エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定

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Summary

ここでは、線虫C.エレガンスにおける細胞タンパク質毒性ストレス応答を、蛍光転写レポーターの活性化を測定し、生理学的ストレスに対する感受性をアッテルすることによって特徴付ける。

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Bar-Ziv, R., Frakes, A. E., Higuchi-Sanabria, R., Bolas, T., Frankino, P. A., Gildea, H. K., Metcalf, M. G., Dillin, A. Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans. J. Vis. Exp. (159), e61001, doi:10.3791/61001 (2020).

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Abstract

生物は環境の変動や細胞内恒常性の変化に晒されることが多く、タンパク質や生理学に有害な影響を及ぼす可能性があります。したがって、生物は損傷を修復し、恒常性を維持するために捧げられた標的と特定のストレス応答を進化させてきた。これらのメカニズムには、小胞体の展開されたタンパク質応答(UPRER)、ミトコンドリア(UPRMT)の展開されたタンパク質応答、熱ショック応答(HSR)、酸化ストレス応答(OxSR)が含まれる。ここで示すプロトコルは、線虫、C.エレガンスにおけるこれらの経路の活性化とその生理学的影響を検出し、特徴付ける方法を記述する。まず、経路特異的蛍光転写レポーターの使用について、迅速な細胞特性評価、薬物スクリーニング、または大規模な遺伝子スクリーニング(例えば、RNAiまたは変異型ライブラリー)について説明する。また、相補的で堅牢な生理学的アッセイが記載されており、これは特定のストレッサーに対する動物の感受性を直接評価するために使用することができ、転写記者の機能的検証として役立つ。これらの方法を組み合わせることで、細胞の迅速な特徴付けと、内部および外部のプロテオ毒性摂動の生理的効果を可能にします。

Introduction

生物が細胞内および細胞外環境の変化に対応する能力は、その生存と適応にとって極めて重要である。これは、細胞の完全性を確保する多数の保護経路を介して細胞レベルで達成される。多くの細胞成分がストレス関連の損傷を受ける一方で、細胞ストレス応答の主な関与の1つは、細胞プロテオームの恒常性を修復し、保護することです。しかし、タンパク質をオルガネラと呼ばれる特別な構造に分体化することは、細胞内のすべてのタンパク質が適切に折り畳まれ、機能することを保証するために、1つの一元化された形態のタンパク質品質管理に頼ることができないため、細胞にとって課題となっています。したがって、タンパク質の摂動に対処するために、オルガネラは、誤って折り畳まれたタンパク質を感知し、そのコンパートメント内のストレスを軽減しようとしてストレス応答を活性化することができる専用の品質管理メカニズムを進化させました。例えば、細胞質は熱ショック応答(HSR)に依存し、小胞体(ER)およびミトコンドリアはコンパートメント特異的に展開されたタンパク質応答(UPR)に依存する。OxSRは活性酸素種(ROS)の毒性作用を緩和する役割を果たす。各ストレス応答は、細胞の課題と環境侮辱の存在下で引き起こされ、調整された転写応答を誘発する。これらの応答の特徴は、適切なオルガネラに標的となる誤って折りたたまれたタンパク質(シャペロンなど)を再折り畳む分子を合成すること、またはタンパク質分解によって損傷したタンパク質を除去することを含む。これらのストレス応答を活性化しないと、損傷したタンパク質の蓄積、細胞機能障害が組織の全身障害に伝播し、最終的には生物の死が生じる。さまざまなストレス応答の機能と調節は、他の場所でレビューされています1.

細胞ストレス応答の調節と活動に関する多くの洞察は、遺伝子研究における多細胞モデル生物である線虫、カエノハブディティス・エレガンスに起因している。線虫は、細胞レベルでのストレス応答の活性化を研究するだけでなく、生物レベルでも研究することができます。線虫は、遺伝的摂動や薬物や汚染物質への暴露が成長と生存に及ぼす影響を研究するために使用されてきました。迅速な生成時間、イソジニー、透明性、遺伝的な難易度、および実験中の使いやすさは、そのような研究に最適です。さらに、ストレスに対する比較的迅速な生理学的反応(数時間から数日の間)と細胞経路の進化的な保全は、線虫をストレス耐性を研究する上で顕著なツールにします。

C.エレガンスを成長させる食料源として使用される2つの一般的に使用される大腸菌株があります:標準OP50、ほとんどの実験が歴史的に行われてきたB株2とHT115、ほぼすべてのRNAi実験3、44に使用されるK-12株。3OP50 と HT115 細菌の食事の間に有意な違いがあることに注意することが重要です。.これらの異なる細菌源の増殖は、代謝プロファイル、ミトコンドリアDNAコピー数、および寿命5を含むいくつかの主要なフェノタイプに大きな違いを引き起こすことが示されている。これらの違いのいくつかは、OP50細菌の増殖に関連するビタミンB12欠乏症に起因し、ミトコンドリア恒常性の欠陥および病原体およびストレスに対する感受性の増加をもたらす可能性がある。これらの現象型のすべては、高レベルのビタミンB126を有するHT115細菌の増殖によって緩和することが示されている。したがって、生理的ストレス応答に関するすべての実験は、RNAi条件の必要性に関係なく、HT115細菌に対して行われることをお勧めします。しかし、OP50上で動物を維持し易いため、ここで説明する実験パラダイムの有意な違いは、OP50上で維持されたワームでは検出されなかったため(すなわち、逮捕または逮捕せずに孵化後の孵化)、全ての標準的な増殖(すなわち、動物の維持および増幅)を行うことができる。

ここで、2つの機能的方法を用いた細胞ストレス応答の活性の特性評価について説明する。提示されるプロトコルは、主に細胞ストレス応答とタンパク質恒常性への影響に焦点を当てていることに留意すべきである。まず、蛍光転写レポーターが利用され、異なる細胞ストレスに応答して特異的に活性化される内因性遺伝子プロモーターによって調節される。これらの蛍光転写レポーターは、ストレス応答のネイティブの一部である特定の遺伝子の転写誘導に基づいています。例えば、HSP-4は、ヒトシャペロンHSPA5/BiPに対する熱ショックタンパク質オルソパチスであり、ER-ストレス時に活性化され、そのストレスを軽減するためにERに局在する。ERストレスの条件(例えば、ツニカマイシンへの曝露)は、緑色蛍光タンパク質(GFP)を、hsp-4プロモーターの調節下に置き、線虫7の大粒子流細胞量を用いて蛍光顕微鏡法または定量的に測定して評価できるように高レベルで合成される。同様に、ミトコンドリアシャペロンのプロモーターは、hsp-6(哺乳動物HSPA9に対するオーソリン)、UPRMT8の活性化を監視するために利用され、そして、細胞質シャペロンhsp-16.2のプロモーター(ヒト結晶性α遺伝子に対する直交性)はHSR9の活性を評価するために使用される。これらのレポーターは、様々な摂動に応答して活性化された経路の迅速な特徴付けを可能にする。

多くの場合、ここで紹介するレポーターは、ストレス応答の活性化の質的な出力を提供する顕微鏡を使用して画像化されます。しかし、イメージング技術は、上記の記者の強度と組織位置の両方に関する情報を提供するが、その定量は必ずしも正確または堅牢ではない。イメージング解析ツールを用いて蛍光活性化を定量することは可能であるが、これらの方法は、比較的低いスループットであり、サンプルサイズが小さいため、画像化された動物の数が比較的少ないことからである。大量の動物を得る容易さと能力は、C.エレガンスを、大きな粒子フローサイトメーターを使用して蛍光ストレスレポーターの活性化をアッセイする理想的なモデルシステムにします。大粒子フローサイトメーターは、多くの生きた動物のサイズと蛍光に基づいて記録、分析、並べ替えが可能です。この方法を使用すると、数千のワームに対する蛍光強度、サイズ、および空間(2D)情報を取得することができます。システムはFlowPilotを使用して制御され、測定されたパラメータのリアルタイムデータ取得および分析が可能になる。ここでは、大粒子流サイトメーターを用いた顕微鏡イメージングと定量分析の両方の方法が、応力応答の活性化を測定する方法として提供されている。

レポーター分析以外にも、動物のストレスに対する感受性や抵抗性は、生理学的ストレスアッセイを用いて測定することができる。これは、特定の細胞ストレス経路を活性化するストレスの多い環境に動物をさらすことによって達成されます。ここでは、特定のタイプのストレッサーに対する全動物の感受性を測定するためのいくつかの方法が提供される。

ERストレスは、化学物質、ツニカマイシンを用いてC.エレガンスに適用され、これはN結合型グリコシル化をブロックし、ER10中に誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積を引き起こす。C.エレガンスでは、チュニカマイシンへの曝露時の成長は、ER機能の大きな摂動をもたらし、寿命11を有意に低下させた。チュニカマイシン含有プレート上の動物の生存率を測定することにより、動物のERストレス感受性を定量化することができる。例えば、異所性UPRER誘導を有する動物は、ERにおけるタンパク質ミスフォールディングストレスに対する耐性が増加し、野生型動物12と比較してチュニカマイシン曝露時の生存率が増加する。

酸化およびミトコンドリアストレスは、化学薬品であるパラコートに動物を曝露することによってC.エレガンスに適用される。パラコートは、一般的に使用される除草剤であり、これはミトコンドリア13で特にスーパーオキシド形成を引き起こす。ミトコンドリア由来の活性酸素種(ROS)の特異的な局在化により、パラコートアッセイは「ミトコンドリア」ストレスアッセイとしてよく使用されます。しかしながら、スーパーオキシドは、ミトコンドリア・スーパーオキシド・ディスムターゼ(SODs)14によって14速やかに過酸化水素に変換される。過酸化水素は、その後、ミトコンドリアから拡散し、細胞の他の区画で酸化ストレスを引き起こす可能性があります。したがって、パラコート生存アッセイは、ミトコンドリアと酸化ストレスの両方に対する感受性を測定すると説明する(他の酸化ストレスアッセイは15を見つけることができる)。

耐熱アッセイは、高温で動物を配置することによってC.エレガンスで行われます。線虫の周囲温度は~15~20°Cで、熱応力は25°C16,17,17以上の温度で誘発される。耐熱アッセイは、一般に、30〜37°Cの範囲の温度で行われ、動物はこの温度で大きな細胞欠陥を示し、生存アッセイは24時間16、18,18時間以内に完了する。ここでは、耐熱性アッセイを行うための2つの代替方法が提供されています:34°Cでの成長と37°Cでの成長。RNA干渉または化学薬物ライブラリーを用いて、標準遺伝子のノックダウンと組み合わせると、ここで提示されるプロトコルを利用して、大規模スクリーンを実行することができます。

このプロトコルは、C.エレガンスの成長とイメージングの準備(セクション1および2)、蛍光顕微鏡(セクション3〜5)を用いた転写記者のイメージング、大粒子流サイトメーター(セクション6)を用いた記者の定量測定、およびC.エレガンスのストレス感受性を測定する生理学的アッセイ(セクション7)の4つの広範な手順に分けることができる。

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Protocol

1. 温度の標準的な成長条件 & OP50 対 HT115

  1. 標準の成長と拡大
    1. OP50の培養物をLB(表1)または周囲温度(〜22〜25°C)で24〜48時間の場合に選択した同等の培地で成長させます。OP50として室温で細菌を成長させるのはウラシル・オーソストロフであり、37°Cで増殖した場合の戻り物(例えば、サプレッサー変異体)の発生率が高い。OP50培養物の長期保存は推奨されません(4°Cで最大1週間)。
    2. 実験のために動物を拡大するために100mmプレートに100mmの培養物と1mLの飽和OP50培養を維持するために、飽和OP50培養液の体積を60mm NGMプレート(表1)にシードします。
    3. ベンチトップで皿を一晩乾かします。
      注:100 mmプレートは、特に非通気プレートを使用する場合は、乾燥するためにより多くの時間が必要な場合があります。すべてのC.エレガンプレートを4°Cに保管した気密容器に保管してください。プレートの乾燥が発生するので、6ヶ月以上前のプレートを使用しないでください, これは、プレートの異なる浸透圧と硬さのためにプレート上の動物の生理学を変更します.
    4. 標準的な維持のために、10-15の若い動物(卵、L1、またはL2段階)を60mmプレートに移動させるが、より低い胎児性を有する突然変異体またはトランスジェニック動物を扱うならば、より多くを動かすことができる。発達上または胎児性の欠陥を有する動物のために、ストックの損失を防ぐために動物のより可変的なプールをチャンクする。15 °Cで保管する場合は、毎週動物を移動します。20°Cの場合は、3〜4日ごとに動物を移動します。
    5. 動物の新鮮な解凍を25〜30回の通路(週に1回移動し、15°Cに保つ場合は6ヶ月)を行います。
    6. 拡張のために、膨張のために100のmm版に完全な60のmm版を塊。参考として、野生型の胎児性を持つ動物は、完全な60mmプレートを4ths-6thsに切断し、20°Cで2日間、または15°Cの大きなプレートに3日間チャンクして、飢餓に達することなく完全な100mmプレートを作成することができます。

