Préparation de Drosophila Larval et Pupal Testes pour l’analyse de la division cellulaire en direct, Tissu intact

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Developmental Biology

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Summary

Le but de ce protocole est d’analyser la division cellulaire dans les tissus intacts par microscopie cellulaire vivante et fixe à l’aide de spermatocytes méiotiques Drosophila. Le protocole démontre comment isoler des testicules entiers et intacts des larves de Drosophila et des pupes précoces, et comment les traiter et les monter pour la microscopie.

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Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue. J. Vis. Exp. (159), e60961, doi:10.3791/60961 (2020).

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Abstract

L’analyse expérimentale des cellules se divisant dans les tissus et les organes vivants et intacts est essentielle à notre compréhension de la façon dont la division cellulaire s’intègre au développement, à l’homéostasie tissulaire et aux processus de la maladie. Les spermatocytes de Drosophila subissant la méiose sont idéaux pour cette analyse parce que (1) les testicules entiers de Drosophila contenant des spermatocytes sont relativement faciles à préparer pour la microscopie, (2) la grande taille des spermatocytes les rend bien adaptés pour l’imagerie à haute résolution, et (3) les outils génétiques puissants de Drosophila peuvent être intégrés avec l’analyse in vivo. Ici, nous présentons un protocole facilement accessible pour la préparation de testicules entiers de Drosophila troisième larves instar et pupes précoces. Nous décrivons comment identifier les spermatocytes méiotiques dans les testicules entiers préparés et comment les imager en direct par microscopie en time-lapse. Des protocoles de fixation et d’immunostaining de testicules entiers sont également fournis. L’utilisation des testicules larvaires présente plusieurs avantages par rapport aux protocoles disponibles qui utilisent des testicules adultes pour l’analyse des spermatocytes. Plus important encore, les testicules larvaires sont plus petits et moins encombrés avec des cellules que les testicules adultes, ce qui facilite grandement l’imagerie à haute résolution des spermatocytes. Pour démontrer ces avantages et les applications des protocoles, nous présentons des résultats montrant la redistribution du réticulum endoplasmique en ce qui concerne les microtubules fuseaux pendant la division cellulaire dans un spermatocyte simple photographié par microscopie confocale en time-lapse. Les protocoles peuvent être combinés avec l’expression d’un certain nombre de protéines marquées fluorescentes ou marqueurs d’organelle, ainsi que des mutations génétiques et d’autres outils génétiques, ce qui rend cette approche particulièrement puissante pour l’analyse des mécanismes de division cellulaire dans le contexte physiologique des tissus entiers et des organes.

Introduction

La division cellulaire est souvent étudiée à l’aide de lignées cellulaires cultivées dans la culture1. Bien que nous ayons acquis une richesse de perspicacité inestimable et la compréhension des mécanismes fondamentaux de ces études2, les cellules cultivées dans la culture ne peuvent pas entièrement récapituler la physiologie de la division cellulaire comme il se produit dans intact, tissu vivant. Par exemple, dans les tissus et les organes intacts, les cellules doivent se diviser au bon endroit et au bon moment afin que les cellules progénitrices soient correctement situées dans le tissu, de sorte qu’elles puissent subir une différenciation appropriée ou des programmes fonctionnels, et de sorte que la prolifération cellulaire soit correctement coordonnée avec la croissance des tissus ou l’homéostasie3. Pour les cellules cultivées en culture d’autre part, la division cellulaire est généralement réglementée par des facteurs de croissance dans le milieu de la culture4, et donc nous ne pouvons pas apprendre de ces cellules comment in vivo facteurs environnementaux tels que l’architecture tissulaire ou la signalisation développementale influencent le processus de division. Il est également important de noter que beaucoup de lignées cellulaires utilisées pour étudier la division cellulaire, telles que Les cellules HeLa et U2OS, ont été dérivées de tumeurs métastatiques5. Par conséquent, de nombreux aspects de la physiologie de base de ces cellules cancéreuses, tels que les mécanismes de régulation du cycle cellulaire et la stabilité chromosomique, ont probablement été modifiés par rapport aux cellules saines. La compréhension complète de la physiologie de division cellulaire dépend donc de notre capacité à étudier les cellules de division dans leurs environnements indigènes in vivo qui préservent les mécanismes physiologiques de régulation et l’architecture tissulaire.

