ऑस्टियोसाइट मेचनोट्रांसडुक्शन को उत्तेजित करने और बोन रीमॉडलिंग के कार्यात्मक परिणामों का विश्लेषण करने के लिए एक लैब-ऑन-ए-चिप प्लेटफॉर्म

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Bioengineering

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Summary

यहां, हम एक प्रयोगशाला-ऑन-ए-चिप प्लेटफॉर्म के भीतर बोन रीमॉडलिंग का विश्लेषण करने के लिए प्रोटोकॉल पेश करते हैं। सेलुलर मैट्रिक्स को विकृत करके ऑस्टियोसाइट मेकेनोट्रांसडुक्शन को प्रेरित करने के लिए एक 3 डी मुद्रित यांत्रिक लोडिंग डिवाइस को मंच के साथ जोड़ा जा सकता है। मंच का उपयोग ऑस्टियोप्लास्ट और ऑस्टियोब्लास्ट (अवशोषण/गठन) से हड्डी रीमॉडलिंग कार्यात्मक परिणामों की मात्रा निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है।

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Truesdell, S. L., George, E. L., Van Vranken, C. C., Saunders, M. M. A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling. J. Vis. Exp. (159), e61076, doi:10.3791/61076 (2020).

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Abstract

बोन रीमॉडलिंग एक कसकर विनियमित प्रक्रिया है जो कंकाल विकास और मरम्मत के साथ-साथ यांत्रिक वातावरण में परिवर्तन के अनुकूल होने के लिए आवश्यक है। इस प्रक्रिया के दौरान, मेचनोसेसिटिव ऑस्टियोसाइट्स कैटाबोलिक ऑस्टियोब्लास्ट और एनाबोलिक ऑस्टियोब्लास्ट के बीच विरोधी प्रतिक्रियाओं को विनियमित करते हैं। इस प्रक्रिया को विनियमित करने वाले अत्यधिक जटिल सिग्नलिंग रास्तों को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हमारी प्रयोगशाला ने एक छोटे पैमाने पर प्रणाली के भीतर हड्डी पुनर्मॉडलिंग के कार्यात्मक परिणामों (गठन और अवशोषण) का विश्लेषण करने के लिए एक नींव प्रयोगशाला-ऑन-ए-चिप (एलओसी) मंच विकसित किया है। चूंकि बोन रीमॉडलिंग एक लंबी प्रक्रिया है जो हफ्तों से महीनों तक के आदेश पर होती है, इसलिए हमने सिस्टम के भीतर दीर्घकालिक सेल क्यूल्चरिंग प्रोटोकॉल विकसित किए। ओएस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोप्लास्ट नियंत्रण रेखा के भीतर कार्यात्मक गतिविधि सब्सट्रेट्स पर उगाए गए थे और सात सप्ताह तक बनाए रखे गए थे। इसके बाद, चिप्स को हड्डी गठन और अवशोषण की मात्रा के लिए अनुमति देने के लिए अलग किया गया। इसके अतिरिक्त, हमने एक 3 डी मुद्रित यांत्रिक लोडिंग डिवाइस तैयार किया है जो एलओसी प्लेटफॉर्म के साथ जोड़े करता है और सेलुलर मैट्रिक्स को विकृत करके ऑस्टियोसाइट मेचनोट्रांसडुक्शन को प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। हमने नियंत्रण रेखा के भीतर ऑस्टियोसाइट्स, ऑस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोप्लास्ट के लिए सेल क्यूलिटिंग प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है और बंध्याकरण और साइटोटॉक्सिकिटी की चिंताओं को दूर किया है। यहां, हम एलओसी को बनाने और स्टरलाइज करने, कार्यात्मक सब्सट्रेट्स पर सीडिंग कोशिकाओं, यांत्रिक भार को प्रेरित करने और अंत बिंदु परिणामों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एलओसी को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हमारा मानना है कि इन तकनीकों को हड्डी remodeling के लिए एक सच्चे अंग पर एक चिप विकसित करने के लिए नींव रखना ।

Introduction

हड्डी एक अत्यधिक गतिशील ऊतक है जिसके लिए तीन प्रमुख कोशिका प्रकारों के बीच जटिल समन्वय की आवश्यकता होती है: ऑस्टियोसाइट्स, ऑस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोप्लास्ट। इन कोशिकाओं के बीच बहुकोशिकीय बातचीत हड्डी के नुकसान के लिए जिम्मेदार होती है जो पक्षाघात और दीर्घकालिक गतिहीनता के दौरान और हड्डी गठन के लिए होती है जो विकास और व्यायाम के जवाब में होती है। ऑस्टियोसाइट्स, सबसे प्रचुर मात्रा में हड्डी कोशिका प्रकार, हड्डी पर लागू यांत्रिक उत्तेजनाओं के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होते हैं। यांत्रिक उत्तेजना ऑस्टियोसाइट मेटाबोलिक गतिविधि को बदल देती है और प्रमुख संकेत अणुओं में वृद्धि होती है1,2. इस प्रक्रिया के माध्यम से, जिसे मेचनोट्रांसडुक्शन के रूप में जाना जाता है, ऑस्टियोसाइट्स सीधे ऑस्टियोब्लास्ट (हड्डी बनाने वाली कोशिकाओं) और ऑस्टियोप्लास्ट (बोन रिसोरबिंग कोशिकाओं) की गतिविधियों का समन्वय कर सकते हैं। हड्डी होमोस्टोसिस को बनाए रखने के लिए हड्डी गठन और हड्डी अवशोषण दरों के बीच एक तंग विनियमन की आवश्यकता होती है; हालांकि, इस प्रक्रिया में व्यवधान ों के परिणामस्वरूप ऑस्टियोपोरोसिस या ऑस्टियोपेट्रोसिस जैसे रोग राज्य हो सकते हैं।

