MeCP2タンパク質変異体に対するエレクトロケミセンスベースアッセイ

JoVE Journal
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

エレクトロケミ発光免疫測定法(ECLIA)は、内因性および外因的に適用されたMeCP2タンパク質変異体の定量的検出のための新しいアプローチであり、幅広い作業範囲での低いイントラおよびインターアッセイ誤差で定量的、正確、再現性の高い測定を行います。ここでは、96 ウェル形式での MeCP2-ECLIA のプロトコルについて説明します。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Steinkellner, H., Beribisky, A. V., Mausberg, P., Christodoulou, J., Scheiber-Mojdehkar, B., Huber, A., Sarne, V., Laccone, F. An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants. J. Vis. Exp. (159), e61054, doi:10.3791/61054 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ECLIAは、96ウェル形式で内因性および組換えタンパク質量を定量化することができる汎用性の高い方法です。ECLIAの効率を実証するために、このアッセイは、マウス脳組織におけるMeCP2の本質的なレベルとヒト真皮線維芽細胞におけるTAT-MeCP2の取り込みの分析に使用された。MeCP2-ECLIAは、低いイントラおよびインターアッセイ誤差で、高精度で再現性の高い測定を行います。要約すると、高スループットスクリーンで利用できるMeCP2タンパク質変異体の定量的手法を開発しました。

Introduction

エレクトロケミフルミネッセンスイムノアッセイ(ECLIA)は、電気化学的に刺激された際に発光を放出するように設計されたラベルを利用するプロセスに基づいています。これは、基礎産業および学術研究、食品産業、ならびに臨床診断における生物学的分析物の定量的検出のための広く適用可能な技術である1.一般的に、カーボンインク電極を備えた使い捨て可能な96ウェルプレートが使用されます。これらの電極は、免疫測定のための固相担体として機能する。二次抗体は電気化学発光ラベルに結合され、電気がシステムに適用されると、化学ラベルの発光がトリガされます。超低雑音電荷結合装置(CCD)は、捕捉抗体に結合した抗原に直接比例する光強度を記録し、その結果、試料2の標的検体の定量化を行。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)と比較して、ECLIAは高感度、再現性、ならびにより優れた自動化および一貫性を提供するので有利であると考えられる3。

ここでは、新開発のECLIAシステムを用いて、ヒトおよびマウス由来のサンプルおよび組換えタンパク質の異なる変異体におけるメチルCpG結合タンパク質2(MeCP2)レベルを分析した。MecP2は、メチル化DNA配列と相互作用することが知られているX結合型核酸結合タンパク質である。このタンパク質は、遺伝子発現44,55の調節に関与している。このタンパク質をコードする遺伝子の機能喪失変異は、Tett症候群(RTT)を引き起こす主な原因である、重度の神経発達障害6である。別のMeCP2関連障害、MECP2重複症候群は、RTT 7のものと重なり合う神経学的症状にもつながり。特に、女性は主にRTTの影響を受け、男性は主にMECP2複製症候群66、77に苦しんでいます。

これらの障害は、中枢神経系(CNS)においてそれぞれ不十分または過剰なMeCP2レベルに関連している。したがって、CNSでMeCP2レベルを増加させるRTTの治療オプションは、MeCP27の過剰に関連する有害な影響を避ける必要があります。この事実により、ECLIAシステムによって提供されるMeCP2タンパク質レベルの高感度かつ正確な定量化は、RTTの進歩とMECP2重複症候群の研究にとって非常に重要です。ヒト細胞株およびマウス組織サンプルからの内因性および外因性MeCP2レベルの正確な測定と、ヒトMeCP2アイソフォームB(アイソフォームe1とも呼ばれる)からなる組換えタンパク質、および血液脳関門8横断する可能性を有する最小N末端HIV-TAT伝達ドメイン(TAT-MeCP2)が提示される

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

研究目的での皮膚生検調達の承認は、オーストラリアのウェストミードにある小児病院の人間研究倫理委員会から得られました。動物実験の同意は、オーストリア連邦科学研究経済省から取得され、地元の動物福祉規制に従って実施されました(GZ:66.009/0218-II/3b/2015)。

