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Optimierung der Manschettentechnik für DieMurine Heart Transplantation

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Immunology and Infection

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Summary

Wir führen einen inneren Röhrenansatz zur Manschettentechnik für die heterotopische Herztransplantation der Maus ein, um das Gefäß über die Manschette zu bringen. Wir stellten fest, dass die Zusammenarbeit zwischen zwei erfahrenen Chirurgen die Operationszeit deutlich verkürzt.

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Ma, Y., Xie, B., Dai, H., Wang, C., Liu, S., Lan, T., Xu, S., Yan, G., Qi, Z. Optimization of the Cuff Technique for Murine Heart Transplantation. J. Vis. Exp. (160), e61103, doi:10.3791/61103 (2020).

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Abstract

Die murine Herztransplantation wird seit mehr als 40 Jahren durchgeführt. Mit Fortschritten in der Mikrochirurgie wurden bestimmte neue Techniken eingesetzt, um die chirurgische Effizienz zu verbessern. In unserem Labor haben wir die Manschettentechnik mit zwei Hauptschritten optimiert. Zuerst verwendeten wir die innere Rohrtechnik, um ein temporäres Innenrohr in die äußere Jugularvene und das Karotisarterienblutgefäß einzufügen, um die Umwandlung des Gefäßes über die Manschette zu erleichtern. Zweitens führten wir eine vollständige heterotopische Herztransplantation in Zusammenarbeit mit zwei erfahrenen Chirurgen durch. Diese Änderungen reduzierten effektiv die Betriebszeit auf 25 Minuten, mit einer Erfolgsrate von 95%. In diesem Bericht beschreiben wir diese Verfahren ausführlich und stellen ein zusätzliches Video zur Verfügung. Wir glauben, dass dieser Bericht über die verbesserte Manschettentechnik praktische Anleitungen für die murine heterotopische Herztransplantation bieten und den Nutzen dieses Mausmodells für die Grundlagenforschung verbessern wird.

Introduction

Die Etablierung einer heterotopischen Mausherztransplantation durch End-to-End-Anastomose im Bauch im Jahr 1973 war ein wichtiger Meilenstein in der grundlagenlichen Transplantimmunologieforschung1. Dieses Modell bot ein wichtiges und gültiges Werkzeug für die Analyse der Mechanismen der Ischämie-Reperfusionsverletzung2, immunologische Abstoßung und Toleranz3,4. Die komplexe und zeitaufwändige Betätigung der Operation sowie das Infektionspotenzial können jedoch zu schweren perioperativen Bauchverklebungen und Entzündungsreaktionen führen, was zu einer geringen Effizienz für das heterotopische Herztransplantationsmodell führt.

Die zervikale heterotopische Herztransplantationstechnik wurde erstmals 1991 von Chen beschrieben5. In diesem Modell wird die äußere Jugularvene des Empfängers an der Lungenarterie des Transplantats anastomosed und die Halsschlagader wird anderastomosed zur aufsteigenden Aorta. Die Hauptvorteile dieser Methode sind die Bequemlichkeit der Überwachung und die Verringerung von Traumata für den Empfänger. Im selben Jahr beschrieb Matsuura eine verbesserte Technik, bei der das Ende der äußeren Jugularvene und der Halsschlagader über eine Teflonmanschette getrungen und mit einer umlaufenden Seidenligatur6fixiert wurde. Einige Forscher fixierten auch die Manschette an der rechten Lungenarterie im Spenderherz, bevor sie die Manschette in die äußere Jugularvene des Empfängers7einsteckten. Bisher wurde die Manschettentechnik in verschiedenen vaskulären Pedikelntransplantationsmodellen weit verbreitet, einschließlich der fürLungen-8-,Leber-9-und Nieren-10-Transplantationen.10

Bis heute gibt es mehrere Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Manschettentechnik. Zum Beispiel ist die Halsschlagader aufgrund der zusätzlichen Elastizität, die dazu führt, dass das Gewebe nach hinten kippt, schwer über die Manschette zu werfen. Daher kann eine zusätzliche Praxis und ein mikrochirurgischer Dilator erforderlich sein, um diesen Schritt abzuschließen. Darüber hinaus kann die Zervixgefäßvorbereitung bis zu 25 Minuten dauern.