इन तीन सेल प्रकारों के बीच बातचीत की जटिलता माइक्रोफ्लूइडिक और लैब-ऑन-ए-चिप (एलओसी) प्रौद्योगिकियों का उपयोग करते हुए जांच करने के लिए अच्छी तरह से उधार देता है। इस उद्देश्य के लिए, हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में हड्डी पुनर्मॉडलिंग प्रक्रिया में अस्थि अवशोषण और गठन (कार्यात्मक परिणामों) का विश्लेषण करने के लिए एक एलओसी मंच की अवधारणा का सबूत स्थापित किया है। मंच सेलुलर बातचीत, बदल लोडिंग वातावरण, और जांच दवा स्क्रीनिंग के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हाल के वर्षों में, हड्डी के रीमॉडलिंग को विनियमित करने वाले आणविक सिग्नलिंग रास्तों की जांच के लिए विभिन्न माइक्रोफ्लूइडिक उपकरण विकसित किए गए हैं; हालांकि, इन प्रणालियों के कई अप्रत्यक्ष मार्कर के माध्यम से रीमॉडलिंग की मात्रा है कि कार्यात्मक गतिविधि3,4 ,5,,66,7का संकेत कर रहे हैं ., हमारी प्रणाली का एक लाभ यह है कि इसका उपयोग कार्यात्मक परिणामों के प्रत्यक्ष परिमाणीकरण के लिए किया जा सकता है। बोन रीमॉडलिंग एक दीर्घकालिक प्रक्रिया है। इस प्रकार, अस्थि अवशोषण और गठन के प्रत्यक्ष परिमाणीकरण के लिए एक एक कुल प्रणाली की आवश्यकता होती है जिसे न्यूनतम कई हफ्तों से,8,9,10,,11महीनों तक बनाए रखा जा सकता है।, इस प्रकार, एलओसी प्लेटफॉर्म को विकसित करते समय, हमने गठन और अवशोषण के लिए आवश्यक दीर्घकालिक खेती प्रोटोकॉल स्थापित किए और सात सप्ताह11तक के लिए सिस्टम के भीतर कोशिकाओं को बनाए रखा है। इसके अतिरिक्त, हमने मंच में दोनों सेल प्रकारों के लिए उपयुक्त खेती सब्सट्रेट्स को शामिल किया; ऑस्टियोप्लास्ट सीधे हड्डी पर सुसंस्कृत थे, और ऑस्टियोब्लास्ट, जिन्हें प्लास्टिक अनुयायी माना जाता है, पॉलीस्टीरिन डिस्क पर सुसंस्कृत थे। इसके अलावा, हमने11,,12के पुनर्मॉडलिंग विश्लेषण के लिए बंध्यता, दीर्घकालिक साइटोटॉक्सिकिटी और चिप डिसअसिबल से संबंधित मुद्दों को संबोधित किया ।

एलओसी प्लेटफॉर्म का उपयोग मैट्रिक्स विरूपण के माध्यम से ऑस्टियोसाइट मेचनोट्रांसडुक्शन को प्रेरित करने के लिए भी किया जा सकता है। एलओसी के साथ जोड़ी बनाने के लिए एक 3डी मुद्रित यांत्रिक लोडिंग उपकरण विकसित किया गया था और कोशिकाओंको 13तक फैलाने के लिए विमान की डिटेंक्शन से एक स्थिर लागू किया गया था । इस मैकेनिकल लोड को समायोजित करने के लिए एलओसी के भीतर कुएं की गहराई बढ़ाई गई थी। इस छोटे पैमाने पर, सरल यांत्रिक लोडिंग डिवाइस को सीमित इंजीनियरिंग अनुभव के साथ प्रयोगशालाओं द्वारा आसानी से उत्पादित किया जा सकता है, और हमने पहले 3 डी मुद्रित घटकों13के चित्र साझा किए हैं। वर्तमान कार्य में, हम नियंत्रण रेखा के सफल उपयोग के लिए आवश्यक कुछ उपन्यास तकनीकों का प्रदर्शन करते हैं । विशेष रूप से, हम चिप निर्माण, कार्यात्मक सब्सट्रेट्स पर सेल सीडिंग, यांत्रिक लोडिंग और मात्राीकरण को फिर से तैयार करने के लिए चिप डिसअसम्बले का प्रदर्शन करते हैं । हमारा मानना है कि इन तकनीकों का स्पष्टीकरण एक दृश्य प्रारूप से लाभान्वित होता है।

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Protocol

1. चिप मास्क तैयार करना

नोट: चरण 1.1 - 1.3 केवल चिप मास्क की प्रारंभिक प्राप्ति पर एक बार प्रदर्शन करने की आवश्यकता है। वे सुनिश्चित करते हैं कि मुखौटा उपयोग के दौरान धनुष नहीं करता है। माइक्रोफ्लूइडिक मास्क का डिजाइन पहले11,14बताया गया था । मास्क इन-हाउस डिजाइन किए गए थे और उच्च रिज़ॉल्यूशन स्टीरियोलिथोग्राफी(चित्रा 1ए)का उपयोग करके व्यावसायिक रूप से गढ़े गए थे।

  1. चिपकने वाले से इस सतह की रक्षा के लिए प्लास्टिक शीटिंग के साथ मुखौटा की शीर्ष सतह को कवर करें। स्प्रे चिपकने वाला का उपयोग करके चिप मास्क को समान रूप से आकार की एक्रेलिक शीट में सुरक्षित करें। चिपकने वाले को पूरी तरह से इलाज करने की अनुमति देने के लिए रातोंरात टुकड़ों को एक साथ क्लैंप करें। चिपकने के बाद सूखी हो जाए तो मास्क के ऊपर से प्लास्टिक की चादर निकाल लें।
  2. एक्रेलिक शीट के नीचे को डबल-साइडेड टेप का उपयोग करके 3 डी मुद्रित लेवलिंग बॉक्स(सप्लीमेंट्री फिगर 1, सप्लीमेंट्री फाइल्स 1-4)से अटैच करें। एक तंग बंधन सुनिश्चित करने के लिए दृढ़ता से दबाएं।
  3. वाटरप्रूफ सीलेंट के साथ लेवलिंग बॉक्स की अलग दीवार के पास किसी भी छोटे उद्घाटन को सील करें। सीलेंट को 24 घंटे तक इलाज करने की अनुमति दें।
  4. 70% इथेनॉल (EtOH) के साथ मुखौटा की सतह को साफ करें। ओवन में वांछित चिप मास्क के साथ लेवलिंग बॉक्स रखें। मास्क के शीर्ष स्तर को सुनिश्चित करने के लिए एक डिजिटल प्रोट्रैक्टर का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो तो समतल शिकंजा समायोजित करें।

2. पीडीएम निर्माण

नोट: एक उथले-अच्छी तरह से (1 मिमी) चिप डिजाइन का उपयोग कार्यात्मक गतिविधि (गठन और अवशोषण) परख के लिए किया जाता है, और यांत्रिक लोडिंग अध्ययनों के लिए एक डीप-वेल (10 मिमी) चिप डिजाइन का उपयोग किया जाता है। डीप-वेल के नीचे एक अलग पतली पीडीएफ झिल्ली(चित्रा 1बी)संलग्न करके बनाई गई है।