Les progrès dans la compréhension du fonctionnement de la division cellulaire dans les tissus et les organes intacts sont entravés par des difficultés inhérentes à l’analyse in vivo ou ex vivo. Tout d’abord, il peut être difficile ou impossible d’accéder à des cellules de division pour une analyse microscopique dans de grands organes ou des tissus épais. Deuxièmement, il est souvent difficile de prédire quand les cellules individuelles se divisent in vivo. Troisièmement, la physiologie tissulaire peut rapidement se détériorer pendant la culture ex vivo. Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes facilement accessibles pour l’analyse vivante et fixe des spermatocytes de mélanogaster de Drosophila pendant qu’ils subissent des divisions méiotiques de cellules dans des testicules entièrement intacts. Ces cellules sont idéales pour l’analyse vivante et ex vivo parce qu’elles sont facilement accessibles avec des méthodes optiques standard telles que la microscopie confocienne, elles se divisent à des moments et des endroits prévisibles, et les testicules intacts peuvent être maintenus dans la culture ex vivo jusqu’à environ 24 h. En outre, les spermatocytes Drosophila sont de grandes cellules rondes (environ 20 à 30 m de diamètre) qui ne changent pas de forme lorsqu’elles se divisent, ce qui les rend idéales pour l’imagerie à haute résolution et en time-lapse des composants cellulaires tels que l’appareil fuseau et les organites cytoplasmiques. Bien que ces cellules subissent la méiose par opposition à la mitose, beaucoup des processus essentiels de division cellulaire sont très semblables entre ces deux mécanismes de division cellulaire6. Ces avantages, combinés avec de puissants outils génétiques Drosophila, ont fait des spermatocytes Drosophila un modèle largement utilisé pour l’analyse ex vivo des processus essentiels de division cellulaire, y compris la formation et la régulation des fuseaux, la cytokinésie, et le remodelage et le cloison d’organelle7,8,9,10,11.

Les spermatocytes sont des cellules qui sont au stade méiotique de la spermatogénèse. Dans Drosophila, la spermatogénèse commence par un groupe de cellules souches germinales qui sont situés dans une petite région ou "hub" à un pôle des testis12,13. Ces cellules se divisent par une mitose asymétrique, donnant lieu à un spermatogonium différencié unique. Spermatogonia subit alors quatre mitoses synchrones pour produire un groupe de 16 cellules qui restent étroitement associées dans un seul kyste. À ce stade, les cellules passent d’un cycle mitotique à un cycle de cellules méiotiques et sont appelées spermatocytes. Les spermatocytes passent environ deux à trois jours dans une étape étendue du cycle G2 de la cellule, au cours de laquelle ils se développent de façon spectaculaire et subissent des changements cytologiques en préparation pour les deux divisions méiotiques et la spermiogénèse suivante13,14. Le groupe entier de 16 spermatocytes dans un seul kyste entrent alors dans la première division méiotique en même temps. Ainsi, plusieurs spermatocytes méiotiques peuvent être photographiés simultanément pendant qu’ils procèdent par division cellulaire. La première division méiotique se poursuit pour environ 1,5 h et est suivie presque immédiatement par la deuxième division méiotique, donnant 64 spermiatdés totaux qui continuent à se différencier en spermatozoïde mature.

Un avantage unique de l’utilisation de spermatocytes pour étudier la division cellulaire dans les tissus vivants et intacts est que les groupes ou les kystes des cellules progressent constamment à travers les différents stades de spermatogénèse, et les cellules à tous les stades de la spermatogénèse peuvent généralement être identifiés dans n’importe quel testicule donné (voir la figure 3A). Par conséquent, il est relativement facile de trouver des cellules méiotiques dans des testicules entiers. Nous concentrons généralement nos analyses sur la première par opposition à la méiose seconde parce que ces cellules sont beaucoup plus grandes et plus agréables à l’imagerie à haute résolution, mais l’ensemble du processus englobant les deux divisions méiotiques peut être photographié avec succès. Il convient également de noter que le protocole général pour la préparation et la culture des testicules peut être utilisé pour analyser d’autres processus de spermatogénèse ainsi, tels que les divisions antérieures de cellules souches mitotiques ou spermatogonial ou les changements cytologiques qui se produisent pendant que les spermatotines mûrissent dans spermatozoa15. Beaucoup de ces aspects de la spermatogénèse sont fortement conservés entre Drosophila et les humains16.

Les spermatocytes de Drosophila commencent à atteindre la phase méiotique de spermatogénèse pendant le troisième stade larvaire instar du développement de Drosophila 13. Par conséquent, les testicules isolés des stades du cycle de vie en commençant par les larves de troisième étoile et y compris les pupes et les adultes peuvent être utilisés pour l’analyse de la division des spermatocytes. Plusieurs protocoles excellents sont disponibles pour l’extraction des testicules de mouches mâles adultes pour l’analyse vivante et fixe de la spermatogénèse17,18,19. Ces protocoles peuvent être préférables pour étudier les stades avancés de la spermatogénèse ou si les marqueurs génétiques qui ne sont visibles que chez les adultes doivent être utilisés. Le protocole se concentre plutôt sur la préparation des testicules à partir de larves et de pupes précoces, car les testicules à ces stades ont plusieurs avantages qui sont spécifiquement pertinents pour l’analyse de division cellulaire par haute résolution, microscopie time-lapse. Tout d’abord, les testicules des larves et des pupes sont plus petits que ceux des adultes, et les cellules à l’intérieur de l’organe sont moins encombrées. Pour cette raison, la division des spermatocytes peut souvent être imagené près de la surface extérieure des testicules larvaires, sans avoir à pénétrer à travers de multiples couches de tissu de diffusion de la lumière. Deuxièmement, les testicules adultes se déplacent rythmiquement en raison des contractions des organes accessoires attachés, et ces mouvements rendent la formation image en time-lapse des cellules individuelles difficile. Et troisièmement, les testicules larvaires sont avantageux lorsqu’ils étudient les mutations génétiques qui causent la létalité pupale ou adulte. Nos méthodes sont optimisées pour la culture à long terme des testicules au stade du microscope, permettant l’imagerie de plusieurs cycles de division cellulaire ou la progression des cellules individuelles à travers de multiples stades de spermatogénèse dans la même préparation. Nous décrivons également un protocole pour la fixation et l’immunostaining des testicules entiers. Dans l’ensemble, nos protocoles sont particulièrement utiles pour ceux qui s’intéressent à l’étude de la division cellulaire dans les tissus intacts, et la capacité de combiner l’analyse de spermatocytes avec des outils génétiques très tractables Drosophila en fait une approche particulièrement puissante.