Um diese Probleme zu lösen, führen wir die Innenrohrtechnik ein, die auf der Manschettentechnik basiert und die Befestigung der Manschette an der äußeren Jugularvene und der Halsschlagader mit einem Innenrohr umfasst, um bei der Eversion der Gefäßwand zu helfen. Darüber hinaus wird die Empfängervorbereitung mit einfachem Training auf 15,5 Minuten reduziert. Diese Technik reduziert die Komplexität der Operation und erfordert keine zusätzliche Praxis oder den Einsatz eines Gefäßdilators. Es kann in der gesamten Transplantationsimmunforschung angewendet werden, insbesondere zur Überprüfung der Immuntoleranz Dritter, bei der der Empfänger zwei Herz-Allografts erhält, eine im Bauch und die andere im Nacken11. Wir empfehlen auch die Zusammenarbeit zwischen zwei erfahrenen Chirurgen, um dieses Modell zu etablieren, wobei ein Chirurg das Empfängertier vorbereitet und das andere das Spenderherz erntet und implantiert. Eine solche Zusammenarbeit kann die Betriebszeit auf 25 Minuten verkürzen. Mit diesem optimierten Verfahren haben wir syngene, allogene12,13,14,15,16,17,18,19, und xenogene Maus Herz Transplantation Modelle20.

Der Grund für die Entwicklung der Innenrohrtechnik war es, die Betriebszeit für die Etablierung eines Mausherztransplantationsmodells mit hoher Erfolgsrate zu reduzieren. Die Optimierung des Zervixherztransplantationsmodells erleichtert den Erwerb hoher Erfolgsraten in kurzer Zeit im Vergleich zur herkömmlichen Naht- und Manschettentechnik21. Darüber hinaus kann das Kooperationsmodell die warme ischämische Zeit des Spenderherzens im Vergleich zu Operationen mit einem einzigen Bediener weiter reduzieren.

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Protocol

Tiere (BALB/c, C57BL/6, männlich, 8-12 Wochen) werden in einer speziellen pathogenfreien Anlage im Xiamen University Laboratory Animal Center untergebracht. C57BL/6 wird als Empfänger und BALB/c als Spender verwendet. Alle Verfahren werden gemäß den Richtlinien des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung (IACUC) durchgeführt.

HINWEIS: Eine Reihe von mikrochirurgischen Instrumenten, einschließlich einer Mikroschere, MikrogeradeZange, Mikro gekrümmten Zangen und Mikronadelhalter, sind für die Operation notwendig (Tabelle und Materialien, Abbildung 1B, C, D, E). Ein Paar Einweg-Bulldog-Klemmen (Abbildung 1F) wird benötigt. Zwei Manschetten für die äußere Jugularvene und die Halsschlagader werden durch Schneiden der kundenspezifischen Polyamidröhren mit einem Skalpell Nr. 10 unter dem Mikroskop hergestellt. Der Durchmesser der Vene und der Arterienmanschette beträgt 0,9 mm bzw. 0,55 mm. Darüber hinaus beträgt der Durchmesser des Innenrohres für die entsprechende Venenmanschette 0,6 mm, und diese des Innenrohres für die entsprechende Arterienmanschette beträgt 0,28 mm(Abbildung 1G).