  1. ढक्कन परत (परत 1)
    1. प्लास्टिक कप में 63 ग्राम पीडीएम प्रीपॉलिमर और 6.3 ग्राम इलाज एजेंट (10:1 अनुपात) को मिलाएं। 30 न्यूनतम के लिए वैक्यूम डेसीकेटर में डिस्पोजेबल सेल स्पैटुला और डेगास के साथ अच्छी तरह मिलाएं।
    2. धीरे-धीरे तैयार लेवलिंग बॉक्स में मिश्रण डालें। पीडीएम को 30 मिन के लिए बैठने दें और फिर 18 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
    3. एक पतला प्रयोगशाला स्पैटुला के साथ पीडीएम के किनारों को ढीला करें और पॉलीमर शीट को समतल बॉक्स से हटा दें।
    4. स्केलपेल और 3 डी मुद्रित टेम्पलेट का उपयोग करके व्यक्तिगत ढक्कन को आकार (70 मिमी x 34 मिमी) में काटें।
    5. एक बायोप्सी पंच (1 मिमी व्यास) के साथ प्रत्येक ढक्कन के माध्यम से पंच पहुंच छेद।
    6. पैकेजिंग टेप के साथ ढक्कन को साफ करें।
      नोट: यदि ढक्कन तुरंत इस्तेमाल नहीं किया जा रहा है, पैकेजिंग टेप में प्रत्येक लपेटें और कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर ।
  2. खैर और माइक्रोचैनल परत (लेयर 2)
    1. एक प्लास्टिक कप में पीडीएम प्रीपॉलिमर और क्यूरिंग एजेंट (10:1 अनुपात) को मिलाएं। उथले-अच्छी तरह से डिजाइन के लिए 43 ग्राम प्रीपॉलिमर और 4.3 ग्राम क्यूरिंग एजेंट की आवश्यकता होती है, और डीप-वेल डिज़ाइन को 227 ग्राम प्रीपॉलिमर और 22.7 ग्राम क्यूरिंग एजेंट की आवश्यकता होती है। 30 मिन के लिए पॉलीमर और डेगास को सख्ती से मिलाएं।
      नोट: यह 152.4 मिमी x 152.4 मिमी का मुखौटा आयाम मानता है।
    2. धीरे-धीरे उपयुक्त पूर्व-समतल मास्क पर मिश्रण डालें। पीडीएम को 30 मिन के लिए बैठने दें और फिर 18 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
    3. एक पतला प्रयोगशाला स्पैटुला के साथ पीडीएम के किनारों को ढीला करें और ध्यान से मुखौटा से दूर बहुलक छील। व्यक्तिगत चिप्स को काटने के लिए स्केलपेल और 3डी मुद्रित टेम्पलेट का उपयोग करें।
      नोट: लोडिंग अध्ययनों के लिए यह महत्वपूर्ण है कि चिप आयाम (70 x 34 मिमी) सटीक हैं और यह कि अच्छी तरह से चिप के केंद्र में स्थित है।
    4. सतह पैकेजिंग टेप के साथ पीडीएफ साफ करें।
      नोट: यदि चिप्स का उपयोग तुरंत नहीं किया जा रहा है, तो प्रत्येक चिप को पैकेजिंग टेप में लपेटें और आरटी पर स्टोर करें।
  3. पतली पीडीएफ झिल्ली (परत 3)
    नोट: इस परत का उपयोग केवल डीप-वेल डिजाइन के लिए किया जाता है।
    1. एक प्लास्टिक कप में 12.7 ग्राम पीडीएम प्रीपॉलिमर और 1.3 ग्राम इलाज एजेंट (10:1 अनुपात) जोड़ें। 30 मिन के लिए सख्ती और डेगा मिलाएं।
    2. धीरे-धीरे तैयार लेवलिंग बॉक्स में बहुलक डालें और जितना संभव हो उतना पीडीएफको हटाने के लिए प्लास्टिक कप को अच्छी तरह से कुरेदलें।
    3. पूरी सतह पर पीडीएफ फैलाने के लिए सेल स्पैटुला का उपयोग करें।
      नोट: यदि बहुलक मैन्युअल रूप से नहीं फैलता है, तो बहुलक को एक समान शीट बनाने से रोकने के लिए सतह तनाव पर्याप्त होगा।
    4. पीडीएम को 30 मिन के लिए बैठने दें और फिर 18 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
    5. पीडीएम के किनारों को एक पतला स्पैटुला के साथ ढीला करें और ध्यान से लेवलिंग बॉक्स से पीडीएम शीट को हटा दें। व्यक्तिगत झिल्ली में कटौती करें जो परत 2 के आयामों से मेल खाती हैं।
    6. कैलिपर्स का उपयोग करझिल्ली के केंद्र में झिल्ली मोटाई को मापें। वांछित मोटाई (0.5 मिमी ± 0.1 मिमी) के बाहर की किसी भी झिल्ली को त्यागें।
    7. पैकेजिंग टेप के साथ सावधानी से झिल्ली को साफ करें और पैराफिन फिल्म के एक टुकड़े पर रखें।
      नोट: यदि झिल्ली का उपयोग तुरंत नहीं किया जा रहा है, तो पैकेजिंग टेप के साथ झिल्ली के शीर्ष को कवर करें और आरटी पर स्टोर करें।

3. कार्यात्मक गतिविधि सब्सट्रेट्स

नोट: पॉलीस्टीरिन डिस्क और हड्डी वेफर्स को कुओं के नीचे से जोड़ा जाना चाहिए जिनका उपयोग क्रमशः ऑस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोप्लास्ट संस्कृतियों के लिए किया जाएगा।

