Preparazione dei test di Drosophila Larval e Pupal per l'analisi della divisione cellulare in live, tessuto intatto

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Developmental Biology

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Summary

L'obiettivo di questo protocollo è quello di analizzare la divisione cellulare nel tessuto intatto mediante microscopia cellulare viva e fissa utilizzando spermatociti meioticiti della Drosophila. Il protocollo dimostra come isolare i testicoli interi e intatti dalle larve di Drosophila e dalle prime pupe, e come elaborarli e montarli per la microscopia.

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Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue. J. Vis. Exp. (159), e60961, doi:10.3791/60961 (2020).

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Abstract

L'analisi sperimentale delle cellule che si dividono in tessuti e organi vivi e intatti è essenziale per la nostra comprensione di come la divisione cellulare si integra con lo sviluppo, l'omeostasi dei tessuti e i processi della malattia. Gli spermatociti di Drosophila sottoposti a meiosi sono ideali per questa analisi perché (1) testiti di Drosophila interi contenenti spermatociti sono relativamente facili da preparare per la microscopia, (2) le grandi dimensioni degli spermatociti li rendono adatti per l'imaging ad alta risoluzione e (3) potenti strumenti genetici della Drosophila possono essere integrati con l'analisi in vivo. Qui, presentiamo un protocollo facilmente accessibile per la preparazione di interi testicoli da Drosophila terza larve instar e pupe prime. Descriviamo come identificare gli spermatociti meiotici in teste interi preparati e come immaginerli dal vivo per microscopia time-lapse. Vengono inoltre forniti protocolli per la fissazione e l'immunostaining dei teste interi. L'uso di testicoli larvali ha diversi vantaggi rispetto ai protocolli disponibili che utilizzano testicoli adulti per l'analisi dello spermatocite. Ancora più importante, i testicoli larvali sono più piccoli e meno affollati di cellule rispetto ai testicoli adulti, e questo facilita notevolmente l'imaging ad alta risoluzione degli spermatociti. Per dimostrare questi vantaggi e le applicazioni dei protocolli, presentiamo risultati che mostrano la ridistribuzione del reticolo endoplasmico rispetto ai microtubuli del mandrino durante la divisione cellulare in un unico spermatocito immagine di microscopia confocale time-lapse. I protocolli possono essere combinati con l'espressione di qualsiasi numero di proteine fluorescenti o marcatori di orgelli, così come mutazioni genetiche e altri strumenti genetici, rendendo questo approccio particolarmente potente per l'analisi dei meccanismi di divisione cellulare nel contesto fisiologico di interi tessuti e organi.

Introduction

La divisione cellulare è spesso studiata utilizzando linee cellulari coltivate nella coltura1. Mentre abbiamo acquisito una ricchezza di informazioni e comprensione inestimabili dei meccanismi fondamentali da questi studi2, le cellule coltivate in coltura non possono ricapitolare completamente la fisiologia della divisione cellulare come si verifica in tessuto intatto e vivente. Ad esempio, nei tessuti e negli organi intatti, le cellule devono dividersi nel posto giusto e al momento giusto in modo che le cellule progenie siano correttamente posizionate all'interno del tessuto, in modo che possano sottoporsi a opportune differenziazioni o programmi funzionali, e in modo che la proliferazione cellulare sia adeguatamente coordinata con la crescita del tessuto o l'omeostasi3 . Per le cellule cresciute nella coltura d'altra parte, la divisione cellulare è generalmente regolata da fattori di crescita nel mezzo di coltura4, e quindi non possiamo imparare da queste cellule come fattori ambientali in vivo come l'architettura dei tessuti o la segnalazione dello sviluppo influenzano il processo di divisione. È anche importante notare che molte delle linee cellulari utilizzate per studiare la divisione cellulare, come le cellule HeLa e U2OS, sono state derivate da tumori metastatici5. Pertanto, molti aspetti della fisiologia di base di queste cellule tumorali, come i meccanismi regolatori del ciclo cellulare e la stabilità cromosomica, sono stati probabilmente alterati rispetto alle cellule sane. La comprensione completa della fisiologia della divisione cellulare, quindi, dipende dalla nostra capacità di studiare le cellule divisorie nei loro ambienti nativi in vivo che preservano i meccanismi regolatori fisiologici e l'architettura dei tessuti.