注: ECLIA システムの原理は図1に示されています。

1. 抗体の選択

  1. 様々なMeCP2抗体の範囲のシグナル対雑音比を評価し、一次マウスモノクローナルMeCP2抗体(クローンMec-168)とウサギポリクローナルMeCP2検出抗体(カスタムメイド)の組み合わせ内で最良のシグナル強度と最高特異性を同定します。二次抗体については、実験的に検証されたシステム特異的抗体(材料表)を用いた。
    注:表 1は、MeCP2-ECLIA の開発中に検証されたすべての抗体とその試験希釈範囲の概要を示しています。
関数 名前 クローン 希釈
プライマリ マウス、抗MeCP2 メック-168 1:500-1:10,000
プライマリ マウス、抗MeCP2 4B6 1:250-1:4,000
プライマリ マウス、抗MeCP2 男性-8 1:500-1:4,000
プライマリ マウス、抗MeCP2 1B11 1:500-1:4,000
プライマリ ウサギ、抗MeCP2 D4F3 1:500-1:4,000
セカンダリ ウサギ、抗MeCP2 ポリクローナル 1:2,000-1:20,000
セカンダリ ウサギ、抗MeCP2 ポリクローナル 1:2,000-1:20,000
検出 スルフォタグラベル付抗ウサギ ポリクローナル 1:500-1:1,000

表1:抗体および使用される働き希釈剤のリスト。

  1. あるいは、従来のELISAとうまく機能するMeCP2抗体の各ペアを使用してください。

2. TAT-MeCP2融合タンパク質によるHDFの治療

注:TAT-MeCP2は、エシェリヒア・コリで組換え発現し、前に説明した8の標準的なクロマトグラフィー技術を用いて精製し、-80°Cで保存しました。

  1. プレート 1 x 106ヒト皮膚線維芽細胞 (HDF) 細胞を 100 mm 皿に入れ、5% CO2で一晩 37 °C で細胞を成長させ、約 90% の合流度に達します。
  2. TAT-MeCP2融合タンパク質のバイアルを1個取り出します。氷の上で解凍し、穏やかに混ぜます。
  3. TAT-MeCP2をHDF培養培地の50mLで500 nMの最終濃度に希釈します。
  4. 100 mmの皿から培地を取り出し、37°Cで500 nM TAT-MeCP2で細胞を24時間まで様々なインキュベーション期間にインキュベートします。
  5. TAT-MeCP2 溶液をセルから削除します。あらかじめ温められたダルベッコのリン酸緩衝生理食塩(DPBS)で細胞2倍を洗浄します。
  6. 37 °C10で5分間0.05%トリプシン-EDTA溶液の2 mLで細胞を治療します。
  7. 6 mLのHDF培養培地を添加してトリプシンを不活性化し、15 mLチューブ内の細胞を収集します。
  8. ペレット細胞は、室温で5分間500xgで遠g心分離して細胞をペレット化した。
  9. 上清を取り除き、氷冷DPBSで細胞2倍を洗います。ペレットを氷の上に保管し、サンプル調製に進みます。