  1. पॉलीस्टीरिन डिस्क(चित्रा 1सी)
    1. एक ऊतक संस्कृति के पीछे की ओर मास्किंग टेप रखें पॉलीस्टीरिन कवरस्लिप का इलाज किया। तेज कॉर्क-बोरर (5.4 मिमी व्यास) का उपयोग करके कवरस्लिप से परिपत्र डिस्क काटें। 70% EtOH में डिस्क जलमग्न और रात भर छोड़ दें।
    2. धीरे-धीरे डिस्क की शीर्ष सतह को 70% EtOH में भिगोए गए कपास इत्तला के साथ फ़ोरेट किया गया। सुनिश्चित करें कि डिस्क के बाहरी किनारे को अच्छी तरह से साफ किया जाए।
    3. दो जोड़े संदंश का उपयोग करके, डिस्क पकड़ें और मास्किंग टेप समर्थन को हटा दें। डिस्क का इलाज साइड नीचे रखें और एक कपास इत्तला दे दी एप्लिकेटर के साथ पीछे की ओर साफ करें।
    4. एक कपास इत्तला दे दी एप्लिकेटर के लकड़ी के अंत को बिना ठीक पीडीएफ के एक डिगास मिश्रण में डुबोएं और वांछित अच्छी तरह से नीचे बहुलक की एक छोटी मात्रा रखें।
      नोट: शेष ठीक नहीं पीडीएफएम -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    5. पॉलीस्टीरिन डिस्क, इलाज साइड ऊपर रखें, कुएं में और धीरे-धीरे एक सूती झाड़ू के साथ डिस्क पर नीचे दबाएं। सुनिश्चित करें कि कोई ठीक नहीं पीडीएम डिस्क के इलाज पक्ष के संपर्क में आता है।
      नोट: यदि पीडीएफ डिस्क की उपचारित सतह के संपर्क में आता है, तो डिस्क को अच्छी तरह से हटा दें और एक नई डिस्क के साथ 3.1.4 और 3.1.5 चरणदोहराएं।
    6. चिप को 30 मिन के लिए लेवल सरफेस पर बैठने दें और फिर 4 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
  2. बोन वेफर्स
    1. 100 मिमी पकवान के तल पर हड्डी वेफर (6 मिमी व्यास, 0.4 मिमी मोटी) रखने के लिए संदंश का उपयोग करें। वेफर को संदंश के साथ स्थिर रखें और धीरे-धीरे स्केलपेल के साथ वेफर के पीछे एक 'एक्स' नक़्क़ाशी करें।
      नोट: इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान, 'एक्स' का उपयोग वेफर के पीछे और सतह के बीच अंतर करने के लिए किया जाता है जिस पर कोशिकाओं को वरीयता दी गई थी।
    2. वांछित अच्छी तरह से नीचे तक थोड़ी मात्रा में बिना ठीक पीडीएफई जोड़ने के लिए कपास इत्तला देने वाले एप्लिकेटर के लकड़ी के छोर का उपयोग करें। हड्डी वेफर, चिह्नित पक्ष नीचे, कुएं में रखें और वेफर को दबाने के लिए कपास इत्तला दे दी एप्लिकेटर का उपयोग करें।
    3. चिप को 30 मिन के लिए लेवल सरफेस पर बैठने दें और फिर 4 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।

4. चिप विधानसभा और नसबंदी

  1. मध्यम रेडियो फ्रीक्वेंसी (आरएफ) पावर सेटिंग (लगभग 10.2 डब्ल्यू के बराबर) का उपयोग करके 30 एस के लिए प्लाज्मा क्लीनर के साथ परत 1 और लेयर 2 की सतहों को सक्रिय करें।
  2. परत 1 में पहुंच छेद को परत 2 में माइक्रोचैनलों के साथ संरेखित करें और मजबूती से दो परतों को एक साथ दबाएं।
  3. डीप-वेल डिजाइन के लिए, लेयर 2 और लेयर 3 के साथ चरण 4.1 दोहराएं। प्लाज्मा उपचार के दौरान, परत 3 की पैराफिन फिल्म को एक सपाट सतह पर संलग्न करने के लिए दो तरफा टेप का उपयोग करें।
  4. पीडीएम झिल्ली से अतिरिक्त सामग्री को ट्रिम करने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। ध्यान से चिप के नीचे से पैराफिन फिल्म की चादर छील
  5. पीडीएम परतों के बीच बांड की ताकत बढ़ाने के लिए 10 न्यूनतम के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर चिप सेंकना।
  6. ढक्कन में एक्सेस छेद में कोण वितरण युक्तियां (18 गेज, 0.5 में, 90 डिग्री) डालें। दो भाग एपॉक्सी के साथ ढक्कन पर डिस्पेंसिंग टिप्स सुरक्षित करें। प्रत्येक वितरण टिप के आसपास एपॉक्सी लागू करने के लिए माइक्रोपाइपेट टिप का उपयोग करें।
  7. एपॉक्सी के पूरी तरह ठीक होने के बाद, सतह चिप को 70% इटोह के साथ साफ करती है और बायोसेफ्टी कैबिनेट में जगह देता है। जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर बाद के सभी कदम ों का प्रदर्शन करें।
  8. बाँझ सिलिकॉन ट्यूबिंग (1/32'आईडी, लंबाई में ~ 10 सेमी) के साथ वितरण युक्तियों के लिए एक 5 mL सिरिंज कनेक्ट और कम से कम 30 एस के लिए 70% EtOH के साथ पूरी चिप भरें। उथले अच्छी तरह से डिजाइन के लिए, एक सिरिंज पंप के साथ सभी तरल पदार्थ 4 mL/h की प्रवाह दर के लिए सेट प्रशासन । गहरे अच्छी तरह से डिजाइन के लिए, धीरे-धीरे हाथ से सिरिंज वितरण करके सभी तरल पदार्थों को प्रशासित करें।
  9. चिप से EtOH निकालें और रात भर यूवी प्रकाश के साथ चिप बंध्याकरण।
  10. चिप को डीएच2ओ से 3 बार धोएं, चिप को डीएच2ओ से भरें, डिस्पेंसिंग टिप्स से ट्यूबिंग निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

5. मैकेनिकल लोडिंग डिवाइस असेंबली

नोट: 3 डी मुद्रित यांत्रिक लोडिंग डिवाइस(चित्रा 2ए-सी)के लिए डिजाइन और निर्माण प्रक्रियाओं को पहले वर्णित किया गया था और मुद्रित घटकों के लिए सभी डिजाइन फाइलों को पहले13प्रदान किया गया है।

  1. 30 मिन के लिए लोडिंग डिवाइस के सभी घटकों को 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव करें।
    नोट: मुद्रित घटकों के युद्ध से बचने के लिए, प्रत्येक टुकड़े को व्यक्तिगत रूप से पन्नी में लपेटें और ऑटोक्लेव प्रक्रिया के दौरान एक कठिन सपाट सतह पर रखें। धातु हार्डवेयर एक साथ लपेटा जा सकता है। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर बाद के सभी कदमों को पूरा करें।
  2. प्लेटन के शाफ्ट के चारों ओर एक संपीड़न वसंत रखें और बेस(चित्रा 2डी)के तल पर केंद्रीय छेद में प्लेटन डालें।
  3. चार सेल्फ टैपिंग शिकंजा का उपयोग करके डायल ब्लॉक को आधार के नीचे से अटैच करें।
  4. केंद्रीय पेंच के चारों ओर एक दूसरा संपीड़न वसंत रखें। डायल के नीचे हेक्सागोनल के आकार के छेद में पेंच डालें और डायल ब्लॉक के केंद्र में पिरोया छेद में विधानसभा पेंच।
  5. पेंच चार पुरुष-महिला गतिरोध आधार के नीचे में ।
  6. डिवाइस से सुस्त निकालें डायल वामावर्त मोड़ जब तक प्लेटन के शीर्ष आधार के शीर्ष से नीचे है । फिर धीरे-धीरे डायल को दक्षिणावर्त तब तक चालू करें जब तक कि प्लेटन का शीर्ष आधार के शीर्ष के साथ स्तर न हो जाए।