I progressi nella comprensione del funzionamento della divisione cellulare all'interno di tessuti e organi intatti sono ostacolati da difficoltà inerenti all'analisi in vivo o ex vivo. In primo luogo, può essere difficile o impossibile accedere alle cellule divisorie per l'analisi microscopica all'interno di grandi organi o tessuti spessi. In secondo luogo, è spesso difficile prevedere quando le singole cellule si dividono in vivo. In terzo luogo, la fisiologia dei tessuti può deteriorarsi rapidamente durante la coltura ex vivo. In questo protocollo, descriviamo metodi facilmente accessibili per l'analisi live e fissa degli spermatociti della Drosophila melanogaster mentre vengono sottoposti a divisioni cellulari meiotiche all'interno di testicoli completamente intatti. Queste cellule sono ideali per l'analisi live, ex vivo perché sono facilmente accessibili con metodi ottici standard come la microscopia confocale, si dividono in tempi e luoghi prevedibili e i teste intatti possono essere mantenuti nella coltura ex vivo fino a circa 24 h. Inoltre, gli spermatociti della Drosophila sono grandi cellule rotonde (circa 20-30 m di diametro) che non cambiano forma quando si dividono, il che le rende ideali per l'imaging ad alta risoluzione e time-lapse di componenti cellulari come l'apparato del mandrino e gli organelli citoplasmici. Anche se queste cellule subiscono la meiosi al contrario della mitosi, molti dei processi di divisione cellulare essenziali sono molto simili tra questi meccanismi di divisione delle due cellule6. Questi vantaggi, combinati con potenti strumenti genetici della Drosophila, hanno reso gli spermatociti della Drosophila un modello ampiamente utilizzato per l'analisi ex vivo di processi di divisione cellulare essenziali, tra cui la formazione e la regolazione del mandrino, la citochina e il rimodellamento delle orgenelle e la partizionamentodi 7,8,9,10,11.

Gli spermatociti sono cellule che sono allo stadio meiotico della spermatogenesi. In Drosophila,la spermatogenesi inizia con un gruppo di cellule staminali germinali che si trovano in una piccola regione o "hub" in un polo del testicolo12,13. Queste cellule si dividono per una mitosi asimmetrica, dando origine a un singolo spermatogonio differenziato. La Spermatogonia viene quindi sottoposta a quattro mitosi sincroni per produrre un gruppo di 16 celle che rimangono strettamente associate all'interno di una singola cisti. In questa fase, le cellule passano da un mitotico a un ciclo cellulare meiotico e sono indicate come spermatociti. Gli spermatociti trascorrono circa due o tre giorni in una fase G2 estesa del ciclo cellulare, durante i quali crescono drammaticamente e subiscono cambiamenti citologici in preparazione per le due divisioni meiotiche e la successiva spermiogenesi13,14. L'intero gruppo di 16 spermatociti all'interno di una singola cisti entra quindi nella prima divisione meiotica allo stesso tempo. Così, diversi spermatociti meiotici possono essere immagine contemporaneamente mentre procedono attraverso la divisione cellulare. La prima divisione meiotica procede per circa 1,5 h ed è seguita quasi immediatamente dalla seconda divisione meiotica, producendo 64 spermatidi totali che si differenziano in spermatozoi maturi.

Un vantaggio unico dell'utilizzo di spermatociti per studiare la divisione cellulare nel tessuto vivo e intatto è che gruppi o cisti di cellule progrediscono costantemente attraverso le diverse fasi della spermatogenesi, e le cellule in tutte le fasi della spermatogenesi di solito possono essere identificate in qualsiasi testicolo dato (vedi Figura 3A). Pertanto, è relativamente facile trovare cellule meiotiche in testicoli interi. Generalmente concentriamo le nostre analisi sulla prima anziché sulla seconda meiosi perché queste cellule sono molto più grandi e più suscettibili all'imaging ad alta risoluzione, ma l'intero processo che comprende entrambe le divisioni meiotiche può essere immaginato con successo. Va anche notato che il protocollo generale per la preparazione e la coltura dei testicoli può essere utilizzato per analizzare anche altri processi di spermatogenesi, come le precedenti cellule staminali mitotiche o divisioni spermatogoniche o i cambiamenti citologici che si verificano quando gli spermatidi maturano in spermatozoi15. Molti di questi aspetti della spermatogenesi sono altamente conservati tra la Drosophila e gli esseri umani16.

Gli spermatociti della Drosophila iniziano a raggiungere la fase meiotica della spermatogenesi durante la terza fase larvale instar dello sviluppo della Drosophila 13. Pertanto, i testicoli isolati dalle fasi del ciclo di vita a partire da larve instelle e tra cui pupe e adulti possono essere utilizzati per l'analisi di spermatociti divisori. Diversi protocolli eccellenti sono disponibili per l'estrazione di testicoli da mosche maschili adulte per l'analisi live e fissa della spermatogenesi17,18,19. Questi protocolli possono essere preferibili per studiare le fasi tardive della spermatogenesi o se devono essere utilizzati marcatori genetici che sono visibili solo negli adulti. Il protocollo si concentra invece sulla preparazione dei testicoli da larve e pupe prime, perché i testicoli in queste fasi hanno diversi vantaggi che sono specificamente pertinenti all'analisi della divisione cellulare mediante microscopia ad alta risoluzione e time-lapse. In primo luogo, i testicoli di larve e pupe sono più piccoli di quelli degli adulti e le cellule all'interno dell'organo sono meno affollate. Per questo motivo, la divisione degli spermatociti può spesso essere vista vicino alla superficie esterna dei testicoli larve, senza dover penetrare attraverso più strati di tessuto di dispersione della luce. In secondo luogo, i testicoli adulti si muovono ritmicamente a causa delle contrazioni degli organi accessori collegati, e questi movimenti rendono difficile l'imaging time-lapse di singole cellule. E terzo, i testicoli larvali sono vantaggiosi quando si studiano le mutazioni genetiche che causano la letalità pupa o adulto. I nostri metodi sono ottimizzati per la coltura a lungo termine di testicoli sullo stadio del microscopio, consentendo l'imaging di più cicli di divisione cellulare o la progressione di singole cellule attraverso più fasi di spermatogenesi nella stessa preparazione. Descriviamo anche un protocollo per la fissazione e l'immunostaining di interi teste. Nel complesso, i nostri protocolli sono particolarmente utili per coloro che sono interessati a studiare la divisione cellulare nel tessuto intatto, e la capacità di combinare l'analisi dello spermatocito con strumenti genetici della Drosophila altamente trattabili lo rende un approccio particolarmente potente.