1. Empfängervorbereitung

  1. Anästhetisieren Sie die Empfängermaus mit Pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Verwenden Sie atraumatische mechanische Clippers, um das Haar im rechten seitlichen Zervixbereich zu entfernen.
  2. Verwenden Sie einen sterilen Baumwollspitzenapplikator, um den chirurgischen Bereich mit Jod-Antiseptikum gefolgt von 70% Ethanol abzuwischen.
  3. Platzieren Sie die Maus in der Supine-Position auf der Bedienplattform. Bedecken Sie die Maus mit steriler Gaze.
  4. Verwenden Sie eine ophthalmologische Schere, um einen Querschnitt vom unteren Ein-Drittel-Ausschnitt-Mittellinie zum rechten Schulter-Clavusgelenk zu machen.
  5. Isolieren Sie die rechte äußere Jugularvene mit mikrogekrümmten Zangen, um genügend Länge freizulegen, schneiden Sie die Zweige durch Elektrokoagulation ab und legen Sie das Gefäß am distalen Ende mit einer 6-0 Seidennaht auf.
  6. Klemmen Sie die äußere juguläre Vene proximal mit einer Bulldoggeklemme und transsektieren Sie die Vene dann proximal mit einer Mikroschere auf die Ligatur.
  7. Waschen Sie das Gefäßlumen mit 100 U/mL 0-4 °C heilsamen Saline, um Restblut zu entfernen.
  8. Ziehen Sie die externe jugular Vene durch die Venenmanschette mit Mikro gerade Zange; Setzen Sie das Veneninnenrohr als Stent in das Lumen ein und lassen Sie die Gefäßwand mit mikrogeraden Zangen über die Manschette legen (Abbildung 2A).
  9. Fixieren Sie das everted Gefäß Endothel am proximalen Ende der Manschette mit einem umfangreichen 8-0 Seidennaht (Abbildung 2B).
  10. Verwenden Sie Mikrogerade Zangen, um das Veneninnenrohr aus dem Venengefäß zu ziehen.
  11. Führen Sie eine stumpfe Zerlegung mit mikrogekrümmten Zangen durch, um die rechte Halsschlagader neben dem inneren Rand des Sternocleidomastoids zu isolieren.
  12. Klemmen Sie die rechte Halsschlagader proximally mit einer Bulldogge Klemme, ligate die Halsschlagader distal mit einer 6-0 Seidennaht, und verwenden Sie eine Mikroschere, um die Halsschlagader proximal auf die Ligatur zu transsektieren.
  13. Waschen Sie die Halsschlagader mit 100 U/mL 0-4 °C heilsamen Saline, um Restblut zu entfernen.
  14. Passieren Sie die Halsschlagader durch die Arterienmanschette und legen Sie das Arterien-Innenrohr mit Mikro-Geradenzangen in das Arteriengefäß ein (Abbildung 2C).
  15. Evert das Gefäß über der Manschette mit Mikro gerade Zange; fixieren Sie das Everted-Gefäß-Endothel mit einem umfangreichen 8-0 Seidennaht (Abbildung 2D).
  16. Ziehen Sie das Arterien-Innenrohr mit Mikrogeraden aus dem Arteriengefäß.
    HINWEIS: Bewahren Sie die submandibuläre Drüse des Empfängers auf.

2. Spendervorbereitung

  1. Anästhetisieren Sie die Spendermaus mit Pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Verwenden Sie atraumatische mechanische Clippers, um das Haar im Bauchbereich zu entfernen.
  2. Platzieren Sie die Maus in der Supine-Position auf der Bedienplattform. Bedecken Sie die Maus mit steriler Gaze.
  3. Verwenden Sie einen sterilen Baumwollspitzenapplikator, um den chirurgischen Bereich mit Jod-Antiseptikum gefolgt von 70% Ethanol abzuwischen.
  4. Machen Sie einen AbdominalMittelschnitt mit einer augenheilbemischen Schere und belichten Sie die Bauchhöhle.
  5. Verwenden Sie mikrogekrümmte Zangen, um die minderwertige Vena cava freizulegen, und intravenös injizieren Sie dann 200 L von 100 U/mL 0-4 °C heparinisierte Saline pro 20 g Körpergewicht durch die inferiorvena cava.
  6. Thorakotomie mit ophthalmologischer Schere durchführen, die Rippen durch die bilateralen midaxillären Linienschnitte abschneiden, die vordere Brustwand nach außen kippen, um die Brusthöhle freizulegen.
  7. Verbrauchen Sie den Thymus mit mikrogekrümmten Zangen.
  8. Setzen Sie die Aorta aus, und durchdringen Sie dann 200 l von 100 U/ml 0-4 °C heilte Saline durch den Aortenbogen an die Herzkranzgefäße.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, Gasblasen in das Spenderherz zu durchdringen.
  9. Verwenden Sie eine Mikroschere, um die aufsteigende Aorta am Anfang des Aortenbogens zu transsektieren.
  10. Transect die Lungenarterie am Anfang der beiden Hauptzweige mit einer Mikroschere.
  11. Ligate die überlegene Vena cava und unterlegenven cava proximally mit einer 6-0 Seidennaht und verwenden Sie eine Mikroschere, um Vene distally auf die Ligatur zu transsektieren.
  12. Die Lungenvenen umlaufend mit einer einzigen 6-0 Seidennaht zusammenziehen und die Venenzweige mit einer Mikroschere distal zur Ligatur abschneiden.
  13. Entfernen Sie das Herztransplantat aus dem umgebenden Weichgewebe; in 0-4 °C heiler Saline aufbewahren.

