, a fluorescência rfp (RFP-KDEL) direcionada ao ER revela que o ER é distribuído uniformemente por todo o citoplasma. Os centrossomos então começam a migrar para lados opostos do envelope nuclear para estabelecer os dois pólos de fuso. Durante este tempo, o PS se acumula rapidamente ao redor dos microtúbulos centrosômicos e é progressivamente limpo do resto do citoplasma. A quebra do envelope nuclear (NEB) é revelada pelo aparecimento da fluorescência gfp-tuborescência dentro da região nuclear. Deve-se notar que as células drosophila se dividem por mitose ou meiose semi-aberta, o que significa que os componentes do envelope nuclear quebram e se dispersam e grandes moléculas citoplasmáticas entram na região nuclear, mas um envelope de membranas derivadas do ER envolve o eixo e os cromátides ao longo da divisão celular22,23,24. No momento do NEB e progredindo através da metafase, o PS está quase completamente associado com os microtúbulos astrais que circundam os dois centrossomos do pólo do eixo. Estes dois acúmulos de microtúbulos astrais do PS, em seguida, partição para as duas células filhas durante a anáfase, garantindo a herança adequada do ER pelas células recém-formadas8,11.

A Figura 5 mostra os efeitos da ruptura de testículos na imagem ao vivo de espermatocitos. Conforme descrito no protocolo, deve-se tomar muito cuidado para não baixar o deslizamento de cobertura muito longe sobre a superfície dos testículos durante as etapas de montagem, pois isso irá aplicar pressão aos testículos e fazê-los estourar. Como visto na Figura 5 e vídeo 2,cistos de espermatocitos fluem rapidamente para fora do testículo rompido, e esse movimento das células torna a imagem ao vivo e com lapso de tempo extremamente difícil.

Figure 1
Figura 1: Ferramentas necessárias para dissecação bem sucedida. (A)Os fórceps utilizados para dissecção devem ser retos e com pontas afiadas e ininterruptas (indicadas pela marca verde de verificação). Não use fórceps com pontas tortas ou quebradas (marcas X vermelhas), pois elas serão ineficazes na apreensão de larvas e na provocação de tecidos. (B)Para preparar a ferramenta do bisturi, dobre um pino de inseto de aço anodizado preto para um ângulo interno de aproximadamente 135°. O ponto afiado é usado como uma faca para cortar tecido, e a borda reta é usada para mover tecidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Identificação de testículos larvais e pupal. (A)Imagens de larvas masculinas e femininas. Os testículos são identificáveis no macho como as estruturas circulares ou ovais translúcidas no terço posterior do animal (ponta de flecha). Note-se a falta de uma estrutura semelhante na fêmea. (B) Imagem de uma pupa macho primitiva, com os dois testículos translúcidos indicados por pontas de flecha. (C) Testículos com corpos de gordura anexados após dissecção. Os dois testículos à esquerda têm corpos de gordura excessivos ainda presos que precisam ser cortados. Os dois testículos à direita foram devidamente aparados de seus corpos gordos e estão prontos para imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Identificação de espermatocitos meiáticos em um testículo preparado com sucesso. (A) Imagem confocal de um testículo vivo e intacto bem preparado expressando GFP-tubulina. O centro das células-tronco está localizado em direção à ponta inferior do testículo, embora não seja identificável nesta preparação. Várias camadas de pequenas espermatogonias são indicadas, e estas são seguidas por numerosos cistos de espermatocitos. Um cisto de espermatocitos na primeira divisão meiótica é identificável com base no grande tamanho das células (aproximadamente 20 a 30 μm de diâmetro) e na presença de fusos meioticos rotulados de GFP-tubulina. Os espermatocitos da segunda divisão meiótica também têm fusos, mas essas células são aproximadamente metade do tamanho das células da meiose I. Espermatários pós-meióticos também são visíveis, assim como espermatozoides alongadores. (B) Os espermatocitos que iniciarão a meiose dentro de 30 a 60 min podem ser identificados por seus dois grandes e muito brilhantes asters de microtúbulos (indicados por pontas de flecha) rotulados por GFP-tubulina. O cisto das células pré-mexióticas é delineado pela linha amarela tracejada. (C) As células em meiosis são identificáveis por seus grandes eixos meióticos que são facilmente visualizados com gfp-tubulina. O cisto das células meióticas é delineado pela linha amarela tracejada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagem de lapso de tempo de meiosis em um único espermatocito. Um único espermatocito co-expressando GFP-tubbulina e RFP direcionado suscitais direcionadas ao ER (RFP-KDEL) foram imagens a cada dois minutos durante o curso da meiose. São mostradas imagens representativas do espermatocito em estágios específicos de meiosis, começando em fase final e progredindo através da telófase. Os tempos estão em minutos. Cada imagem é um único plano óptico de uma pilha de quinze fatias ópticas adquiridas em cada ponto de tempo. Este número foi modificado a partir de Karabasheva e Smyth, 20198. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Imagens representativas de um testículo antes e depois do rompimento. A imagem à esquerda, rotulada como "Intacta", mostra um testículo de voz gfp-tubulina pouco antes de romper. A imagem à direita mostra o mesmo testículo após a ruptura. Cistos de espermatocitos podem ser vistos saindo do testículo rompido. As pontas das flechas indicam um cisto de espermatocitos meiáticos; note o movimento significativo desses espermatocitos após as rupturas dos testículos, tornando a imagem desses espermatocitos ao longo do tempo extremamente desafiadora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Divisão meiótica completa de um único espermatocito. Mostrado é o lapso de tempo total do GFP-tubbulin e RFP-KDEL expressando espermatocito na Figura 4. As imagens foram capturadas a cada dois minutos, e a taxa de reprodução é de três quadros por segundo. Este vídeo foi modificado de Karabasheva e Smyth, 20198. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Testículo rompido. Lapso de tempo de um testículo antes e depois de romper. A ruptura é evidente devido ao fluxo repentino de cistos de células através do canto inferior esquerdo do testículo. As imagens foram capturadas a cada dois minutos, e a taxa de reprodução é de três quadros por segundo. Clique aqui para baixar este vídeo.