6. प्रयोग

नोट: कार्यात्मक गतिविधि प्रयोगों के लिए प्रोटोकॉल पहले11,12प्रदान किए गए थे ।

  1. लोडिंग अध्ययन(चित्रा 3)
    1. चरण 4.9 के बाद, डीप-वेल चिप से डीएच2ओ को हटाने के लिए 5 मिलील सिरिंज का उपयोग करें। 0.02 मीटर एसीटिक एसिड में 0.02 मीटर एसिटिक एसिड में 0.15 मिलीग्राम/mL प्रकार मैं कोलेजन (सीटीआई) के 200 माइक्रोन के साथ कुएं के नीचे 1 घंटे के लिए कोट करें।
    2. कैल्शियम और मैग्नीशियम (DPBS++) के साथ Dulbecco के फॉस्फेट-बफर खारा के साथ चिप तीन बार कुल्ला ।
    3. चिप धारक में चिप रखें और एमएलओ-वाई4 ऑस्टियोसाइट्स के साथ बीज न्यूनतम आवश्यक अल्फा मीडियम (MEMα) में 2 x 104 कोशिकाओं/mL के घनत्व पर 5% बछड़े सीरम, 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक हैं ।
    4. डिस्पेंसिंग टिप्स से ट्यूबिंग निकालें और चिप को डीप-वेल कल्चर डिश (150 एमएम x 25 एमएम) में रखें। 37 डिग्री सेल्सियस और 72 घंटे के लिए 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    5. सुझावों को वितरित करने के लिए बाँझ टयूबिंग संलग्न करें और चिप से खर्च संस्कृति माध्यम को हटाने के लिए 5 मिलीएल सिरिंज का उपयोग करें। चिप को फिर से भरने के लिए धीरे-धीरे ताजा संस्कृति माध्यम में बांटें।
    6. चिप धारक को लोडिंग डिवाइस बेस के शीर्ष पर आयताकार इनसेट में रखें। लोडिंग डिवाइस ढक्कन पर स्थित स्लॉट के माध्यम से ट्यूबिंग खिलाएं और ढक्कन को चार पैन हेड शिकंजा और हेक्स नट्स के साथ आधार पर सुरक्षित करें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि ढक्कन स्तर बना हुआ है, पहले दो शिकंजा सुरक्षित करें जो शेष दो शिकंजा को सुरक्षित करने से पहले एक-दूसरे से तिरछे स्थित हैं।
    7. वांछित प्लेटन विस्थापन तक पहुंचने तक डायल दक्षिणावर्त मोड़ कर कोशिकाओं पर लोड लागू करें।
      नोट: डिवाइस इतना है कि डायल के एक रोटेशन 1 मिमी के एक प्लेटन विस्थापन के बराबर है बनाया गया है । पीडीएम झिल्ली के शीर्ष पर उत्पन्न तनाव क्षेत्र को पहले परिमित तत्व विश्लेषण (एफईए)13का उपयोग करके प्लेटन विस्थापन के एक समारोह के रूप में मॉडलिंग की गई थी।
    8. लोडिंग डिवाइस को एक खाली पी1000 माइक्रोपाइपेट टिप बॉक्स में रखें। 15 मिन के लिए लागू लोड के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: यहां उपयोग की जाने वाली लोडिंग समय अवधि एक उदाहरण के रूप में कार्य करती है। वैकल्पिक लोडिंग समय का उपयोग किया जा सकता है।
    9. इनक्यूबेशन बाद, डायल काउंटरक्लॉकवाइज को तब तक मोड़कर कोशिकाओं से लोड निकालें जब तक कि प्लेटन मूल शुरुआती स्थिति में नहीं लौटता। डिवाइस से ढक्कन निकालें और चिप धारक को डीप-वेल कल्चर प्लेट में रखें। 90-मिन पोस्ट लोड वसूली अवधि के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: फिर, यहां उपयोग की जाने वाली वसूली समय अवधि एक उदाहरण के रूप में कार्य करती है। वैकल्पिक वसूली समय का उपयोग किया जा सकता है। दीर्घकालिक अध्ययन के लिए, हर 72 घंटे कोशिकाओं को खिलाएं।
    10. चिप से वातानुकूलित माध्यम को हटाने के लिए 5 मिलीएल सिरिंज का इस्तेमाल करें।
      नोट: इस माध्यम को बचाया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    11. चिप धारक से चिप निकालें और पीडीएम ढक्कन और अच्छी तरह से परत के बीच बांड को तोड़ने के लिए एक पतला स्पैटुला का उपयोग करें।
      नोट: सेलुलर परख अब एक सेल संस्कृति प्लेट के लिए स्थापित किसी भी प्रोटोकॉल के बाद किया जा सकता है ।

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Representative Results

उथले-अच्छी तरह से विन्यास का उपयोग ऑस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोप्लास्ट की कार्यात्मक गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। ऑस्टियोब्लास्ट के माध्यम से अस्थि गठन और ऑस्टियोप्लास्ट के माध्यम से अवशोषण के लिए कई हफ्तों से महीनों के आदेश पर खेती के समय की आवश्यकता होती है। MC3T3-E1 पूर्व ऑस्टियोब्लास्ट से अस्थि गठन अलीजारिन लाल और वॉन कोसा दाग11,,15का उपयोग कर के निर्धारित किया गया था । दिन 49 पर, अलीज़रिन लाल से दाग औसत सतह क्षेत्र 10.7% ± 2.2% (मतलब ± मतलब की मानक त्रुटियों)11था। वॉन कोसा से दागित औसत सतह क्षेत्र 6.4% ± 1.6%11था। चित्रा 4 दिन 49 पर ऑस्टियोब्लास्ट संस्कृतियों से विशिष्ट गठन के परिणाम ों को दिखाता है जो अलीज़रिन लाल और वॉन कोसा से दागित हैं। RAW264.7 पूर्व ऑस्टियोप्लास्ट से अस्थि अवशोषण toluidine नीले धुंधला 11,15का उपयोग कर निर्धारित किया गया था । 30 दिन में औसत सतह क्षेत्र toluidine नीले रंग से दाग 30.4% ± 4.5%11था . चित्रा 4बी 30 दिन में toluidine नीले रंग के साथ दाग ऑस्टियोप्लास्ट संस्कृतियों से ठेठ हड्डी अवशोषण परिणाम से पता चलता है । अवशोषण गड्ढों की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की गई थी। विशिष्ट परिणाम चित्र 4सीमें दिखाए जाते हैं। ये परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि डिवाइस के भीतर की कोशिकाएं कम से कम सात सप्ताह तक व्यवहार्य और कार्यात्मक रूप से सक्रिय रहती हैं।