3. Herzimplantation

  1. Legen Sie das Spenderherz kopfüber in den rechten Halsbereich des Empfängers.
  2. Geben Sie die Lungenarterie des Spenderherzens in eine 6-0 Seidenschlaufe mit Mikrogeraden ein.
  3. Wickeln Sie das Gefäßlumen um die Venenmanschette, und ziehen Sie dann die 6-0 Seidennahtschlaufen um die Manschette, um das Gefäßgelenk zu banden.
  4. Führen Sie eine Anastomose der Aorta des Transplantats und der Arterienmanschette durch Befolgen der in Schritt 3.2 beschriebenen Schritte.
  5. Lassen Sie die geklemmte Jugularvene gefolgt von der geklemmten Jugulararterie los. Halten Sie das Gefäßgelenk ungedreht und stellen Sie sicher, dass der Blutfluss ungehindert ist.
    HINWEIS: Der Sinusrhythmus, der innerhalb von 1 min zu mehr als 200 Mal zurückkehrt, gilt als normal.
  6. Befeuchten Sie das Spenderherz mit warmer (37 °C) Saline und prüfen Sie, ob das Transplantat blutet. Stellen Sie das pulsierende Herztransplantat in den subkutanen Raum ein, und verschließen Sie dann den Schnitt.

4. Postoperative Pflege und Graft-Bewertung

  1. Nehmen Sie die Zeit zum normalen Sinusrhythmus und die Erhaltung des normalen Sinusrhythmus für mindestens 5 Minuten nach der Klemmenfreigabe auf, um die postoperative Transplantatfunktion zu überwachen.
  2. Legen Sie den Empfänger allein auf eine warme Decke, bis der Empfänger aus der Anästhesie aufwacht. Verabreichen Sie Buprenorphin Analgesie, 0,05 mg/kg, s.c. am Ende der Operation und alle 12 Stunden für 72 Stunden nach der Operation.
  3. Zeichnen Sie das Gewicht und den postoperativen Wiederherstellungsstatus des Empfängers täglich auf. Im Falle von >15% Gewichtsverlust im Vergleich zu dem am Operationsdatum, hemiplegische Lähmung, oder Infektion, einschläfern den Empfänger über terminale Isofluran-Inhalation21.
  4. Überwachen Sie das Transplantatüberleben durch tägliche Palpation. Die Operation gilt als erfolgreich, wenn der murine Allograft für >72 Stunden überlebt. Grad die Transplantatfunktion, wie zuvor berichtet22: Skala 3 - kräftig pulsieren und Frequenz; Skala 2 - weniger pulsierend; Skala 1- Fibrillation und bevorstehende Ablehnung; oder Skala - 0, Verlust des Herzschlags und vollständige Ablehnung.

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Representative Results

Chirurgische Operationszeit

Nach der Ausbildung kann ein erfahrener Chirurg die Operation innerhalb von 35 Minuten mit der Innenrohrtechnik erfolgreich durchführen, wobei ca. 15,5 Minuten für die Empfängervorbereitung benötigt werden, 10,9 Minuten für die Spendervorbereitung und 4,4 Minuten für Spenderherzanastomosen erforderlich sind. Die kalte und warme Ischämiezeit (von der Spendervorbereitung bis zur Herzimplantation) wird im Vergleich zur Operation mit der Manschettentechnik ohne die Innenrohrtechnik und Nahttechnik auf 15,3 Minuten reduziert (Tabelle 1)21.

Wir haben ein Kooperationsmodell entwickelt, um die Effizienz der Operation weiter zu verbessern. Wie im Schaltplan gezeigt (Abbildung 3), beginnt zunächst ein Chirurg mit der Vorbereitung des Empfängers, gefolgt von der Einleitung der Spendervorbereitung durch einen zweiten Chirurgen nach 4-5 Minuten. Nach 15-16 Minuten sollte der erste Chirurg die Empfängervorbereitung beendet haben, und dann sollte der zweite Chirurg, der die Ernte des Spenderherzens beendet hat, damit beginnen, das Spenderherz innerhalb des Empfängers zu anastomosing. Dieses Kooperationsmodell erfordert, dass jeder Chirurg nur in einem einzigen Teil der Manschettentechnik geschult wird und die Gesamteinsatzzeit weiter auf ca. 25 Minuten verkürzt. Eine Analyse von >600 heterotopischen murinen Transplantationen, die in Zusammenarbeit zwischen zwei Chirurgen in den letzten zwei Jahren am Organtransplantationsinstitut der Universität Xiamen durchgeführt wurden, zeigt eine Erfolgsrate bei Herztransplantationen mit dieser Technik von bis zu 95%.