2. 漂白を用いたワームのステージング/同期

  1. ワームを同期するための漂白プロトコル
    1. M9(表1)を使用して寒天プレートからグラビッドワーム(卵でいっぱいの大人)を洗い流す。漂白を介して連続した同期ラウンドで重大な遺伝的ドリフトが起こり得るため、ワームの非同期集団(すなわち、ステップ1.1.6からのチャンクワーム)から実験のための漂白剤に始める。
    2. ガラスピペットを使用して、ワーム/M9混合物を15 mLの円錐形チューブに移動します。ワームのいくつかのプレートは、単一の15 mL円錐管に収集することができます。
    3. 1,000 x gで30 sのスピン動物。吸引M9上清。汚染の深刻な量や細菌の大きな塊がない限り、残留細菌を洗い流す必要はありません。この場合は、M9で数回のスケーを行います。
    4. 漂白液の新鮮なストックを準備する(表1)。漂白液は4°Cで数日間保つことができますが、非効率的な漂白剤として作りたての漂白液を使用すると、不均一な漂白が発生し、すべてのワームの死体を排除する前に卵に損傷を与える可能性があります。
    5. 動物に2〜10mLの漂白液を加える(動物ペレットの約0.1mLごとに約1mLの漂白剤溶液)。漂白剤とワーム混合物を〜5分間反転します(10分を超えないでください。漂白時間は変化する可能性があり、ラボごとに特に滴定する必要があります)。ワームの死骸をより速く溶解し、卵の最適な保存を助けるために激しく振る。定期的に解剖顕微鏡の下を見るか、または成虫の死体が完全に溶解し、卵だけがチューブに残っているときに観察するために円錐形のチューブを光に置きます。
    6. 卵を30sで1,000xggで回転させて、上清を吸引する。卵は完全性を乱すことなくワームよりも速く遠心分離することができるので、遠心分離機の速度がわからない場合、卵は生理学に影響を与えることなく最大2,500 x gで回転することができます。
    7. M9を15 mLまで加え、チューブを反転して卵から漂白剤を取り除きます。
    8. 手順 2.1.6-2.1.7 (洗浄/ペレットプロセス) 2~3 回繰り返して漂白剤を除去します。
    9. ピペットエッグ/M9はプレートに混ぜ、実験のために15〜20°Cで成長します。使用するワームの数を測定するには、5μLの卵混合物を寒天プレートまたはスライドにピペットし、卵数を5で割って体積1μL当たりの卵数を決定することで、おおよその卵数を実行します。3つの独立したカウントの平均化は、精度を向上させる可能性があります。飢餓を避けるために、プレートごとの推奨卵数の表を表2に示します。
    10. 必要に応じて、L1は20°Cの回転子に卵/M9ミックスを24時間まで置くことによって、より緊密な時間同期のために動物を逮捕する。野生型動物の場合、L1が最大48時間逮捕されたときに動物生理学の欠陥は検出されなかった。しかし、飢餓に敏感な変異体(例えば、リソソームまたはオートファジー変異体)はL1の逮捕で非常に悪く、したがって飢餓に敏感であることが知られている突然変異体に対してこの同期方法を実行することは推奨されない。L1を逮捕できない動物に対して、より緊密な同期化が必要な場合は、セクション2.2に記載されている卵子レイ法を使用してください。
  2. ワームを同期するための卵の敷設プロトコル
    注:漂白の代替方法として、卵子の横置きのアッセイを行うことができます。卵子は、動物の漂白が十分に近い同期を提供しない場合に使用され、成虫動物の卵嚢内の卵は8〜12時間離れている可能性があります。実験パラダイムでは、動物が可能な限り密接にステージングされるが、L1逮捕が不可能な場合(例えば、飢餓変異体では)、卵子敷設アッセイが推奨される。しかしながら、卵子の議定書に関与する労働のために、大規模な実験を行うことは実現不可能である。
    1. 4-12 gravid大人(ステップ2.2.2後の注を参照)を標準OP50またはHT115シードのNGMプレートに置きます(細菌株に関する推奨事項については、上記のセクション1を参照)。実験の規模に応じて、複数のプレートを使用することができます。ステップ2.2の各プレートにいくつの動物がいるかを注意深く文書化してください。
    2. 実験のために所望の温度(15-20°C)に動物を4-8時間置く。
      注:動物がプレートに残っている時間数は、最初に産んだ卵と最後に産卵がどのくらい密接に同期しているかを決定するので、タイミングは必要に応じて調整することができます。インキュベーション時間が短いと、各動物が卵を産む時間が少なくなるので、十分な卵が産まれるように、より多くの動物をプレートに置く必要があります。実際の産卵率は、動物が正常化された産卵率ではなく産卵の短いバーストを通過する傾向があるため完全に正規化されていないが、動物1匹あたりの卵の平均率は、野生型の胎児性19を示す動物の卵/時間の平均値を推定することができる。1日目の成人期に動物を育てようとするとき、飢餓を避けるために卵子が1皿あたり100個の卵を持つ時間を取ります(プレートごとの推奨動物の詳細については表2を参照)。
    3. プレートから成虫の動物を取り除きます。動物が卵を産み続け、プレートの同期化された集団および/または飢餓をもたらすので、すべての成体動物がプレートから取り除かれるようにしてください。

3. 転写レポーターのイメージングのためのワームの成長条件

  1. ワームの増殖
    1. HT115の接種細菌培養は、pL4440 RNAiプラスミド(EV)を有し、または所望の標的遺伝子に対してRNAiカセットを100μg/mLカルベニシリンおよび20μg/mLテトラサイクリンを補ったLB培地に運ぶ。
    2. 培養物を一晩(約16時間)に振る振る37°Cインキュベーターで飽和させる。
    3. 200 μLの飽和細菌培養液と100mm NGM RNAiプレートを1,000 μL飽和細菌培養で発見。暗闇の中で一晩(約22°C)の周囲温度(約22°C)で乾燥させます(アルミ箔でゆるやかに覆われています)。
    4. 蛍光レポーターを運ぶトランスジェニックワームの同期された集団(完全なリストについては表3を参照)を、選択した細菌を播種したNGM RNAiプレートに配置します。
    5. 以下に概説するように、特定の記者のために必要な段階に15-20 °Cで成長します。
  2. 実験のためのワームのステージングに関する考慮事項
    1. L4動物を必要とするアッセイを除き、成人の1日目に転写記者の実験を行う。ワームアトラスによると、L4動物は卵期から20°Cで約2.5日(〜56時間)の成長を得る(www.wormatlas.org)。
    2. 「1日目大人」の場合、卵をめっきした後20°Cで約3〜4日(〜65〜96時間)の成長で動物を使用する。
      注:この広い範囲は次のように説明されています:20°Cで〜65時間は、動物が真の「成人期」状態である「産卵」に達したときです。96 hは、動物がワームアトラスが「産卵最大」と表現するものに入るとき、それは大人がグラビッドな大人であり、完全な卵嚢を持っているときです。これは、動物が1日目よりも古いと説明され、違いを表示し始める可能性があり、したがって、ここで説明するプロトコルはすべて、早ければ65時間から96時間遅くから始まるこの「1日目」段階で開始することをお勧めします。ここで説明するアッセイについては、この〜65〜96時間のウィンドウで動物を使用する場合、大きな違いは観察されなかった。
    3. 単一の実験の反復の場合、より強い再現性のために同様のタイムポイントを使用してください(例えば、卵をめっきした後〜65時間または〜96時間ですべての実験を行います)。
      注:トランスジェニック動物や変異体の一部は、成長率が遅くなります。このために、2 つの推奨事項があります。1)動物が同時に実験を行うために異なる時間に漂白することができる時間をずらした同期を使用する。これは、アッセイの技術的変動が同期アッセイから生じる技術的変動性よりも大きい場合に推奨されます(例えば、生存アッセイは、同時に実行しないと長期間実行される可能性があります)。2)動物を同時に漂白することができるが、アッセイ自体が異なる時間に行われる、ずらした分析を使用する。これは、固有の変動性を持たない非常に単純なアッセイ(例えば、RNAi-応力応答の誘導)に推奨されます。