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Protocol

1. Preparare animali, strumenti e supporti per la dissezione

  1. Attraversare mosche maschili e femminili per ottenere la progenie del genotipo desiderato. Indicatori transgenici utili per l'identificazione e la messa in scena di spermatociti meiotici includono GFP-tubulina per etichettare il mandrino meiotico e RFP-histone 2A per etichettare i cromosomi8. Utilizzare da cinque a dieci femmine per croce e mantenere le croci sul cibo a mosca standard nelle fiale in un'incubatrice di 25 gradi centigradi fino a quando le larve della terza stella iniziano a strisciare sui lati della fiala (4-5 giorni). Le prime pupe bianche inizieranno a formarsi un giorno dopo.
  2. Ottieni due paia dritte con punte fini. Assicurarsi che le punte siano nitide, anche in lunghezza e dritte (Figura 1A). Utilizzare queste pinze solo per le dissezioni e il tappo con punte di 10 l-pipette quando non sono in uso.
  3. Preparare uno strumento bisturi.
    1. Inserire l'estremità smussata di un perno di insetto in acciaio anodizzato nero in un supporto perno e ruotare la vite del supporto per fissare il perno in posizione. Utilizzando una coppia di pinze e sotto un microscopio dissetante, afferrare il perno dell'insetto al centro e piegarlo per formare un angolo interno di 135 gradi (Figura 1B). L'estremità tagliente è per il taglio del tessuto, mentre il bordo viene utilizzato per il trasferimento di testicoli tra le gocce di supporti.
    2. Concappucciare con una punta di pipetta da 1.000 ll quando non è in uso.
  4. Lavorando in una cappa di coltura tissutale, prepara 5 mL dei media di Schneider e conserva a 4 gradi centigradi fino al momento dell'uso dell'aliquota. Quando si è pronti per iniziare le dissezioni, scaldare uno da 5 mL di un'aliquota a temperatura ambiente. Trasferire quindi il supporto di dissezione riscaldato su una siringa da 10 mL e fissare un filtro per siringhe da 0,22 m.

2. Dissezione dei testicoli da Larve e prime pupe

  1. Utilizzare la siringa del filtro riempito dai supporti per espellere tre gocce di supporti (50 gradi l ciascuna) nella parte superiore, centrale e inferiore di uno scivolo di vetro.
  2. Utilizzare una sonda dissezionante per trasferire da cinque a dieci 3 3 larve instelle o pupe prime (pupe che sono ancora bianche o gialle) verso la goccia superiore. Agitare delicatamente le larve e le pupe nei media con la sonda di dissezione per rimuovere qualsiasi cibo o detriti.
  3. Al microscopio dissezioso, girare una singola larva o pupa su un lato con una sonda sezionata per identificare i due testicoli bilaterali se presenti, che appaiono come strutture traslucide a forma ovale nel terzo posteriore del corpo(Figura 2A, B). Gli animali privi di testicoli sono femmine e devono essere scartati.
  4. Quando viene trovata una larva o una pupa maschio ed è pulita, spostala alla seconda goccia di supporto. Ripetere fino a quando 3 o 4 larve maschili e/o pupe sono state trasferite alla seconda goccia di supporti.
  5. Lavorando nella seconda goccia di supporti, afferrare una singola larva maschio o pupa con un paio di pinze nella sua regione centrale, appena anteriore ai testicoli. Utilizzare il secondo paio di pinze per strappare delicatamente l'animale a metà.
  6. Tenere l'estremità posteriore della larva o della pupa sullo scivolo di vetro con un paio di pinze. Partendo proprio accanto alle pinze, spingere verso il basso sulla cuticola utilizzando il bordo dello strumento bisturi e spostare il bisturi verso l'estremità tagliata dell'animale. Questo espellerà gli organi interni dell'animale, che includono le budella, i corpi grassi e i testicoli.
  7. Prendere in giro delicatamente i testicoli dal resto degli organi. I testicoli sono chiari, organi a forma ovale incorporati in nastri del corpo grasso (Figura 2C).
  8. Trasferire i testicoli uno alla volta alla terza goccia di supporti. Per raggiungere questo obiettivo, inserire il bordo del bisturi sotto il corpo grasso, sollevare il tessuto dal supporto e spostarlo rapidamente alla terza goccia.
  9. In alternativa, se non c'è abbastanza corpo grasso ancora attaccato ai testicoli per sollevare con successo il tessuto, trasferire delicatamente il tessuto utilizzando una pipetta Pasteur di vetro che è stata pre-bagnata con supporti di dissezione.
  10. Utilizzare l'estremità tagliente dello strumento bisturi per tagliare delicatamente via il corpo grasso in eccesso dai testicoli, lasciando solo un piccolo bordo di corpo grasso intorno ai bordi (Figura 2C). Non è necessario rimuovere tutto il corpo grasso, e il tentativo di farlo probabilmente si tradurrà in danneggiare o rottura dei testicoli.
  11. Ripetere i passaggi precedenti per tutte le larve maschili sullo scivolo di vetro.
  12. Procedere al passaggio 3 o 5.