3. サンプル準備

  1. HDFライセート
    1. スズキら11によれば細胞質および核下膜内への細胞内分画のためのREAP法を用いてMeCP2の最高タンパク質レベルを決定する。分数を実験ごとに 6 個以下のサンプルに制限します。
  2. マウスの脳のライセート
    1. 各低張性リシス試薬および抽出バッファーの 100 mL を調製します。
      1. 低張性のリシス試薬の場合は、10 mM HEPES、1.5 mM塩化マグネシウム、10 mMの塩化カリウムをよく混ぜます。
      2. 抽出バッファーの場合は、20 mM HEPES、1.5 mM 塩化マグネシウム、0.42 M 塩化ナトリウム、0.2 mM EDTA、および 25% (v/v) グリセロールをよく混ぜます。
      3. 両方のバッファーの pH を 7.9 に調整します。
      4. 1 mMジチオスレイトール(DTT)と1xプロテアーゼ阻害剤カクテルを両方のバッファーに新たに加えます。使用前に氷の上で冷やします。
    2. 全マウス脳(株:C57BL/6J、野生型男性と女性、B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J、ヘミジグウス男性およびヘテロ接合雌;年齢:4〜8週齢)の全マウス脳(株:C57BL/6J)を1mLの氷冷低血圧リシス試薬で中断する。
    3. ホモジナイザーA(緩い、大きなクリアランスのために)とB(狭い、小さなクリアランスのために)の15ストロークによって、事前に冷却されたDounceオールガラス組織ホモジナイザーで脳を均質化する。
    4. 均質化した細胞をクリーンチューブに移し、4°Cで20分間10,000 x gで遠心分離機を送ります。上清を捨てる(または、さらなる使用のためにサイトプラズマ分画として保管する)。
    5. 出発原料の100mgあたり140μLの抽出バッファーでペレットを再懸濁します。チューブをあらかじめ冷却したサーモブロックに入れ、4°Cで30分間軽く混ぜます。
    6. チューブを16,000gで4°Cで10分間遠心分離します。上清(すなわち、核分率)を新しい前冷蔵チューブに移し、使用するまで-80°Cで保管します。
      注:マウス脳およびHDFに由来するライゼートのタンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイによって評価することができます。

4. MeCP2-ECLIA プロトコル

  1. 洗浄液の調製、ブロッキング緩衝液およびアッセイ希釈液(1日目)
    1. 500 μLの Tween 20 ~ 1 L の PBS を加えて、PBS 溶液に 0.05% Tween 20 を準備し、激しく混ぜ合わせて「洗浄液」とラベルを付けます。
      メモ:準備したての洗浄バッファのみを使用するようにしてください。
    2. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3%ブロッカーA(材料表)のブロッキング溶液を調製します。穏やかな攪拌で混ぜ、殺菌し、最大2週間使用するまで冷蔵庫に保管します。
    3. PBSの10 mLに5mLのブロッキング溶液を加え、アッセイ希釈液(PBS中の1%ブロッカーA)を調製する。
  2. 高結合プレートのコーティング
    1. 96ウェルマルチアレイシングルスポット高バインドプレートを取り出します。
      注:高結合プレートは、結合能力が高く、疎水性表面を持つ標準プレートよりもダイナミックレンジが大きくなります。
    2. モノクローナルマウス抗MeCP2抗体を氷上で解凍し、抗体の0.67 μLを4 mLのPBS(PBSで1:6,000抗体希釈)と混合します。ボルテックス抗体溶液を良好に混合し、チューブを「コーティング溶液」としてラベル付けする。
    3. マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルの下隅に25 μLのコーティング溶液を慎重に分配します。これを溶液コーティング法と呼んでいます。コーティング液が各ウェルの底部を覆っていることを確認するために、両側の96ウェルプレートを軽くタップします。
    4. 粘着ホイルでプレートを密封し、一晩(12-16時間)4°Cで冷蔵庫にプレートをインキュベートします。
  3. ブロック(2日目)
    1. 冷蔵庫から皿を取り出し、ホイルを取り出します。
    2. 抗体コーティング液をゴミ箱にフリックして取り出し、ペーパータオルのプレートをタップしてウェルからすべてのコーティング溶液を取り除きます。
    3. 1ウェルあたり125μLのブロッキングソリューションを追加します。プレートをもう一度シールし、軌道マイクロプレートシェーカーに置きます。
    4. 800 rpmで一定の揺れを保ち、室温で90分間プレートをインキュベートします。
  4. 標準およびサンプルの準備
    1. インキュベーションの時間中に、MeCP2および/またはTAT-MeCP2タンパク質標準および様々なサンプルを準備してください。
      注: 標準希釈に使用する Lysis バッファーは、分析されたサンプルで使用されるリシス バッファーと同じである必要があります。
    2. MePC2および/またはTAT-MeCP2タンパク質ストック溶液(250 μg/mL)、マウス脳溶解物、HDF溶解液を-80°Cから取り出します。氷の上でそれらを解凍します。
    3. 表2に従って、標準ストック溶液(MeCP2および/またはTAT-MeCP2)をクリーンチューブで希釈します。
    4. サンプルをリシスバッファーで希釈する:25μLのリシスバッファーあたり1-20 μgのマウス脳リゼート、および25μLのリシスバッファーあたり0.25-1 μgのHDFリセートを、リシスバッファーの25 μLあたりにします。各サンプルの十分な量を準備して、三重で分析を行います。
標準 濃度 希釈
標準 1 1,800 ng/mL 1.08 μL 標準ストックソリューション + 148.92 μL 溶解バッファー
スタンダード2 600 ng/mL 50 μL 標準 1 + 100 μL リシスバッファー
スタンダード3 200 ng/mL 50 μL 標準 2 + 100 μL リシスバッファー
スタンダード4 66.67 ng/mL 50 μL 標準 3 + 100 μL リシスバッファー
スタンダード5 22.22 ng/mL 50 μL 標準 4 + 100 μL リシスバッファー
スタンダード6 7.41 ng/mL 50 μL 標準 5 + 100 μL リシスバッファー
スタンダード7 2.47 ng/mL 50 μL 標準 6 + 100 μL リシスバッファー
スタンダード8 0.82 ng/mL 50 μL 標準 7 + 100 μL リシスバッファー
スタンダード9 0.27 ng/mL 50 μL 標準 8 + 100 μL リシスバッファー
標準 10 0 ng/mL 150 μL のリシスバッファー