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Discussion

Descrevemos um protocolo para a preparação de testículos de Drosophila larval ou pupal precoce, otimizados para imagens ao vivo de longo prazo da divisão celular de espermatocitos. Este é um poderoso método de análise da divisão celular no contexto fisiológico do tecido intacto. O poder deste método é ainda mais expandido quando combinado com ferramentas genéticas de Drosophila, como mutações genéticas específicas, supressão mediada por RNAi específica do tecido, e marcadores de proteína e organela fluorescentemente rotulados. Além disso, o pequeno tamanho de testículos larvais e pupal, e a capacidade de imagem de células divisórias muito próximas ao deslizamento de vidro, tornam o método ideal para imagens de alta resolução, incluindo abordagens de superresolução. A versatilidade deste sistema experimental é demonstrada pelos resultados representativos que descrevem a reorganização dinâmica do PS durante a divisão celular. Os espermatocitocitos drosophila são particularmente úteis para tal análise da dinâmica organela durante a divisão celular devido ao grande tamanho dessas células e ao trânsito relativamente lento através da meiose. Além disso, as mesmas células podem ser imagem post-meioticamente para entender como as mudanças na dinâmica organela ou mecanismos de divisão celular afetam eventos subseqüentes da espermatogênese. Assim, há grande potencial com essa abordagem experimental para compreender a fisiologia da divisão celular dentro do contexto maior de desenvolvimento de tecidos e diferenciação celular, desfechos inatingíveis ao estudar células cultivadas na cultura.

O protocolo inclui vários elementos que facilitam a cultura ex vivo de longo prazo de testículos por até cerca de 24 horas. Primeiro, a mídia de Schneider, que foi desenvolvida para manutenção de células de cultura de tecidos drosophila, contém fontes de energia prontamente disponíveis e é otimizada para manter o pH fisiológico no ar atmosférico. Em segundo lugar, a membrana gasosa permeável usada para a montagem de testículos permite a troca rápida de gás. Uma vantagem importante da cultura de longo prazo é que se as células no estágio desejado de desenvolvimento ou meiose não forem encontradas imediatamente após a preparação da amostra, a amostra pode ser armazenada e imagem novamente posteriormente. Verificamos que os testículos mantidos em uma incubadora de 25 °C durante a noite, por um total de 16-24 horas, são viáveis e parecem saudáveis com base na presença rotineira de células em meiose ativa e progredindo através de estágios posteriores de diferenciação de espermatozoides. No entanto, devem ser tomadas precauções ao cultivar testículos por mais de 2-3 horas para garantir que a fisiologia do tecido não seja afetada adversamente. Mais importante, os testículos continuam a crescer na cultura à medida que as células proliferam e amadurecem o esperma alongado. Isso pode fazer com que os testículos aumentem a ponto de estourarem devido ao espaço restritivo entre a membrana e o deslizamento de cobertura, tornando os testículos inadequados para imagens ao vivo por razões descritas abaixo. Além disso, se as culturas de longo prazo devem ser rotineiramente empregadas em experimentos, é aconselhável testar se as condições de cultura estendida específicas do laboratório resultam em anormalidades meióticas, como durações mexióticas prolongadas ou frequências aumentadas de cromossomos atrasados ou falha de citocinese.