डीप-वेल चिप कॉन्फ़िगरेशन को समायोजित करने के लिए एक 3 डी मुद्रित लोडिंग डिवाइस डिज़ाइन और निर्मित किया गया था। साथ में, यह प्रणाली एक स्थिर आउट-ऑफ-प्लेन डिटेनेशन के माध्यम से कोशिकाओं को खींचकर ऑस्टियोसाइट मेचनोट्रांसडुक्शन को प्रेरित कर सकती है। चरण 4.9 में वर्णित चिप के 48 एच इनक्यूबेशन सेल व्यवहार्यता और विशिष्ट आकृति विज्ञान को बनाए रखने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया साबित हुई है। चित्रा 5एक के साथ और इस इनक्यूबेशन अवधि के बिना चिप्स में वरीयता प्राप्त ७२ एच में MLO-Y4 ऑस्टियोसाइट्स के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है । लोडिंग के मुकाबलों के दौरान, ऑस्टियोसाइट्स को पीडीएम झिल्ली पर प्रेरित एक तनाव ढाल के संपर्क में किया गया था जिस पर कोशिकाओं को वरीयता दी गई थी(पूरक वीडियो 1)। इस प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न समकक्ष उपभेदों को एफईए13 के साथ मॉडलिंग की गई थी और पीडीएफएम झिल्ली के शीर्ष पर उत्पादित औसत समकक्ष तनाव निर्धारित किया गया था। चित्रा 5बी 1 और 2 मिमी के बीच मूल्यों के लिए औसत समकक्ष तनाव और प्लेटन विस्थापन के बीच संबंध दिखाता है। प्रेरित तनाव ढाल का एक प्रतिनिधि गर्मी नक्शा चित्रा 5सीमें दिखाया गया है । इस उदाहरण में, 1.5 मिमी के प्लेटन विस्थापन ने झिल्ली के शीर्ष पर 12.29% का औसत बराबर तनाव उत्पन्न किया। यह मॉडल यह भी दर्शाता है कि कुएं के केंद्र के पास प्रेरित उपभेद अपेक्षाकृत कम हैं और धीरे-धीरे रेडियल रूप से जावक बढ़ाते हैं, जिसमें प्लेटन के बाहरी किनारे से सीधे ऊपर उत्पन्न अधिकतम उपभेद होते हैं। लोडिंग के बाद, सेल व्यवहार्यता का विश्लेषण लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज धुंधला और एनेक्सिन वी और डेड सेल परख14,,16के साथ किया गया था। विशिष्ट परिणाम क्रमशः चित्रा 5डी, ईमें दिखाए जाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस। (A)चिप मास्क को गढ़ना और समतल करना। (बाएं) सीएडी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके घर में डिजाइन किए गए गहरे-अच्छी चिप मास्क की योजनाबद्ध। (मध्य) गहरे-अच्छी तरह से चिप मास्क की छवि जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्टीरियोलिथोग्राफी का उपयोग करके व्यावसायिक रूप से मुद्रित की गई थी। (दाएं) मास्क को 3 डी प्रिंटेड लेवलिंग बॉक्स के भीतर रखा गया है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि चिप्स की परत 2 की कास्टिंग के दौरान मास्क स्तर बना हुआ है। (ख)डिवाइस के उथले-अच्छी तरह से और गहरे-अच्छी तरह से डिजाइनों के योजनाबद्ध नमूने । (शीर्ष) उथले-अच्छी तरह से डिजाइन का उपयोग ऑस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोप्लास्ट की कार्यात्मक गतिविधि (गठन और अवशोषण) का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। यह विन्यास दो पीडीएम परतों से बनता है। परतों को एक साथ सील करने से पहले एक कार्यात्मक गतिविधि सब्सट्रेट को संस्कृति के नीचे तक सुरक्षित किया गया था। पॉलीस्टीरिन डिस्क और अस्थि वेफर्स का उपयोग क्रमशः ऑस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोप्लास्ट संस्कृतियों के लिए किया जाता था। (नीचे) ओस्टियोसाइट्स के लिए यांत्रिक भार लागू करने के लिए डीप-वेल डिजाइन का उपयोग किया गया था। इस विन्यास में तीन पीडीएम परतें होती हैं। संस्कृति के नीचे अच्छी तरह से विकृत पीडीएम झिल्ली (परत 3) द्वारा बनाई गई है। (ग)ऑस्टियोब्लास्ट संस्कृतियों के लिए उपयोग की जाने वाली पॉलीस्टीरिन डिस्क के लिए निर्माण कदम। एक ऊतक संस्कृति का इलाज कवरस्लिप के पीछे मास्किंग टेप के साथ चिह्नित किया गया था । एक कॉर्क-बोरर के साथ व्यक्तिगत डिस्क को काट दिया गया था। डिस्क को इथेनॉल और कॉटन झाड़ू से साफ किया गया। टेप समर्थन हटा दिया गया था और डिस्क PDMS संस्कृति के नीचे अच्छी तरह से संलग्न किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: यांत्रिक लोडिंग डिवाइस का डिजाइन और असेंबली। (A)इकट्ठे यांत्रिक लोडिंग डिवाइस की छवि। जब पीडीएम चिप के गहरे-अच्छी तरह से डिजाइन के साथ मिलकर, लोडिंग डिवाइस एक विकृत झिल्ली के लिए विमान की डिटेंक्शन से बाहर लागू करके कोशिकाओं को फैलाता है। (ख)डिवाइस का विस्फोट-दृश्य । नीले रंग में दिखाए गए सभी भागों को गर्मी प्रतिरोधी पॉलीलैक्टिक एसिड फिलामेंट के साथ 3 डी मुद्रित किया गया था। सभी हार्डवेयर स्टेनलेस स्टील है। }Cलोडिंग डिवाइस का स्क्रू जैक मैकेनिज्म। केंद्रीय पेंच (नारंगी) का रोटेशन बेस के माध्यम से प्लेटन (हरे) को ऊपर की ओर धकेलता है। प्लेटन का ऊपर की ओर आंदोलन गहरे-अच्छी चिप की पीडीएम झिल्ली को विकृत करता है जिस पर कोशिकाओं को वरीयता दी गई है। (D)लोडिंग डिवाइस की विधानसभा प्रक्रिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: मैकेनिकल लोडिंग प्रयोग। सभी तरल पदार्थ प्रशासित और एक 5 मिलीआर का उपयोग कर चिप से हटा दिया गया था उपयोग ट्यूबिंग से जुड़े । इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम सेल सीडिंग से पहले बाँझ आसुत पानी के साथ ४८ एच इनक्यूबेशन है । इसइनक्यूबेशन कोशिकाओं के बिना कम व्यवहार्यता और असामान्य आकृति विज्ञान दिखाया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: विशिष्ट कार्यात्मक गतिविधि परिणाम। (ए)ठेठ गठन के परिणाम अलीज़रिन लाल (बाएं) और वॉन कोसा (दाएं) से प्रेरित MC3T3-E1 ऑस्टियोब्लास्ट संस्कृतियों से ४९ दिन में दाग । संपूर्ण डिस्क छवियां व्यास में 5.4 मिमी मापते हैं। (ख)परमाणु कारक कापा-बी लिगांड (रैंकल) के रिसेप्टर एक्टिवेटर के साथ प्रेरित RAW264.7 प्रीओस्टेओलस्ट से विशिष्ट ऑस्टियोप्लास्ट अवशोषण परिणाम। कोशिकाओं को हड्डी वेफर्स पर सुसंस्कृत और 30 दिन में toluidine नीले रंग के साथ दाग रहे थे । (ग)हड्डी वेफर्स पर अवशोषण गड्ढों की उपस्थिति की पुष्टि करने वाली विशिष्ट स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियां। शीर्ष छवि में स्केल बार नीचे की छवि में 200 माइक्रोन और स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है 50 μm का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: ऑस्टियोसाइट्स पर यांत्रिक रूप से प्रेरित तनाव का प्रभाव। (क)सेल सीडिंग से पहले आसुत पानी के साथ 48 घंटे की इनक्यूबेशन के साथ निर्मित गहरे कुएं में 72 घंटे में एमएलओ-वाई4 ऑस्टियोसाइट्स की छवियां । (ख)फिनिट तत्व विश्लेषण का उपयोग लोडिंग डिवाइस प्लेटन के विस्थापन के आधार पर विकृत पीडीएम झिल्ली के शीर्ष पर उत्पन्न औसत समकक्ष तनाव को मॉडल करने के लिए किया गया था। 1.0 मिमी और 2.0 मिमी के बीच विस्थापन से परिणाम दिखाए गए हैं। (ग)1.5 मिमी के प्लेटन विस्थापन के लिए पीडीएम झिल्ली पर प्रेरित मॉडलिंग स्ट्रेन ग्रेडिएंट का हीट मैप।(डी)1.5 मिमी प्लेटन विस्थापन का उपयोग करके फैलाई गई दवा प्रेरित ऑस्टियोसाइट्स के लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज दाग के विशिष्ट परिणाम। कुएं के बाहरी किनारे के पास एक हल्का सेल धुंधला देखा जाता है, जो कोशिका क्षति और/या मृत्यु के संकेत वाले उच्च तनाव मूल्यों के स्थान से मेल खाता है । (ई)प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री परिणाम लोड-प्रेरित एपोप्टोसिस के परिणाम जो एक एनेक्सिन वी और मृत सेल परख द्वारा इंगित किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 1
पूरक चित्रा 1: अलग दीवार के साथ 3 डी मुद्रित समतल बॉक्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सप्लीमेंट्री फाइल 1: लेवलिंग बॉक्स सीएडी फाइल 1। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