表2:0から1,800 ng/mLまでの標準シリーズ。

  1. サンプルと標準ソリューションの追加
    1. ブロック溶液をゴミ箱にフリックして取り出し、ペーパータオルのプレートをタップして、すべてのブロッキング溶液を井戸から取り除きます。
    2. 洗浄液を加えてすぐに取り除いて、150μLの洗浄液でプレート3xを洗浄します。
    3. 単一のチャネルピペットを使用して、ウェルの下隅に25 ulの標準とサンプルを追加します。
    4. プレートを密封し、800rpmで一定の揺れを保って室温で4時間プレートをインキュベートします。
  2. 標識されていない検出抗体
    1. ポリクローナルウサギ抗MeCP2抗体を氷上で解凍します。抗体を1:6,000のアッセイ希釈液で希釈します。
    2. ゴミ箱にフリックして標準とサンプルを取り除き、ペーパータオルのプレートをタップします。
    3. 洗浄液を加えてすぐに取り除いて、150μLの洗浄液でプレート3xを洗浄します。
    4. マルチチャネルピペットを用いて、25 μLの非標識検出抗体を各ウェルに添加します。プレートを密封し、室温で800rpmで一定の揺れをして1時間インキュベートします。
  3. 特異的共役抗体
    1. 特定の二次抗体(材料表)を冷蔵庫から取り出し、氷の上に置きます。抗体1:666.67をアッセイ希釈液で希釈し、軽く混ぜます。
    2. 廃棄バスケットにフリックして、ラベル付けされていない無料の二次抗体を取り出し、ペーパータオルのプレートをタップします。
    3. 洗浄液を加えてすぐに取り除いて、150μLの洗浄液でプレート3xを洗浄します。
    4. マルチチャネルピペットを用いて、各ウェルに25μLの特異的共役抗体(材料表)を加えます。プレートを密封し、室温で800rpmで一定の揺れをして1時間インキュベートします。
  4. プレートを読む
    1. 廃棄バスケットにフリックしてフリーコンジュゲート抗体(材料表)を取り出し、ペーパータオルのプレートをタップします。
    2. 150 μLの洗浄液でプレート3xを洗います。
    3. 1x Trisベースのゴールド読み取りバッファー(材料表)の150 μLを加え、トリプロピルアミンを含む界面活性剤をプレートへの光生成のための共反応剤として追加します。逆ピペット技術を使用して、気泡を避けてください。
    4. プレートをマイクロプレート検出プラットフォーム(材料表)に置き、すぐに測定を開始します。96 ウェルプレート取得の設定を使用します。
    5. 電気化学発光検出システム()で内蔵CCDカメラで電気化学発光信号をキャプチャし、相対光ユニット(RLU)に対応し、光の強度に直接比例する信号数を記録します。
      注:電気化学的刺激の際、炭素電極に結合したルテニウムラベルは、620nmで発光光を発します。計測器付属のソフトウェア(資料一覧)を使用してデータを分析します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ECLIA システムの原理は図 1に説明されています。図2に、2 つの MeCP2 バリアントの標準曲線を示します。幅広い濃度(1-1,800 ng/mL)で正確な定量が可能でした。図3では、マウス脳およびHDFに由来するライセートのMeCP2レベルを分析した。図3Aでは、ヘテロ接合、野生型およびノックアウトマウス由来の脳核ライゼートにおけるMeCP2発現を比較したが、図3BではECLIAを用いたMECP2欠損ヒト線維芽細胞(c.806delG)ではMeCP2タンパク質が検出されなかった。MECP2欠損セルライン(c.806delG)によるTAT-MeCP2の取り込みも経時に調査された(図4)。最後に、表3に示すように、相互アッセイとイントラアッセイの精度が示されました。