Überleben der wichtigsten Histokompatibilität Komplex Herz nicht übereinstimmende und abgestimmte HerzGrafts

Major Histocompatibility Complex (MHC), genannt "H-2", wurde verwendet, um genetische Disparitäten und Ähnlichkeiten zu bestimmen. Spender-nicht übereinstimmende MHC-Antigene können eine Transplantatabstoßung auslösen, indem sie direkt mit den Empfänger-T-Zellen interagieren oder indirekt als Spender-MHC-abgeleitete Peptide, die auf Empfänger-MHC-Moleküle23ausgedrückt werden. Ein vollständig MHC nicht übereinstimmendes BALB/c (H-2d) Allograft-Herz kann abgelehnt werden, mit einer medianen Überlebenszeit von 7,5 Tagen nach der Transplantation in C57BL/6 (H-2b) Empfängermäuse (Abbildung 4A). In unseren Studien überlebten syngene Herztransplantationen mehr als 100 Tage, außer in einem seltenen Fall aufgrund eines Gewichtsverlustes von 15 % im Vergleich zum normalen Gewicht vor der Operation.

Herz-Allografts können zur histopathologischen Untersuchung zum Zeitpunkt der Ablehnung geerntet werden. Abbildung 4B zeigt das Auftreten von markierten zellvermittelten Abstoßungsmerkmalen, wie z. B. entzündliche Zellinfiltration, Gewebeödeme und mikrovaskuläre Okklusion. Syngene Transplantate sind nahezu normal, ohne Dassindizfürst in Myozytennekrose oder entzündliche Zellinfiltration.

Wirkung der inneren Röhre auf das vaskuläre Endothel

Zur Beurteilung der Schädigung des vaskulären Endothels nach dem Einsetzen des Innenrohrs in das Lumen kann 100 Tage nach der syngenischen Herztransplantation das vaskuläre Endothel der Anastomose-Stelle gesammelt und durch Immunfluoreszenz gefärbt werden. In dieser Analyse wurde keine offensichtliche Verengung der Gefäßwand, Thrombose oder Verdickung der Intima beobachtet (Abbildung 4C). Elektronenmikroskopische Bildgebung ergab, dass ein glattes Endothel und eine regelmäßige Längskammbildung, mit den Endothelzellen sauber und eng angeordnet, ohne offensichtliche Sedimente auf der Oberfläche(Abbildung 4D).