3. Test di montaggio per l'imaging microscopico dal vivo

NOT: Questa procedura di montaggio è stata adattata da un protocollo recentemente pubblicato per l'imaging di neuroblasti cerebrali larghi della Drosophila 20. Ulteriori dettagli sono disponibili in questo riferimento.

  1. Utilizzare la siringa per filtrare per depositare una singola goccia di supporti di Schneider (circa 30 gradi centigradi) al centro di un piatto di coltura permeabile a gas da 50 mm.
  2. Utilizzare una pipetta Pasteur pre-bagnata per trasferire i testicoli preparati alla goccia sul piatto a gas permeabile. I testicoli generalmente galleggiano sulla superficie della caduta.
  3. Utilizzare lo strumento bisturi per spingere delicatamente i testicoli verso il basso sulla membrana permeabile al gas. Fare attenzione a non rompersi la membrana permeabile al gas con il punto acuto del bisturi. Spingere tutti i testicoli al centro della caduta.
  4. Utilizzare una siringa da 1 mL ripiena di olio di alocarbonio per fare quattro gocce di olio, circa 30 ll, sulla membrana permeabile a gas. Distanziale le gocce d'olio intorno alla goccia di supporti contenenti i testicoli in modo che corrispondano ai quattro angoli di una vetrina di vetro da 22 mm.
  5. Allineare gli angoli di un coperchio di vetro da 22 mm con le quattro gocce di olio di alocarbonio e abbassare delicatamente il coperchio sui supporti e sull'olio. Lasciare che il coperchio si accontenti e che i supporti contenenti i testicoli si diffondano tra le gocce di olio.
  6. Rimuovere i supporti in eccesso per consentire al coperchio di depositarsi sulla superficie dei testicoli. Osservando i testicoli al microscopio dissezioso, inserire l'angolo di un delicato compito pulire nel supporto sotto il coperchio per spazzare via una piccola quantità di liquido. Wick via abbastanza supporti fino a quando il vetro coverslip solo entra in contatto con la superficie del più grande testis. È fondamentale non rimuovere troppo i supporti e abbassare troppo lo scivolo, in quanto ciò eserciterà pressione sui testicoli e li farà rompersi (vedi Figura 5).

4. Live Imaging di spermatociti meiotici

NOT: Gli spermatociti possono essere immagini utilizzando un microscopio confocale a scansione laser o rotante del disco. Il sistema deve avere velocità e sensibilità adeguate per evitare il fotosbiancamento di proteine fluorescenti o i fotodanni del tessuto.

  1. Mettere una goccia di olio di immersione sulla copertura di vetro appena sopra i testicoli. Capovolgere il piatto e posizionarlo sullo stadio del microscopio e spostare l'obiettivo del microscopio (40x o 60x) nell'olio fino a quando non è appena sotto i testicoli. Utilizzare la luce trasmessa per trovare un singolo testicolo e metterlo a fuoco.
  2. Durante l'acquisizione di immagini veloci con il confocale, spostare i testicoli intorno per esaminare l'organizzazione delle cellule. Un'estremità del testicolo avrà molte piccole cellule densamente imballate. Questo finale contiene le cellule staminali germinali e la spermatogonia. Spostandosi verso l'altra estremità dell'organo, identificare cellule progressivamente più grandi organizzate in ammassi discreti o cisti. Queste grandi cellule sono gli spermatociti (Figura 3A).
  3. Se si fa l'imaging di GFP-tubulina, identificare gli spermatociti che inizieranno la meiosi entro 30-60 min dalla presenza di due astri di microtubuli luminosi (cioè centroni) situati alla corteccia della cellula (Figura 3B, C).
  4. Una volta identificata una cisti di spermatociti meiotici, impostare i parametri di acquisizione per catturare z-stack di immagini nel tempo. In genere, l'acquisizione di 15-20 immagini distanziate di 1,5 m nella dimensione z è sufficiente per catturare l'intero volume di diversi spermatociti all'interno della stessa cisti.
  5. Acquisire z-stack completi ogni 2 min se l'imaging dell'intera prima divisione meiotica, che dura circa 1,5 ore. È possibile utilizzare tassi di acquisizione più rapidi, in particolare se si vuole analizzare solo un evento specifico di meiosi. Tuttavia, fare attenzione a non causare fotosbiancamento o danni fotografici a causa dell'esposizione ripetuta del campione all'eccitazione laser.
  6. Utilizzare un sistema di controllo della messa a fuoco continuo e automatico per evitare la deriva focale nel lungo periodo di acquisizione. Il controllo della temperatura del campione sullo stadio del microscopio generalmente non è necessario, supponendo una temperatura ambiente di circa 22-23 gradi centigradi. Se il controllo della temperatura è disponibile, mantenere il campione a 25 gradi centigradi sullo stadio del microscopio.
  7. Se gli spermatociti meiotici non vengono trovati, conservare il campione per diverse ore o peruna durante la notte in un'incubatrice e in un'immagine a 25 gradi centigradi.