Figure 1
図1:MeCP2電気化学発光アッセイの図。この数字はwww.meso-scale.comから適応した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:ヒトMeCP2から複数の測定で生成されたMeCP2標準曲線ブランクより上の 2.5 標準偏差 (SD) として定義される検出の下限 (LLOD) は 1.00 ng/mL です。組換えヒトMeCP2(アブノバ)は、R2 = 0.996で1.00 ng/mL(LLOD)から1,800 ng/mL(検出の上限[ULOD])までの範囲で正確に定量化することができます。誤差範囲は、n = 3 の標準誤差を表します。この図はスタインケルナーら8.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: マウス脳と HDF の MeCP2 レベル(A)MeCP2-タンパク質レベルは、ヘテロ接合(灰色、HET)および雌の野生型マウス(n = 4)および1つのMecp2-ノックアウトマウス(RTT)から脳核ライセートで測定された。(B) RTT症候群のモデルとして新生児脳症の男性患者由来のMeCP2欠損線維芽細胞株(c.806delG)からの細胞ライセートをヒトにおけるMeCP2タンパク質レベルおよび健康なコントロール(黒)を評価するために実施した。提示されたデータは、平均±三重ウェルのSDである(n=3)。免疫蛍光またはECLIAを用いて変異細胞株中でMeCP2タンパク質が検出されなかった(以下の検出範囲)、さらにTAT融合タンパク質を用いた研究を取り込むための高感度システムであることを実証した。この図はスタインケルナーら8.から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:TAT-MeCP2の時間依存の取り込みC.806delG HDFにおける核分画のMeCP2レベルは、500 nM組換えTAT-MeCP2融合タンパク質で処理された。分析は、MeCP2-ECLIAを用いて行った。規定された時点で、細胞をDPBSで洗浄し、0.05%トリプシン-EDTAを5分間インキュベートして、細胞外結合TAT-MeCP2を排除した。トリプシン化は、血清で培地を添加することによって停止した。細胞懸濁液を5分間500xgで遠g心分離した。細胞ペレット2xを氷冷DPBSで洗浄した後、プロトコルセクションに記載されているように核画分の抽出用に試料を調製した。この図はスタインケルナーら8.から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

イントラアッセイ インターアッセイ
mLタンパク質あたりのng MeCP2 mLタンパク質あたりのng MeCP2
まあ1 まあ2 まあ3 意味 SDa SEMb %CVc 意味 SDa SEMb %CVc
ヒト線維芽細胞 6.42 6.30 6.45 6.39 0.08 0.05 1.24 6.61 0.64 0.37 9.71
マウスの脳のリゼート 9.92 10.16 10.36 10.14 0.22 0.13 2.17 11.22 0.94 0.54 8.33
a標準偏差、b標準誤差平均、変動係数