Figure 1
Abbildung 1: Ein Satz steriler chirurgischer Instrumente:
(A) Feine Zange und Augenschere; (B) Mikrogekrümmte Zange; (C) Mikrogerade Zangen; (D) Mikronadelhalter; (E) Mikroschere; (F) Bulldogklammern; (G) Ein Arterien-Innenrohr (roter gepunkteter Pfeil) und Manschette (roter durchgezogener Pfeil), zusammen mit einem Venen-Innenrohr (schwarz gepunkteter Pfeil) und Manschette (schwarzer massiver Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Vorbereitung des Empfängers.
(A) Legen Sie das Veneninnenrohr in das äußere Jugularvenengefäß ein; (B) Das Venengefäß über die Manschette legen und mit einem Umfang 8-0 fixieren Seide Naht; (C) Legen Sie das Innenrohr der Arterie in das Lumen des Arteriengefäßes ein; (D) Das Venengefäß über die Manschette legen und mit einem Umfang 8-0 fixieren Seide Naht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Betriebszeit jedes Schritts bei der heterotopischen Murine-Transplantation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: (A) Herztransplantat Überlebenszeit. Kaplan-Meier-Diagramm, das das Überleben von Herzallografts (BALB/c) und syngenischen Transplantaten (C57BL/6) von Spendermäusen zeigt, die in C57BL/6-Empfängermäuse transplantiert wurden (n=12 Mäuse/Gruppe); (B) Mikroskopische Untersuchung von C57BL/6 (links) Isograft und Wild Type BALB/c Allograft (rechts) am Tag 7 nach der Transplantation (Scale bars, 50 um; Vergrößerung 400); (C) Immunfluoreszenz (Scale bars, 50 'm; Vergrößerung 400) (D) Elektronenmikroskopische Scanning von Vaskulärem Endothel bei Transplantation (links) und Naive (rechts) Empfänger. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Anastomose-Technik Vorbereitungszeit für Empfänger Vorbereitungszeit für Spender Herzimplantationszeit Kalte und warme Ischämie Zeit Gesamtbetriebszeit
5 Cervical Heterotopic Naht N N N < 45 min N
6 Cervical Heterotopic Manschette 45 Min. 15 Min. 10 Min. N N
24 Zervikal es Manschette 15 Min. 20 Min. 15 Min. 25-40 min < 60 min
25 Abdomen Heterotopisch Naht N N N N 35 Min.
7 Cervical Heterotopic Manschette N 20 Min. N 30 Min. 35 Min.
26 Cervical Heterotopic Manschette N 20 Min. 20 Min. < 35 min N
4 Abdomen Heterotopisch Naht 60–70 Min. 6-7 min N N 75 Min.
21 Cervical Heterotopic Manschette N N 7 Min. 20 Min. 45 Min.
27 Abdomen Heterotopisch Naht N 10-15 min N N 45-60 Min.
28 Cervical Heterotopic Manschette 25 Min. 20 Min. 15 Min. 20 Min. 60 x 8 min
29 Cervical Heterotopic Manschette 31.9 Min. 21.1 Min. 5.1 Min. 28.5 Min. 57,8 bis 3,9 min
29 Cervical Heterotopic Naht 25.2 Min. 20.5 Min. 30.8 Min. 51.3 Min. 83,9 bis 2,9 min
Cervical Heterotopic in unserem Protokoll Manschette 15.5 Min. 10.9 Min. 4.4 Min. 15.3 Min. 35 Min.
(Einzelbetrieb)
23 Min.
(Zusammenarbeit)

Tabelle 1: Vergleich der Zeit verschiedener Phasen in verschiedenen Mausherztransplantationstechniken.

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Discussion

Mausherztransplantationsmodelle sind wichtige Werkzeuge für die Transplantationsimmunologieforschung, da Werkzeuge und Materialien zur Bewertung der Immunmechanismen dieses Modells und einer großen Anzahl genmodifizierter Mäuse zur Verfügung stehen. Mikrochirurgische technische Herausforderungen, wie Die Naht gefäßnah und die Eversion, haben jedoch ihre weit verbreitete Verwendung eingeschränkt. In der vorliegenden Studie haben wir einige technische Kernherausforderungen der murinen Herztransplantation untersucht und gute Ergebnisse erzielt. Ein kritischer Schritt des Protokolls das Einsetzen eines Innenrohrs in das Lumen als Stent, um die Gefäßwand über die Manschette zu stellen. Dieser Optimierungsschritt löst die technische Herausforderung, das Arteriengefäß aufgrund der Notwendigkeit einer ausgedehnten Strecke zu entfachen. Personen ohne mikrochirurgische Fähigkeiten können nach zweimonatiger Ausbildung mit der Durchführung der Technik beginnen, was auch bei der breiten Anwendung dieses Modells helfen wird.

Unserer Erfahrung nach wird ein geeignetes Innenrohr die Transplantationsergebnisse verbessern. Der Außendurchmesser des Innenrohres sollte etwas kleiner sein als der Innendurchmesser des Empfängerblutgefäßes. Darüber hinaus sollten stumpfe Polypropylenrohre oder Zylinder mit rutschiger Oberfläche als temporäre Innenkerne verwendet werden, um eine Beschädigung des vaskulären Endothel zu vermeiden. In unseren Händen trat keine Thrombose in den 5% der Modelle auf, die versagten, obwohl Thrombus ein wichtiger Faktor für das Versagen nach Anastomose mit der Nahttechnik ist. Mit diesen ausgereiften Modellen haben unsere Labore mehrere grundlegende Forschungsartikel veröffentlicht, die von Peer-Reviewern14,15,16,17,18,19anerkannt wurden.