सप्लीमेंट्री फाइल 2: लेवलिंग बॉक्स सीएडी फाइल 2। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

सप्लीमेंट्री फाइल 3: लेवलिंग बॉक्स सीएडी फाइल 3। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

अनुपूरक फाइल 4: लेवलिंग बॉक्स हार्डवेयर सूची। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Supplementary Video 1
पूरक वीडियो 1: मैकेनिकल लोडिंग डिवाइस। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

यह लेख ऑस्टियोसाइट्स, ऑस्टियोप्लास्ट और ऑस्टियोब्लास्ट की रचनात्मकता के लिए बोन रीमॉडलिंग एलओसी प्लेटफॉर्म बनाने की नींव का वर्णन करता है। चिप के भीतर कुएं की गहराई और आकार में फेरबदल करके, यांत्रिक भार के साथ ऑस्टियोसाइट्स को उत्तेजित करने और हड्डी रीमॉडलिंग(चित्रा 1बी)के कार्यात्मक परिणामों की मात्रा निर्धारित करने के लिए कई विन्यास विकसित किए गए थे।

चिप असेंबली के दौरान, रिसाव चिंताओं को दूर करने के लिए प्लाज्मा ऑक्सीकरण प्रोटोकॉल का अनुकूलन महत्वपूर्ण था। हमने पाया कि लगभग 10.2 डब्ल्यू के बराबर मध्यम आरएफ पावर सेटिंग (चरण 4.1) का उपयोग करके उत्पन्न ऑक्सीजन प्लाज्मा के 30 एस तक पीडीएम सतहों को उजागर करना, परतों के बीच एक मजबूत बंधन बनाने के लिए पर्याप्त था। बांड की अखंडता में कमी आई जब अब जोखिम समय या एक उच्च आरएफ बिजली की स्थापना का इस्तेमाल किया गया । यह पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है जिसमें पीडीएम के ऑक्सीजन प्लाज्मा में सतह की खुरदरापन और कम चिपकने वाली संख्या17,18को नोट किया गया था .

इसके अतिरिक्त, उच्च सेल व्यवहार्यता और विशिष्ट सेल आकृति विज्ञान को बनाए रखना पीडीएम इलाज प्रक्रिया पर गंभीर रूप से निर्भर था। पीडीएस बहुलक में क्रॉसलिंक्ड डाइमेथिलसिलोक्सनी ओलिगोमर होते हैं। यह क्रॉसलिंकिंग प्रक्रिया समय और तापमान दोनों निर्भर है; हालांकि, यहां तक कि व्यापक इलाज के साथ पॉलीमर पूरी तरह से19पॉलीमरेज विफल रहता है . शेष ओलिगोमर्स को थोक बहुलक से बाहर लेजाने के लिए दिखाया गया है और यहां तक कि बहुलक सतह20पर उगाई जाने वाली कोशिकाओं की झिल्ली में भी पाया गया है । कई समूहों ने गैर -क्रॉसलिंक्ड पीडीएमओ ओलिगोमर्स21,22,,23से साइटोटॉक्सिक प्रभाव ों की सूचना दी है । हमारी प्रणाली में इस चिंता को दूर करने के लिए, हमने पीडीएम इलाज प्रक्रिया को अनुकूलित किया। यद्यपि पीडीएम के लिए इलाज दर तापमान निर्भर है, लेकिन हमारे चिप मास्क के भौतिक गुणों ने हमारे इलाज के तापमान को 45 डिग्री सेल्सियस तक सीमित कर दिया। इस प्रकार, हमने निर्धारित किया कि चिप्स को न्यूनतम 18 घंटे के लिए बेक किया जाना चाहिए। इसके अलावा, हमने पाया है कि साइटोटॉक्सिक प्रभावों को कम करने के लिए सेल सीडिंग (चरण 4.9) से कम से कम 48 घंटे के लिए डीएच2ओ के साथ चिप्स इनक्यूबेटिंग आवश्यक थी। चित्रा 5एक से पता चलता है MLO-Y4 ऑस्टियोसाइट्स के साथ और इस इनक्यूबेशन अवधि के बिना चिप्स में सुसंस्कृत ।