表3:HDFと野生型マウス脳の3日間連続でアッセイ間精度の決定細胞リセートの1〜10μgのタンパク質を塗布した。aSD、標準偏差;bSEM、標準誤差平均;cCV、変動係数。このテーブルはスタインケルナーら8から変更されました。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

内因性MeCP2、組換えMeCP2およびTAT-MeCP2レベルを測定するために、96ウェルプレートECLIAが開発されました。MeCP2タンパク質機能の喪失は、現在、治療が症状管理および理学療法に限定されているRTT症候群6につながることが示されている。1つの有望な治療手段は、MeCP2レベルが必要な,濃度12、13、14、15,13まで滴定することができる、いわゆるタンパク質補充療法,14です。TAT融合タンパク質が血液脳関門を越える可能性は、過去20年間で成功することが証明されています12,,13,,14,,15.したがって、MeCP2送達のためのこの方法は、タンパク質置換療法投与のコンテキストにおいて有用であり得る。TAT融合タンパク質および他の治療法がMeCP2タンパク質レベルを回復させる可能性を評価するためには、それらを定量化できる効率的で手頃な価格のアッセイを開発することが最も重要です。本研究に記載されたアッセイは、ECLIAが、良好なイントラアッセイ値および相互アッセイ値を有する正確かつ一貫してMeCP2のレベルを正確に決定することができる(表3)。

以下のMeCP2-ECLIAプロトコルでは、マウス脳ライゼおよびHDFが対象細胞として用いられた。しかし、このプロトコルは、少なくともヒトおよびマウス起源の他のすべての細胞タイプで使用され得る。さらに、HDFは、このアッセイの能力を示すためにTAT-MePC2融合タンパク質で処理され、様々なMeCP2タンパク質変異体を測定した。サンプル調製の間、DTTまたはβ-メルカプトエタノールのようなリシスバッファー内の還元剤を回避または最小化することは、技術の効率を維持するために極めて重要である。この方法の追加の重要なステップは、マウス抗MeCP2抗体、プレートブロッキング、およびサンプル添加を用いたプレートコーティング、ウサギ抗MeCP2抗体との4時間のインキュベーションを含む。その後、特定の二次抗体を用いたインキュベーション(材料表)と、発光反応に必要な試薬の添加が行われ、この手順の最終重要なステップを含む。

ECLIAのパフォーマンスを最適化するために、以下のステップを実行できます。このアッセイの信号の最大出力は、100万カウントを超えてはならない。電極を超えて流体が広がるのを防ぐために、スポットコーティングと呼ばれる技術を使用して、塗料溶液をウェルに導入することができます。この技術は、高精度のピペット加工やピペットロボットの使用を必要とします。さらに、様々な抗体濃度の試験は、アッセイ特異性を高め、バックグラウンドシグナルを低減するのに役立つ可能性があります。後者に対処するために、様々なブロッカー(MSD、ブロッカーD-Mなど)を最終濃度0.1%に使用することもできます。信号品質を最適化するために、様々なインキュベーション時間(300rpm以上で振る)をテストすることをお勧めします。最後に、血清、血漿、尿または脳脊髄液などの特定の媒体における回復および希釈直線性を高めるために、いくつかの希釈剤を試験することができる。

半定量的にウェスタンブロットおよび市販のMeCP2-ELISAは、通常、MeCP2タンパク質レベルを研究するために使用される。ELISAの背後にある作業原理は、検出モードという顕著な違いがあるECLIAのそれと同様です。これらの方法と比較して、MeCP2-ECLIAはより速く、より便利である。ECLIAは、野生型、ヘテロ接合、Mecp2ノックアウトマウスの脳サンプル(図3A)のアッセイに使用され、ウェスタンブロッティングによって得られた同じサンプルからのMeCP2量と比較して所見が得られた(データは示されていない)。ECLIAによって測定された雌の野生型およびヘテロ接合マウス脳サンプルのMeCP2レベルでは顕著な差が認められ、ウェスタンブロットによって統計的に有意であると検出されなかった。この高いECLIAアッセイ精度は、MeCP2タンパク質レベルを上昇させることができる新規化合物の探索において重要であり得る。