4. 応力応答の誘導

  1. UPRERのアクティブ化のための読み出しとして hsp-4p::GFP を使用する
    1. RNAiを用いたERストレスの誘導
      1. NGM RNAiプレート上に目的の遺伝子を標的とするRNAi細菌で発見されたプレートを準備する (表 1) セクション 3のように.EV を基底 UPRERレベルとタグ 335の RNAi ノックダウンのコントロールとして使用します (ER の生体タンパク質の N 結合型グリコシル化酵素;RNAiノックダウンは、ERストレス下でのUPRERの活性化のための肯定的なコントロールとして、ツニカマイシン治療と同様の効果を有する。
      2. セクション 2 で説明されている方法を使用してhsp-4p::GFPレポーター動物を同期します。
      3. 表2で推奨される基準を使用して、卵をRNAiプレートにプレートします。
      4. 卵を20°Cで約3〜4日間(〜65〜96時間)インキュベートし、成人の1日目に実験を行う。UPRER実験では、異なる温度で成長した場合のhsp-4::GFPレポーターの基底蛍光に違いがあります。そのため、全ての実験を20°Cで行う。
    2. 化学物質を用いたERストレスの誘導
      1. hsp-4p::GFPレポーター動物は、セクション2に記載の方法を使用して、動物がL4段階に達するまで20°Cで成長します。M9のチューブに動物を移す。ワームが落ち着くようにし (重力で約 2~3 分、1,000 x gで 30 s スピン) してから M9 を除去します。
      2. M9で25 ng/mLにチューニカマイシンを希釈(1mg/mLストックから1:40希釈)。コントロールとして、M9でDMSOの同等の体積を希釈する。
      3. 25 ng/mL tunicamycin/M9を加えるか、または制御DMSO /M9溶液をワームに(1.5 mLチューブに400-500 mL、15 mL円錐管に2 mLを使用する)。回転プラットフォーム上で20°Cで3〜4時間インキュベートします。
        注:チュニカマイシンは、ワーム/M9ミックスに直接希釈することができます。
      4. ワームが解決し、M9/TM溶液を取り除き、M9の1 mLで洗浄することを許可します。
      5. 動物をNGMプレートまたはNGM RNAiプレートに移し、蛍光顕微鏡検査を行う前に一晩(または〜15〜20時間)、成人期の1日目に到達することを可能にします(セクション5)。GFP の検出可能なレベルが蓄積できるように、夜間の回復が実行されます。
      6. あるいは、25 ng/μLチュニカマイシンを含む寒天プレートにL4動物を16〜24時間移動させることでhsp-4p::GFPを誘導する。これは、ストレスの長い持続時間のためにhsp-4p::GFPのはるかに堅牢な誘導を有し、したがって、ダイナミックレンジは、上記のアッセイよりもはるかに低い。
  2. UPR MT のアクティブ化のための読み出しとしてhsp-6p::GFPを使用する
    1. RNAiを用いたミトコンドリアストレスの誘導
      1. セクション 4.1.1 と同じプロトコルに従って UPRMTを活性化しますが、cox-5b/cco-1 (シトクロム c オキシダーゼ サブユニット 5B; ノックダウンは電子輸送鎖活性を阻害する) などのミトコンドリア遺伝子の RNAi ノックダウンを使用する以外。電子輸送鎖機能の摂動によるUPRMT活性化のために、RNAiノックダウンは初期開発20の間に行われる必要がある。従って、これらの実験のためにハッチからRNAiを行う。
    2. 化学薬品を用いたミトコンドリアストレスの誘導
      1. RNAi細菌で発見されたプレートを準備し、セクション3のように目的の遺伝子を標的にします。RNAiノックダウンを伴わない実験でもHT115細菌を使用してください(セクション1参照)。NGM RNAi プレート (または NGM RNAi + DMSO0.2) と NGM RNAi + アンチマイシン A プレート (表 1)の両方が、ステップ 4.2.2.5 用に準備されていることを確認します。
      2. hsp-6p:::GFPまたはhsp-60p::GFPレポーター動物を同期するセクション 2 で説明する方法を使用します。
      3. 表2で推奨される基準を使用して、選択した種付きプレートに卵をプレート。抗マイシンAはDMSOに溶解しているので、動物を孵化からNGM RNAi+ DMSO0.2プレート上で成長させる。
      4. 卵を20°Cで2日間(〜56時間)L4段階にインキュベートする。あるいは、15°Cで3日間(〜75時間)で動物を成長させる。
      5. ワームをNGM RNAi + DMSO0.2プレートからNGM RNAi + アンチマイシンAプレートまたはNGM RNAi + DMSO0.2プレートにコントロールとして移動します。ワームは小規模な実験用ピックで手動で移動できますが、大規模な実験では、M9で動物を洗浄し、遠心分離、吸引M9、NGM RNAi +アンチマイシンAプレートへのメッキを行うことをお勧めします。
      6. ワームを追加で培養する〜20時間および1日目の成人(セクション5)で画像。
  3. 酸化ストレス応答の読み出しとしてgst-4p::GFPを使用する。
    1. RNAiを用いたOxSR誘導
      1. あるいは、セクション 4.1.1 で説明されているプロトコルを使用して、wdr-23の RNAi ノックダウンを使用してgst-4p::GFPを誘導します(skn-1の負のレギュレータをコードします。
    2. 化学酸化剤テルトブチルヒドロペルオキシド(TBHP)への暴露を使用してOxSRを誘導する
      1. RNAi細菌で発見されたプレートを準備し、セクション3のように目的の遺伝子を標的にします。RNAiノックダウンを伴わない実験でもHT115細菌を使用してください(セクション1参照)。
      2. gst-4p::GFPレポーター動物を同期させる方法は、セクション2で説明されている方法を使用します。
      3. 表2で推奨される基準を使用して、選択した種付きプレートに卵をプレート。薬物治療プロトコルは動物の>10-20%の損失をもたらすので、必要以上に多くのプレートを準備してください。イメージングの場合は、>100匹の動物から始め、並べ替えの場合は、>1,000匹の動物から始めます。
      4. 卵を20°Cで2日間(〜56時間)L4段階にインキュベートする。あるいは、15°Cで3日間(〜75時間)で動物を成長させる。
      5. L4動物をプレートから洗い、条件ごとに2つの15 mL円錐管に分割します。吸引量は少なくとも1 mLに減少し、2 mM TBHPの作りたての等量を追加します。少量の体積は、回転時にワームの重大な死を引き起こす可能性がありますので、少なくとも2 mLに総液体量を使用してください。プレートからの残留細菌は、インキュベーション中にワームがオーバースターブしないようにするのに役立ちますので、薬物治療の前に洗浄しないでください。
      6. 20°Cで4時間、回転器にワームをインキュベートする。
      7. 1,000 x gで紡糸し、M9+ TBHPミックスを吸い込み、M9の15 mLに交換して、ワームを洗浄します。2回目の洗浄を繰り返します。
      8. EV RNAi上のプレートワームは、20°Cで一晩(〜16〜24時間)回復する。一致するRNAiでワームを回収できますが、EV RNAiで回収しても有意な違いは見られなかったため、実験的なセットアップを容易に行うことができます。回復後の大人1日目の画像を撮る。
        注: 一晩の回復は、GFP の検出可能なレベルが蓄積できるように実行されます。この回復がなければ、検出可能なGFP信号は存在しない。短期的な回復が望ましい場合には、セクション4.3.3に記載のアッセイを使用することができる。
    3. 化学酸化パラコート(PQ)への曝露を用いてOxSRを誘導する
      1. セクション 4.2.2 のすべての手順を繰り返して、条件ごとに 15 mL 円錐管で L4 gst-4p::GFP動物を 2 バッチ取得します。
      2. 吸引量は少なくとも1 mLに減少し、100 μM PQの新しく作られた等量を追加します。4.3.2.5 と同様に、最小体積は 2 mL を推奨します。
      3. 20°Cで2時間、回転器にワームをインキュベートする。
      4. 1,000 x gで紡糸し、M9+ PQミックスを吸い込み、M9の15 mLに交換して、ワームを洗浄します。2回目の洗浄を繰り返します。
      5. EV RNAi上のプレートワームは、20°Cで2時間回復し、その後、すぐに回復後に画像を撮る。
        注:回復の2時間は、GFP誘導を可視化するために必要な最小限の回復でした。
  4. HSR アクティベーションの読み出しとして hsp-16.2p::GFP とhsp-70p::GFPを使用します。
    1. 高温への暴露を使用してHSRを誘導する
      1. RNAi細菌で発見されたプレートを準備し、セクション3のように目的の遺伝子を標的にします。RNAiノックダウンを伴わない実験でもHT115細菌を使用してください(はじめに参照)。
      2. hsp-16.2p::GFPまたはhsp-70p::GFPレポーター動物を同期する セクション 2 で説明する方法を使用します。
      3. 表2で推奨される基準を使用して、選択した種付きプレートに卵をプレート。サンプルの半分が熱ショック誘導のために高温にさらされ、残りの半分が非熱衝撃制御として機能するので、必要なプレートの数を2倍に準備してください。
      4. 卵を20°Cで約3〜4日間(〜65〜96時間)インキュベートし、成人の1日目に実験を行う。熱ショック実験では、15°Cと20°Cの熱ショックを経験している動物の間にわずかな違いしか存在しないので、15°Cでワームを増殖させないでください。
      5. 実験用動物群を34°Cインキュベーターに移動し、2時間にわたってプレートを単層としてインキュベーターに配置します(すなわち、プレートの積み重ねなし)、プレート全体の熱の最速かつ最も等しい分布を確保します。
      6. 熱ショックを受けた動物を20°Cインキュベーターに移動して2時間回収し、すぐに画像を画像化します(セクション5を参照)。動物は、より高いGFP誘導のために必要に応じて長く回収することができる。
        注:回復の2時間は、GFP誘導を可視化するために必要な最小限の回復でした。

5. ステレオ顕微鏡または低倍率広視野/複合顕微鏡を用いたイメージング

  1. 蛍光顕微鏡用ワームの調製
    1. 標準的なNGMプレートの上に100 mMナトリウムアジドのピペット5-10 μL(すなわち、細菌なし)。
      注:アジドナトリウム濃度は10mMまで低く下がることができますが、最も堅牢な固定化は100 mMのアジドナトリウムで観察され、蛍光シグナルに対する検出可能な影響はありません。
    2. 解剖顕微鏡の下で、実験プレートから10〜20匹の動物を選び、アジドナトリウムのスポットに移します。動物はアジドナトリウムに着陸した直後に動きを止めるべきであり、アジドナトリウム自体は数秒以内に蒸発する。
    3. アジドナトリウムが蒸発したら、所望のイメージングセットアップに動物を並べています。すべての動物のために同じ方向に前部および後部側と並んで動物を動かします。すぐに動物をイメージします。
      注:アジドナトリウムで麻痺した後、表3の転写記者のいずれにも最大15分間、レポーターシグナルの変化は認められなかった。
  2. 実体顕微鏡による画像取得
    注:このプロトコルのために、Leica DFC3000G単色CCDカメラ、標準ライカGFPフィルタ(EX 395-455、EM 480 LP)とLAS Xソフトウェアを搭載したLeica M205FA顕微鏡が使用されました。露出時間の推奨設定は、表 4を参照してください。
    1. LAS X プログラムを起動します。
    2. 新しいプロジェクトを開始する:取得タブを開き、[プロジェクトを開く]をクリックし、[フォルダ]をクリックして新しいプロジェクトを開きます。このプロジェクトの名前を変更するには、フォルダを右クリックし、[名前の変更]までスクロールするか、または F2キーを押します。取得タブには、露出時間を調整するオプションと、必要な設定に合わせてズームするオプションもあります。
    3. 顕微鏡の目的の下にワームサンプルを配置し、蛍光漂白を最小限に抑えるために明視野設定を使用してワームの正しい焦点を見つけます。サンプルの中心は、卵の線がはっきりと見え、あいまいではないところです。露出時間、ズーム、フォーカス、および明視野コンデンサーを希望の設定に設定します。
    4. [イメージのキャプチャ]ボタンを使用して画像を取得します。
    5. すべての生画像とメタデータを保存するので、イメージを.lif(ライカイメージファイル)形式で保存します。TIFF は、イメージ (またはプロジェクト) を右クリックし、[名前を付けて保存] オプションの[TIFF]をクリックしてエクスポートすることもできます。これは、すべてのチャンネル(例えば、明視野とGFP)を任意の変更とともに保存します(例えば、コントラストが調整された場合、これはTIFFに保存されます)。
  3. 蛍光画像の定量分析
    1. 定量分析を行う場合は、3D画像を撮影してください。これは、右上に「z」というラベルの付いた z セクションオプションをクリックして実行します。このボックスが赤の場合、Z セクションはアクティブになります。
    2. 調整可能なオプションの左下にある範囲とスライスの厚さを選択して、Z セクションを最適化します。可能な限り、[システム最適化]ボタンを使用して最適な設定を行います。
    3. イメージをキャプチャし、上記のセクション 5.2 に記載されているイメージを保存します。簡単に測定するためにそれらの間にスペースとワームを並べ替えます。
    4. TIFF イメージを、選択したイメージング ソフトウェア (ImageJ など) にインポートします。
    5. ImageJ の場合は、[分析] メニューの [計測値の設定] を選択します。以下を確認してください: 面積、平均グレー値、統合密度、表示ラベル。
    6. ROI (対象領域) ツールを使用して、ROI を描画します。各ワームを個別に測定します。[分析] メニューの [メジャー ] を選択するか、Mキーを押します。ワームがない背景に ROI を描画し、同じ方法で背景を測定します。[結果] ウィンドウに表示される測定値をコピーまたは保存します。
    7. 各測定された ROI の統合密度から背景の統合密度を引きます。ROI の背景の強度は、背景平均グレー値と描画された ROI の面積の積として定義されます。
  4. 化合物/広視野顕微鏡を用いた画像取得
    注:化合物/広視野顕微鏡を使用した転写レポーターのイメージング用に、このプロトコルは、オリンパス4xプランフルオアイトNA 0.13対物レンズ、標準オリンパスFITCフィルタ(ex 470/40;em 525/50;を装備した回転ECHO R4顕微鏡を使用します。DM 560)、カメラ用のiPad ProとECHOソフトウェアを駆動します。露出時間の推奨設定は、表 4を参照してください。
    1. タッチパッドを使用してコントロールプログラムを起動します。新しいアルバムとファイル名を作成します。
    2. 対物レンズの下にプレートを配置します。ベースライン(EV/制御治療)と正のコントロールを使用して、信号が見えるが飽和しないように、露光時間と蛍光強度を設定します。
    3. 明視野画像とGFP/FITC画像を保存します。

6. 大粒子フローサイトメーターを用いたレポーターの定量測定

注: 大粒子フローサイトメーター分析のためのワームの成長と準備は、蛍光イメージングのためのワームの調製のためのセクション1-5と同じパラダイムに従うことができます。一部の動物は操作中に失われ、すべての動物が定量中にフィルタリング基準を満たすわけではなく、フローサイトメーターによって適切に読み取られていない動物もいるので、条件ごとに>500匹の動物を使用してください。M9溶液の5-10 mLでプレートを15 mLの円錐形チューブに選別し、その後のフローサイトメーターでの選別のために動物を洗います。