डीप-वेल कॉन्फ़िगरेशन, जिसे मैकेनिकल लोड एप्लिकेशन को समायोजित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, के लिए आवश्यक है कि चिप को तीन अलग-अलग परतों से गढ़ा जाए। उथले-अच्छी तरह से विन्यास के विपरीत, गहरे-अच्छी तरह के विन्यास के लिए एक टुकड़े के रूप में अच्छी तरह से और झिल्ली भागों को गढ़ने से झिल्ली ताना पैदा हुई। यह चिप के मोटे और पतले हिस्सों के बीच इलाज दरों में अंतर के कारण हो सकता है। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, झिल्ली परत अलग से निर्माण किया गया था और इलाज की प्रक्रिया के बाद चिप के नीचे करने के लिए बंधुआ । एक समान मोटाई के साथ एक अलग झिल्ली परत उत्पन्न करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि पीडीएम (चरण 1.4) को जोड़ने से पहले समतल बॉक्स पूरी तरह से स्तर पर हो। इस प्रकार, उच्च स्तर की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए डिजिटल प्रोट्रैक्टर के उपयोग की सिफारिश की जाती है। इसके अतिरिक्त, चरण 2.3.2 के दौरान, प्लास्टिक कप से जितना संभव हो उतना पीडीएफ को हटाना महत्वपूर्ण है। इस कदम पर विसंगतियों झिल्ली मोटाई में उच्च विचलन के लिए नेतृत्व करेंगे, और अंततः औसत सब्सट्रेट तनाव में उच्च विचलन ऑस्टियोसाइट mechanotransduction प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया ।

हमारा बोन रीमॉडलिंग प्लेटफॉर्म उच्च स्तर की बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है। इस प्रणाली का उपयोग विभिन्न कारकों की जांच करने के लिए किया जा सकता है जो बोन रीमॉडलिंग को विनियमित करते हैं, जैसे लोड-प्रेरित मेचनोट्रांसडुक्शन, बहुकोशिकीय सिग्नलिंग, सूजन या दवा प्रभाव। उदाहरण के लिए, इस प्रणाली का उपयोग यांत्रिक भार के संयुक्त प्रभावों और दवा प्रेरित वातावरण14में हड्डी के पुनर्मॉडलिंग पर सूजन का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। बिस्फोस्फोनेट-इलाज ऑस्टियोसाइट्स पर मैकेनिकल लोड लगाया गया था। वातानुकूलित माध्यम के प्रोटीन विश्लेषण से लेप्टिन और ऑस्टियोनेक्टिन के स्तर में उल्लेखनीय वृद्धि हुई और सीसीएल21 और सीडी 36 के स्तर में उल्लेखनीय कमी आई, जबकि ऑस्टियोसाइट्स की तुलना में जो यांत्रिक रूप से लोड नहीं किए गए थे14

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल नियंत्रण रेखा के भीतर प्रत्येक सेल प्रकार को संजोने के साथ-साथ यांत्रिक भार को प्रेरित करने और कार्यात्मक गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के तरीकों के लिए एक नींव प्रदान करते हैं। आगे बढ़ते हुए हम एक सच्चे बोन ऑर्गन-ऑन-ए-चिप की दिशा में काम कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, हमारा मानना है कि गणितीय मॉडलिंग सिस्टम विकसित करने के लिए हमारी प्रणाली का उपयोग करने से जटिल बहुकोशिकीय सिग्नलिंग प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ में काफी वृद्धि हो सकती है जो हड्डी रीमॉडलिंग24,,25को विनियमित करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को ग्रांट नग (सीबीएटी 1060990 और ईबीएस 1700299) के तहत नेशनल साइंस फाउंडेशन ने सपोर्ट किया था। इसके अलावा, यह सामग्री ग्रांट नंबर (2018250692) के तहत नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित काम पर आधारित है। इस सामग्री में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, निष्कर्ष या सिफारिशें लेखकों की हैं और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के विचारों को प्रतिबिंबित करें।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic sheet Optix -- 3.175 mm thick
Angled dispensing tips Jensen Global JG18-0.5X-90 Remove plastic connector prior to use
Biopsy punch Robbins Instruments RBP-10 1 mm diameter
Bone wafers Boneslices.com 0.4 mm thick Bovine cortical bone
Bovine calf serum Hyclone SH30072
Calipers Global Industrial T9F534164
Cell spatula TPP 99010
Chip mask ProtoLabs Custom-designed Print material: Accura SL 5530
Cork borer Fisher Scientific 07-865-10B
Cotton tipped applicator Puritan 806-WCL
Culture dish (100 mm) Corning 430591 Sterile, Non-tissue culture treated
Culture dish (150 mm) Corning 430597 Sterile, Non-tissue culture treated
Double sided tape 3M Company Scotch 237
Fetal bovine serum Hyclone SH30910
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Leveling box Custom-made -- 3D printed
Masking tape 3M Company Scoth 2600
MC3T3-E1 preosteoblasts ATCC CRL-2593 Subclone 4
Mechanical loading device Custom-made -- 3D printed
Minimum essential alpha medium Gibco 12571-063
MLO-Y4 osteocytes -- -- Gift from Dr. Lynda Bonewald
Packaging tape Duck Brand -- Standard packaging tape
Paraffin film Bemis Parafilm PM999
Penicillin/streptomycin Invitrogen p4333
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001 Expanded plasma cleaner
Polydimethylsiloxane kit Dow Corning Sylgard 184
Polystyrene coverslips Nunc Thermanox 174942 Sterile, tissue culture treated
Oven Quincy Lab 12-180
RAW264.7 preosteoclasts ATCC TIB-71
Scalpel BD Medical 372611
Silicone tubing Saint-Gobain Tygon ABW00001 ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm)
SolidWorks software Dassault Systèmes -- Used to generate 3D printed models and perform FEA
Spray adhesive Loctite 2323879 Multi-purpose adhesive
Syringe (5 ml) BD Medical 309646 Sterile
Syringe pump Harvard Apparatus 70-2213 Pump 11 Pico Plus
Tapered laboratory spatula Fisher Scientific 21-401-10
Two-part expoxy Loctite 1395391 5 minute quick set
Type I collagen Corning 354236 Rat tail collagen
Vacuum desiccator Bel-Art F42010-0000
Waterproof sealant Gorilla 8090001 100% silicone sealant

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References

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