5. Fissaggio e immunostaining

  1. Dal passo 2.10 sopra, utilizzare una pipetta di pasteur di vetro per trasferire i testicoli in un pozzo in un piatto di seziono di vetro 9-po ' contenente 0,5 mL di paraformaldeide 8% in PBSTx (fosfato bufferizzato salina con 0.3% Triton X-100). Assicurarsi che i testicoli siano posati sul fondo del piatto.
    NOT: La paraformaldeide è tossica e deve essere maneggiata con i guanti in una cappa di fumi.
  2. Fissare i testicoli per 20 min a temperatura ambiente.
  3. Trasferire i testicoli in un pozzo contenente 0,5 mL PBSTx. Lavaggio per 5 min con agitazione delicata. Ripetere il passaggio di lavaggio in nuovi pozzi con PBSTx fresco altre due volte.
  4. Diluire l'anticorpo primario alla concentrazione desiderata in PBSTx da 0,5 mL contenente il 5% di albumina del siero bovino (BSA) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Trasferire i testicoli dal piatto di seziono di vetro a 9 pozzetti al tubo di anticorpo primario diluito e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi con dondolo delicato o nutazione.
  5. Lavare i testicoli in 0,5 mL di PBSTx per 5 min in un pozzo di un piatto di sedizione in vetro di 9 pozzetti. Ripetere il passo di lavaggio con PBSTx fresco altre due volte.
  6. Diluire l'anticorpo secondario in 250 gradi l di PBSTx contenente il 5% di BSA e dispensare in un pozzo pulito di un piatto di sedizione in vetro 9-well. Se lo si desidera, aggiungere DAPI al DNA macchia. Trasferire i testicoli nel pozzo contenente anticorpi secondari, coprire con involucro di plastica, e incubare al buio con agitazione delicata per 4 ore a temperatura ambiente.
  7. Trasferire i testicoli in un pozzo pulito riempito con 0,5 mL di PBSTx. Lavare con PBSTx fresco due volte per 5 min e una terza volta per 30 min.

6. Montaggio teste fissi

  1. Trasferire i testicoli dall'ultimo lavaggio su uno scivolo di microscopia in vetro utilizzando una pipetta Pasteur. Se necessario, utilizzare il bordo dello strumento bisturi per spingere le testicoli verso il basso sulla superficie del vetrino.
  2. Utilizzare l'angolo di una delicata pulizia del compito per eliminare il liquido in eccesso dai testicoli. Rimuovere il più liquido possibile.
  3. Applicare una goccia di 30-50 gradi del supporto di montaggio della microscopia ai testicoli.
  4. Posizionare un coperchio di 22 mm sulla goccia del supporto di montaggio e lasciare che il coperchio si stabilizzi e il supporto di montaggio per diffondersi sotto il coperchio. Applicare una leggera pressione sul coperchio se necessario per spremere il supporto di montaggio in eccesso e lasciare che il coperchio poggia sulla superficie dei testicoli.
  5. Utilizzare smalto per sigillare i bordi del coverslip.

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Representative Results

Quando questo protocollo viene eseguito con successo, i testicoli rimarranno completamente intatti per l'imaging mediante microscopia confocale o altri metodi di microscopia a fluorescenza. Come si è visto nella Figura 3A, l'organizzazione cellulare dei testicoli è preservata e la progressione della differenziazione cellulare da un'estremità del testicolo all'altra, tra cui spermatogonia, spermatociti e spermatidi aploidi è visibile. GFP-tubulina è un marcatore utile per identificare la divisione degli spermatociti e per l'imaging dal vivo della progressione delle cellule attraverso la meiosi. Come mostrato nella Figura 3B, gli spermatociti sulla meiosi iniziale possono essere identificati dai loro due prominenti astri di microtubuli. Per metafase i grandi mandrini meiotici sono splendidamente etichettati da GFP-tubulina (Figura 3C).

Le grandi dimensioni degli spermatociti della Drosophila e la loro relativa lenta progressione attraverso la meiosi li rendono ideali per l'analisi della dinamica e della riorganizzazione dei componenti cellulari come gli organelli citoplasmici durante la divisione cellulare8,11,21. La figura 4 e il video 1 mostrano l'analisi delle immagini dal vivo della riorganizzazione dinamica del reticolo endoplasmico (ER) rispetto ai microtubuli nel corso della meiosi. Come descritto sopra, durante l'interfase tardiva appena prima dell'inizio della meiosi, due centrosomi situati nella corteccia della cellula sono chiaramente visibili dalla fluorescenza GFP-tubulina. In questa fase, la fluorescenza RFP (RFP-KDEL) mirata all'ER rivela che il ER è distribuito uniformemente in tutto il citoplasma. I centronesi iniziano quindi a migrare verso i lati opposti dell'involucro nucleare per stabilire i due poli del mandrino. Durante questo periodo, il ER si accumula rapidamente intorno ai microtubuli centrosomici e viene progressivamente eliminato dal resto del citoplasma. La ripartizione delle buste nucleari (NEB) è rivelata dalla comparsa della fluorescenza GFP-tubulina all'interno della regione nucleare. Va notato che le cellule di Drosophila si dividono per mitosi semi-aperta o meiosi, il che significa che i componenti dell'involucro nucleare si rompono e si disperdono e grandi molecole citoplasmatiche entrano nella regione nucleare, ma un involucro di membrane derivate da ER circonda il mandrino e le cromatidi in tutta la divisione cellulare22,23,24. Al momento del NEB e procedendo attraverso la metafase, il ER è quasi completamente associato ai microtubuli astrali che circondano i due centrosori del polo del mandrino. Questi due accumuli astrali di microtubuli del ER quindi si dividano alle due cellule figlie durante l'anafase, garantendo una corretta ereditarietà ER da parte delle cellule appena formate8,11.