Operationen, die innerhalb von 35 Minuten durchgeführt wurden, unterschieden sich nicht wesentlich von der traditionellen Manschettentechnik, aber die kalte und warme Ischämiezeit war deutlich niedriger als die anderer Techniken (Tabelle 1). Die Verwendung des Kooperationsmodells reduziert die durchschnittliche Betriebszeit weiter auf 23-25 Minuten, was sich in der Anästhesiezeit der Empfängermaus und in der Implantationszeit des Spenderherzens widerspiegelt. Ein weiterer Vorteil der Manschettentechnik, dass sie die warme ischämische Zeit einschränkt (Tabelle 1). Da kein Eisbeutel verwendet wird, um das Herztransplantat vor der warmen Körpertemperatur des Mausempfängers zu schützen, entspricht die warme ischämische Zeit der Anastomosezeit. Die optimierte Manschettentechnik beinhaltet die Vorbereitung beider Manschetten am Empfänger, um das Anastomoseverfahren zu vereinfachen und verkürzt dementsprechend die Anastomosezeit. Daher begrenzt die Manschettentechnik die warme ischämische Zeit auf durchschnittlich nur 4,4 Minuten.

Es gibt jedoch einige wichtige Schritte, die mit der neuen beschriebenen Technik zu beachten sind. Achten Sie darauf, die submandibuläre Drüse der Empfängermaus in zervikalen heterotopischen Herztransplantation30zu bewahren, da die submandibuläre Drüse verwendet werden kann, um das Herztransplantat zu fixieren und Verdrehungen der Gefäße zu vermeiden. Vermeiden Sie es, den Vagusnerv zu beschädigen, wenn Sie die äußere Jugularvene und die Halsschlagader isolieren, da Verletzungen zu Halshemiplegie im Empfänger führen können. Der Druck der Bulldoggenklemmen sollte bei 20-25 Gramm gehalten werden, um Clipverletzungen oder Gefäßlecks zu vermeiden. Waschen Sie das Lumen der Gefäße und die Manschetten mit 0-4 °C heilte Saline, um restliche Blut- und Gasblasen zu entfernen; dies verhindert Embolie in Transplantaten nach der Reperfusion. Verwenden Sie eine 1 ml Spritze, um den Spender mit 0-4 °C heiler Kochsaline zu durchdringen, und erhöhen Sie die Geschwindigkeit auf 50 l pro Sekunde, um einen angemessenen Druck aufrechtzuerhalten. Während der Anastomose die Umfangs- 8-0 nicht Nähte (verwendet, um das immerklästigen Vaskuläredothel an den Manschetten zu fixieren) in das Lumen der Transplantatarterien.

Obwohl das Kooperationsmodell, das die Notwendigkeit mikrochirurgischer Techniken, die Verfügbarkeit von zwei Simultanmikroskopen und die Doppelte Zahl qualifizierter Chirurgen umfasst, Grenzen hat, hat es sich dennoch als erfolgreicher Ansatz für die Durchführung von vaskulären Organtransplantationen erwiesen. Seine breitere Anwendung kann weiter zur Entwicklung neuer immunsuppressiver Protokolle und zur Untersuchung der Mechanismen der akuten und chronischen Abstoßung im Transplantationsbereich beitragen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Fujian Provincial Health Education Joint Research Project (WKJ2016-2-20), die National Natural Science Foundation of China (81771271 und 81800664), das National Key R&D Program of China (2018YFA0108 304) und das Bildungs- und Wissenschaftliche Forschungsprojekt für junge und mittlere Lehrer in der Provinz Fujian (JAT170714), die Natural Science Foundation of Hunan Province of China (2019JJ50842) und Huxiang Young Talents of Hunan Province (2019RS2013).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artery cuff Self-made Polyamide tube. diameter: 0.55 mm,length: 1.0 mm
Artery inner tube Self-made Polyamide tube. Diameter: 0.28mm
Micro curved forceps Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory WA3050 1/8 arc, 0.3-mm tip without a hook
Micro needle holders Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory WA2050 0.2-mm tip
Micro scissors Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory WA1050 Straight, blade length: 10 mm
Micro straight forceps Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory WA3060 0.15-mm tip without a hook
Scanlan Vascu-Statt Bulldog Clamps Scanlan International Inc 1001-531 Clamping pressure 20–25 grams
Vein cuff Self-made Polyamide tube. diameter: 0.9 mm,length: 1.2 mm
Vein inner tube Self-made Polyamide tube. Diameter: 0.6 mm