  1. 大きなパーティクル フロー サイトメーターを使用した並べ替え設定
    1. フローサイトメーターをオンにする前に
      1. シース液のボトルが空でないことを確認します。シース液中に少量の洗剤があり、取得時に泡が発生する可能性があるので、ソーターを使用する前に少なくとも数時間前に250xストックからシース液を調製します。
      2. すべての廃棄物コンテナがいっぱいにならないようにします。
    2. フローサイトメーターをオンにする
      1. エアコンプレッサーをオンにします。[自動] にします。圧力計をチェックしてください - それは約30 psiでなければなりません。
      2. 楽器の電源を入れます。計測器の左側にある電源コードの横にある電源スイッチを使用します。
      3. レーザーをオンにします。488 nmの光源は通常、ほとんどの実験で十分ですが、赤色蛍光に高い励起が必要な場合は561nmの光源を使用する必要があります。
      4. フローパイロットソフトウェアを開きます。器械は異なった弁の切り替えの連続のクリックをするべきである。
      5. ソフトウェア ウィンドウでレーザーをオンにします。[実行] をクリックして、アルゴンレーザーコントロールポップアップウィンドウでレーザーを開始します。これにより、レーザーがオンになり、約12 mWに達するはずです。488光源レベルは約12まで上がります。
      6. [完了] をクリックしてウィンドウを閉じます。
    3. 処理を進める前にソフトウェアをチェックする
      1. 圧力計を確認する - ウィンドウの下部に表示される 4 つの圧力値を確認します。値は元の設定の周りにある必要があります(Sheath 5.5-5.7;サンプル 5.7-6.0;ソーター 3.1-3.3;8.5-8.7をきれいにしてください。類似している場合は、[圧力OK]の横にあるチェックボックスをオンにします。
      2. 流体を確認する - 流量セルを通るシース/サンプルの流れを妨げている気泡や破片がないことを確認するには、[クリーニング]を数回クリックします。
      3. シースの流量を確認する - このために、60 s.スイッチオフソートのためのシースを収集し、シースの流れを開始するために手動制御でオンシースを切り替えます。60 sのための15 mLの管で集める;流量は~9~10 mL/分である必要があります。
    4. フローサイトメーターの使用前清掃
      1. コレクションの「カップ」に10%漂白剤溶液の〜3〜5 mLを入れて、取得をクリックします。~30 s で実行し、[中止] をクリックして、真空で余分な値を削除します。
      2. 脱イオン水でコレクションの「カップ」をすすい、真空で取り除きます。2x を繰り返します。
      3. コプタス洗浄液の〜3〜5 mLをコレクション'カップ'に入れて、取得をクリックします。~30 s で実行し、[中止] をクリックして、真空で余分な洗浄液を取り除きます。
      4. 脱イオン水でコレクションの「カップ」をすすい、真空で取り除きます。2x を繰り返します。
      5. M9溶液の3-5 mLをコレクション'カップ'に入れて、取得をクリックします。~30 s で実行し、停止をクリックして、真空で余分な M9 溶液を除去します。
  2. ソーターでのサンプルの実行
    1. 目的の転写レポーターの最も明るい活性化を引き起こす条件に基づいて、レーザーPMTパワーとサイズの格子を調整します。推奨設定は、表 4を参照してください。
    2. 「カップ」に準備されたワームを追加します。[取得] をクリックします。すべての液体が機械に取り込まれていないことを確認するために見てください。これにより、フローサイトメーターが空気を取り込み、検出器に気泡が発生します。
    3. サンプルが少ない場合や十分な動物が収集されたら、[中止] をクリックします。
    4. [設定] をクリックして 、[ 設定 ] をクリックデータストレージ |ゲートのみ.これにより、サイズ制約に基づいてのみデータが保存されます。[ゲートを保存]をクリックし、ゲート データを保存します。データを消去するには、[消去] をクリックします。
    5. 脱イオン水でコレクションの「カップ」をすすい、真空で取り除きます。2x を繰り返します。
    6. 残りのサンプルと同じ手順 6.2.1 ~ 6.2.5 を繰り返します。
  3. キャリブレーション/品質管理 - 必要に応じて
    注:488レーザーを校正するために、制御42 μM GYR蛍光粒子を実行する必要があります。
    1. サンプルカップの上部にある金属リップを押して、エアチューブを取り外します。キャップを外し、注射器を使用してサンプルカップから液体を取り除きます。
    2. 使用前によくコントロール粒子のボトルを混合し、サンプルカップに数ミリリットルを追加します。キャップを閉じ、所定の位置がクリックされるまで押して空気を元に戻します。
    3. ソフトウェアで、[ツール] オプションを選択し、[コントロール パーティクルの実行] をクリックします。
    4. コントロール パーティクルの場合は、PMT 値を次の値にリセットします: GREEN - 325;イエロー - 365;赤 - 575。
    5. [取得] をクリックします。シースは、サンプルが続いてオンにする必要があります。ビーズがフローセルを通過し始めると、画面の下部に流量が表示されます。最適な場合、流量は 5/s ~ 15/s の間にする必要があります。流量が低すぎるかゼロの場合は、サンプルバルブを時計回りに物理的に回して流量を増やします。流量が高すぎる場合は、サンプルバルブを反時計回りに物理的に回して流量を減らします。
      注: 通常、ビード セーバー モードでは、500 個のビーズが読み取られた後、スイッチがオフになります。データを消去して、ビーズを再読み込みできます。
    6. 読み取りが完了したら、CV 値と同様に、5 つのパラメーターの単一のピークを確認します。分散係数 (CV) は <15% にする必要があります。また、3つの異なる蛍光チャネルのCV値が互いに近い値であることを確認してください。
    7. QC チェックの記録を作成する: [ファイル] タブで、[画面イメージとして保存] をクリックします。
  4. クリーニングとシャットダウン
    1. 真空を使用してサンプルカップからサンプルを取り除き、セクション4.1.4を繰り返します。
    2. 脱イオン水の〜3〜5 mLをコレクション'カップ'に入れて、[取得]をクリックし、〜30 sの実行を行い、[中止]をクリックします。サンプルカップに蒸留水を残します。
    3. サンプル回収カップと廃棄物ボトルを空にします。
    4. ソフトウェアをオフにします。[ファイル] タブで[終了]をクリックします。ポップアップ メニューで、[消去せずにオフにする] をクリックします。
    5. レーザーの電源を切り、機器の電源を切り、空気圧縮機の電源を切ります。ハッチを閉じて器具を覆います。

7. C.エレガンスにおけるストレス感受性を測定する生理学的アッセイ

  1. チュニカマイシン暴露を用いたERストレス感受性の測定
    1. セクション3のように目的の遺伝子を標的とするRNAi細菌で発見されたNGM RNAi DMSOプレートを準備します。RNAiノックダウンを伴わない実験でもHT115細菌を使用してください(セクション1参照)。NGM RNAi TM プレートもシードすることを忘れないでください (表 1を参照)。十分な量のプレートをシードする:NGM RNAi DMSOプレートの〜5〜7セットおよびNGM RNAi TMプレートの〜2〜3セットを計画してください。
    2. セクション2で説明した方法を使用して、選択した動物を同期させる。
    3. NGM RNAi DMSO に卵をプレートプレート選択のプレートは、表 2で推奨される基準を使用して選択したプレートをシードします。試料の半分がNGM RNAi TMプレートに移されるので、必要なプレートの数を2倍に準備してください。
    4. 卵を成人期の約3〜4日間(〜65〜96時間)に20°Cでインキュベートする。
    5. 1日目に、動物を別々のプレートに移して寿命を準備します。プレートを節約するには(TMコストが高いため)、条件ごとに15匹の動物の8プレートを使用し、条件ごとに合計120匹の動物を使用します。これは、スコアリングのためのプレートあたりの動物の管理可能な数を可能にし、いくつかの検閲であっても、統計的分析のための動物の十分な量を可能にします。
    6. 最初の5〜7日間、子孫が見えなくなるまで、毎日子孫から新しいプレートに成体動物を移動します。この段階では、ERストレス感受性に関連する死亡ではないため、袋に入れられた動物を検閲したり、陰陰性突起/爆発を示したり、プレートの側面を這い上がったりします。なお、TM治療は動物の逮捕を引き起こし、したがって2〜3日毎にこれらの動物の1-2の動きは、TM含有プレートの製造に関連するコストを最小限に抑えるのに十分である。野生型動物は、DMSOで〜15〜17日、チュニカンシンで12〜14日の平均生存率を有する。
    7. 動物が子孫の生産を停止した後、すべての動物が死んでいるか検閲されるまで、1〜2日ごとに寿命をスコアします。TMは、成人期の6〜14日目に毎日動物を治療し、より高い解像度を求める。
  2. パラコートへの曝露を用いたミトコンドリアと酸化ストレス感受性の測定
    1. RNAi細菌で発見されたプレートを準備し、セクション3のように目的の遺伝子を標的にします。RNAiノックダウンを伴わない実験でもHT115細菌を使用してください(はじめに参照)。
    2. セクション2で説明した方法を使用して、選択した動物を同期させる。
    3. NGM RNAi に卵をプレートを選択したプレートを使用して、表 1で推奨される基準を使用します。アッセイは、条件ごとに〜60〜100匹の動物を必要とするので、それに応じて準備してください。
    4. 卵を成人期の約3〜4日間(〜65〜96時間)に20°Cでインキュベートする。
    5. M9溶液で100 mMパラコートの新鮮なバイアルを準備します。
    6. 必要に応じて、M9+パラワアのピペット50-75 μLを平底96ウェルプレートの多くのウェルに入れ替えます。一般的に、1ウェルあたり〜8〜10匹の動物を含む条件ごとに〜8〜10の井戸を持つことをお勧めします。これは、株当たり〜80匹の動物とウェルあたり動物の容易に見える数を可能にする。
    7. 条件ごとに8-10動物を選び、M9 +パラコートを含む各井戸に移します。量の違いとパラコート濃度の意図しない変化を避けるために、ピペットではなく井戸に動物を転送するためにピックを使用してください。
    8. 2時間ごとに、各井戸の動物の死のスコア。プレートを軽くタップすると、生きている動物がスラッシュまたは曲がります。生きている動物が死んだと得点されるほど長く麻痺する可能性があることに注意してください。したがって、生きている動物の数が以前の時点から生きている動物の数を超えた場合、その動物は生きていて、スコアを付けてはならない可能性があります(例えば、4時4時に2/10の動物が死んだと得点され、時間6で死んだのは1/10動物だけであり、時間4は1/10動物が死んだとして再評価されるべきです)。
  3. 高温への曝露を用いた熱感度測定
    1. RNAi細菌で発見されたプレートを準備し、セクション3のように目的の遺伝子を標的にします。RNAiノックダウンを伴わない実験でもHT115細菌を使用してください(セクション1参照)。
    2. セクション2で説明した方法を使用して、選択した動物を同期させる。
    3. 表1で推奨される基準を使用して、選択した種付きプレートに卵をプレートします。耐熱アッセイのための条件ごとに60-100動物を持っています。耐熱性アッセイの場合は、アッセイの動物の年齢に基づく大きな変動性があるので、最良の同期のためにL1逮捕または卵レイアッセイを使用してください。
    4. 成人の1日目に実験を行うために、約3〜4日間(〜65〜96時間)、20°Cで動物をインキュベートする。熱ショック実験では15°Cと20°Cの熱ショックを経験する動物の間にわずかな違いがあるので、ワームを15°Cで増殖させないでください。
    5. 1日目に、動物を別々のプレートに移して準備します。一般的に、4〜6個のプレートを持つプレートあたり〜10〜15匹の動物を持つことをお勧めします。これは、スコアリングのためのプレートあたりの動物の管理可能な数を可能にし、動物が高温から引き抜かれる最小時間を可能にします。
    6. 動物を37°Cインキュベーターに入れ、2時間ごとにスコアを付け、5時間前に死に至らず、5時に37°Cで耐熱性のスコアを付けます。温度耐性の中央値は~9時間で達成されるため、時間7、9、11は重要なタイムポイントですが、インキュベーターとラボ間の変動のために、ラボごとに滴定する必要があります。さらに、変動性を減少させる方法(例えば、プレートを積み重ねず、単一のインキュベーター内の同じ領域にプレートを配置し、インキュベーターが開閉される時間を最小限に抑え、動物が37°C外で過ごす時間を最小限に抑えるためにインキュベーターから少ないプレートを取り出すなど)に役立ちます。完全なガイドについては、21を参照してください。
    7. ステップ7.3.6の代替として、37°Cの代わりに34°Cに動物を置く。34°Cの温度耐性の中央値は14時間を少し超えているため、34°Cの耐熱アッセイでは、ポイント12、14、16が重要です。