La figura 5 mostra gli effetti della rottura dei testicoli sull'imaging dal vivo degli spermatociti. Come descritto nel protocollo, occorre prestare molta attenzione a non abbassare troppo la copertura sulla superficie dei testicoli durante le fasi di montaggio, in quanto ciò applicherà pressione ai testicoli e li farà scoppiare. Come si vede nella Figura 5 e nel Video 2,le cisti degli spermatociti fuoriescono rapidamente dai testicoli rotti, e questo movimento delle cellule rende estremamente difficile l'imaging live, time-lapse.

Figure 1
Figura 1: Strumenti necessari per la dissezione. (A) Le pinze utilizzate per la dissezione devono essere dritte e avere punte affilate e ininterrotte (indicate da un segno di spunta verde). Non usare pinze con punte piegate o rotte (segni X rossi), in quanto saranno inefficaci nel cogliere le larve e prendere in giro i tessuti. (B) Per preparare lo strumento bisturi, piegare un perno di insetto in acciaio anodizzato nero ad un angolo interno di circa 135 gradi. Il punto acuto viene utilizzato come coltello per tagliare il tessuto, e il bordo dritto viene utilizzato per i tessuti in movimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Identificazione dei testicoli larvali e puformi. (A) Immagini di larve maschili e femminili. I testicoli sono identificabili nel maschio come le strutture traslucide circolari o ovali nel terzo posteriore dell'animale (punta di freccia). Si noti la mancanza di una struttura simile nella femmina. (B) Immagine di una pupa maschio precoce, con i due testicoli traslucidi indicati da punte di freccia. (C) Testi con corpi grassi attaccati dopo la dissezione. I due testicoli a sinistra hanno corpi grassi eccessivi ancora attaccati che devono essere tagliati via. I due testicoli sulla destra sono stati correttamente tagliati dai loro corpi grassi e sono pronti per l'imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Identificazione degli spermatociti meiotici in un testicolo preparato con successo. (A) Immagine confocale di un testicolo vivo e intatto preparato con successo che esprime GFP-tubulina. Il mozzo delle cellule staminali si trova verso la punta inferiore del testicolo, anche se non è identificabile in questa preparazione. Sono indicati diversi strati di piccoli spermatogonia, e questi sono seguiti da numerose cisti di spermatociti. Una cisti di spermatociti nella prima divisione meiotica è identificabile in base alle grandi dimensioni delle cellule (circa 20 -30 m di diametro) e alla presenza di mandrini meiotici etichettati GFP-tubulina. Gli spermatociti nella seconda divisione meiotica hanno allo stesso modo dei mandrini, ma queste cellule sono circa la metà delle cellule meiosi I delle dimensioni. Sono visibili anche spermatidi post-meiotici, così come gli spermatozoi allunganti. (B) Gli spermatociti che inizieranno la meiosi entro 30 – 60 min possono essere identificati dai loro due grandi, molto luminosi astri di microtubuli (indicati da punte di freccia) etichettati da GFP-tubulin. La cisti delle cellule premeiotiche è delineata dalla linea gialla tratteggiata. (C) Le cellule nella meiosi sono identificabili dai loro grandi mandrini meiotici che sono facilmente visualizzabili con GFP-tubulina. La cisti delle cellule meiotiche è delineata dalla linea gialla tratteggiata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Immagine time-lapse di meiosi in un singolo spermatocito. Un singolo spermatocito co-espresso GFP-tubulina e RFP mirato al ER (RFP-KDEL) è stato imageizzato ogni due minuti attraverso il corso della meiosi. Le immagini rappresentative dello spermatocito in fasi specifiche della meiosi, a partire dalla tarda interfase e progredindo attraverso la telofase. I tempi sono in pochi minuti. Ogni immagine è un singolo piano ottico da una pila di quindici fette ottiche acquisite in ogni momento. Questa cifra è stata modificata da Karabasheva e Smyth, 20198. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Immagini rappresentative di un testicolo prima e dopo la rottura. L'immagine a sinistra, etichettata "Intact", mostra un test escheg gFP-tubulina che esprime poco prima della rottura. L'immagine a destra mostra lo stesso testire dopo la rottura. Le cisti degli spermatociti possono essere viste uscire fuori dai testicoli rotti. Le punte di freccia indicano una cisti di spermatociti meiotici; notare il movimento significativo di questi spermatociti dopo le rotture dei testicoli, rendendo l'imaging di questi spermatociti nel tempo estremamente impegnativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Divisione meiotica completa di un singolo spermatocito. È mostrato il time-lapse completo del GFP-tubulina e RFP-KDEL esprimendo spermatocito in Figura 4. Le immagini sono state acquisite ogni due minuti e la velocità di riproduzione è di tre fotogrammi al secondo. Questo video è stato modificato da Karabasheva e Smyth, 20198. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Testicoli intatti. Time-lapse di un testicolo prima e dopo la rottura. La rottura è evidente a causa dell'improvviso sflusso di cisti di cellule attraverso l'angolo inferiore sinistro del testicolo. Le immagini sono state acquisite ogni due minuti e la velocità di riproduzione è di tre fotogrammi al secondo. Clicca qui per scaricare questo video.