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Protocol

1. Préparer les animaux, les outils et les médias pour la dissection

  1. Traversez les mouches mâles et femelles pour obtenir la progéniture du génotype désiré. Les marqueurs transgéniques utiles pour l’identification et la mise en scène des spermatocytes méiotiques incluent GFP-tubulin pour étiqueter le fuseau méiotique et la DP-histone 2A pour étiqueter les chromants8. Utilisez cinq à dix femelles par croix et maintenez les croix sur les aliments à mouche standard dans des flacons dans un incubateur de 25 oC jusqu’à ce que les larves de l’étoile troisième commencent à ramper sur les côtés de la fiole (4-5 jours). Les premières pupes blanches commenceront à se former un jour plus tard.
  2. Obtenez deux paires de forceps droits avec des pointes fines. Assurez-vous que les pointes sont nettes, même en longueur, et droites (figure 1A). Utilisez ces forceps uniquement pour les dissections, et le bouchon avec des pointes de pipette de 10 l lorsqu’ils ne sont pas utilisés.
  3. Préparer un outil de scalpel.
    1. Insérez l’extrémité émoussée d’une goupille noire d’insecte en acier anodisé dans un porte-épingle, et tordez la vis du support pour fixer la goupille en place. À l’aide d’une paire de forceps et sous un microscope disséqué, saisissez la goupille d’insecte au milieu et pliez-la pour former un angle interne de 135 degrés(figure 1B). L’extrémité pointue est pour couper le tissu, tandis que le bord est employé pour transférer des testicules entre les gouttes de support.
    2. Capuchon avec une pointe de pipette de 1 000 l lorsqu’il n’est pas utilisé.
  4. Travailler dans une hotte de culture tissulaire, préparer 5 mL aliquots des médias de Schneider et stocker à 4 oC jusqu’au moment de l’utilisation. Lorsqu’il est prêt à commencer les dissections, réchauffer un aliquot média de 5 ml à température ambiante. Ensuite, transférer le support de dissection réchauffé dans une seringue de 10 ml et attacher un filtre à seringue de 0,22 m.

2. Dissection des testicules des larves et des pupaes précoces

  1. Utilisez la seringue de filtre remplie de supports pour expulser trois gouttes de support (50 ll chacune) en haut, au milieu et au bas d’une glissière en verre.
  2. Utilisez une sonde disséquée pour transférer cinq à dix troisième larves instar ou pupes précoces (pupes encore blanches ou jaunes) à la chute supérieure. Agitez doucement les larves et les pupes dans les médias avec la sonde disséquante pour enlever toute nourriture ou débris.
  3. Sous un microscope disséqué, tournez une seule larve ou pupe sur le côté avec une sonde disséquante pour identifier les deux testicules bilatéraux s’ils sont présents, qui apparaissent comme des structures translucides ovales dans le tiers postérieur du corps(figure 2A, B). Les animaux qui n’ont pas de testicules sont femelles et doivent être jetés.
  4. Lorsqu’une larve ou une pupe mâle est trouvée et est propre, déplacez-la vers la deuxième goutte de médias. Répétez l’opération jusqu’à ce que 3 ou 4 larves mâles et/ou pupes aient été transférées à la deuxième goutte de médias.
  5. Travaillant dans la deuxième goutte de médias, saisissez une seule larve mâle ou pupe avec une paire de forceps à sa mi-région, juste antérieur aux testicules. Utilisez la deuxième paire de forceps pour déchirer doucement l’animal en deux.
  6. Maintenez l’extrémité postérieure de la larve ou la pupe vers le bas sur la glissière en verre avec une paire de forceps. En commençant juste à côté des forceps, poussez vers le bas sur la cuticule en utilisant le bord de l’outil de scalpel et déplacez le scalpel vers l’extrémité coupée de l’animal. Cela expulsera les organes internes de l’animal, qui comprennent les intestins, les corps gras et les testicules.
  7. Taquiner doucement les testicules du reste des organes. Les testicules sont des organes clairs de forme ovale encastrés dans des rubans de graisse corporelle(figure 2C).
  8. Transférer les testicules un à la fois à la troisième goutte de médias. Pour ce faire, insérer le bord du scalpel sous le corps gras, soulever le tissu hors des médias, et rapidement le déplacer à la troisième goutte.
  9. Alternativement, s’il n’y a pas assez de corps de graisse encore attaché aux testicules pour soulever avec succès le tissu, transférer doucement le tissu à l’aide d’une pipette pasteur en verre qui a été pré-mouillé avec des supports de dissection.
  10. Utilisez l’extrémité pointue de l’outil de scalpel pour trancher doucement l’excès de graisse du corps des testicules, laissant juste une petite jante de corps gras autour des bords(figure 2C). Il n’est pas nécessaire d’enlever tout le corps gras, et tenter de le faire entraînera probablement une endommagement ou une rupture des testicules.
  11. Répétez les étapes ci-dessus pour toutes les larves mâles sur la glissière en verre.
  12. Procédez soit à l’étape 3, soit à l’étape 5.