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Representative Results

転写レポーターを使用したストレス応答の活性化測定
ここでは、蛍光転写レポーターが使用され、C.エレガンスのほとんどのストレス応答の活性化を測定するための堅牢なツールとして機能します。GFP発現は、コンパートメント固有のストレスへの対応に関与するマスター転写調節因子の正規標的のプロモーターの下で駆動される。一般的に使用される転写記者の包括的なリストは、表3に記載されています。

ER恒常性を乱すタンパク質や脂質二重層ストレスを介してER恒常性を乱すと、ER(UPRER)の展開されたタンパク質応答が活性化し、ERの品質と機能を回復させます。UPRERは、膜貫通センサーによって定義される3つの異なる分岐から構成されています:イノシトールを必要とするタンパク質1(IRE1)、活性化転写因子6(ATF6)、およびプロテインキナーゼRNA(PKR)様ERキナーゼ(PERK)は、いずれもC.エレガンス7、22、2322,23で保存されています。7線虫中のUPRERの活性化を監視する最も一般的なツールは、hsp-4プロモーターの制御下でGFPを発現する転写レポーター株(hsp-4p::GFP)7である7。この遺伝子hsp-4は、哺乳類Hsp70、HSPA5(またはBiP/Grp78)のオルソローグをコードする。UPR ERが活性化された場合のERストレスの時に、hsp-4p::GFPレポーター株はGFPを発現する。このレポーターはストレスがない場合には基礎的発現が少ないが、動物がチュニカマイシンにさらされると堅牢なGFP発現を示す(図1A)。これらの違いは、大粒子フローサイトメーターを用いて定量化することもできる(1B)。また、hsp-4p:::Erストレス下でのGFPは、xbp-1のRNAi-ノックダウンにより完全に抑制され得るが、この転写レポーターの活性化が転写因子に依存するので、XBP-112。12

UPRERと同様に、ミトコンドリアは、タンパク質毒性ストレスに対する独自の保護機構を備えています。このメカニズムは、ミトコンドリアUPR(UPRMT)24と呼び、主に転写因子によって調節され、ATFS-1は、輸入効率の低下によるストレス下でミトコンドリアに入ることができず、核MT25にATFS-1が入り込む結果となる。興味深いことに、ミトコンドリアプロセスに対する異なる摂動は、タンパク質凝集、電子輸送鎖(ETC)複合体サブユニットのノックダウン、ミトコンドリアDNA複製ストレス、およびミトコンドリアタンパク質翻訳88,2626を含むこの応答を活性化することができる。UPRMTの活性化は、ミトコンドリアシャペロン遺伝子のプロモーターの調節下にGFPを置いたトランスジェニック構築物を発現するワームを用いて監視されている、 hsp-6及びhsp-608。hsp-4p::GFP動物と同様に、hsp-6p::GFP動物はストレスがない場合に最小限の基底信号を示す。UPRMTを誘導する最も堅牢な方法は、次のミトコンドリアタンパク質のRNAi-ノックダウンを介してである: cox-5B,シトクロムcオキシダーゼサブユニットVb/COX4 (複合体IV)20, nuo-4, NADH脱水素酵素タンパク質 (コンプレックスI)27, またはmrps-5, ミトコンドリアリボソームタンパク質28, hsp活性化された.このレポーターを介したGFP発現は、強く活性化され、これらの条件下で容易に可視化および定量化することができる(図2A-B)。UPRMTは、シトクロムcレダクターゼ(複合体III)を阻害するアンチマイシンAなど、電子輸送鎖(ETC)の化学的阻害によっても引き起こされる。ETCコンポーネントのRNAi-ノックダウンと同様に、アンチマイシンA治療はhsp-6p::GFP(図2C-D)の強い誘導を引き起こす。

生物が酸化ストレスを感知し、反応する能力は、細菌からヒト29に存在する保存プロセスである。C.エレガンスでは、NRF2ホモローグSKN-1は、タンパク質全体の反応性システインによる酸化還元変化に敏感な重要な転写因子として機能する。SKN-1は、NRF230に結合した抗酸化応答元素に非常に似た保存されたコンセンサス配列への結合を介してOxSRの転写活性化剤の30一つとして機能する。ヒトにおいて、NRF2はKEAP1によって負の調節を行い、これはタンパク質31全体にわたって反応性システインによる酸化還元変化に敏感であると考えられている。ワームにはKEAP1の直接の正射体はないが、SKN-1はWDリピートタンパク質WDR-23によって、KEAP1/NRF2阻害32とは機械的に区別される方法で負の調節を行う。Tert-ブチルヒドロペルオキシド(TBHP)などの酸化ストレスの場合、SKN-1は、グルタチオンS-トランストランスナーゼであるgst-4などの解毒および抗酸化遺伝子を活性化します。酸化ストレスを測定するために、GFP発現はgst-4のプロモーターの下に置かれ、グルタチオンS-トランスレコーゼ33と。ここで示されている他の転写調節因子とは異なり、gst-4p::GFPは高い基底発現を有する。しかし、この発現は、遺伝的にも化学的にも行うことができる酸化ストレスの条件下で依然として強く活性化することができる。酸化ストレスを遺伝的に誘導するために、我々は、SKN-134のプロテアソーム分解に役割を果たすタンパク質をコードするwdr-23をノックダウンする。34wdr-23ノックダウン結果gst-4p::GFPの堅牢な活性化が行われます。さらに、化学酸化剤TBHPによるワームの治療は、穏やかなが、gst-4p::GFPの活性化をもたらす(図3)。gst-4pの化学的および遺伝的活性化の両方::GFPは、OxSRのマスター転写調節因子をコードする遺伝子であるskn-1のRNAiノックダウンによってほぼ完全に抑制することができる。

ほとんどの細胞タンパク質は細胞質中に翻訳され、他の場所で標的にされる前に一時的にしか存在していなくてもそこに存在する。したがって、細胞質は、適切なタンパク質の折りたたみと機能を促進するシャペロンの多様な配列だけでなく、損傷、機能不全、または過剰なタンパク質を分解する責任を負う酵素およびタンパク質をホストしています。細胞質のこの複雑なタンパク質の景観を保護するために、細胞は、熱ショック応答(HSR)35、36を含むいくつかの細胞質ストレス応答経路36進化させた。HSRは、熱ストレスの条件下でタンパク質ホメオスタシスを促進することに専念する経路であり、マスター転写調節因子HSF-137によって変調される。定常状態下では、HSF-1は細胞質シャペロン、HSP90およびHSP70/40によって結合され、単量体で非アクティブな状態でロックされた状態に保たれている。熱または同様のストレスの条件下では、誤って折り畳まれたタンパク質の増加は、HSF-1から離れたシャペロンの滴定をもたらし、HSR38、39,39を活性化するために核に三量体化および転化することを可能にする。HSR活性化の下でHSF-1の最も研究された下流ターゲットは、HSP70、HSP90、DNAJ、およびHSP6017、40,のような熱ショックタンパク質(HSP)である可能性があります。C.エレガンスでは、HSR用転写レポーターは、正規のHsPsのプロモーターの下でGFPの発現を駆動することによって合成されている、hsp-16.2およびhsp-709、41。419彼らのUPRMTおよびUPRERのカウンターパートと同様に、hsp-16.2p::GFPおよびhsp-70p::GFPはストレスがない場合の最小基礎的表現を示す。しかし、両方のレポーターは熱ストレスの条件下で強く誘導され、顕微鏡検査によって容易に視覚化したり、大きな粒子流量サイトメーターを使用して定量化することができます(図4)。両方の記者は、大きなダイナミックレンジを持っており、誘導はhsf-1に完全に依存しています, hsf-1のRNAiノックダウンは完全にhsp-16.2pの誘導を抑制します::GFPhsp-70p::GFP.これらのレポーターは、ほとんどの状況で同じ意味で使用できますが、組織間で発現レベルと発現に違いがある可能性があります。

C.エレガンスにおけるストレス感受性を測定する生理学的アッセイ
C.エレガンスは、RNAiを使用したゲノム編集や遺伝的ノックダウンの維持と実験の低コストと容易さのためにストレス感受性を測定する素晴らしいモデル生物であり、生物全体で大規模な実験を行う能力を提供します。ERストレスに対するストレス耐性をアッセイするために、我々は、N結合型グリコシル化10を遮断することによってER中の損傷タンパク質の蓄積を引き起こす化学薬品、チュニカマイシンにC.エレガンスを曝露する。動物は、薬物が発達上の欠陥を引き起こすので、発達後にチュニカマイシンにさらされる。ツニカマイシンに曝露されると、成虫は寿命が著しい低下を示す。また、遺伝子のノックダウンは、xbp-1、UPRER誘導に関与する一次転写因子の1つをコードする、チュニカマイシン(図5A)12に対する感受性の有意な増加12をもたらす。したがって、これは、成虫のERストレス感受性を測定するための堅牢なアッセイとして機能する。

酸化ストレスとミトコンドリアストレスを測定するために、我々は、化学物質、パラコートに動物をさらします。パラコートはミトコンドリアマトリックス内でROSを合成することによりミトコンドリア応力を引き起こし、その後過酸化水素に変換し、ミトコンドリアから拡散して全細胞酸化損傷を引き起こす13。ERストレスアッセイと同様に、成人期に動物をパラコートにさらす。しかし、コストと手作業を削減するために液体でパラコートアッセイを行い、寒天プレートベースのアッセイはほとんどのラボにとって困難です。ここでは、液体中にパラコートにさらされた動物が約5時間の生存期間の中央値を示すことを示す(図5B)。また、インスリン受容体のノックダウンは、daf-16/FOXOの活性化としてパラコートに対する抵抗性の増加をもたらし、SOD-342,43,43などのROSのクリアランスに関与する発現の増加をもたらす。パラコート生存アッセイは短く、14時間まで持続し、したがってミトコンドリアおよび酸化ストレス応答を問い合わせるための効率的な方法として役立つ。

最後に、高温での生存は、熱ストレスに対する生理学的応答を尋問するために使用される。これらのアッセイは、液体または固体寒天の両方で行うことができる、と21の概説多数の異なるプロトコルが存在する。このアッセイでは非常に高い変動性を減らすため、ラボ内の単一のアッセイを標準化することをお勧めします。耐熱性は、34°Cまたは37°Cのいずれかで、標準的な寒天プレート上の1日目の成体動物で行われるべきです。37°Cでは、死亡の大半は7〜11時間の間に起こり、これは簡単な1日のアッセイであり、34°Cでの12〜16時間の実験は一晩で最も容易に行われる(図5C-E)。遺伝子の変異は、ttx-3、温度感覚神経回路を担うAIYインターニューロンの仕様の不全をもたらし、そして、温度感受性44の有意な増加を引き起こす。耐熱性データは生存曲線(図5C)としてプロットすることができますが、これらのアッセイは少なくとも4〜6回実行し、すべての反復を互いにプロットする必要があります(図5D-E)、耐熱性は他の応力アッセイと比較して非常に高い変動性を示しています。これは、これらの実験の設定に存在する多くの注意点に起因する、 関心のある株の変動、インキュベーターにおける空気の不均等なサイクリング、不均一な寒天プレート等を含む。34°Cでは、中央値生存期間は約14時間で起こり、37°Cと同様に、ttx-3変異体は34°Cで生存率を低下させた(図5E)。