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Discussion

Abbiamo descritto un protocollo per la preparazione di testicoli della Drosophila larvale o pupilla precoce, ottimizzato per l'imaging live a lungo termine della divisione delle cellule di spermatocite. Questo è un metodo potente per l'analisi della divisione cellulare nel contesto fisiologico del tessuto intatto. Il potere di questo metodo è ulteriormente ampliato se combinato con strumenti genetici della Drosophila, come specifiche mutazioni genetiche, soppressione mediata dall'RNAi specifici dei tessuti e marcatori di proteine e orgelli etichettati fluorescenti. Inoltre, le piccole dimensioni dei testicoli larvali e puupali, e la capacità di immagini di cellule che si dividono molto vicino alla vetrina di vetro, rendono il metodo ideale per l'imaging ad alta risoluzione, compresi gli approcci di super-risoluzione. La versatilità di questo sistema sperimentale è dimostrata dai risultati rappresentativi che descrivono la riorganizzazione dinamica del ER durante la divisione cellulare. Gli spermatociti della Drosophila sono particolarmente utili per tale analisi delle dinamiche di orgelli durante la divisione cellulare a causa delle grandi dimensioni di queste cellule e del transito relativamente lento attraverso la meiosi. Inoltre, le stesse cellule possono essere immagini post-meioticamente per capire come i cambiamenti nella dinamica degli orgelli o nei meccanismi di divisione cellulare influenzano gli eventi successivi della spermatogenesi. Quindi, c'è un grande potenziale con questo approccio sperimentale per comprendere la fisiologia della divisione cellulare all'interno del più ampio contesto di sviluppo dei tessuti e differenziazione cellulare, risultati che sono irraggiungibili quando si studiano le cellule coltivate in coltura.

Il protocollo include diversi elementi che facilitano la coltura ex vivo a lungo termine dei testicoli fino a circa 24 ore. In primo luogo, i media di Schneider, sviluppati per il mantenimento delle cellule di coltura del tessuto della Drosophila, contengono fonti energetiche prontamente disponibili ed è ottimizzato per mantenere il pH fisiologico nell'aria atmosferica. In secondo luogo, la membrana permeabile a gas utilizzata per il montaggio di testicoli consente un rapido scambio di gas. Un importante vantaggio della coltura a lungo termine è che se le cellule nella fase desiderata di sviluppo o meiosi non si trovano immediatamente dopo la preparazione del campione, il campione può essere memorizzato e ricominciato immagine in un secondo momento. Abbiamo verificato che i testicoli mantenuti in un'incubatrice di 25 gradi centigradi durante la notte, per un totale di 16-24 ore, sono vitali e appaiono sani in base alla presenza di routine di cellule che subiscono attivamente la meiosi e progrediscono attraverso fasi successive di differenziazione dello sperma. Tuttavia, precauzioni devono essere prese durante la coltura testicoli per più di 2-3 ore per garantire che la fisiologia dei tessuti non è influenzata negativamente. Ancora più importante, i testicoli continuano a crescere in coltura come le cellule proliferano e maturando spermatozoi allungano. Ciò può causare l'allargamento dei testicoli al punto da scoppiare a causa dello spazio restrittivo tra la membrana e il coverslip, rendendo i testicoli inadatti per l'imaging dal vivo per i motivi descritti di seguito. Inoltre, se le colture a lungo termine devono essere impiegate regolarmente negli esperimenti, è consigliabile verificare se condizioni di coltura estesa specifiche del laboratorio causano anomalie meotiche come durate meiotiche prolungate o frequenze crescenti di cromosomi in ritardo o fallimento della citocinesi.