A fim de visualizar células individuais ao longo de longos tempos, é importante que as células não se movam significativamente uma vez que os testículos preparados estão no estágio do microscópio. Assim, é essencial ao executar o protocolo que os testículos permaneçam intactos e intactos, pois as células transbordam de testículos danificados e todas as células dentro do órgão se movem como resultado (ver Figura 5 e Vídeo 2). Ainda pode ser possível imaginar espermatocitos em testículos danificados se as células eventualmente se estabelecerem e pararem de se mover, embora no momento em que isso ocorra os estágios de meiosis que se pretende analisar podem já ter ocorrido. Além disso, os efeitos dos danos teciduais no processo de divisão celular em si não podem ser descontados. Danos aos testículos podem ocorrer ao limpar corpos de gordura após a remoção dos testículos das larvas. Por isso, deve-se tomar muito cuidado para evitar perfurar ou puxar os órgãos durante esta etapa do protocolo. Na verdade, muitas vezes não é necessário remover muito dos corpos gordos, desde que não obscureçam a visualização dos testículos. Mais comumente, o dano testis é o resultado da remoção de muito meio de cultura após a colocação do deslizamento de cobertura durante o procedimento de montagem para imagem ao vivo (etapa 3.6). À medida que o meio é removido, o deslizamento de cobertura cai mais baixo e exerce pressão sobre os testículos, e o excesso de pressão fará com que os testículos se rompam. Assim, embora seja importante que o deslizamento de cobertura esteja o mais próximo possível dos testículos para facilitar a imagem ideal dos espermatocitos, alguma prática é necessária para evitar remover muito médio e diminuir o deslizamento de cobertura muito longe. Também é útil salientar que para algumas aplicações, como exposição aguda de espermatocitos a drogas ou outras pequenas moléculas, pode ser vantajoso interromper os testículos e dispersar os cistos dos espermatocitos para análise. Vários protocolos excelentes estão disponíveis para a preparação e cultura de cistos de espermatocitos dispersos18,25.

Uma consideração importante ao usar espermatocitos para análise de divisão celular é que essas células executam meiotic em oposição às divisões mitóticas. É importante ressaltar que muitos dos aspectos essenciais da mecânica da divisão celular, como a arquitetura do fuso e a citocinese, são semelhantes entre a meiose masculina e a mitose6. Assim, insights mecanicistas obtidos a partir do estudo da meiose espermatocito podem ser amplamente aplicáveis aos mecanismos gerais da divisão de células animais7. No entanto, dependendo das questões mecanicistas que estão sendo abordadas, podem precisar ser consideradas diferenças importantes entre espermatocitos e células mitóticas em processos como dinâmica cromossômica e regulação do ciclo celular26. Ao mesmo tempo, os espermatocitos drosophila apresentam a oportunidade única de comparar células mitóticas e meióticas dentro do mesmo tecido e linhagem germinal. Por exemplo, a mesma preparação de testículos pode ser usada para analisar células-tronco germinais ou espermatogonia submetidas a mitoses e espermatocitos submetidos a meiose. Normalmente não tentamos imagem de células-tronco germinais ou mitoses espermatogativas em preparações de testículos vivos porque o tempo dessas divisões é difícil de prever. No entanto, capturamos fortuitamente essas divisões em nossos experimentos, demonstrando que o protocolo geral pode ser aplicado à análise de células mitóticas dentro dos testículos também.

A metodologia apresentada enfoca a preparação de testículos para a imagem ao vivo de meiosis espermatocitos, pois permite a análise em tempo real da dinâmica celular e molecular. Também fornecemos um método de fixação e imunocoloração de testículos intactos, pois esta abordagem pode ser preferível se necessário que construções de expressão rotuladas fluorescentes não estejam disponíveis ou para evitar efeitos confusos da superexpressão proteica. Uma consideração importante, porém, é que a fixação nem sempre preserva fielmente o tecido nativo e a arquitetura celular. Por exemplo, nós e outros descobrimos que a fixação muitas vezes resulta em fragmentação ou interrupção do ER11,27. Alguns desses problemas podem ser amentecidos usando diferentes fixadores ou métodos de preparação de tecidos, e alguns problemas podem, portanto, ser necessários para identificar o protocolo de fixação ideal para a preservação de um determinado componente celular ou organização proteica. Felizmente, uma série de protocolos adicionais para fixação de espermatocitos Drosophila também estão disponíveis18,28,29.

Em conclusão, descrevemos métodos versáteis para a preparação de testículos de Drosophila para análise celular viva e fixa de meiosis espermatocitos. Os pontos fortes específicos desta abordagem experimental incluem a análise da divisão celular em tecido intacto, imagens de alta resolução de células grandes e integração com ferramentas genéticas drosophila. Experimentos que utilizam a metodologia têm o potencial de fazer contribuições importantes para nossa compreensão de como a divisão celular se integra com mecanismos complexos de desenvolvimento de tecidos e homeostase.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por fundos iniciais do Departamento de Defesa para J.T.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5" Dissecting Probe Fisher 08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet Fisher 13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9703-100
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides Fisher 12-544-2 Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100 mL
Lumox Dish 50 Sarstedt SAR946077410 Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass Fisher 12-541-B 22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade Electron Microsocopy Sciences 15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides Fisher 12-549-5 Slides used for dissections
PYREX Spot Plates Fisher 13-748B 9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium Fisher 21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm EMD Millipore SLGS033SB
Triton X-100 Fisher BP151-500
Vectashield Vector Labs H-1000 Microscopy mounting medium

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