Figure 1
図1:UPRER誘導のレポーターとしてhsp-4p::GFPを使用する。(A) hsp-4pの代表的な蛍光顕微鏡写真::GFPは、コントロール空ベクトル(EV)またはxbp-1 RNAiで増殖した動物を発現する。動物は、20°CでL4まで孵化からRNAiで増殖させ、20°CでM9に浮遊する25ng/μLチュニカマイシンまたは1%DMSOで4時間、イメージング前に20°CでOP50プレート上で16時間回収した。動物はNGM寒天板上の100μMナトリウムアジ化物で麻痺し、実体顕微鏡を用いて画像化した。(B)大粒子バイオソルターを用いた(A)の定量分析。データは、各ドットが単一の動物を表す動物全体にわたって統合された蛍光強度として表されます。DMSOコントロールは灰色で、チュニカマイシン処理動物は赤色である。中央線は中央値を表し、ひげは四分位範囲を表します。n = 1株当たり123-291動物。パラメトリックマンホイットニー検定を使用したp < 0.001。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:UPRMT誘導のレポーターとしてhsp-6p::GFPを使用する。() hsp-6p::GFP発現動物の代表的な蛍光顕微鏡写真は、コントロール空ベクトル(EV)、cco -1、mrps-5、またはnuo-4 RNAiで増殖する。-1 mrps-5動物は、孵化からRNAi上で成長し、20°Cで成人の1日目に画像化した。動物はNGM寒天板上の100μMナトリウムアジ化物で麻痺し、化合物顕微鏡を用いて画像化した。(B)大粒子バイオソルターを用いた(A)の定量分析。データは、各ドットが単一の動物を表す動物全体にわたって統合された蛍光強度として表されます。EVコントロールは灰色RNAi処理動物が赤色である。中央線は中央値を表し、ひげは四分位範囲を表します。n = 303-384 動物 1株あたり.p < 0.001 非パラメトリックマンホイットニー試験を用いたEV制御と比較した。(C) hsp-6p:::DMSOまたはAntimycin A.で処理されたGFP動物は、0.2%DMSOプレート上のハッチから増殖させ、0.2%DMSOまたは3 mMアンチマイシンAを含むプレートに16時間回転ECHO R4化合物顕微鏡でイメージングする前に移された。全ての増殖は20°Cで行った。(D)(B)と同様の大粒子バイオソルターを用いた(C)の定量分析DMSOコントロールは素晴らしく、アンティマイシンA処理動物は赤です。n = 495 DMSO、219はアンチマイシンA. ***p < 0.001 非パラメトリックマンホイットニー試験を用いたEV制御と比較した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: OxSR のレポーターとしてgst-4p::GFPを使用する() gst-4p::GFP発現動物の代表的な蛍光顕微鏡写真(コントロール空ベクトル(EV)、skn-1、またはwdr-23 RNAi。 skn-1動物は、20°CでL4段階まで孵化からRNAi上で増殖させた。動物は、20°CでL4まで孵化からRNAiで増殖させ、M9で2mM TBHP、または20°Cで4時間「未処理」制御のためにM9のみで処理し、イメージング前に20°Cで16時間EVプレート上で回収した。動物はNGM寒天板上の100μMナトリウムアジ化物で麻痺し、化合物顕微鏡を用いて画像化した。(B)大粒子バイオソルターを用いた(A)の定量分析。データは、各ドットが単一の動物を表す動物全体にわたって統合された蛍光強度として表されます。未処理のコントロールは灰色で、TBHP処理された動物は赤です。中央線は中央値を表し、ひげは四分位範囲を表します。n = 1株当たり101-204動物。p < 0.001 非パラメトリックマンホイットニー試験を用いた各EV制御と比較した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4: 熱衝撃応答のレポーターとしてhsp16.2p::GFPおよびhsp-70p::GFPを使用する。(A) hsp16.2pの代表的な蛍光顕微鏡写真::制御空ベクトル(EV)またはhsf-1 RNAiで増殖した動物を発現するGFP。動物は、20°Cでハッチから1日目までRNAi上で増殖させた。1日目の動物は、20°C(未処理)で放置するか、34°Cで2時間の熱ストレスにさらされ、20°Cで2時間回収した。動物はNGM寒天板上の100μMナトリウムアジ化物で麻痺し、実体顕微鏡を用いて画像化した。(B)大粒子バイオソルターを用いた(A)の定量分析。データは、各ドットが単一の動物を表す動物全体にわたって統合された蛍光強度として表されます。未処理のコントロールは灰色で、熱ショックを受けた動物は赤です。中央線は中央値を表し、ひげは四分位範囲を表します。n = 320-364動物株あたり。パラメトリックマンホイットニー検定を使用したp < 0.001。(C) hsp-70pの代表的蛍光顕微鏡写真::制御EVおよびhsf-1 RNAiで増殖し、(A)に記載Aされているように処理された動物を発現するGFP。(D) (B) に記載されているように (C) の定量的分析n = 株当たり773-941動物。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5: C.エレガンスにおけるストレス下の生理的生存アッセイ.(A)25 ng/μL チューニカマイシン(TM)プレートを含む1%DMSOで生育した線虫の寿命。動物は、1日目まで、ハッチから1%DMSOプレート上で増殖させ、1日目にそれぞれのTMプレートに移した。動物は、20°Cでアッセイの終わりまでハッチから制御空のベクター(EV)またはxbp-1 RNAiに保たれた。成虫動物は、子孫が検出されなくなった〜日7-8まで毎日生後から手動で移動され、その後、すべての動物が死んでいるか検閲として記録されるまで2日ごとに採点される。袋詰め、陰性突起/爆発を持つ動物、またはプレートの側面を這い上がったものは検閲されたと考えられていました。(B)M9溶液に溶解した100mMパラコート(PQ)中の線虫の生存曲線。B動物は、20°Cで成人期の1日目まで、孵化からEVまたはdaf-2 RNAi上で増殖させた。動物は20°Cの96ウェルプレートでM9+PQ溶液の50μLに入れ、すべての動物が動かなくなるまで2時間ごとに視覚化した。(C)37°Cにおける線虫の生存曲線C野生型(N2)、ttx-3(KS5)、およびsur-5p::hsf-1動物は、孵化から20°Cで1日目までEVプレート上で増殖させた。1日目、動物は37°Cに移動し、すべての動物が死んでいるか検閲されるまで2時間ごとに採点した。(D) 37 °Cで行われた全耐熱アッセイのプールデータ。データは、恒熱性アッセイの9時間に生きているパーセントとして表され、各行は同じ日に実行された一致した実験を表します。(E) 34 °Cで行われた全耐熱アッセイのプールデータ。データは、恒熱アッセイの14時間で生きているパーセントとして表され、各行は同じ日に実行された一致した実験を表します。A-C のすべての統計は、Log-Rank (マンテル-コックス) テストを使用して実行されましたこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

試薬 レシピ
リソゲニー・ブロス (LB) このプロトコルでは、市販のLBが使用されました(材料を参照してください)が、バクトトリプトン、酵母エキス、およびNaClを使用して、すべての標準的なLB自家製レシピで十分です。
線虫成長メディア(NGM) 1 mM CaCl2, 5 μg/mL コレステロール, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) 寒天, 0.25% (w/v) Bacto-ペプトン, 51.3 mM NaCl
漂白剤溶液 1.8% (v/v) 次亜塩素酸ナトリウム, 0.375 M KOH
M9ソリューション 22 mM KH2PO4 モノベーシック, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
NGM RNAi プレート 1 mM CaCl2、 5 μg/mL コレステロール、25 mM KPO4 pH 6.0、1 mM MgSO4、2% (w/v) 寒天、 0.25% (w/v) ペプトン, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL カルベニニシル/アンピニック.暗闇の中で4°Cで最大3ヶ月間保存
テトラサイクリン 100%エタノール中の10mg/mLのストック溶液(500x)。-20 °Cで保管
カルベニシリン 100 mg/mL ストック溶液 (1000x) の水。4 °Cで最大6ヶ月間、長期保存用-20 °Cで保管
アジドナトリウム 1 M在庫(6.5%)水中のアジドナトリウムのストック溶液。暗闇の中で4°Cで保管してください。これは10xの解決であり、ほとんどのイメージ投射実験のための100 mMの作業ストックに薄くされる
トゥニカマイシン 2.5 mg/mLの100%DMSOの貯蔵の水を含む。長期保存のため-80°Cで保管してください。これは100xの解決である(25 ng/μLの働く解決)
アンティマイシンA 15 mM アンチマイシン A ストック溶液を 100% DMSO に含む。-20°Cで保管してください。これは5000xの解決(3 μMの作業ストック)である
パラコート 水の50 μMの解決- 新鮮な準備をする必要があります
テルブチルヒドロペルオキシド(TBHP) 水の7.7 M溶液。これは3850xの解決である(2 mMの作業ストック)
NGM RNAi + DMSO0.2 1 mM CaCl2, 5 μg/mL コレステロール, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) 寒天, 0.25% (w/v) 細菌- ペプトン, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL カルベニニシル/アンフィチル 0.2%
(アンチマイシンAのコントロール)
NGM RNAi + アンチマイシンA 1 mM CaCl2, 5 μg/mL コレステロール, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) 寒天, 0.25% (w/v) Bacto-Peptone, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL カルベニシリン/アンピシリン, 0.2%
NGM RNAi DMSO 1 mM CaCl2, 5 μg/mL コレステロール, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) 寒天, 0.25% (w/v) バクトペプトン, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL カルベニシル/アンピチル;1% DMSO
(チュニカマイシンのコントロール)
NGM RNAi TM 1 mM CaCl2, 5 μg/mL コレステロール, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, 2% (w/v) 寒天, 0.25% (w/v) バクトペプトン, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL カルベニシル/アンピチル;1% DMSO、 25 ng/μL チュニカマイシン
Iptg 水に1 M溶液。

表1:試薬用の推奨レシピこのプロトコルで使用される試薬の正確なレシピはすべてここに概説されています。試薬を購入した特定の会社も、材料表で入手可能です。多くの異なる化学物質の供給源がテストされ、材料表に記載されているものは、最も堅牢で再現可能な結果を示したものである。

プレートサイズ バクテリアタイプ 1日目成人に達する動物の# L4ステージに到達する動物の#
60 mm OP50 100-150 150-300
60 mm HT115 70-100 120-200
100 mm OP50 600-1000 1500-2000
100 mm HT115 350-600 700-1300

表2:飢餓を避けるために、同期後にプレートを打つ動物の推奨数。飢餓を避けるために、我々は条件ごとに動物の特定の数をめっきすることをお勧めします。OP50はHT115よりも密度が高いため、より多くの動物をめっきすることができます。ここに記載されている数字はすべて、私たちの研究室で使用されるガイドラインであり、いくつかの変数と実験室の条件間の違いのために数字がわずかに異なる場合があります。したがって、太字フォントの下側に推奨される数値が表示されます。最大数は、飢餓に達することなく、私たちの研究室で最適な条件でメッキすることができるものですが、最初にあなたの条件を刺激せずにこれらの値を使用することはお勧めしません。すべての数字は、細菌がプレートに播種され、ワームが置かれる前にプレート上の周囲温度(〜22°C)で〜24時間増殖することを前提に決定されます。卵やL1をめっきする場合は、飢餓率に大きな差はありませんが、卵をめっきすると卵を10%高くし、すべての卵が漂白後に孵化するわけではないので、より高い値を推奨します。

ひずみ名 トランスジーン 目的 ストレスの推奨アプリケーション ソース
SJ4005 hsp-4p::GFP アップルER 25 μg/mL チュニカマイシン CGC
SJ4100 hsp-6p::GFP アップルMT 3 μM アンチマイシン A; CGC
ETCまたはミトコンドリアリボソームに対するRNAi
SJ4058 hsp-60p::GFP アップルMT 3 μM アンチマイシン A; CGC
ETCまたはミトコンドリアリボソームに対するRNAi
CL2070 hsp-16.2p::GFP 熱衝撃応答 34 °C 2時間 CGC
AM446 hsp-70p::GFP 熱衝撃応答 34 °C 2時間 森本研究室
CL2166 グスト-4p::GFP オックスサー 50 mMパラコート; CGC
2 mM tert-ブチルヒドロペルオキシド
CF1553 ソッド-3p::GFP OxSRとインスリンシグナル伝達 DAF-2 (インスリン受容体) に対する RNAi CGC
AU78 T24B8.5p::GFP 自然免疫応答 病原体曝露(例えば、緑素症) CGC