3. Montage d’essaiicules pour l’imagerie microscopique en direct

REMARQUE: Cette procédure de montage a été adaptée d’un protocole récemment publié pour l’imagerie des neuroblastes larvaires larvaires de Drosophila 20. Vous trouverez des détails supplémentaires dans cette référence.

  1. Utilisez la seringue de filtre pour déposer une seule goutte de supports de Schneider (environ 30 ll) sur le centre d’un plat de culture à gaz de 50 mm perméable.
  2. Utilisez une pipette Pasteur pré-mouillée pour transférer les testicules préparés à la goutte sur le plat perméable au gaz. Les testicules flottent généralement à la surface de la chute.
  3. Utilisez l’outil scalpel pour pousser doucement les testicules vers le bas sur la membrane perméable au gaz. Veillez à ne pas rompre la membrane perméable au gaz avec le point pointu du scalpel. Poussez tous les testicules au centre de la goutte.
  4. Utilisez une seringue de 1 ml remplie d’huile de halocarbone pour faire quatre gouttes d’huile, environ 30 ll chacune, sur la membrane perméable du gaz. Espacez les gouttes d’huile autour de la goutte de support contenant les testicules pour correspondre aux quatre coins d’un housse de verre de 22 mm.
  5. Alignez les coins d’un housse en verre de 22 mm avec les quatre gouttes d’huile de halocarbone et abaissez doucement le coverlip sur le support et l’huile. Laissez le coverlip se déposer et que les supports contenant les testicules se propagent entre les gouttes d’huile.
  6. Retirez l’excès de support pour permettre au coverlip de s’installer sur la surface des testicules. Tout en observant les testicules sous un microscope disséquant, insérer le coin d’une tâche délicate essuyer dans les médias sous le coverlip pour évincer une petite quantité de liquide. Wick loin assez de médias jusqu’à ce que le coverlip de verre prend juste contact avec la surface des plus grands testis. Il est essentiel de ne pas enlever trop de supports et d’abaisser le coverlip trop loin, car cela exercera une pression sur les testicules et les entraînera à la rupture (voir la figure 5).

4. Imagerie en direct des spermatocytes méiotiques

REMARQUE: Les spermatocytes peuvent être photographiés à l’aide d’un microscope confocal de balayage laser ou de disque tournant. Le système doit avoir une vitesse et une sensibilité adéquates pour éviter le photoblachage des protéines fluorescentes ou le photodamage du tissu.

  1. Placez une goutte d’huile d’immersion sur le housse en verre juste au-dessus des testicules. Retournez sur le plat et placez-le sur le microscope et déplacez l’objectif de microscope (40x ou 60x) dans l’huile jusqu’à ce qu’il soit juste en dessous des testicules. Utilisez la lumière transmise pour trouver un testicule unique et la mettre au point.
  2. Tout en capturant des images rapides avec le confocal, déplacez les testicules autour d’examiner l’organisation des cellules. Une extrémité des testicules aura beaucoup de petites cellules densément emballées. Cette extrémité contient les cellules souches germinales et la spermatogonie. Se déplaçant vers l’autre extrémité de l’organe, identifier les cellules progressivement plus grandes organisées en grappes discrètes ou kystes. Ces grandes cellules sont les spermatocytes(figure 3A).
  3. Si l’imagerie GFP-tubulin, identifier les spermatocytes qui commenceront la méiose dans les 30-60 min par la présence de deux asters microtubule lumineux (c.-à-d., centrosomes) situés au cortex de la cellule(figure 3B, C).
  4. Une fois qu’un kyste de spermatocytes méiotiques a été identifié, configurez des paramètres d’acquisition pour capturer des z-stacks d’images au fil du temps. Typiquement, l’acquisition de 15-20 images espacées de 1,5 m dans la dimension z est suffisante pour capturer le volume complet de plusieurs spermatocytes dans le même kyste.
  5. Acquérir des z-stacks complets toutes les 2 minutes si l’imagerie de toute la première division méiotique, qui prend environ 1,5 heures. Il est possible d’utiliser des taux d’acquisition plus rapides, surtout si seulement un événement spécifique de méiose doit être analysé. Cependant, prenez soin de ne pas causer de photoblaching ou de photodamage en raison de l’exposition répétée de l’échantillon à l’excitation laser.
  6. Utilisez un système de commande de mise au point automatique et continu pour prévenir la dérive focale au cours de la longue période d’acquisition. Le contrôle de température de l’échantillon au stade du microscope n’est généralement pas nécessaire, en supposant une température ambiante d’environ 22 à 23 oC. Si un contrôle de la température est disponible, maintenez l’échantillon à 25 oC au stade du microscope.
  7. Si les spermatocytes méiotiques ne sont pas trouvés, conservez l’échantillon pendant plusieurs heures ou toute la nuit dans un incubateur et une image de 25 oC.