Al fine di immaginare singole cellule su lunghi corsi temporali, è importante che le cellule non si muovano in modo significativo una volta che i testicoli preparati sono sullo stadio del microscopio. Pertanto, è essenziale quando si esegue il protocollo che i testicoli rimangono intatti e intatti, perché le cellule fuoriescono dai testicoli danneggiati e tutte le cellule all'interno dell'organo si muovono di conseguenza (vedere Figura 5 e Video 2). Potrebbe ancora essere possibile immagini di spermatociti in testicoli danneggiati se le cellule alla fine si depositano e smettono di muoversi, anche se nel momento in cui questo accade, le fasi della meiosi che si intende analizzare potrebbero essersi già verificate. Inoltre, gli effetti del danno tissutale sul processo di divisione cellulare stesso non possono essere scontati. Danni ai testicoli possono verificarsi quando si cancellano i corpi grassi dopo la rimozione dei testicoli dalle larve. Occorre quindi prestare molta attenzione per evitare piercing o tirando sugli organi durante questo passaggio del protocollo. Infatti, spesso non è necessario rimuovere molto dei corpi grassi, purché non oscurino la visualizzazione dei testicoli. Più comunemente, il danno da testicoli è il risultato della rimozione di un'eccessiva coltura media dopo il posizionamento del coverslip durante la procedura di montaggio per l'imaging dal vivo (passaggio 3.6). Quando il mezzo viene rimosso, l'incretaggio si abbassa ed esercita pressione sui testicoli, e l'eccesso di pressione causerà la rottura dei testicoli. Pertanto, mentre è importante che il coperchio sia il più vicino possibile ai testicoli per facilitare l'imaging ottimale degli spermatociti, è necessaria una certa pratica per evitare di rimuovere troppo il mezzo e abbassare troppo il coperchio. È anche utile sottolineare che per alcune applicazioni, come l'esposizione acuta di spermatociti a farmaci o altre piccole molecole, può essere vantaggioso interrompere i testicoli e disperdere le cisti degli spermatociti per l'analisi. Diversi protocolli eccellenti sono disponibili per la preparazione e la coltura di cisti spermatociti disperse18,25.

Una considerazione importante quando si utilizzano spermatociti per l'analisi della divisione cellulare è che queste cellule eseguono meiotico al contrario delle divisioni mitotiche. È importante sottolineare che molti degli aspetti essenziali della meccanica di divisione cellulare, come l'architettura del mandrino e la citocinesi, sono simili tra meiosi maschile e mitosi6. Così, le intuizioni meccanicistiche raccolte dallo studio della meiosi spermatocite possono essere ampiamente applicabili ai meccanismi generali della divisione delle cellule animali7. Tuttavia, a seconda delle questioni meccanicistiche affrontate, potrebbero essere necessarie importanti differenze tra spermatociti e cellule mitotiche in processi come la dinamica cromosomica e la regolazione del ciclo cellulare26. Allo stesso tempo, gli spermatociti della Drosophila offrono l'opportunità unica di confrontare cellule mitotiche e meiotiche all'interno dello stesso tessuto e del lignaggio germinale. Ad esempio, la stessa preparazione di testicoli può essere utilizzata per analizzare le cellule staminali germinali o la spermatogonia sottoposta a mitosi e spermatociti sottoposti a meiosi. In genere non cerchiamo di immaginare le cellule staminali germinali o le mitosi spermatogoniali nei preparati vinti dei testicoli perché la tempistica di queste divisioni è difficile da prevedere. Tuttavia, abbiamo catturato fortuitamente queste divisioni nei nostri esperimenti, dimostrando che il protocollo generale può essere applicato anche all'analisi delle cellule mitotiche all'interno dei teste.

La metodologia presentata si concentra sulla preparazione dei testicoli per l'imaging dal vivo della spermatocite meiosi, in quanto ciò consente l'analisi in tempo reale delle dinamiche cellulari e molecolari. Forniamo anche un metodo per la fissazione e l'immunostaining dei testicoli intatti, in quanto questo approccio può essere preferibile se non sono disponibili costrutti di espressione etichettati fluorescenti richiesti a livello fluorescente o per evitare effetti di confusione della sovraespressione delle proteine. Una considerazione importante però è che la fissazione non sempre conserva fedelmente il tessuto nativo e l'architettura cellulare. Per esempio, noi e altri abbiamo scoperto che la fissazione spesso si traduce in frammentazione o interruzione del ER11,27. Alcuni di questi problemi possono essere alleviati utilizzando diversi fissativi o metodi di preparazione dei tessuti, e alcuni problemi possono quindi essere necessari per identificare il protocollo di fissazione ottimale per la conservazione di un particolare componente cellulare o organizzazione proteica. Fortunatamente, una serie di protocolli aggiuntivi per la fissazione spermatocite Drosophila sono disponibili anche18,28,29.

In conclusione, abbiamo descritto metodi versatili per la preparazione di testicoli della Drosophila per l'analisi delle cellule vive e fisse della meiosi della spermatocite. I punti di forza specifici di questo approccio sperimentale includono l'analisi della divisione cellulare nel tessuto intatto, l'imaging ad alta risoluzione di cellule di grandi dimensioni e l'integrazione con gli strumenti genetici della Drosophila. Gli esperimenti che utilizzano la metodologia hanno il potenziale per dare importanti contributi alla nostra comprensione di come la divisione cellulare si integra con meccanismi complessi di sviluppo dei tessuti e omeostasi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avviamenti del Dipartimento della Difesa per J.T.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5" Dissecting Probe Fisher 08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet Fisher 13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9703-100
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides Fisher 12-544-2 Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100 mL
Lumox Dish 50 Sarstedt SAR946077410 Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass Fisher 12-541-B 22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade Electron Microsocopy Sciences 15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides Fisher 12-549-5 Slides used for dissections
PYREX Spot Plates Fisher 13-748B 9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium Fisher 21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm EMD Millipore SLGS033SB
Triton X-100 Fisher BP151-500
Vectashield Vector Labs H-1000 Microscopy mounting medium

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