表3:細胞ストレス応答の活性化を評価するための転写レポーターここに記載されている株はすべて、CGCを通じて、または本稿に記載されている定性的および定量的イメージング方法の両方で使用するための実験室への特別な要求を通じて利用可能である。これらの株はすべてブリストルN2の背景に由来する。レポーターを活性化するためにストレスを適用するための推奨方法も提供されています。sod-3p::GFP45およびT24B8.5p::GFP46を除くすべての記者がテキストに記載されています。

トランスジーン ストレスの推奨アプリケーション ライカM2250FAステレオ顕微鏡を用いた露光時間 回転エコー顕微鏡による露光時間 ユニオンバイオメトリカコプタスバイオソルターを用いたPMT値
hsp-4p::GFP 25 μg/mL チュニカマイシン(一晩の回復で〜4時間) 200 ミリ秒 275 ミリ秒 450
hsp-6p::GFP 3 μM アンチマイシン A (~16 時間); 100ms 50ミリ秒 350
ETCまたはミトコンドリアリボソームに対するRNAi(ハッチから)
hsp-60p::GFP 3 μM アンチマイシン A (~16 時間); 200 ミリ秒 100ミリ秒 450
ETCまたはミトコンドリアリボソームに対するRNAi(ハッチから)
hsp-16.2p::GFP 34 °C 2時間 400ミリ秒 200 ミリ秒 500
hsp-70p::GFP 34 °C 2時間 400ミリ秒 300ミリ秒 500
グスト-4p::GFP 50 mMパラコート(~2時間) 100ミリ秒 50ミリ秒 350
2 mM tert-ブチルヒドロペルオキシド(一晩の回復との間で4時間)
ソッド-3p::GFP DAF-2 (インスリン受容体) に対する RNAi 300ミリ秒 300ミリ秒 475
T24B8.5p::GFP 病原体曝露(例えば、緑素症) 100ミリ秒 50ミリ秒 350

表4:大粒子バイオソルターを用いた蛍光顕微鏡と定量化の推奨設定この表は、蛍光顕微鏡の推奨暴露時間、または大粒子バイオソルターのPMT値のガイドラインとして機能します。これらは出発点として良い役割を果たしますが、飽和が発生しないように、蛍光値がバックグラウンド信号の検出限界を超えるように、実験ごとに露光時間とPMT値を調整する必要があります。実験用に最も明るい信号を持つサンプルが既知である場合(例えば、応力誘導のための正のコントロール)、それらのサンプルは、飽和信号なしで使用できる最高の露光時間またはPMTを決定するために使用することができる。最も明るいサンプルが不明な場合は、コントロールを使用でき、システムのダイナミックレンジの中心にある露出時間またはPMTを使用できます。

対応する図 ひずみ、治療 寿命の中央値 # 死亡者数/総数 中央値の寿命の% 変化 p値(ログランク;マンテル・コックス)
5A N2、ベクターRNAi、1%DMSO 22日 95/120 -- --
N2、 xbp-1 RNAi、1% DMSO 14日間 92/120 -36.4 < 0.001
N2,ベクトルRNAi,25 ng/μL TM 14日間 97/120 -36.4 < 0.001
N2, xbp-1 RNAi, 25 ng/μL TM 12日 98/120 -45.4 < 0.001
5B N2,ベクトルRNAi,100 mM PQ 5時間 73/73 -- --
N2,ダフ-2 RNAi, 100 mM PQ 6.5時間 74/74 30 < 0.001
5C N2,ベクターRNAi,37°C 8時間 59/60 -- --
ttx-3(KS5),ベクターRNAi, 37 °C 7時間 60/60 -12.5 0.002
シュル-5p::hsf-1、ベクターRNAi、37 °C 9時間 59/60 12.5 0.012

表5:寿命とストレス生存アッセイの統計図 5のサンプル サイズ、統計、および検閲の割合はすべて、ここで入手できます。

ストレス応答 標的遺伝子 フォワードプライマー リバースプライマー
アップルER hsp-3 TCGCTGGATTガーックGTTGTTCG GTTGCGTGTGTクトクトクトクトグ
アップルER hsp-4 ガーカアックタクトクトグクトクトットッグ ガーカアックタクトクトグクトクトットッグ
アップルER セル-11 TTGATCTGGGGAAACGCACG TTGATCTGGGGAAACGCACG
アップルER ire-1 TCCTCAACCGCカカカキャット TCCTCAACCGCカカカキャット
アップルER xbp-1 ガクトクトクトクトCGTCTGGGT ガクトクトクトクトCGTCTGGGT
アップルER xbp-1 (スプライス) グッガッガッグガガガガタット グッガッガッグガガガガタット
アップルER crt-1 ガーグタータグッカガガーガグ ガーグタータグッカガガーガグ
アップルER T14G8.3 カックカカカカアカアキャット カックカカカカアカアキャット
Hsr hsp-17 TCGTTTCCATATTCTCCCCCCCA TGTTTガットクッカガパグタット
Hsr hsp-70 TGTTTガットクッカガパグタット TTCGCAATGAGAAGGCGACT
Hsr F44E5.4 TTCGCAATGAGAAGGCGACT CGTTGTGCGTCTCTCTCtTTTTTT
Hsr hsp-16.2 トカクトガグット
グッタ
トグットアクトクトガガックガツガ
Hsr hsf-1 TTTATTTCTCTCTCTCTCTCTC トゥクトッカグカカッテクト
アップルMT hsp-6 ガガツグッガークガーガーガガ CGGCATTCTTTTCGTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
アップルMT hsp-60 CGGCATTCTTTTCGTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CGTCGTTGCAGAGCTCAAAG
アップルMT イメル-1 カアアアックトガックトクトクトグッググ TTCTCAATGTCGGCTCAGT
アップルMT clpp-1 タガターグテクGCACCAGTCCA トゥガットッガガグツクガガ
アップルMT ロンプ-1 CGATATGGATATGTGCAG CGCTTTGAACATCATTCAT
Cca
オックスサー gst-4 ガトクトクGTGCTTGCTG クガートクトクトカトクサック
オックスサー gst-6 クガートクトクトカトクサック TTTGGCAGTTGTTGAGGAG
オックスサー gst-7 TTTGGCAGTTGTTGAGGAG TGGGTAATCTGGGGGTGtTG
オックスサー gcs-1 TGGGTAATCTGGGGGTGtTG アクトットGCCTCGAATGTT
オックスサー skn-1 ガカカカガトゥカアガグ チャガアッカカカチャガガ
オックスサー ソッド-3 グアックグガタグカッガガーグ GCGAGAGCACATAtGAC
オックスサー ptps-1 アトCGATTTTTGGAGACC カアクトクトクトクテクトGCクト
カアアGC
参照 pmp-3 TGGCCGGGGATATGTCGC アグアカアットコッチャグ
参照 Y45F10.4 チャガアマクGCガートグクガ CGGTTGCGCガーガガガグ
参照 樹液-49 TGGCGGATCGTGTGCTTCC アゲージトクッチクトクトクCCCマ
参照 tba-1 トカアクトGCキャットCGCC TCCAAGCGAGACCAGGCTTCAG

表6:ストレス応答遺伝子の転写アップレギュレーションを測定するための推奨遺伝子標的およびプライマー対

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Discussion

ここでは、C.エレガンスにおける細胞ストレス応答を問い込む方法、蛍光転写レポーターおよび生理学的ストレス生存アッセイを用いて説明する。レポーターは、細胞ストレス応答の取り付けに関与する転写因子の下流転写標的のプロモーターの下で駆動されるGFP発現を利用する。Hsp-4p::GFPは、XBP-1s媒介UPRERによって変調され、hsp-6p::GFPはATFS-1媒介UPRMTによって制御され、gst-4p::GFPはSKN-1媒介性OxSRの下で、hsp16.2p::GFPhsp-70p:GFP:HSF反応の下で説明される。他の標準化された転写レポーターは、表3に記載されています。ここで発表されたすべての転写記者は広いダイナミックレンジを有し、遺伝的摂動またはストレス誘発化学物質への暴露のいずれかを通じてストレスを適用することによって堅牢に活性化することができる。さらに、これらのレポーターは、採用したプロモーターの上流の転写因子のノックダウンによってすべて抑制することができる。最後に、各転写レポーターは、特定のストレス応答を活性化または抑圧のいずれかの影響の生理学的読み出しを提供するために、特定の生理学的ストレス生存アッセイと対にされる。

転写レポーターの利用を成功させるためには、各レポーターのダイナミックレンジを決定することが不可欠です。メディア、寒天、環境環境などの違いによって引き起こされるラボ間の大きな変動のために、濃度とタイミングに対して各薬剤を評価するか、または推奨値をベースラインとして使用することをお勧めします。次に、動物が健康で適切に同期されていることを確認することが重要です。何らかのストレス(飢餓、光への長期暴露、高温への曝露など)を経験した動物は、実験の前に何世代かの間回収されるべきである。適切な同期は、いくつかのストレス応答がエージングプロセス中に異なるレベルの活性化を有するので不可欠であるセクション2で概説されている方法を使用することによって達成することができる。最後に、画像やデータの品質に影響を与えるさまざまなものがあるので、イメージングプロトコルは標準化に不可欠です。例えば、アジドナトリウム中の動物の持続時間は、動物にストレスを引き起こし、レポーター信号に影響を与える可能性がありますので、最小限に抑える必要があります。また、顕微鏡とバイオソルタの仕様は、飽和を引き起こすことなく、信号対雑音比とダイナミックレンジを最大化するように適切に設定する必要があります。最大蛍光シグナルを極度に過小評価できるため、飽和ピクセルはサンプルの定量分析において大きな問題を引き起こす可能性があります。

ここで説明する転写レポーターは、ストレス応答の活性化を測定するための堅牢で効率的な手段を提供しますが、既知の転写因子の単一の遺伝子標的であることを理解することが重要です。したがって、大規模な画面や関心のある株の最初の合格テストのための信頼性の高い方法として機能する一方で、適切な検証を実行する必要があります。各ストレス応答の誘導時に活性化されたいくつかの正規標的遺伝子を測定するためにqPCRを実施することを推奨します。推奨される遺伝子標的のリストは、表6に記載されています。さらに、RNA-seqを介したトランスクリプトームプロファイリングは、一度に複数の転写標的に対する影響を広く見るためのもう一つの代替手段です。特に、蛍光レポーターのイメージングは、摂動の影響を受ける組織に関する空間情報を提供します。このような情報は、scRNA-seq、FISH、および組織特異的なRNAEqプロトコル47を除いて、ワーム全体抽出物を使用するため、qRT-PCRまたはRNA-seqからは得られない。最後に、これらのストレスレポーターは、一般的にストレス応答機械に特異的であると特徴付けられる。ただし、すべてのストレス応答パラダイムが一意で明確なわけではありません。たとえば、ER応力はOxSRを活性化し、その逆も48であり、熱衝撃応答とER応力応答の重複は一般的に49に見られる。これらは、クロスコミュニケーションの文献の多くの例のほんの一部であり、ストレス応答間の重複であり、したがって、すべてのアッセイが最終的な結論を導き出すために特異性についてもテストされるべきであることを理解することが重要です。

説明する方法のもう1つの制限は、バイオソルターを介したイメージングおよび定量はスループットが限られているということです。biosorterの定量化は、より高いスループットのために96ウェルプレートで行うことができますが、ワームを溶液に移す必要性によって制限されていますが、イメージングは、ワームを調製し、顕微鏡を実行する調査官の能力によって制限されています。したがって、大規模なスクリーンは、蛍光レポーター信号の視覚的スクリーニングのみを含む可能性が最も高く、ヒットのみが画像化され、定量化されます。