5. Fixation et immunostachation

  1. De l’étape 2.10 ci-dessus, utilisez une pipette Pasteur en verre pour transférer les testicules dans un puits dans un plat de dissectage en verre de 9 puits contenant 0,5 mL de paraformaldéhyde de 8% dans PBSTx (phosphate tamponné saline avec 0,3% Triton X-100). Assurez-vous que les testicules sont posés sur le fond du plat.
    REMARQUE: Le paraformaldéhyde est toxique et doit être manipulé avec des gants dans une hotte à fumée.
  2. Fixer les testicules pendant 20 minutes à température ambiante.
  3. Transférer les testicules dans un puits contenant 0,5 mL PBSTx. Laver pendant 5 min avec une agitation douce. Répétez l’étape de lavage dans de nouveaux puits avec PBSTx frais deux fois de plus.
  4. Diluer l’anticorps primaire à la concentration désirée dans 0.5 mL PBSTx contenant 5% d’albumin de sérum bovin (BSA) dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL. Transférer les testicules du plat de dissectage en verre de 9 puits au tube d’anticorps primaire dilué et incuber toute la nuit à 4 oC avec une légère berçage ou une noix.
  5. Laver les testicules dans 0,5 ml de PBSTx pendant 5 minutes dans un puits d’un plat de dissection en verre de 9 puits. Répétez l’étape de lavage avec PBSTx frais deux fois de plus.
  6. Diluer l’anticorps secondaire dans 250 l 'L de PBSTx contenant 5% BSA et distribuer dans un puits propre d’un plat de dissection de verre 9-bien. Si désiré, ajouter DAPI à tacher l’ADN. Transférer les testicules vers le puits contenant des anticorps secondaires, couvrir d’une pellicule plastique et incuber dans l’obscurité avec une agitation douce pendant 4 heures à température ambiante.
  7. Transférer les testicules à un puits propre rempli de 0,5 ml de PBSTx. Laver avec PBSTx frais deux fois pendant 5 min et une troisième fois pendant 30 min.

6. Montage des testicules fixes

  1. Transférer les testicules du dernier lavage sur une glissière en verre à l’aide d’une pipette Pasteur. Si nécessaire, utilisez le bord de l’outil scalpel pour pousser les testicules vers le bas sur la surface de la glissière.
  2. Utilisez le coin d’une tâche délicate essuyer pour éventer l’excès de liquide des testicules. Retirer autant de liquide que possible.
  3. Appliquer une goutte de microscopie de 30 à 50 l de mioscopie à la vitesse des testicules.
  4. Placez un housse de 22 mm sur la goutte de support de montage et laissez reposer le coverlip et le support de montage pour se propager sous le coverlip. Appliquer une légère pression sur le coverlip si nécessaire pour presser l’excès de support de montage et permettre au coverlip de se reposer sur la surface des testicules.
  5. Utilisez du vernis à ongles pour sceller les bords du coverlip.

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Representative Results

Lorsque ce protocole est exécuté avec succès, les testicules resteront entièrement intacts pour l’imagerie par microscopie confocienne ou d’autres méthodes de microscopie de fluorescence. Comme on le voit dans la figure 3A, l’organisation cellulaire des testicules est préservée, et la progression de la différenciation cellulaire d’une extrémité des testicules à l’autre, y compris la spermatogonie, les spermatocytes et les spermiatdés haploïdes est visible. GFP-tubulin est un marqueur utile pour identifier la division des spermatocytes et pour l’imagerie vivante de la progression des cellules par la méiose. Comme le montre la figure 3B, les spermatocytes au sujet de la méiose de départ peuvent être identifiés par leurs deux asters de microtubule proéminents. En métaphase, les gros fuseaux méiotiques sont magnifiquement étiquetés par GFP-tubulin(figure 3C).

La grande taille des spermatocytes de Drosophila et leur progression lente relative par la méiose les rendent idéales pour l’analyse de la dynamique et de la réorganisation des composants cellulaires tels que les organites cytoplasmiques pendant la division cellulaire8,,11,21. La figure 4 et la vidéo 1 montrent l’analyse d’imagerie en direct de la réorganisation dynamique du réticulum endoplasmique (ER) en ce qui concerne les microtubules au cours de la méiose. Comme décrit ci-dessus, pendant l’interphase tardive juste avant l’apparition de la méiose, deux centrosomes situés au cortex de la cellule sont clairement visibles par la fluorescence de GFP-tubulin. À ce stade, la fluorescence de la DP (RFP-KDEL) ciblée par les urgences révèle que l’ER est réparti uniformément dans tout le cytoplasme. Les centrosomes commencent alors à migrer vers les côtés opposés de l’enveloppe nucléaire pour établir les deux poteaux de fuseau. Pendant ce temps, l’ER s’accumule rapidement autour des microtubules centrosomales et est progressivement effacé du reste du cytoplasme. La dégradation de l’enveloppe nucléaire (ONÉ) est révélée par l’apparition de la fluorescence GFP-tubulin dans la région nucléaire. Il convient de noter que les cellules Drosophila se divisent par la mitose semi-ouverte ou la méiose, ce qui signifie que les composants de l’enveloppe nucléaire se décomposent et se dispersent et de grandes molécules cytoplasmiques entrent dans la région nucléaire, mais une enveloppe de membranes dérivées d’ER entoure le fuseau et les chromatides à travers la division cellulaire22,23,24. Au moment de l’ONÉ et en progressant à travers la métaphase, l’ER est presque entièrement associé aux microtubules astrales qui entourent les deux centrosomes de mâts fuseaux. Ces deux accumulations de microtubule astrale de l’ER puis la partition aux deux cellules de fille pendant l’anaphase, assurant l’héritage approprié d’ER par les cellules nouvellement formées8,11.

La figure 5 montre les effets de la rupture des testicules sur l’imagerie vivante des spermatocytes. Comme décrit dans le protocole, il faut faire très attention de ne pas abaisser le coverlip trop loin sur la surface des testicules pendant les étapes de montage, car cela exercera une pression sur les testicules et les fera éclater. Comme on le voit dans la figure 5 et la vidéo 2, les kystes des spermatocytes sortent rapidement des testicules rompus, et ce mouvement des cellules rend l’imagerie vivante et en time-lapse extrêmement difficile.

Figure 1
Figure 1 : Outils nécessaires pour une dissection réussie. (A) Les Forceps utilisés pour la dissection doivent être droits et avoir des pointes nettes et ininterrompues (indiquées par la marque de contrôle verte). N’utilisez pas de forceps avec des pointes pliées ou cassées (marques X rouges), car elles seront inefficaces pour saisir les larves et taquiner les tissus. (B) Pour préparer l’outil scalpel, plier une goupille noire d’insecte en acier anodisé à un angle interne d’environ 135 degrés. Le point pointu est utilisé comme un couteau pour couper à travers les tissus, et le bord droit est utilisé pour le déplacement des tissus. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Identification des testicules larvaire et pupal. (A) Images de larves mâles et femelles. Les testicules sont identifiables chez le mâle comme les structures translucides circulaires ou ovales dans le tiers postérieur de l’animal (pointe de flèche). Notez l’absence d’une structure similaire chez la femelle. (B) Image d’une pupe mâle précoce, avec les deux testicules translucides indiqués par des pointes de flèche. (C) Testes avec des corps de graisse attachés après dissection. Les deux testicules sur la gauche ont des corps graisseux excessifs encore attachés qui doivent être coupés loin. Les deux testicules de droite ont été correctement coupés de leur corps gras et sont prêts pour l’imagerie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Identification des spermatocytes méiotiques dans un testicule bien préparé. (A) Image confocale d’un testicule vivant et intact préparé avec succès exprimant GFP-tubulin. Le moyeu des cellules souches est situé vers la pointe inférieure des testicules, bien qu’il ne soit pas identifiable dans cette préparation. Plusieurs couches de petites spermatogonia sont indiquées, et celles-ci sont suivies par de nombreux kystes de spermatocytes. Un kyste de spermatocytes dans la première division méiotique est identifiable basé sur la grande taille des cellules (environ 20 à 30 m de diamètre) et la présence de fuseaux méiotiques étiquetés GFP-tubulin. Les spermatocytes dans la deuxième division méiotique ont également des fuseaux, mais ces cellules sont approximativement la moitié de la taille des cellules I de méiose. Les spermiatdés post-méiotiques sont également visibles, tout comme l’elongating spermatozoa. (B) Spermatocytes qui commenceront la méiose dans les 30 - 60 min peuvent être identifiés par leurs deux grands asters microtubule très lumineux (indiqué par des têtes fléchées) étiquetés par GFP-tubulin. Le kyste des cellules pré-méiotiques est délimité par la ligne jaune pointillée. (C) Les cellules de la méiose sont identifiables par leurs grandes broches méiotiques qui sont facilement visualisées avec GFP-tubulin. Le kyste des cellules méiotiques est délimité par la ligne jaune pointillée. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Imagerie en accéléré de la méiose dans un seul spermatocyte. Un seul spermatocyte co-exprimant GFP-tubulin et RFP ciblées à l’ER (RFP-KDEL) a été photographié toutes les deux minutes au cours de la méiose. Les images représentatives du spermatocyte à des stades spécifiques de la méiose, commençant par interphase tardif et progressant par telophase. Les temps sont en quelques minutes. Chaque image est un seul plan optique à partir d’une pile de quinze tranches optiques acquises à chaque point de temps. Ce chiffre a été modifié à partir de Karabasheva et Smyth, 20198. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Images représentatives d’un testicule avant et après la rupture. L’image de gauche, étiquetée "Intact", montre un GFP-tubulin exprimant des testicules juste avant la rupture. L’image de droite montre les mêmes testicules après la rupture. Des kystes de spermatocytes peuvent être vus en streaming hors des testicules rompus. Les pointes de flèche indiquent un kyste des spermatocytes méiotiques ; Notez le mouvement significatif de ces spermatocytes après les ruptures de testis, rendant l’imagerie de ces spermatocytes au fil du temps extrêmement difficile. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Vidéo 1: Division méiotique complète d’un spermatocyte unique. On y voit le temps plein de la GFP-tubulin et de la DP-KDEL exprimant le spermatocyte dans la figure 4. Les images ont été capturées toutes les deux minutes, et le taux de lecture est de trois images par seconde. Cette vidéo a été modifiée à partir de Karabasheva et Smyth, 20198. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Testicules rompus. Time-lapse d’un testicule avant et après la rupture. La rupture est évidente en raison de la diffusion soudaine de kystes de cellules à travers le coin inférieur gauche des testicules. Les images ont été capturées toutes les deux minutes, et le taux de lecture est de trois images par seconde. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

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Discussion

Nous avons décrit un protocole pour la préparation des testicules larvaires ou précoces de Drosophila, optimisé pour la formation image vivante à long terme de la division de cellules de spermatocyte. Il s’agit d’une méthode puissante pour l’analyse de la division cellulaire dans le contexte physiologique du tissu intact. La puissance de cette méthode est encore élargie lorsqu’elle est combinée avec des outils génétiques Drosophila, tels que des mutations génétiques spécifiques, la suppression tissu-spécifique de RNAi-négocié, et fluorescenté protéine et marqueurs d’organelle. En outre, la petite taille des testicules larvaires et pupal, et la capacité d’imager les cellules de division très près de la couverture de verre, rendent la méthode idéale pour l’imagerie à haute résolution, y compris les approches super-résolution. La polyvalence de ce système expérimental est démontrée par les résultats représentatifs décrivant la réorganisation dynamique de l’ER pendant la division cellulaire. Les spermatocytes de Drosophila sont particulièrement utiles pour une telle analyse de la dynamique d’organelle pendant la division cellulaire due à la grande taille de ces cellules et au transit relativement lent par la méiose. En outre, les mêmes cellules peuvent être images post-méiotically pour comprendre comment les changements dans la dynamique des organelles ou les mécanismes de division cellulaire affectent les événements ultérieurs de spermatogénèse. Ainsi, il y a un grand potentiel avec cette approche expérimentale pour comprendre la physiologie de la division cellulaire dans le contexte plus large du développement des tissus et de la différenciation cellulaire, des résultats qui sont inaccessibles lors de l’étude des cellules cultivées en culture.

Le protocole comprend plusieurs éléments qui facilitent la culture ex vivo à long terme des testicules pendant environ 24 heures. Tout d’abord, les médias de Schneider, qui a été développé pour le maintien des cellules de la culture tissulaire Drosophila, contiennent des sources d’énergie facilement disponibles et sont optimisés pour maintenir le pH physiologique dans l’air atmosphérique. Deuxièmement, la membrane perméable au gaz utilisée pour monter les testicules permet un échange rapide de gaz. Un avantage important de la culture à long terme est que si les cellules au stade désiré du développement ou de la méiose ne sont pas trouvées immédiatement après la préparation de l’échantillon, l’échantillon peut être stocké et photographié à nouveau à une date ultérieure. Nous avons vérifié que les testicules maintenus dans un incubateur de 25 oC pendant la nuit, pour un total de 16-24 heures, sont viables et semblent en bonne santé en fonction de la présence de routine des cellules subissant activement la méiose et progressant à travers les stades ultérieurs de la différenciation des spermatozoïdes. Cependant, des précautions doivent être prises lors de la culture des testicules pendant plus de 2-3 heures pour s’assurer que la physiologie tissulaire n’est pas affectée négativement. Plus important encore, les testicules continuent de croître dans la culture que les cellules prolifèrent et la maturation des spermatozoïdes s’allongent. Cela peut amener les testicules à s’agrandir au point qu’ils éclatent en raison de l’espace restrictif entre la membrane et le coverlip, rendant les testicules impropres à l’imagerie en direct pour des raisons décrites ci-dessous. En outre, si les cultures à long terme doivent être régulièrement utilisées dans des expériences, il est conseillé de tester si les conditions de culture prolongée spécifiques au laboratoire entraînent des anomalies méiotiques telles que des durées méiotiques prolongées ou des fréquences accrues de chromosomes à la traîne ou d’échec de cytokinesis.

Afin d’imager les cellules individuelles au cours de longs cours de temps, il est important que les cellules ne se déplacent pas de manière significative une fois que les testicules préparés sont sur le stade du microscope. Ainsi, il est essentiel lors de l’exécution du protocole que les testicules restent intacts et intacts, parce que les cellules se déversent des testicules endommagés et toutes les cellules de l’organe se déplacent en conséquence (voir la figure 5 et la vidéo 2). Il peut encore être possible d’image spermatocytes dans les testicules endommagés si les cellules finissent par se régler et arrêter de se déplacer, bien que le temps que cela se produise les stades de la méiose que l’on a l’intention d’analyser peut-être déjà eu lieu. En outre, les effets des lésions tissulaires sur le processus de division cellulaire lui-même ne peuvent pas être écartés. Les dommages aux testicules peuvent se produire lors de l’élimination des corps graisseux après l’enlèvement des testicules des larves. Il faut donc faire grand soin d’éviter le perçage ou le tir sur les organes pendant cette étape du protocole. En fait, il n’est souvent pas nécessaire d’enlever une grande partie des corps gras, tant qu’ils n’obscurcissent pas la visualisation des testicules. Plus souvent, les dommages aux testicules sont le résultat de l’élimination de trop de milieu de culture après le placement du coverlip pendant la procédure de montage pour l’imagerie en direct (étape 3.6). Lorsque le support est enlevé, le coverlip tombe plus bas et exerce une pression sur les testicules, et l’excès de pression entraînera la rupture des testicules. Ainsi, s’il est important que le coverlip soit aussi proche que possible des testicules pour faciliter l’imagerie optimale des spermatocytes, une certaine pratique est nécessaire pour éviter d’enlever trop de médium et d’abaisser le coverlip trop loin. Il est également utile de souligner que pour certaines applications, telles que l’exposition aigue de spermatocytes à des médicaments ou d’autres petites molécules, il peut être avantageux de perturber les testicules et de disperser les kystes des spermatocytes pour analyse. Plusieurs protocoles excellents sont disponibles pour la préparation et la culture des kystes dispersés spermatocyte18,25.

Une considération importante en utilisant des spermatocytes pour l’analyse de division cellulaire est que ces cellules exécutent le méiotique par opposition aux divisions mitotic. Fait important, beaucoup des aspects essentiels de la mécanique de division cellulaire, tels que l’architecture de fuseau et la cytokinésie, sont semblables entre la méiose masculine et la mitose6. Ainsi, les idées mécanistes recueillies à partir de l’étude de la méiose spermatocyte peuvent être largement applicables aux mécanismes généraux de la division des cellules animales7. Cependant, selon les questions mécanistes abordées, d’importantes différences entre les spermatocytes et les cellules mitotic dans des processus tels que la dynamique chromosomique et la régulation du cycle cellulaire peuvent devoir être considérées26. Dans le même temps, les spermatocytes Drosophila présentent l’occasion unique de comparer les cellules mitotiques et méiotiques dans le même tissu et la lignée germinale. Par exemple, la même préparation de testicule peut être utilisée pour analyser les cellules souches germinales ou la spermatogonie subissant la mitose et les spermatocytes subissant la méiose. En général, nous n’essayons pas d’imager les cellules souches germinales ou les mitoses spermatogones dans les préparations de testicules vivants parce que le moment de ces divisions est difficile à prévoir. Cependant, nous avons capturé fortuitement ces divisions dans nos expériences, démontrant que le protocole général peut être appliqué à l’analyse des cellules mitotic dans les testicules ainsi.

La méthodologie présentée se concentre sur la préparation des testicules pour l’imagerie en direct de la méiose spermatocyte, car cela permet une analyse en temps réel de la dynamique cellulaire et moléculaire. Nous fournissons également une méthode pour la fixation et l’immunostaining des testicules intacts, car cette approche peut être préférable si les constructions d’expression fluorescentes requises ne sont pas disponibles ou pour éviter les effets confondants de la surexpression des protéines. Une considération importante est cependant que la fixation ne préserve pas toujours fidèlement les tissus indigènes et l’architecture cellulaire. Par exemple, nous et d’autres avons constaté que la fixation entraîne souvent la fragmentation ou la perturbation de l’ER11,27. Certains de ces problèmes peuvent être atténués en utilisant différents fixatifs ou méthodes de préparation des tissus, et certains dépannage peuvent donc être nécessaires pour identifier le protocole optimal pour la préservation d’un composant cellulaire particulier ou l’organisation des protéines. Heureusement, un certain nombre de protocoles supplémentaires pour la fixation Drosophila spermatocyte sont également disponibles18,28,29.

En conclusion, nous avons décrit des méthodes polyvalentes pour la préparation des testicules de Drosophila pour l’analyse vivante et fixe de cellules de la méiose de spermatocyte. Les points forts spécifiques de cette approche expérimentale comprennent l’analyse de la division cellulaire dans les tissus intacts, l’imagerie à haute résolution des grandes cellules et l’intégration avec les outils génétiques Drosophila. Les expériences utilisant la méthodologie ont le potentiel d’apporter des contributions importantes à notre compréhension de la façon dont la division cellulaire s’intègre aux mécanismes complexes de développement des tissus et d’homéostasie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage du ministère de la Défense à J.T.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5" Dissecting Probe Fisher 08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet Fisher 13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9703-100
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides Fisher 12-544-2 Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100 mL
Lumox Dish 50 Sarstedt SAR946077410 Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass Fisher 12-541-B 22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade Electron Microsocopy Sciences 15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides Fisher 12-549-5 Slides used for dissections
PYREX Spot Plates Fisher 13-748B 9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium Fisher 21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm EMD Millipore SLGS033SB
Triton X-100 Fisher BP151-500
Vectashield Vector Labs H-1000 Microscopy mounting medium

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References

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