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References

  1. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplantation Proceedings. 5 (1), 733-735 (1973).
  2. Que, W. et al. Prolonged cold ischemia time in mouse heart transplantation using supercooling preservation. Transplantation. (2019).
  3. Wang, C. Y. et al. Suppression of murine cardiac allograft arteriopathy by long-term blockade of CD40-CD154 interactions. Circulation. 105 (13), 1609-1614 (2002).
  4. Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nature Protocols. 2 (3), 471-480 (2007).
  5. Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52 (6), 1099-1101 (1991).
  6. Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).
  7. Wang, Q., Liu, Y., Li, X. K. Simplified technique for heterotopic vascularized cervical heart transplantation in mice. Microsurgery. 25 (1), 76-79 (2005).
  8. Li, W. et al. Surgical technique for lung retransplantation in the mouse. Journal of Thoracic Disease. 5 (3), 321-325 (2013).
  9. Kamada, N., Calne, R. Y. A surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat. Surgery. 93 (1 Pt 1), 64-69 (1983).
  10. Chen, H., Zhang, Y., Zheng, D., Praseedom, R. K., Dong, J. Orthotopic kidney transplantation in mice: technique using cuff for renal vein anastomosis. PLoS One. 8 (10), e77278 (2013).
  11. Miller, M. L. et al. Spontaneous restoration of transplantation tolerance after acute rejection. Nature Communications. 6, 7566 (2015).
  12. Lin, Y. et al. Overexpression of Jagged-1 combined with blockade of CD40 pathway prolongs allograft survival. Immunology and Cell Biology. 93 (2), 213-217 (2015).
  13. Xie, B. et al. Combined costimulation blockade inhibits accelerated rejection mediated by alloantigen-primed memory T cells in mice. Immunological Investigations. 38 (7), 639-651 (2009).
  14. Shao, W. et al. Combination of monoclonal antibodies with DST inhibits accelerated rejection mediated by memory T cells to induce long-lived heart allograft acceptance in mice. Immunology Letters. 138 (2), 122-128 (2011).
  15. Dai, H. et al. Blockade of CD27/CD70 pathway to reduce the generation of memory T cells and markedly prolong the survival of heart allografts in presensitized mice. Transplant Immunology. 24 (4), 195-202 (2011).
  16. Yan, G. et al. Inhibition of accelerated rejection mediated by alloreactive CD4(+) memory T cells and prolonged allograft survival by arsenic trioxide. Immunological Investigations. 42 (5), 438-454 (2013).
  17. Yan, G. et al. Inhibiting accelerated rejection mediated by alloreactive CD4(+) memory T cells and prolonging allograft survival by 1alpha,25-dihydroxyvitamin D(3) in nude mice. Immunology Letters. 149 (1-2), 54-61 (2013).
  18. Lin, Y. et al. Arsenic trioxide is a novel agent for combination therapy to prolong heart allograft survival in allo-primed T cells transferred mice. Transplant Immunology. 25 (4), 194-201 (2011).
  19. Shao, W. et al. CD44/CD70 blockade and anti-CD154/LFA-1 treatment synergistically suppress accelerated rejection and prolong cardiac allograft survival in mice. Scandinavian Journal of Immunology. 74 (5), 430-437 (2011).
  20. Li, Y. et al. A highly reproducible cervical cuff technique for rat-to-mouse heterotopic heart xenotransplantation. Xenotransplantation. (2017).
  21. Oberhuber, R. et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753 (2014).
  22. Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
  23. Felix, N. J. et al. H2-DMalpha(-/-) mice show the importance of major histocompatibility complex-bound peptide in cardiac allograft rejection. Journal of Experimental Medicine. 192 (1), 31-40 (2000).
  24. Tomita, Y. et al. Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. 64 (11), 1598-1601 (1997).
  25. Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
  26. Wang, K., Zhang, N., Li, H. Improved technique of mouse heterotopic heart graft retransplantation. Microsurgery. 26 (3), 200-202 (2006).
  27. Plenter, R. J., Grazia, T. J. Murine heterotopic heart transplant technique. Journal of Visualized Experiments. (89) (2014).
  28. Ratschiller, T. et al. Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice. Journal of Visualized Experiments. (102), e52907 (2015).
  29. Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Experimental and Clinical Transplantation. 8 (3), 245-249 (2010).
  30. Fukunaga, N., Bissoondath, V., Rao, V. Submandibular Gland-preserving Technique for Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice. Transplantation. 102 (11), e464-e465 (2018).

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