これらの蛍光レポーターを使用する場合の重要な注意点は、ストレス応答の活性化または抑制が生理学的に意味のある型に寄与するとは限らない、または他のグローバルな効果(例えば、タンパク質合成の減少)を反映する可能性があることである。したがって、すべての転写レポーターは、ストレス生存をアッセイする方法と対にされる。UPRERのチュニカマイシン生存アッセイ、UPRMTおよびOxSRのパラコート生存アッセイ、および熱ショック応答のための高温での生存を行うことを推奨します。これらは一般的に堅牢で高速で簡単なアッセイですが、集中的な手作業が必要であり、スケーラビリティが著しく制限されています。さらに、これまでに発表されたほぼすべての耐熱性アッセイは大きなばらつきを有し、多数の複製をほぼ不可欠な21にする。チュニカマイシンとパラコート生存アッセイは、この再現性の欠如に苦しんでいませんが、広範な実践的な労働力やプロトコルの期間を含む独自の課題があります。新しい技術が、寿命と生存アッセイの自動化に生まれるので、これらのストレス生存アッセイもハイスループット50になり得る可能性が高い。しかしながら、これらの自動アッセイが標準になるまで、生存アッセイは現在、ストレス応答活性の変化するダイナミクスにおける生理学的影響の検証に限定されている。

ここに記載されているストレス生存アッセイ以外にも、動物の生理学を測定する方法は他にも数多くあります。たとえば、市販のシーホースXFpアナライザは、細胞呼吸の監視を可能にすることができ、追加の機械的な洞察を提供する51.転写レポーターに代わるもう1つの代替手段は、蛍光標識転写因子の核局在化の使用である。この技術には数多くの変形がありますが、ここで説明する方法には特に興味深い:熱衝撃応答52のためのHSF-1::GFP、UPRMT53のDVE-1:GFP、およびDAF-16::GFPおよびSKN-1:GFP OxSR 54、55。54,55最後に、関心のある特定のオルガネラの形態の直接の尋問を行うことができる。例えば、ミトコンドリア形態は、ミトコンドリア局在化配列56を用いてミトコンドリアマトリックスを標的としたフルオロフォアを利用して可視化することができる。ER形態は、Er末に融合したN末語とHDELに融合したシグナル配列を介してERに標的化された蛍光泳動を利用して、ER膜タンパク58に融合したC末語57またはGFPに融合して可視化することができる。最後に、アクチン細胞骨格完全性はHSF-1の下流の熱ストレス感受性の代理として使用することができる。このアクチン細胞骨格は、HSF-1の転写標的によって調節され、特に加齢及び熱ストレスの間に、アクチン組織を可視化してHSF-1および熱関連ストレス59,60,60の機能的読み出しを決定することができる。

ここで説明するすべての方法は、個別に、または互いに組み合わせて使用して、対象となる遺伝子または薬剤の包括的な分析と、ストレス応答への影響を示すことができます。大規模スクリーンは、ハイスループット転写レポーターアッセイを用いて行うことができるし、二次スクリーンはこれらのレポーターの定量的分析を用いて行うことができる。より管理しやすい遺伝子/薬物リストが同定されれば、生理学的アッセイを行い、動物生理学全体に直接影響を与える候補を同定することができる。上記で提案された他の方法は、検証またはさらなる調査として使用することもできます。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

R.BZ。EMBO長期フェローシップとラリー・L・ヒルブロム財団の支援を受けています。R.H.Sは、国立老化研究所(NIA)とグレン医学研究博士研究員財団を通じて5F32AG032023-02を助成金で支えています。A.F.は、NIAを通じてF32AG051355を付与することによってサポートされています。H.K.G.は、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムを通じて、DGE1752814の助成金によって支援されています。M.G.M.は1F31AG060660-01からNIAまでサポートされています。A.D.はトーマスとステイシー・シーベル財団、ハワード・ヒューズ医学研究所、NIAから4R01AG042679-04および5R01AG05891-02、およびNIEHSから5R01ES021667-09によってサポートされています。ラリー・ジョー、メリッサ・サンチェス、ナーメ・ケレット、アネル・エスキベルに対し、重要な技術支援をよろしくお願いします。私たちは、モリモト研究所とCGC(研究インフラプログラムP40 OD010440のNIH事務局が出資)に対して、株に感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 for mitochondrial stress
Bacto Peptone Fisher Scientific DF0118072 for NGM plates
BD Difco granulated agar VWR 90000-782 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin BioPioneer C0051-25 for RNAi
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 for NGM plates
COPAS Biosorter Union Biometrica 350-5000-000 equipped with a 488 nm light source.
COPAS Cleaning Solution Union Biometrica 300-5072-000 to use with COPAS
COPAS Sheath Solution Union Biometrica 300-5070-100 to use with COPAS
DMSO Sigma-Aldrich 472301 solvent for drugs
IPTG dioxane free Denville Scientific CI8280-4 for RNAi
LB Broth Miller Fisher Scientific BP1426500 for LB
M205FA stereoscope Leica 10450040 equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software
Magnesium sulfate heptahydrate VWR EM-MX0070-3 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride Fisher P217-500 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
Revolve ECHO 75990-514 equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software
Sodium Azide Sigma-Aldrich 71289-50G for imaging
Sodium Chloride EMD Millipore SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tert-butyl hydroperoxide Sigma-Aldrich 458139 for oxidative stress
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660-5G for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress

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References

  1. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44, (2), 139-163 (2018).
  2. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, (1), 71-94 (1974).
  3. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14, (10B), 2162-2168 (2004).
  4. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, (1-2), 103-112 (2001).
  5. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100, (3), 274-282 (2010).
  6. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15, (3), e1008011 (2019).
  7. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415, (6867), 92-96 (2002).
  8. Yoneda, T., Benedetti, C., Urano, F., Clark, S. G., Harding, H. P., Ron, D. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones. Journal of Cell Science. 117, (Pt 18), 4055-4066 (2004).
  9. Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4, (4), 235-242 (1999).
  10. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Biochemistry. 18, (11), 2186-2192 (1979).
  11. Struwe, W. B., Hughes, B. L., Osborn, D. W., Boudreau, E. D., Shaw, K. M. D., Warren, C. E. Modeling a congenital disorder of glycosylation type I in C. elegans: a genome-wide RNAi screen for N-glycosylation-dependent loci. Glycobiology. 19, (12), 1554-1562 (2009).
  12. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153, (7), 1435-1447 (2013).
  13. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282, (19), 14186-14193 (2007).
  14. Oberley, L. W., Buettner, G. R. Role of Superoxide Dismutase in Cancer: A Review. Cancer Research. 39, (4), 1141-1149 (1979).
  15. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring Oxidative Stress in Caenorhabditis elegans: Paraquat and Juglone Sensitivity Assays. Bio-protocol. 7, (1), (2017).
  16. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49, (6), B270-B276 (1994).
  17. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The Biology of Proteostasis in Aging and Disease. Annual Review of Biochemistry. 84, (1), 435-464 (2015).
  18. Park, H. E. H., Jung, Y., Lee, S. J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40, (2), 90-99 (2017).
  19. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a Neuropeptide Gene on Behavioral States in Caenorhabditis elegans Egg-Laying. Genetics. 154, (3), 1181-1192 (2000).
  20. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144, (1), 79-91 (2011).
  21. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological Considerations for Heat Shock of the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 68, (3), 450-457 (2014).
  22. Shen, X., Ellis, R. E., Sakaki, K., Kaufman, R. J. Genetic interactions due to constitutive and inducible gene regulation mediated by the unfolded protein response in C. elegans. PLoS genetics. 1, (3), e37 (2005).
  23. Frakes, A. E., Dillin, A. The UPR(ER): Sensor and Coordinator of Organismal Homeostasis. Molecular Cell. 66, (6), 761-771 (2017).
  24. Martinus, R. D., et al. Selective induction of mitochondrial chaperones in response to loss of the mitochondrial genome. European Journal of Biochemistry. 240, (1), 98-103 (1996).
  25. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science (New York, N.Y). 337, (6094), 587-590 (2012).
  26. Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial protein quality control during biogenesis and aging. Trends in Biochemical Sciences. 36, (5), 254-261 (2011).
  27. Shore, D. E., Carr, C. E., Ruvkun, G. Induction of Cytoprotective Pathways Is Central to the Extension of Lifespan Conferred by Multiple Longevity Pathways. PLOS Genetics. 8, (7), e1002792 (2012).
  28. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497, (7450), 451-457 (2013).
  29. Chiang, S. M., Schellhorn, H. E. Regulators of oxidative stress response genes in Escherichia coli and their functional conservation in bacteria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 525, (2), 161-169 (2012).
  30. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, (Pt B), 290-301 (2015).
  31. Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 284, (20), 13291-13295 (2009).
  32. Lo, J. Y., Spatola, B. N., Curran, S. P. WDR23 regulates NRF2 independently of KEAP1. PLOS Genetics. 13, (4), e1006762 (2017).
  33. Link, C., Johnson, C. Reporter Transgenes for Study of Oxidant Stress in Caenorhabditis elegans. Methods in enzymology. 353, 497-505 (2002).
  34. Choe, K. P., Przybysz, A. J., Strange, K. The WD40 Repeat Protein WDR-23 Functions with the CUL4/DDB1 Ubiquitin Ligase To Regulate Nuclear Abundance and Activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Molecular and Cellular Biology. 29, (10), 2704-2715 (2009).
  35. Velazquez, J. M., Lindquist, S. hsp70: nuclear concentration during environmental stress and cytoplasmic storage during recovery. Cell. 36, (3), 655-662 (1984).
  36. Tissières, A., Mitchell, H. K., Tracy, U. M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. Journal of Molecular Biology. 84, (3), 389-398 (1974).
  37. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. (2017).
  38. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS genetics. 9, (4), e1003466 (2013).
  39. Hentze, N., Le Breton, L., Wiesner, J., Kempf, G., Mayer, M. P. Molecular mechanism of thermosensory function of human heat shock transcription factor Hsf1. eLife. 5, (2016).
  40. Li, J., Labbadia, J., Morimoto, R. I. Rethinking HSF1 in Stress, Development, and Organismal Health. Trends in Cell Biology. (2017).
  41. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, (2), 657-664 (2004).
  42. Senchuk, M. M., et al. Activation of DAF-16/FOXO by reactive oxygen species contributes to longevity in long-lived mitochondrial mutants in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 14, (3), (2018).
  43. Henderson, S. T., Bonafè, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61, (5), 444-460 (2006).
  44. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the Cellular Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans by Thermosensory Neurons. Science. 320, (5877), 811-814 (2008).
  45. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115, (4), 489-502 (2003).
  46. Shivers, R. P., Kooistra, T., Chu, S. W., Pagano, D. J., Kim, D. H. Tissue-specific activities of an immune signaling module regulate physiological responses to pathogenic and nutritional bacteria in C. elegans. Cell Host & Microbe. 6, (4), 321-330 (2009).
  47. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14, (8), (2018).
  48. Glover-Cutter, K. M., Lin, S., Blackwell, T. K. Integration of the Unfolded Protein and Oxidative Stress Responses through SKN-1/Nrf. PLOS Genetics. 9, (9), e1003701 (2013).
  49. Liu, Y., Chang, A. Heat shock response relieves ER stress. The EMBO journal. 27, (7), 1049-1059 (2008).
  50. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The Caenorhabditis elegans Lifespan Machine. Nature Methods. 10, (7), 665-670 (2013).
  51. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of Oxidative Stress: Mitochondrial Function Using the Seahorse System. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1710, 285-293 (2018).
  52. Morton, E. A., Lamitina, T. Caenorhabditis elegans HSF-1 is an essential nuclear protein that forms stress granule-like structures following heat shock. Aging Cell. 12, (1), 112-120 (2013).
  53. Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, (4), 467-480 (2007).
  54. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466, (7305), 498-502 (2010).
  55. An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (45), 16275-16280 (2005).
  56. Daniele, J. R., Esping, D. J., Garcia, G., Parsons, L. S., Arriaga, E. A., Dillin, A. High-Throughput Characterization of Region-Specific Mitochondrial Function and Morphology. Scientific Reports. 7, (1), 6749 (2017).
  57. Daniele, J. R., et al. A non-canonical arm of UPRER mediates longevity through ER remodeling and lipophagy. bioRxiv. 471177 (2018).
  58. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198, (5), 895-911 (2012).
  59. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science (New York, N.Y.). 346, (6207), 360-363 (2014).
  60. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29, (21), 2522-2527 (2018).

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