さらに、MeCP2-ECLIAは、そのMeCP2-ELISAの対応先よりも低コストであり、1 ng / mLから1,800 ng /mL(R2 = 0.996)までの高いダイナミックレンジのために、低いMeCP2量を含むサンプルで使用することができます。2すべての市販のELISAキットと比較すると、ECLIAは非常に優れたパフォーマンスを発揮します。ECLIAは、0.312-20 ng/mL(マウス、クラウドクローン社)および0.156-10 ng/mL(ヒト、クラウドクローン社)であることが判明したELISAの対応機と比較して、より有利なダイナミックレンジを有しています。検出の下限の明示的な定義がないため、この作業の目的のために、これら2つのアッセイ間の直接的な比較は不可能である。

要約すると、MeCP2-ECLIAは生体内およびインビトロでMeCP2量を正確に決定できることが示されている。RTTの影響を受けた患者のニューロンにMeCP2タンパク質レベルを補充することは確かに有望な治療手段であるが、過剰なMeCP2の存在はまた、重篤な神経学的症状をもたらし、MECP2重複症候群16、17、1817,18に関連する。16したがって、この方法は、タンパク質置換療法中に外因的に導入されたMeCP2の量を最適化する上で不可欠な重要なことができます。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

ブリジット・シュトゥルム博士がECLIAの楽器を支えてくれたことにとても感謝しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D9779 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad Laboratories Inc. 500-0006 Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit Meso Scale Diagnostics R32AB-1 Antibody
Discovery workbench 4.0 Meso Scale Discovery Software
DMEM (1X) gibco by Life Technologies 41966-029 Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile) Sigma-Aldrich D8537-500ML Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA Sigma-Aldrich EDS Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F9665 Sample preperation
Glycerol Sigma-Aldrich G2025 Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant Meso Scale Diagnostics R92TG MeCP2 ECLIA protocol
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set Sigma-Aldrich D8938 Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) GFL 3014 MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) Sigma-Aldrich M2670 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) Abnova Corporation H00004204-P01 Cell treatment
Microseal B seal Bio-Rad Laboratories Inc. MSB1001 for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin Sigma-Aldrich M6818-100UL; RRID:AB_262075 Antibody, Coating solution
MSD Blocker A Meso Scale Diagnostics R93BA-4 Blocker
MSD SECTOR Imager 2400 Meso Scale Diagnostics I30AA-0 MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate Meso Scale Diagnostics L15XB-3/L11BX-3 MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin gibco by Life Technologies 15140122 Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit Eurogentec S.A. custom-designed Antibody
Potassium chloride (KCl) Merck KGaA 1049361000 Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) Sigma-Aldrich SAB1404063; RRID:AB_10737296 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) Sigma-Aldrich WH0004204M1; RRID:AB_1842411 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) Sigma-Aldrich M6818; RRID:AB_262075 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) Sigma-Aldrich M7443; RRID:AB_477235 Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) Cell Signaling Technology 3456S; RRID:AB_2143849 Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X) Sigma-Aldrich 8340 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 Eurogentec S.A. custom Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 Merck 07-013 Antibody
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014 Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) Meso Scale Diagnostics W0015528S Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein in-house production Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X) gibco by Life Technologies 25200-056 Cell treatment
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416 Washing solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
  2. Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15, (11), 1087-1093 (1999).
  3. Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160, (1), 191-198 (2015).
  4. Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9, (1), 17 (2017).
  5. Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320, (5880), 1224-1229 (2008).
  6. Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16, (5), 261-275 (2015).
  7. Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39, (2), 100-113 (2016).
  8. Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9, (1), 7929 (2019).
  9. Laccone, F. A. Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. Canada. CA2647125C (2007).
  10. Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, (2), 147-153 (2009).
  11. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  12. Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19, (7), 640-644 (2001).
  13. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285, (5433), 1569-1572 (1999).
  14. Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4, (12), 1449-1452 (1998).
  15. Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27, (9), 1572-1592 (2018).
  16. Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2, (3-5), 128-136 (2012).
  17. Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13, (21), 2679-2689 (2004).
  18. Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (16), 6033-6038 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics